Système immunitaire

1200 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour entretenir des lignées de l'élevage. Elles subissent un jeûne de trois semaines et des mesures de poids sous anesthésie, 30 d'entre elles faisant l'objet de prises de sang répétées par ponction de la veine caudale. Le projet vise à estimer l'efficacité alimentaire pour réduire les coûts et l'impact environnemental de l'aquaculture. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro et qu'il est "nécessaire" de mesurer cette efficacité dans des conditions proches de l'élevage commercial.

Objectifs

Dans un contexte de développement durable de l’aquaculture, il existe aujourd’hui une volonté grandissante de sélectionner les poissons ayant la meilleure EA possible. L’EA peut être vue comme la capacité à produire plus à partir d’une même quantité d’aliment ingérée. En effet, d’une part, l’alimentation représente de 30 à 70% des coûts de production, et, d’autre part, l’utilisation de granulés entrainent de lourds impacts environnementaux à différents niveaux : de la production des ingrédients qui les composent aux rejets dissous des effluents d’élevage. Améliorer l’EA requiert de pouvoir quantifier précisément l’ingestion individuelle ce qui reste, encore aujourd’hui, difficile à entreprendre chez les poissons élevés en larges groupes. C’est pourquoi, des critères indirects pour l'estimation de l’EA ont été évalués ces dernières années chez les poissons. Chez la truite arc en ciel, il a été démontré que la perte de poids au jeûne combinée aux performances de croissance observée après le jeûne peut expliquer jusqu’à 60% de la variabilité de l’ingéré individuel un critère d’estimation de l’EA. Les poissons perdant le moins de poids durant le jeûne sont supposés être ceux avec une meilleure EA car ayant de moindres besoins d’entretien. Bien que potentiellement intéressante, une sélection sur un tel critère pose alors la question de la capacité des poissons à maintenir de bonnes performances pour d’autres caractères associés à la robustesse (santé, reproduction).

Bénéfices attendus

Ce projet se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM). Ces deux lignées expérimentales divergentes constituent un modèle biologique de choix dans ce projet, en effet elles ont montré une utilisation différente de l’énergie. Nous faisons l’hypothèse qu’elles réagissent différemment à l’effet du jeûne avec des réponses différentes en terme d’EA. Sur le plan scientifique, le projet REFER-Trout, permettra de tester l’intérêt de la perte de poids au jeûne comme paramètre indirect d’estimer de l’EA, difficile à mesurer chez la truite arc-en-ciel en conditions de production, tandis que les analyses de sang permettront de tester les relations entre EA et d’autres fonctions biologiques et notamment l’immunité. Ces connaissances seront utiles pour mieux appréhender l’allocation des ressources chez le poisson et affiner la notion de robustesse.

Procédures

Les animaux seront soumis à des mesures non-invasives de poids et d'adiposité (3 fois sur l'ensemble de l'expérience) qui concerne l'ensemble des individus (n = 1200) et nécessitent l'anesthésie et l'émersion des animaux. Des prises de sang, par ponction de la veine caudale, répétées sur un nombre limité d’individus (n = 30) seront réalisées également lors des périodes de mesures décrites précédemment (3 fois sur l'ensemble de l'expérience). L'ensemble des mesures biométriques et d'échantillonnage de sang sera réalisée dans un temps limitant l'émersion à une durée maximale de 1 minute.

Impact sur les animaux

La procédure est classée en modérée en raison du jeûne prolongé de trois semaines combiné à des prises de sang répétées sur un nombre limité d’individus, qui si, mal réalisés peuvent conduire à générer de la douleur et du stress et une sensibilité accrue aux pathogènes. Les prises de sang sont effectuées sur 30 poissons afin de réduire au maximum le nombre d’individus concernés tout en permettant des résultats exploitables. Les prises de sang auront lieu uniquement lors des phénotypages, ce faisant, les poissons concernés n’auront pas à subir des anesthésies et manipulations supplémentaires.

Devenir

A la fin de la procédure, l’ensemble des individus (1200 poissons) seront gardés en vie pour compléter les effectifs destinés à l’entretien des lignées grasse et maigre au sein de l'établissement utilisateur (UE PEIMA, INRAE).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé qu’in vivo. Il n’y a pas d’alternative in vitro pour caractériser l’EA des truites arc en ciel et, plus largement, des animaux d’élevage. De plus, l’objectif étant, in fine, de promouvoir une aquaculture durable par la réduction des intrants alimentaires, il est nécessaire de mesurer l’EAs des poissons dans des conditions proches de l’élevage commercial.

Réduction

Nous avons recours à un matériel biologique original, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle. Les individus utilisés pour l’expérimentation envisagée seront issus de l’entretien annuel de ces lignées. Nous avons réduit le nombre d'animaux au minimum nécessaire pour avoir une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux impliqués correspond au strict minimum requis pour déterminer avec le plus de précision possible la loi de distribution des caractères ciblés et ainsi d'être mieux en mesure de différencier statistiquement les caractéristiques de chaque lignée. Ces chiffres permettent de s'assurer de la robustesse de nos analyses statistiques et nous semblent être un minimum pour mettre en œuvre une analyse de variance fiable.

Raffinement

Avant et pendant les procédures, une surveillance du comportement des animaux est effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Tout au long de l’expérimentation et tout particulièrement durant la phase de jeûne prolongée, les poissons seront observés au moins 2 fois par jour et les poissons au comportement anormal (léthargie, perte d’équilibre) seront péchés et mis à mort. Par ailleurs, aucune manipulation ne sera réalisée durant la phase de jeûne, la plus critique de l’expérimentation, afin de minimiser autant que possible le stress généré.

Choix des espèces

La truite arc en ciel est l’espèce principalement étudiée au laboratoire. Il s’agit de l’espèce prépondérante de la pisciculture en France et l’une d’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipides du muscle, LG et LM, permettent de réaliser le projet sur un matériel biologique original. Les truites arc-en-ciel sont utilisées au stade juvénile (animaux non matures). Ce stade est plus sensible aux stress que les poissons maturants.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit des injections induisant une encéphalomyélite, modèle de sclérose en plaques, dont le porteur décrit les signes attendus, une faiblesse pouvant aller jusqu'à la paralysie des membres. Les souris sont suivies par un score clinique pendant 28 jours puis tuées pour prélever cerveau, moelle épinière et organes. Le porteur affirme que ce modèle est la seule alternative adaptée à l'étude des mécanismes immunitaires de la maladie.

Objectifs

Notre projet a pour objectif général de caractériser la composante immunitaire de l’inflammation chronique. Celle-ci est liée à des pathologies aussi diverses que les cancers, les maladies cardio-vasculaires et les maladies autoimmunes, notamment la sclérose en plaques (SEP), maladie autoimmune du système nerveux central (SNC), touchant plus de 100.000 personnes en France et 3 millions dans le monde. Il a en effet été montré que chez des patients atteints de SEP, les lymphocytes T régulateurs (Treg) perdent leur fonction suppressive. De plus, dans un environnement inflammatoire, l’identité même des Tregs est modifiée, menant à des modifications épigénétiques et phénotypiques, et aboutissant à une perte de leur capacité régulatrice. La compréhension de ces phénomènes pourrait pourtant permettre de mieux comprendre le déficit fonctionnel des Treg au cours de la SEP, et de définir des cibles thérapeutiques et donc de nouveaux traitements de cette pathologie. Les modèles animaux de SEP permettent, contrairement à ce qui est possible chez les patients, d’étudier l’inflammation locale. L’objectif de ce projet est d’étudier les modifications d’identité des Tregs au cours de l’inflammation chronique dans un modèle de SEP, l’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE) chez la souris.

Bénéfices attendus

La SEP est une maladie extrêmement invalidante, réduisant l’espérance de vie, induisant un coût social important et touchant plus de 3 millions de patients dans le monde. Les traitements actuels permettent dans certains cas de ralentir la progression de cette pathologie, mais l’arsenal thérapeutique n’est encore pas assez développé, et bon nombre de patents ne répondent pas, ou plus, aux traitements. Cette pathologie a pour origine un dysfonctionnement du système immunitaire dont les mécanismes ne sont pas encore bien identifiés. Les recherches portant sur la compréhension de ces mécanismes immunologiques sont indispensables à l’élaboration de nouveaux traitements de la SEP. Le système immunitaire formant un système complexe dont la globalité n’est pas pleinement reproductible in vitro, les modèles animaux de cette maladie permettent de mieux comprendre les étapes cellulaires et moléculaires à l’origine de l’initiation, du développement et de l’entretien des atteints du SNC caractérisant la SEP et menant au handicap qui en résulte. Les bénéfices attendus de notre projet sont, à court terme, de comprendre les mécanismes immunitaires de l’inflammation chronique du SNC dans le modèle d‘EAE pour, à plus long terme, définir des cibles thérapeutiques qui constitueront la base de nouveau traitements de la SEP chez les patients.

Procédures

2 injections sous cutanées et 2 injections intra-péritonéales en 2 jours, sur animaux vigiles, d'une durée de moins d'une minute par injection. Un prélèvement de sang rétro-orbitaire sous anesthésie générale (1 à 2 minutes pour le prélèvement, environ 1h d'anesthésie) une semaine avant le début des injections et un prélèvement de sang intra-cardiaque (1 à 2 minutes de prélèvement) sous anesthésie générale terminale également en fin d'expérimentation. Les traitements seront réalisés quotidiennement par voie orale (moins de 2 minutes) ou intra-péritonéale (moins de 1 minute) dans un volume maximum de 0.2 ml et dilués dans de l’eau ou du PBS, au maximum pendant toute la durée de l’expérience, soit 28 jours. Le scoring (environ 2 minutes par souris) sera effectué par examen clinique des animaux : simple observation de la queue (flaccidité ou non), des pattes postérieures et antérieures (mobiles ou non). L’état général des animaux sera évalué à chaque scoring. Le scoring sera réalisé trois fois par semaine pendant 28 jours.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sont les signes cliniques de l’EAE : perte de mobilité (faiblesse à paralysie des membres postérieurs et antérieurs) réversibles après 2 semaines en absence de traitement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ceci permettra d'effectuer de nombreux prélèvements d'organes (cerveau, rate, moelle épinière, ganglions, moelle osseuse et sang) et de réaliser de nombreuses analyses in vitro complémentaires aux résultats cliniques obtenus.

Remplacement

Notre projet porte sur la compréhension de la physiopathologie d’une maladie autoimmune inflammatoire, la SEP. Aucun système in vitro ou in silico ne peut à l’heure actuelle reproduire la complexité des mécanismes cellulaires et moléculaires initiant et entretenant cette pathologie. Les modèles animaux de SEP, dont le principal est l’EAE, miment le développement de l’autoimmunité et le declenchement de l’inflammation chronique du SNC. Ils sont ainsi la seule alternative adaptée à l’étude des mécanismes immunitaires de la SEP.

Réduction

Cette étude utilisera un total de 1200 animaux. Le nombre de souris nécessaires dans chaque procédure est défini sur la base d'un calcul de puissance et des études réalisées historiquement dans le laboratoire. Le nombre de souris défini pour chaque groupe devrait être suffisant pour obtenir des données statistiquement exploitables. Nous avons tenu également compte d'une possible perte d'animaux liée à la procédure expérimentale. Des analyses statistiques seront réalisées pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Sur les animaux seront prélevés sur chaque animal le sang, le cerveau, la moelle épinière la rate, les ganglions et la moelle osseuse afin d’obtenir un maximum d’information sur l’homéostasie immunologique dans les différents tissus et limiter ainsi la répétition d'expériences.

Raffinement

Les souris sont maintenues en groupe de plusieurs individus afin de respecter leurs besoins sociaux. Elles sont hébergées dans des cages enrichies avec du coton et des igloos pour améliorer leur bien-être. Une période d’adaptation est respectée avant le début de la procédure pour réduire le stress des animaux lié à leur transport. Toutes les conditions sont réunies pour prendre en compte la douleur des animaux, notamment avec la mise en place d'une anesthésie. Des points limites ont été définis pour limiter la souffrance des animaux sans remettre en cause les objectifs du projet et les données obtenues. Les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs, Le score clinique précis des souris et évalué 3 fois par semaine par les expérimentateurs. L’euthanasie se fera sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le modèle de l’EAE existe chez la souris, le rat et le primate non humain. Il reproduit les signes cliniques, histologiques et immunologiques de la maladie humaine, la SEP. Le choix de la souris est de plus justifié par l’existence d’outils biotechnologiques (anticorps, dosage de molécules..) adapté à cette espèce. L’induction de l’EAE se fera sur des animaux de 5-10 semaines. Les scores cliniques de l’EAE seront évalués pendant 2 à 8 semaines après l'induction. L'âge des souris au moment de leur utilisation est déterminé par la maturation du système immunitaire

18 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Chaque animal reçoit le virus de la grippe ou des extraits de levure, subit des lavages des poumons et des prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie, avant d'être tué pour récolter les poumons. Le porteur indique que l'infection grippale provoque de la fièvre, une baisse d'appétit et des troubles respiratoires pendant plusieurs jours. Il présente le porc comme un bon modèle de la grippe humaine et affirme que les analyses in vitro ne suffisent pas à répondre à l'objectif.

Objectifs

L’immunité entrainée est liée à une mémoire à long terme de certaines cellules immunitaires. Elle se caractérise par une réponse accrue lors d’une ré-infection avec le même micro-organisme ou avec un micro-organisme différent. Cette seconde réponse plus forte représente une mémoire immunitaire vis à vis d’un large éventail de pathogènes, ce qui est différent de la mémoire obtenue par la vaccination qui elle, est spécifique de l’agent pathogène utilisé. Le concept d’immunité entrainée a été décrit dans de nombreuses études chez la souris. Ainsi, il a été montré que différents stimuli (par exemple des extraits de paroi de levure (β-glucanes), ou le vaccin atténué de la tuberculose (BCG)) pouvaient protéger contre des infections mortelles par des bactéries, des champignons ou des parasites de manière non spécifique. A l’occasion d’un précédent projet mené chez le porc, des cellules immunitaires pulmonaires (appelées macrophages alvéolaires) ont été récoltées chez 3 porcs ayant été infectés 3 semaines plus tôt par le virus de la grippe et chez 3 autres porcs n’ayant pas été infectés (porcs naïfs). Ces macrophages alvéolaires ont été restimulés in vitro avec une molécule permettant de simuler une infection virale. Les macrophages alvéolaires de porcs précédemment infectés par la grippe ont présenté des réponses immunitaires plus fortes que ceux issus de porcs naïfs. Ces résultats suggèrent fortement un entrainement des macrophages alvéolaires porcins par l’infection grippale. Cet entrainement pourrait avoir un effet protecteur sur des sur-infections par d’autres virus infectant le système respiratoire. Les objectifs de ce projet sont (i) de confirmer ces résultats préliminaires d’entrainement des macrophages alvéolaires par une infection grippale et (ii) d’évaluer l’entrainement des monocytes (cellules immunitaires circulant dans le sang), voire de leurs précurseurs dans la moëlle osseuse, et des macrophages alvéolaires chez le porc par une injection de β-glucanes (stimuli connu pour induire une immunité entrainée chez l’homme et la souris).

Bénéfices attendus

Ces éléments aideront à approfondir les connaissances sur l’immunité entraînée chez le porc et sur son induction. De plus, le porc étant un bon modèle de l’infection grippale chez l’Homme, ces résultats pourraient permettre une extrapolation dans le domaine médical.

Procédures

Les animaux (n=18) recevront du virus grippal ou des β-glucanes ou du milieu de culture par voie trachéale ou péritonéale (jour 0 (J0)). Les porcs seront soumis à : 1/ un lavage broncho-alvéolaire sous anesthésie générale de courte durée (

Impact sur les animaux

Suite aux inoculations par un virus grippal, une hyperthermie est attendue, ne persistant guère plus de 4 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 - 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (dyspnée, toux, éternuements) pendant la semaine suivant l’infection. Aucun effet indésirable n’est attendu suite à l’administration de β glucanes.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter les poumons.

Remplacement

Les analyses in vitro ne permettent pas de répondre à l’objectif, des expériences sur l’animal vivant sont nécessaires.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux à comparer : 1 lot inoculé par le virus grippal H1N2, 1 lot traité aux β-glucanes et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Chaque lot comprendra le même effectif, à savoir 6 animaux. Ce nombre est le minimum pour obtenir des données statistiquement fiables. Le groupe de porcs recevant les β-glucanes comportera 4 animaux ce qui est suffisant pour vérifier si ces composés permettent un entrainement immunitaire chez cette espèce. Les lots infectés par le virus grippal et le lot témoin comporteront 7 animaux ce qui permettra d’obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

Chaque lot sera dans une animalerie différente contenant 2 parcs, soit 3 ou 4 porcs par parc, élevés en groupe stable au cours de la durée totale du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes. Enfin, ils auront accès à des jouets. Après chaque acte vétérinaire, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Les lavages broncho-alvéolaires et les ponctions de moelle osseuse se feront sous anesthésie générale. Pour ces dernières, une anesthésie locale et l’administration d’un antidouleur seront également effectuées. Après les lavages broncho-alvéolaires, une visite supplémentaire aura lieu quelques heures après l’intervention afin de contrôler le réveil des animaux.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du virus influenza porcins H1N2. Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 9 semaines d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de 9 semaines développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec une souche H1N2, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge, par cette même voie. De plus, les études préliminaires avaient été réalisées à partir de macrophages alvéolaires de porcs infectés à cet âge. Nous souhaitons donc nous placer dans les mêmes conditions.

Sous anesthésie, les souris reçoivent une sonde thermique dans le ventre, puis une partie est vaccinée et portée pendant deux jours à 2 ou 3 °C au-dessus de sa température par un champ magnétique, avec une prise de sang chaque semaine sans anesthésie. D'autres se voient implanter sous la peau du flanc un objet métallique d'un centimètre de côté, que le champ chauffe trois heures dix jours plus tard. 880 souris adultes vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Il s'agit de mesurer l'effet d'une fièvre ou d'une inflammation locale sur la production d'anticorps, une piste qui "pourrait" selon le porteur servir un jour à renforcer la vaccination. Il justifie le choix de l'espèce par un système immunitaire "proche de l'homme" et par une espèce qui "régule la température comme l'homme".

Objectifs

La température corporelle des mammifères dont l'homme est régulée, mais peut augmenter, notamment dans tout le corps lors de la fièvre, et localement dans les zones inflammées. L’élévation de la température peut être induite par différents mécanismes, notamment la production de chaleur dans de la graisse. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate), difficile à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet d’une augmentation locale (comme dans l’inflammation locale) ou du corps entier (comme dans la fièvre) de la température sur la réponse humorale. Dans un premier temps, nous analyserons l'effet de l'élévation globale de la température corporelle sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Nous étudierons également si la production de chaleur dans la graisse spécialisée participe à l’élévation de la température lors de la fièvre, et si elle modifie la réponse humorale. Enfin, nous mettrons au point un modèle permettant de tester l’effet d’une augmentation locale de la température autour d’un ganglion lymphatique, mimant l’effet d’une inflammation locale, sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, l’identification de la production de chaleur par la graisse comme mécanisme de contrôle de la température et de la réponse humorale pourrait permettre d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour augmenter (vaccination) ou diminuer (maladies causées par une réponse immunitaire trop importante ) la réponse humorale.

Procédures

Les souris seront injectéés avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris seront vaccinées par voie sous-cutanée (durée de l'injection : 1 minute), et une élévation de température de 2 à 3°C sera induite pendant 2 jours à l'aide d'un champ magnétique. Du sang sera prélevé une fois par semaine (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes). D'autres souris seront implantées avec des objets métalliques de 1cm x 1cm sous la peau du flanc par chirurgie sous anesthésie générale (durée de la chirurgie : 10 minutes), dans une position n'affectant pas la mobilité des animaux. 10 jours plus tard, une élévation locale de température de 2 à 3°C sera induite pendant 3 heures à l'aide d'un champ magnétique, puis les souris seront mises à mort.

Impact sur les animaux

L'élévation de la température et la vaccination, peuvent dans certains cas induire une douleur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire (2 jours), correspondant à la fièvre. L'implantation d'objets métalliques peut également mener à un inconfort et une douleur modérée et transitoire, correspondant à une petite chirurgie cutanée (3 jours). Les expériences se terminent par l'euthanasie des souris.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocytes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo. Il est également impossible d'étudier in vitro la contribution à la fièvre et l’inflammation de la production de chaleur dans la graisse. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris. Pour les implants d’objets métalliques, nous avons au préalable testé la capacité du champ magnétique à élever la température d’objets en différents métaux sans les implanter à des souris, et avons sélectionné les 3 plus ‘chauffant’ pour les tests in vivo.

Réduction

Le nombre de sours (880) a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L'implantation des objets métalliques par chirurgie se fait sous anesthésie générale, avec analgésie. De plus, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris. Les critères sont la perte de poids, l’apparence, le comportement, l'activité de souris et des signes cliniques tels que les yeux anormaux, un écoulement nasal, ou un fèces anormal. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 3 jours suite à l'implantation d'objets métalliques, et 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie, soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson), et sont observés tous les jours.

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule la température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte),

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris transgéniques exprimant deux onco-protéines du papillomavirus reçoivent un allergène cutané, une exposition aux UV ou des mesures d'oreille sous brève anesthésie, pour étudier l'effet de ces protéines sur le système immunitaire. Le porteur indique que l'application de l'allergène ne génère pas de douleur apparente et que les doses d'UV sont contrôlées pour éviter des lésions cutanées. Il affirme que le développement d'une réponse immunitaire est trop complexe pour être étudié in vitro.

Objectifs

Le cancer de la peau de type non-mélanome (Non-Melanoma Skin Cancer, NMSC) est la forme de cancer la plus répandue dans le monde et particulièrement chez les populations adultes à peau claire. Le développement de nouvelles stratégies pour lutter contre l’apparition de ce type de cancer reste un enjeu sociétal mondial, le nombre de cas détectés par an étant en constante augmentation. Parmi les facteurs de risques majeurs impliqués dans le développement de ce cancer, il a déjà été démontré une coopération entre les rayons ultraviolets et l’infection par les papillomavirus humains cutanés (HPV). L’objectif de ce projet est donc d’étudier l’impact de 2 onco-protéines du virus HPV sur l'immuno-surveillance tumorale et plus globalement, sur les réponses immunitaires. Pour cela, des souris transgéniques exprimant ces onco-protéines au niveau de la peau seront comparées à des souris sauvages contrôles. Leur réponse immunitaire sera étudiée dans un modèle d’hypersensibilité de contact induite par l'application d'un allergène sur la peau, car il reproduit bien le phénomène d'inflammation locale généré suite à une exposition aux UVs. Ce modèle est bien établi et couramment utilisé dans la littérature.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir les connaissances sur les mécanismes de la coopération entre les UVs et une infection par un papillomavirus dans le développement de cancers cutanés. A terme, la mise en évidence des mécanismes immunitaires qui sont dérégulés dans ce contexte pourrait mener à l’identification de cibles thérapeutiques pour le développement de traitement prophylactiques face à ces cancers.

Procédures

_Application d’un allergène sur la peau. Cette procédure concerne 560 animaux. Parmi eux, 220 animaux subiront une application unique, 340 animaux subiront 2 applications espacées de 5 jours. La durée nécessaire pour cette intervention est de 3 minutes par souris environ. _Mesure quotidienne de l'oreille, sous brève anesthésie, pendant 3 jours consécutifs. Cette procédure concerne 220 animaux, et sa durée est d'environ 3 minutes par souris. _Exposition de la peau aux UVs. Cette procédure concerne 80 animaux, qui seront exposés à une faible dose d’UVs quotidiennement pendant 4 jours consécutifs. Sa durée est de 2 minutes par souris environ.

Impact sur les animaux

L'application épicutanée d'un allergène chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. Cette procédure peut conduire les souris à se gratter, mais il n'a jamais été observé de signe excessif de grattage dans ce modèle. Concernant les expositions aux UVs, elles sont réalisées à faible dose, et cette dernière est bien contrôlée de manière à ne pas induire de lésions cutanées chez l'animal. Il est à noter que les onco-protéines exprimées par les souris transgéniques utilisées dans ce projet peuvent conduire au développement de tumeurs cutanées uniquement en coopération avec les UVs, si ces souris sont exposées à des doses croissantes et pendant de longues périodes (plus de 20 semaines). Les expériences d'exposition aux UVs qui seront réalisées dans ce projet ayant une durée maximale de 18 jours, les animaux transgéniques n'ont pas de risques de développer des tumeurs. En résumé, les effets indésirables attendus dans ce projet sont donc le stress généré par le contact avec l’expérimentateur, et une réaction inflammatoire locale et modérée au niveau du site d’exposition aux UVs ou à l'allergène.

Devenir

A l’issue de ces procédures, les animaux seront mis à mort de manière à récolter les tissus ou organes étudiés. Cela permettra de réaliser ex vivo une analyse fine de la réponse immunitaire développée chez ces animaux, à l’échelle moléculaire et cellulaire.

Remplacement

Le papillomavirus humain est impliqué dans le développement de tumeurs épithéliales bénignes et malignes. L’influence des protéines du papillomavirus ne peut être visible que dans un épithélium complet, étant capable de se différencier (habitat naturel du papillomavirus). De plus, le développement d’une réponse immunitaire est un phénomène biologique très complexe impliquant une collaboration étroite de l’ensemble des cellules immunitaires, ainsi qu’une forte influence de l’environnement, rendant impossible son étude par des tests in vitro.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base d'expériences précédentes ainsi que sur la littérature scientifique, et a été réduit au maximum sans mettre en péril l'interprétation statistique des résultats. Ainsi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximal d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra être diminué en fonction des résultats obtenus.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre pour optimiser le bien-être des animaux. L’observation des animaux sera effectuée quotidiennement et une grande importance sera accordée à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le plus adapté pour l'étude de mécanismes immunologiques. De plus, ce modèle permet d’utiliser des animaux génétiquement modifiés n'existant que dans cette espèce. Le modèle murin utilisé correspond ainsi au seul modèle connu pour étudier les effets des papillomavirus cutanés sur le système immunitaire. Enfin, ce modèle étant couramment employé, cela permettra de discuter les résultats obtenus à la lumière des données existantes dans la littérature. Les animaux seront utilisés au stade adulte de 8 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire doit être mature et non vieillissant.

1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe tumorale sous-cutanée, puis des agents anticancéreux par injection intrapéritonéale ou péritumorale, pour tester une technologie de délivrance locale prolongée dans le mélanome. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité systémique et renvoie les applications cliniques à un brevet et à des essais futurs. Il conclut que la preuve de concept ne peut s'établir que sur des modèles précliniques proches de la tumeur humaine et qualifie cette étape d'"incontournable".

Objectifs

L’apparition de nouvelles molécules anticancéreuses durant ces 10 dernières années a conduit à une révolution dans le traitement de certains cancers, en particulier le mélanome. Cependant seule une fraction des patients (30% à 50%) montrent une réponse efficace et durable au traitement et nombre d’entre eux sont obligés de stopper le traitement à cause d’effets secondaires sévères, surtout lorsque plusieurs molécules sont combinées et administrées au patient. Il y a donc une urgence pour comprendre les mécanismes de résistances aux thérapies actuelles et mettre en évidence de nouveaux protocoles thérapeutiques avec une toxicité plus faible et une tolérance maximale. Ce projet vise en particulier à démontrer une meilleure tolérance et une meilleure efficacité de traitements combinés montrant des effets secondaires sévères aux doses efficaces. Nous utiliserons une nouvelle technologie, nommée BEPO, pour administrer des molécules en solution ou en suspension localement sur le site tumoral permettant une diffusion lente des médicaments. Nous éviterons de ce fait les effets indésirables observés lorsque ces molécules sont injectées par voie classique intraveineuse. Cette technologie a fait ses preuves dans des modèles de maladies inflammatoires (polyarthrite rhumatoïdes) et l’objectif principal de ce projet et d’établir une preuve de concept de l’efficacité de ce procédé dans le modèle de tumeur solide de mélanome cutané pourlequel nous avons une grande expertise. Ce nouveau mode d’administration ouvrira de nombreuses possibilités en thérapie anti-cancéreuse et constituera une véritable avancée dans l’administration des agents anti-cancéreux. D’autre part la diffusion lente et continue des drogues au voisinage de la tumeur augmentera l’efficacité thérapeutique, nous permettant de tendre vers des rémissions totales plus fréquentes. L’idée, à travers les modèles d’études précliniques décrits dans ce projet, est de rapidement mettre en œuvre de tels protocoles chez les patients.

Bénéfices attendus

Le but de notre projet est double: i) améliorer l’efficacité des médicaments antitumoraux en administrant plusieurs molécules en même temps, en une dose unique et avec une diffusion de longue durée sur le site de la tumeur ii) éliminer les effets secondaires souvent sévères de ces médicaments lorsqu’ils sont administrés de manières répétées par voie intraveineuse. En effet la délivrance locale évitera d’endommager les tissus sains, ce qui se passe en général lorsque les agents anticancéreux sont inoculés par voie intraveineuse et ce qui explique la majeure partie de leur toxicité et parfois pousse à l’arrêt du traitement. Le partenariat que l’on développe dans le cadre de ce projet nous permettra de rapidement breveter ce concept et d’envisager des applications cliniques dans la mesure où nous aurons validé les effets sur les deux modèles précliniques proposés dans ce projet. Nous sommes également en collaboration avec des cliniciens désireux de démarrer des essais cliniques utilisant ces thérapies inovantes capables d'améliorer grandement le confort des patients au cours du traitement et surtout d'augmenter leur chance de guerison sans récidive.

Procédures

L’ensemble des animaux de cette étude (1600 souris) seront greffés une fois en sous cutané (15 secondes/souris, contention comprise). Pour la procédure n°1, en plus de la greffe sous-cutanée, la moitié des animaux (260 souris) recevra les différents agents thérapeutiques en injection intrapéritonéale (10 secondes/souris, contention comprise), l’autre moitié (260 souris) recevra ces mêmes agents thérapeutiques sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Pour les procédures suivantes n°2 et 3 les lots validés dans la procédure n°1 recevront la ou les molécules sous formulation BEPO en injection péritumorale (10 secondes/souris, contention comprise). Aucun prélèvement n'est prévu sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’y aura aucun effet indésirable de toxicité systémique de ces drogues comme on pourrait s’y attendre en injection conventionnelle. Des preuves de concepts de ce mode d'administration ont été établies sur des pathologies inflammatoires (polyarthrite) et montrent notamment que ce procédé n’engendre aucun rejet ni effet secondaire avec une tolérance maximale chez la souris. Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs et le suivi quotidien des animaux nous permettra de procéder à l’euthanasie de tout animal atteignant un des points limites décrit ci-après.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral, soit pour prélever la tumeur afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments.

Remplacement

La preuve de concept de ce nouveau mode de délivrance d’agents anticancéreux revêt une importance capitale dans le cadre du développement de nouveaux modes d’administrations de combinaisons thérapeutiques en clinique. Cette preuve de concept ne peut s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Seuls les deux modèles proposés très proches des deux grands groupes de patients atteints de mélanome cutané, nous permettront non seulement de mesurer l’efficacité de nos traitements sur la croissance tumorale mais aussi de valider ce nouveau mode d’administration très innovant et d’étudier les mécanismes de la mise en place d’une réponse immunitaire anti-tumorale pour un contrôle durable de la pathologie. L'obtention de tels résultats est une étape incontournable si on veut démarrer par la suite des essais cliniques chez l'homme avec ce nouveau procédé. A ce stade du projet il n’est donc plus possible de substituer l’animal à un modèle in vitro qui ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos combinaisons thérapeutiques et surtout pour valider ce nouveau mode d’administration.

Réduction

Le nombre d’animaux sera au maximum de 1600 souris sur 4 ans, nous permettant d’évaluer de manière exhaustive les effets physiologiques (effets anti-tumoraux, croissance tumorale et survie) mais aussi mécanistiques (implication du système immunitaire et composantes cellulaires et moléculaires associées) de nos combinaisons thérapeutiques. Les molécules et combinaisons utilisées le seront de manière séquentielle ce qui implique que lorsque nous aurons des effets significatifs sur un protocole nous nous focaliserons sur celui-ci et ne testerons pas les autres molécules. D’autre part le projet est dessiné dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux dans le cheminement expérimental proposé, dans la mesure où la validation d’une étape donnera le feu vert à l’étape suivante uniquement si les résultats attendus sont statistiquement significatifs. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été évalué de manière à obtenir une significativité statistique de nos résultats afin de valider ou d’invalider notre procédure. L’expertise et le recul que nous avons au laboratoire sur le modèle de mélanome mais également sur d’autres modèles de tumeurs solides nous permettra de limiter le nombre d’animaux à son strict minimum . Grace à notre maîtrise et à notre connaissance des gestes de greffe ou d’administration en sous-cutané, nous éviterons ainsi les artefacts et les pertes liées à l’expérimentateur.

Raffinement

Les animaux seront hébergés (5 par cage d'une superficie de 500cm2) à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Le milieu est enrichi par une litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et une ouate coton pour le confort des animaux. Le comportement sera observé quotidiennement pour détecter tout signe de stress. La prostration, les difficultés respiratoires, l'agressivité et l'isolement sont tous des critères d’arrêt conduisant à l'euthanasie des animaux avant la fin du protocole. Si nécessaire un animal agressif pourra être isolé des autres mais pour une durée maximale de 5 jours. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux afin de réduire le risque d’agressivité et d’isolement. Un suivi de l’apparition d’autres signes cliniques sera effectué au cours de l’expérience. Ils seront reportés sur une fiche de suivi clinique. Dans les conditions expérimentales définies, les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. Les différentes molécules seront utilisées en administration locale en une seule administration dans un composé permettant leur diffusion dans le temps, permettant d’éviter tout effet secondaire et d’éviter des administrations répétées. Même si l'ensemble de nos procédures sur lesquelles nous avons du recul ne devrait pas le nécessiter, l'utilisation d'analgésiques ou d'anti-inflammatoires pourra être utilisée. Au cours de nos expériences antérieures, nous n’avons jamais observé de signe de prostration, de diarrhée ou de déshydratation induite par les greffes de cellules de mélanome. Notre pratique vise à réduire le plus possible les contacts avec les animaux pour limiter les contentions et le stress qui y est associé. Les signes listés ci-dessous feront l’objet d’une attention particulière lors de nos visites journalières: - le volume tumoral et l’ulcération de la tumeur (observation de la tumeur et mesure) - l’absence d'hydratation ou de prise de nourriture (observation de l’état général) - la gêne de la locomotion (observation du déplacement dans la cage) - l’isolement par rapport aux autres animaux, le dos vouté, les yeux enfoncés, la respiration saccadée, des diarrhées (observation du comportement de l’animal).

Choix des espèces

L'espèce murine C57Bl/6 utilisée dans notre étude est la plus relevante pour atteindre les objectifs fixés et tester les effets de nos thérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale afin de mettre en évidence les effets de nos molécules sur le long-terme. Ces souris C57Bl/6 dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique . Nous avons déjà obtenus l'ensemble des données préliminaires à l'origine de ce projet sur ce modèle et devont continuer avec le même modèle pour une cohérence des résultats. L'âge des animaux utilisés dans cette étude est de 7 à 8 semaines, âge où l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité, et âge ou le système immunitaire est complètement fonctionnel.

150 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque macaque, maintenu vigile sur une chaise à contention, reçoit une administration de bactéries dans les voies respiratoires, puis subit jusqu'à cinq lavages bronchiques et dix prises de sang sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever ses organes. Le porteur reconnaît que la contention représente la principale contrainte pour l'animal. Il justifie le recours au macaque par la proximité de son système respiratoire avec celui de l'humain, un passage préalable par des rongeurs étant prévu.

Objectifs

Les maladies inflammatoires respiratoires représentent un ensemble de syndrome dont le développement est croissant avec l'augmentation de la pollution athosméphique et d'autres facteurs d'environnement. Ces maladies invalidantes sont souvent bien contrôles chez les malades, mais les traitements peuvent être lourds ou présentent des effets indésirables. Actuellement, les traitements des maladies inflammatoires du système respiratoire font appel à des thérapeutiques anti-inflammatoires chimiothérapeutiques ou à des immunothérapies classiquees administrées par voie générale. Ce projet a pour but d'étudier l'innocuité, la biodistribution et la biodisponibilité de produits de type Live Biotherapeutics Product administré par voie pulmonaire. Ces produits sont en cours de développement, leur effet aura été prouvé au préalable in vitro et doit être testé in vivo chez le singe macaque cynomolgus.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de mieux caractériser produits immunostimulants innovants, et de mieux les connaître avant de les utiliser pour le traitement des maladies inflammatoires pulmonaires. Les informations obtenues chez les singes, dont la physiologie et l'immunologie des voies respiratoires sont très proches de l'homme.

Procédures

L'administration des produits se fait avec un animal vigile, maintenu sur une chaise à contention. Les prélèvements prévus sont des lavages broncho-alvéolaires, et des prélèvements de sang, d'urine ou de fécès. La fréquence et le durée des prélèvements sont fonction des caractéristiques estimées du produit, avec un maximum de 4 semaines. Au total, on peut envisager 5 lavages bronchiques et 10 prises de sang au maximum.

Impact sur les animaux

L'adminstration du produit représentante un stress pour les animaux, mais elle n'est pas douloureuse. La principale contrainte est que l'animal est immobilisé dans une chaise à contention. Les prélèvements réprésentante une contrainte, mais ils sont réalisés sous anesthésie générale. Il est prévu de pouvoir réaliser dees prélèvements sanguins ou des lavages bronchiques principalement.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés sous anesthésie à la fin des protocoles pour pouvoir prélever les organes.

Remplacement

L'administration de LBP dans les voies pulmonaires pour lutter contre des maladies inflammatoires chroniques nécessite des développements précliniques spécifiques, permettant de mesurer la quantité de bactéries nébulisées dans les voies respiratoires, il est nécessaire de disposer d’un modèle animal pertinent. En effet, la nécessite de pouvoir observer des interactions complexes et fines entre organes n’est aujourd’hui possible que sur modèle animal, dans ce cadre d’étude. Même si des modèles in vitro de poumons existent, ils ne permettent pas de prédire la distribution et la viabilité d'un produit biologique aussi spécifique qu'un LBP, ni la réponse de l'organisme a l'influx soudain d'une large quantité de bactéries, même non pathogènes. Une approche sur des modèles de rongeurs est préalable aux essais sur Singes.

Réduction

Le nombre d'animaux est limité au minimum nécessaire. Pour tester un LBP, un groupe de 3 à 5 animaux au maximum est suffisant. Nos études sont exploratoires, très en amont dans le développement des produits. L'évaluation de l'effet se fait sur la base de l'analyse hostologique microscopique et de l'évaluation des populations cellulaires détectées après administration du produit. Avec un groupe de 3 à 5 animaux, seules des statistiques descriptives sont possibles, sachant que nous n'utilisons pas d'animaux témoins non traités. Nous comparons les résultats obtenus avec nos données de base, en comparant les données et parfois les moyennes pour évaluer une tendance. Le nombre d'animaux présenté dans ce projet est une estimation qui tient compte du nombre de produits qui pourraient être confiés à notre société pour en évaluer la biodistribution et l'innocuité. Si la demande est faible, il est évident que seuls les animaux nécessaires (3 à 5 par produit) seront utilisés.

Raffinement

Chacun des actes techniques mis en oeuvre pour ce projet ont été mis au point, étudiés et raffinés pour limiter le stress ou la douleur des animaux. La plupart des prélèvements sont réalisés sous anesthésie générale. L'administration se fait avec un système de contention auquel les animaux sont habitués au préalable pendant plusieurs jours, sans administration. Les techniques analytiques auxquelles nous faisont appel sont suffisamment sensibles pour réduire la quantité de prélèvement nécessaire. Ainsi, les volumes des prises de sang ou des lavages alvéolaires sont très faibles.

Choix des espèces

La macaque cynomolgus possède une proximité physiologique et immunitaire avec l’homme ainsi qu’une anatomie des grandes fonctions extrêmement proche de l’homme. En effet, l’anatomie de son système respiratoire (en partie liée à sa posture verticale (semi-bipède- par opposition aux modèles rongeurs ou porcins) est très proche de celle de l’homme, ou encore un système digestif ou urinaire sensiblement similaire également. Ces similitudes permettent de tester la distribution et la viabilité d’un produit biologiques pour une transposition future chez l’Homme (thérapie par nébulisation, administration par voie orale). Selon le type de LBP choisi et sa cible thérapeutique, des animaux jeunes (2 ans) ou plus âgés (à partir de 3 ans) pourront être utilisés pour des raisons de maturité du système immunitaire et de poids. Cependant, le stade de développement pourra être affiné avec le donneur d’ordre selon le type d’individus visé par la thérapie.