Système immunitaire
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Oncologie
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- Système gastrointestinal
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- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de l’impact des dermatites sur la réactivité gliale et les conséquences sur la démangeaison et les troubles de l’humeur
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
Tuées à la fin de chaque procédure pour des prélèvements de tissus, 3 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sur la peau des applications répétées de substances qui provoquent une inflammation ou abîment la barrière cutanée, jusqu'à dix applications en cinq jours pour la peau sèche, et jusqu'à neuf applications sur trois semaines pour un autre protocole d'induction. Le porteur indique que ces souris peuvent présenter des lésions cutanées, des rougeurs, un épaississement de la peau et des grattages répétés, avec un inconfort transitoire ou persistant, et qu'elles passent jusqu'à six séances de tests de grattage, de stimulation cutanée légère et d'exploration, de dix à quarante-cinq minutes. Sur le remplacement, il affirme que les cultures et les tissus isolés ne reproduisent pas ensemble l'inflammation, l'activation des nerfs et le grattage, et qu'il est donc "nécessaire d'utiliser des modèles animaux permettant d'étudier la démangeaison dans un organisme entier".
Objectifs
La démangeaison est une sensation très fréquente dans les maladies de peau. Elle pousse à se gratter et peut devenir difficile à supporter lorsqu’elle dure longtemps. Dans ce cas, elle peut gêner le sommeil, augmenter le stress et modifier le comportement. Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi la peau démange et pourquoi cette sensation peut devenir chronique. Nous allons étudier le rôle des nerfs qui transmettent le signal de démangeaison depuis la peau, ainsi que celui de cellules de soutien présentes dans le système nerveux. Ces cellules peuvent influencer la façon dont le signal de démangeaison est traité. L’objectif est de comprendre comment ces différents acteurs participent à l’apparition, au maintien et aux conséquences de la démangeaison.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes neurobiologiques du prurit et sur la manière dont les signaux provenant de la peau sont traités par le système nerveux. Il apportera également des informations nouvelles sur l’impact du prurit chronique sur le comportement et l’état émotionnel. À moyen et long terme, ces connaissances pourront contribuer à orienter la recherche dans le domaine du prurit chronique et des maladies cutanées associées, sans constituer une évaluation directe de traitements chez l’animal.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1. Injections Les animaux recevront des injections répétées selon les procédures La durée de chaque injection est d’environ 5 à 10 secondes. Selon la nature de l’injection, les gestes sont réalisés sur animal vigile ou sous anesthésie gazeuse brève. Le nombre maximal d’injections pour un même animal est de 6 injections au total, réparties sur une période pouvant aller jusqu’à environ 4 semaines, dans le cas d’une injection initiale suivie, après un délai nécessaire à son action, d’injections répétées d’un produit permettant de moduler l’activité de cellules ciblées. Dans les autres procédures, le nombre d’injections est inférieur ou égal à 4, réparties sur 3 jours à 2 semaines selon le protocole. 2. Applications cutanées répétées Dans les modèles de dermatite chronique, les animaux sont soumis à des applications cutanées répétées de substances induisant une inflammation ou une altération de la barrière cutanée. Chaque application a une durée d’environ 10 à 30 secondes et est réalisée sous anesthésie gazeuse brève afin de limiter le stress lié à la contention. Le nombre maximal d’applications cutanées est de 10 applications sur 5 jours pour le modèle de peau sèche, réalisé deux fois par jour. Pour les modèles de dermatite induits par des agents inflammatoires ou allergènes, le schéma le plus long correspond au modèle HDM, avec 9 applications réparties sur 3 cycles, soit environ 3 semaines. 3. Manipulations comportementales et observations Les animaux sont soumis à des tests comportementaux non invasifs, incluant l’observation du comportement de grattage, des stimulations cutanées légères et des tests d’exploration. Ces tests sont réalisés sur animaux vigiles et ont une durée comprise entre 10 et 45 minutes par session, selon le test. Le nombre maximal de sessions comportementales pour un même animal est de 6 sessions. Ces sessions sont réparties sur la durée de la procédure, jusqu’à environ 3 semaines pour les modèles les plus longs, avec habituation préalable lorsque nécessaire.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues dans le cadre de ce projet sont principalement liées à l’induction des modèles de prurit, aux administrations de produits par différentes voies d’administration, aux manipulations expérimentales associées et aux évaluations comportementales répétées. Dans les modèles de prurit chronique associés à une inflammation cutanée, les animaux peuvent présenter des lésions cutanées locales, des rougeurs, un épaississement de la peau et des comportements de grattage répétés, associés à un inconfort transitoire ou persistant dont l’intensité dépend du modèle utilisé et de la durée d’exposition. Les modèles de prurit aigu peuvent entraîner une réponse transitoire de grattage et un inconfort de courte durée, sans inflammation chronique. Les administrations de produits peuvent entraîner un inconfort transitoire lié à la contention, au geste d’administration ou à l’effet attendu du produit administré. Des réactions locales au point d’administration peuvent également survenir, incluant une rougeur, un gonflement, une irritation, une inflammation locale ou, plus rarement, une infection ou une ulcération. Certaines interventions expérimentales visant à moduler l’activité neuronale et/ou gliale peuvent entraîner une modification transitoire de l’activité des cellules ciblées, pouvant s’accompagner d’un inconfort ou d’une douleur de courte durée selon la population cellulaire concernée et la modalité utilisée. Les évaluations comportementales peuvent générer un stress modéré lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel environnement ou à la répétition des tests. Elles sont réalisées sur des durées limitées, avec des méthodes non invasives et non nociceptives.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasié à la fin de chaque procédure afin de réaliser des prélèvements tissulaires post-mortem.
Remplacement
Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines démangeaisons apparaissent, pourquoi elles peuvent devenir chroniques, et comment elles peuvent modifier le comportement des animaux, par exemple en augmentant le stress ou en altérant l’humeur. La démangeaison ne dépend pas seulement de la peau : elle implique aussi les nerfs qui transmettent le signal depuis la peau, la moelle épinière, des cellules de soutien du système nerveux et des cellules immunitaires. Ces différents éléments interagissent entre eux, ce qui rend le phénomène difficile à reproduire avec des méthodes uniquement réalisées en boîte de culture ou sur des tissus isolés. Ces approches alternatives peuvent apporter des informations utiles, mais elles ne permettent pas de reproduire en même temps une inflammation de la peau, l’activation des nerfs responsables de la démangeaison, l’intervention des cellules de soutien du système nerveux, et l’apparition de comportements comme le grattage ou les changements liés à l’état émotionnel. Pour répondre aux objectifs du projet, il est donc nécessaire d’utiliser des modèles animaux permettant d’étudier la démangeaison dans un organisme entier, depuis la peau jusqu’aux comportements observables.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été défini de manière à obtenir des résultats scientifiquement interprétables tout en limitant le recours aux animaux au strict nécessaire. Une veille bibliographique sera réalisée tout au long du projet afin d’éviter la duplication d’expériences déjà publiées et d’adapter les choix expérimentaux aux connaissances disponibles. La stratégie de réduction repose d’abord sur l’utilisation d’un modèle de référence. Ce modèle permettra de valider les approches expérimentales nécessitant des groupes contrôles complets et de vérifier que les effets observés sont interprétables. Une fois ces validations réalisées, les autres modèles seront étudiés avec des plans expérimentaux allégés, limités aux comparaisons nécessaires, afin d’éviter la répétition de groupes contrôles redondants. Lorsque cela est scientifiquement justifié, les groupes contrôles seront mutualisés au sein d’une même procédure, en particulier lorsque les conditions expérimentales sont comparables. Cette organisation permet de réduire le nombre total de groupes tout en conservant des comparaisons valides. Pour les lignées génétiques, les croisements seront planifiés afin de maximiser l’utilisation des animaux produits. Les animaux présentant un génotype compatible avec les groupes expérimentaux ou contrôles prévus seront utilisés autant que possible, ce qui limite la production d’animaux excédentaires et le nombre de reproducteurs nécessaires. Lorsque plusieurs approches indépendantes répondent à une même question scientifique, elles seront d’abord limitées au modèle de référence. Leur extension à d’autres modèles ne sera réalisée que si les premiers résultats le justifient. Les effectifs reposent sur un minimum de 12 animaux par condition expérimentale, répartis en 3 répétitions indépendantes de 4 animaux par groupe. Les données seront analysées en regroupant ces répétitions, tout en vérifiant la cohérence des effets observés. Ce dimensionnement tient compte de l’expérience de l’équipe, de la variabilité attendue et de la nécessité de détecter des différences biologiquement pertinentes. Enfin, chaque animal sera inclus dans une seule procédure expérimentale et suivra une trajectoire complète au sein d’un modèle donné, afin d’éviter toute exposition cumulative inutile.
Raffinement
Lors de leur arrivée dans la zootechnie d’expérimentation, quelle que soit leur origine, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation d’au moins cinq jours dans une pièce dédiée, sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables, séparés par sexe, à un maximum de cinq par cage de 500 cm², dans un environnement contrôlé. Les groupes seront maintenus aussi stables que possible afin de limiter le stress lié aux remaniements. Une attention particulière sera portée aux interactions sociales, notamment chez les mâles, afin de détecter précocement toute agressivité ou blessure. Un enrichissement systématique sera mis en place, comprenant une maison et du matériel de nidification. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par jour par le personnel de zootechnie ou par le personnel impliqué dans le projet. Le poids sera suivi régulièrement au cours des manipulations, notamment lors des phases de traitement ou d’induction des modèles. Les grilles de suivi clinique et les points limites spécifiques sont définis dans chaque procédure afin d’encadrer la surveillance, les mesures de soutien éventuelles et le retrait anticipé des animaux si nécessaire. Les manipulations expérimentales sont réalisées de manière à limiter le stress, la durée de contention et l’inconfort. Les gestes susceptibles d’induire une gêne transitoire ou nécessitant une contention prolongée sont réalisés sous anesthésie gazeuse brève lorsque cela est compatible avec les objectifs expérimentaux. Les volumes administrés sont limités au strict nécessaire et adaptés à la voie utilisée. Le matériel est choisi de manière appropriée afin de réduire au maximum les lésions tissulaires. Les expérimentateurs impliqués dans le projet sont formés à l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et aux gestes techniques mis en œuvre. L’apprentissage et la maîtrise des gestes techniques sont encadrés et consignés dans les livrets de compétences des personnes concernées. Enfin, une analyse rétrospective sera réalisée à l’issue des expériences afin d’identifier d’éventuelles possibilités d’amélioration des procédures et de réduction supplémentaire de la souffrance animale pour les études ultérieures.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie pour ce projet en raison de sa pertinence pour l’étude des mécanismes du prurit aigu et chronique et de ses conséquences comportementales. Des modèles murins validés permettent de reproduire différents contextes de prurit cutané, inflammatoire ou non inflammatoire, et d’étudier de manière intégrée les interactions entre la peau, les neurones sensoriels, les cellules gliales et la moelle épinière. La souris offre également l’accès à de nombreuses lignées transgéniques et conditionnelles permettant le ciblage spécifique de populations neuronales et gliales impliquées dans le prurit, ce qui est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Enfin, des protocoles comportementaux standardisés et largement utilisés permettent d’évaluer de façon fiable le prurit et ses conséquences comportementales. Les animaux utilisés dans ce projet sont exclusivement des souris adultes (Mus musculus). Les procédures expérimentales sont réalisées à des stades de développement compatibles avec la maturité des systèmes nerveux, immunitaire et comportemental. De manière générale, les souris sont utilisées à partir de 6 semaines d’âge. Certaines manipulations préalables (approches génétiques, virales ou inductibles) peuvent être réalisées chez des animaux âgés de 4 à 6 semaines, suivies d’un délai suffisant avant l’induction des modèles expérimentaux et les évaluations comportementales, afin de garantir une expression ou une recombinaison stable. Les modèles de prurit aigu et chronique ainsi que l’ensemble des évaluations comportementales sont réalisés chez des souris adultes, typiquement âgées de 6 à 12 semaines au moment des tests. Aucune procédure n’est réalisée chez des animaux en phase juvénile précoce ou néonatale.
Etude chez la souris de la réponse immunitaire au cours de l’infection par la microsporidie Encephalitozoon cuniculi
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des spores de microsporidie sont injectées dans la peau de l'oreille de souris transgéniques dont les cellules immunitaires sont fluorescentes, après élimination ou non de certains globules blancs par un anticorps injecté deux fois avant l'infection. 290 souris sont utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 20 d'entre elles subissant en plus quatre jours d'imagerie quotidienne sous anesthésie. Le porteur écrit : "Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l'animal", et écrit ailleurs "Bien que tout stress ne puisse être totalement évité". Les 290 souris sont tuées, les unes à la fin de l'imagerie, les autres à cinq temps échelonnés de deux heures à sept jours après l'infection, pour prélever leurs tissus.
Objectifs
L’immunobiologie des microsporidioses est un domaine encore peu exploré. Les cellules dendritiques et les macrophages sont des cellules de l’immunité qui jouent un rôle important dans la réaction de défense contre l’infection par les microsporidies chez l’hôte infecté. En piratant ces cellules, la microsporidie contourne la réponse immunitaire de l’hôte. Cependant, peu de données existent encore sur la mise en place de ces stratégies de piratage immunitaire in vivo. Notre projet vise tout d’abord à explorer, chez la souris, la mise en place de la réponse immunitaire anti-microsporidie, en étudiant en temps réel les interactions entre le parasite et les cellules de l’immunité innée (macrophages, cellules dendritiques). En particulier, le modèle du pavillon de l’oreille de la souris est un des plus utilisés pour analyser, par imagerie en temps réel, chez l’animal anesthésié, la dynamique de la réponse immunitaire innée. L’objectif est ici d’appliquer ce modèle à l’étude de l’immunobiologie des microsporidioses. En parallèle, les interactions entre les microsporidies et les macrophages ou les cellules dendritiques murines seront étudiées in vitro. En améliorant nos connaissances sur la réponse immunitaire dirigée contre la microsporidie E. cuniculi, de nouveaux traitements ciblant le système immunitaire pourront être mis au point pour mieux contrôler ces infections chez l’homme.
Bénéfices attendus
De façon globale, ce projet nous apportera des connaissances nouvelles pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire dirigée contre l’espèce microsporidienne E. cuniculi, un domaine encore peu exploré à ce jour. L’objectif in fine sera de développer des stratégies de traitement permettant de mieux contrôler ces infections dans le futur.
Procédures
1. Imagerie de la réponse immunitaire dirigée contre Encephalitozoon cuniculi -Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez des souris transgéniques possédant des cellules immunitaires fluorescentes. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. -Anesthésie générale des animaux traités ou non (avec ou sans polynucléaires neutrophiles) et infectés -Imagerie du tissu de l’oreille sur animal vivant anesthésié, par microscopie (imagerie en temps réel), chaque jour pendant 4 jours. Les animaux anesthésiés sont mis à mort à la fin de l’expérience (jour 4). Nombre total d’animaux concernés : 20 souris (10 souris traitées, 10 souris contrôle) 2. Expériences avec biopsies tissulaires chez les animaux C57BL6 infectés par E. cuniculi. - Elimination ou non des polynucléaires neutrophiles chez les souris C57BL6. Les groupes de souris « traitées » (sans polynucléaires neutrophiles), ou de souris « contrôle » (avec polynucléaires neutrophiles), reçoivent respectivement une injection d’un anticorps anti-polynucléaire neutrophile ou d’un anticorps contrôle, aux jours 3 et 5 précédant l’infection parasitaire. - Inoculation des parasites fluorescents (spores) dans le tissu cutané de l’oreille, sous anesthésie générale, avec application d'une pommade anesthésiante localement avant l'injection. - Mise à mort des souris aux différents temps d’infection (2h, 24h, 48h, 72h et 7 jours). Les tissus d’intérêt sont prélevés très rapidement après vérification de la mort de l’animal. Nombre total d’animaux concernés : 135 animaux pour les études immunologiques et 135 animaux pour les mesures de charge parasitaire.
Impact sur les animaux
Toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié, ce qui évite tout stress, inconfort ou douleur chez l’animal. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection intradermique des spores pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’injection des spores dans l’oreille, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. Les expériences sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutanée est généralement minime. Point limite : Pendant toute la durée de l’expérience, toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière mènera à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec mise à mort des animaux.
Devenir
Procédure 1 : mise à mort à la fin de l’expérience de microscopie confocale. Le suivi des souris infectées s’effectue sur une durée de 4 jours. Au-delà, les animaux sont sacrifiés afin d’éviter les complications liées à la dissémination tissulaire des parasites. De plus, les animaux étant infectés, ils ne sont pas réutilisables pour d’autres expérimentations. Procédure 2 : mise à mort pour prélèvement de tissus
Remplacement
Notre projet inclut des expérimentations réalisées avec des cellules immunitaires en culture, mais elle reste largement insuffisante pour étudier en détail les interactions entre parasites et cellules immunitaires. En effet, elle n’englobe que très partiellement la complexité de la réponse immunitaire à l'échelle tissulaire chez un animal. Le recours à l’approche d’imagerie en temps réel chez l’animal vivant anesthésié permet d’étudier la mise en place de cette réponse immunitaire au sein du tissu cutané.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum dans la mesure où cela ne compromet pas les objectifs du projet. Pour les expériences de microscopie en temps réel chez l’animal vivant, le nombre d'animaux requis sera faible (20 au total sur une année : 10 animaux avec ou sans polynucléaires neutrophiles) car cette approche permet d'étudier la réponse immunitaire chez un même animal en fonction du temps, après anesthésie. Pour les expériences étudiant la réponse immunitaire, ainsi que pour les mesures de charge parasitaire dans les tissus, le nombre total d'animaux utilisés est réduit au minimum et fixé à 135 (3 animaux par point de cinétique, 5 points de cinétique, 3 conditions expérimentales, 3 expériences). Ce chiffre a été défini selon la puissance statistique et la variabilité des paramètres étudiés. Total des animaux utilisés sur 3 ans : 20+135+135= 290 animaux
Raffinement
Les animaux sont élevés dans un environnement contrôlé et enrichi. Ils sont hébergés par groupes de 5 individus au maximum pour permettre le maintien d’un bien-être social. Ils sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié, des points limites précis sont établis et les expériences sont arrêtées en conséquence. Bien que tout stress ne puisse être totalement évité, les procédures et mesures de raffinement mises en œuvre visent à en limiter l’intensité et la durée. En particulier, toutes les interventions sont réalisées sur animal anesthésié. Une pommade anesthésiante est appliquée localement sur le tissu de l’oreille 15 minutes avant l'injection des parasites dans la peau pour éviter tout inconfort lié à l’injection. Les animaux sont pesés chaque jour après l’infection, et ce pendant toute la durée de l’expérience. Après l’injection des parasites dans l’oreille, il n’y a aucune lésion observable au point d’injection (aspect intact du tissu cutané). Les souris sont gardées en observation pendant 2 heures et regroupées à plusieurs par cage. S’il y a bagarre, elles sont immédiatement séparées. A chaque temps de l’expérimentation de microscopie, une couverture chauffante thermorégulée est placée sur l’animal anesthésié pour éviter l’hypothermie. Après l’expérimentation et pendant la phase de réveil, l'animal est maintenu sur le tapis chauffant et gardé en observation pendant 2 heures, puis remis dans sa cage initiale si tout va bien (pas de poil hérissé, respiration régulière, recouvrement d'une motricité normale, alimentation normale). Les expériences de microscopie sont de courte durée (4 jours maximum) et la réponse inflammatoire observée localement au point d’injection cutané est généralement minime. Point limite : Toute souffrance apparente de l’animal repérable en surveillance journalière : poil hérissé, baisse de la motricité mènera cependant à l’arrêt immédiat de l’expérimentation avec la mise à mort des animaux.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines, y compris dans le domaine de la parasitologie et de l’immunologie. Le recours à une lignée de souris transgénique qui possède des cellules immunitaires fluorescentes nous permet de visualiser en temps réel chez l’animal anesthésié la mise en place de la réponse immunitaire innée lors d’une infection microsporidienne. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 à 12 semaines (âge adulte), ce qui correspond à l'âge d'une souris possédant un système immunitaire mature.
Évaluation de traitements anti-Leptospira dans un modèle murin de leptospirose.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Cochons d'Inde : 36
Pour évaluer des sérums neutralisants et des associations d'antibiotiques contre la leptospirose, 3 188 souris et 36 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les souris sont infectées par injection dans l'abdomen, reçoivent jusqu'à cinq injections supplémentaires et passent quatre séances d'imagerie de vingt à vingt-cinq minutes à J3, J7, J14 et J28, les cobayes étant utilisés pour produire des sérums enrichis en immunoglobulines. À dose élevée, le porteur décrit une perte de 10 à 12 % du poids, un poil hérissé, une perte de tonus, un ictère possible et une légère prostration. Chaque souris infectée à cette dose est tuée trois jours après l'infection, avant toute dégradation clinique, et aucun des 3 224 animaux non-humains n'est réutilisé, replacé ni adopté.
Objectifs
Cette étude porte sur la leptospirose, une infection bactérienne véhiculée par des animaux et transmise accidentellement à l’homme par contact avec des milieux contaminés (eaux, sols). Bien que méconnue, cette maladie représente un enjeu de santé publique croissant, parce-que liée à des facteurs comme les changements climatiques ou l’expansion des réservoirs animaux naturels. Les formes graves, bien que rares, peuvent entraîner des complications sévères, voire mortelles (10 % des cas). À ce jour, les options thérapeutiques disponibles restent limitées : • Aucun traitement préventif (comme un vaccin) n’offre une protection large et durable contre les nombreuses variantes de la bactérie responsable. • Le traitement actuel, basé sur des antibiotiques, n’est efficace que s’il est administré très tôt après l’infection. De plus, chez certains patients, il peut provoquer une réaction inflammatoire excessive et dangereuse, aggravant brutalement leur état. Par ailleurs, une fois la bactérie installée dans certains organes, elle devient résistante aux traitements classiques. Face à cette situation, il est urgent d’explorer de nouvelles stratégies thérapeutiques, applicables dès les premiers signes de la maladie, pour améliorer la prise en charge des patients et réduire les risques de complications. Ce projet vise à évaluer deux stratégies thérapeutiques innovantes, appliquées précocement après l’infection, afin de : 1. Renforcer les défenses immunitaires par l’administration de préparations biologiques (sérums) capables de neutraliser les différentes souches de bactéries. Ces préparations sont obtenues grâce à un composé expérimental qui potentialise la production d’anticorps naturels. 2. Optimiser l’utilisation des traitements existants en : o Adaptant les protocoles d’administration pour en maximiser l’efficacité tout en réduisant les risques de réaction inflammatoire indésirable. o Testant des combinations thérapeutiques (associant le traitement de référence à des anti-inflammatoires ou à d’autres molécules aux propriétés antimicrobiennes), afin de limiter les effets secondaires et d’améliorer la réponse globale. Parallèlement, le projet cherchera à : • Comprendre les mécanismes à l’origine de la réaction inflammatoire excessive observée chez certains sujets après traitement. • Identifier les cellules immunitaires impliquées dans cette réponse, afin de mieux cibler les futures stratégies.
Bénéfices attendus
La leptospirose, infection bactérienne causée par des Leptospira, pose un défi thérapeutique majeur : les antibiotiques, bien que nécessaires, peuvent aggraver les symptômes et sont inefficaces une fois les bactéries installées dans les reins. Le traitement doit donc intervenir précocement, durant la phase de dissémination sanguine, pour être efficace. Ce projet de recherche explore deux stratégies thérapeutiques innovantes, appliquées en phase aiguë : 1. L’administration d’anticorps optimisés. L’objectif est de développer des préparations d’anticorps capables de cibler et neutraliser les leptospires, quelle que soit la souche infectante. Cela implique d’étudier les mécanismes d’action du composé pharmacologique utilisés pour améliorer la reconnaissance des bactéries et d’évaluer l’efficacité curative sur des modèles expérimentaux. Les bénéfices attendus sont une éradication rapide des leptospires après traitement et une prévention de la colonisation rénale chronique. 2. L’administration d’antibiotiques, seuls ou combinés. Actuellement, les antibiotiques restent le traitement de référence, mais leur efficacité est limitée à la phase précoce, et ils peuvent déclencher une réaction inflammatoire grave chez le patient. Ce projet cherche à : a) élucider les mécanismes cellulaires de la réaction inflammatoire, en lien avec le type d’antibiotique, la souche bactérienne, la dose infectante et le protocole d’administration, b) prévenir cet effet indésirable via des ajustements thérapeutiques ou en associant l’antibiotique avec d’autres composés pharmacologiques pour limiter la réponse immunitaire excessive, c) proposer de nouvelles recommandations cliniques pour une prise en charge plus sûre. Ce projet, dans sa globalité, permet de caractériser et définir les acteurs de la réponse immunitaire, au cours d’une infection à Leptospira. C’est un projet de recherche qui devrait apporter des éléments pertinents et adaptés pour une meilleure prise en charge des patients atteints de leptospirose. C’est important dans un contexte où, à cause du changement climatique notamment, cette maladie sous-estimée, négligée, connaît actuellement une réémergence.
Procédures
1. Injections dans l’abdomen o Nombre : 1 à 5 injections par souris (selon protocole). o Durée : Quelques secondes par injection. 2. Intervention sous anesthésie o Nombre : 1 intervention par animal. o Durée : quelques dizaines de secondes 3. Injections intraveineuses o Nombre : 1 injection par souris. o Durée : Quelques secondes. 4. Infection par injection dans l’abdomen o Nombre : 1 injection par souris infectée. o Durée : Quelques secondes. 5. Imagerie o Nombre : 4 sessions par souris (J3, J7, J14, J28). o Durée : 20-25 min par session.
Impact sur les animaux
1. Effets liés aux injections et manipulations Les animaux (souris et cobayes) subissent des injections à différents stades du protocole : • Infection par la bactérie étudiée • Administration de composés pharmacologiques Les nuisances potentielles peuvent être une légère douleur locale lors de l’insertion de l’aiguille et du stress lié à la manipulation (contention) et durent généralement quelques secondes. 2. Effets liés à l’imagerie in vivo Les souris infectées subissent des séances d’imagerie pour suivre l’évolution de l’infection. Ces séances impliquent : • Une injection dans l’abdomen • Une anesthésie gazeuse légère pour immobiliser l’animal pendant l’acquisition des images. Les nuisances potentielles peuvent être liées à de l’inconfort lié à l’anesthésie et du stress lié à la manipulation (contention) et durent généralement de 20 à 25 mn maximum. 3. Effets liés à l’infection bactérienne ; durée de 3 jours en cas de dose sévère, < 5 jours pour une dose modérée Deux doses d’infection sont utilisées, entraînant des effets différents sur les animaux : a. Dose sub-létale (modérée) • Effets légers et transitoires (< 5 jours) : o Perte de poids limitée (~5 % du poids initial) o Signes cliniques mineurs sans impact sur le bien-être général. b. Dose élevée Cette dose est utilisée uniquement pour étudier les mécanismes des formes graves de l’infection. • Perte de poids attendue de 10 à 12% du poids initial Signes cliniques : poil hérissé, perte de tonus, ictère possible ainsi que légère prostration.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les organes cibles et/ou le sang de tous les animaux, sans aucune exception, seront prélevés et utilisés à l’étude scientifique menée.
Remplacement
L’étude des réponses immunitaires de l’hôte ne peut pas être réalisée sans expérimentation animale. En effet, les études in vitro ne tiennent pas compte de la complexité des coopérations cellulaires et de l’environnement biologique (interaction cellulaire, recrutements cellulaires, …). Il existe une technique qui permet de générer des anticorps sans recourir à des animaux mais elle n’est pas adaptée à ce stade de notre projet car nous souhaitons obtenir une collection de sérums contre 3 souches bactériennes, mimant la réponse immunitaire naturelle et sa diversité, pour tester des traitements. Des données préliminaires menées ex vivo à partir de sang volontaires sains humains montrent une élévation des marqueurs inflammatoires dans les échantillons de sang mis en contact avec des leptospires, puis incubés avec des antibiotiques comparativement aux échantillons infectés non traités. Chaque fois qu’il est possible de progresser dans nos études avec des expériences ex vivo ou in vitro, cela permet de réduire et restreindre les études in vivo au strict nécessaire.
Réduction
Le plan expérimental (nombre d’animaux par lot, nombre de lots expérimentaux, répétition des expérimentations) est établi de façon à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de l’exploitabilité et de la significativité des résultats. Pour ce projet nous souhaitons étudier les deux sexes indifféremment, c’est pourquoi chaque groupe expérimental, selon les expériences utilisant des souris, est constitué de 3 ou 5 mâles et de 3 ou 5 femelles. Pour la procédure utilisant des cobayes, chaque groupe expérimental comprend de 2 à 6 individus selon l’expérience, mâles et femelles également. Ce nombre est défini d’après notre expérience, et avec l’aide d’un biostatisticien. Des tests statistiques sont appliqués pour déterminer la significativité des données. De plus, les expériences utilisant de l’imagerie permettent de suivre le cours d’une infection de façon longitudinale sans mises à mort intermédiaires, ce qui réduit significativement le nombre d’animaux utilisés et seules les expériences donnant des résultats intéressants seront répétées. Au fil des expériences, l’effectif de certains groupes témoins pourra être diminué selon la reproductibilité des données.
Raffinement
Les souris et cobayes, qu’ils soient témoins ou ne recevant que le composé chimique d’essai, bénéficient d’un suivi avec pesée régulière jusqu’à leur mise à mort. Les composés utilisés sont connus pour ne pas induire d’effets indésirables ou néfastes, à la dose utilisée. Chaque souris est observée, pesée quotidiennement jusqu’à 5 jours après infection puis hebdomadairement, et évaluée sur le plan clinique. Chaque symptôme clinique est relevé pour établir un score. Une échelle de sévérité de ces signes, spécifiques de la leptospirose est établie. Des points limites sont établis, à partir desquels l’animal est mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si des signes cliniques apparaissent, une aide à l’alimentation est ajoutée dans la cage (gel nutritif), ainsi qu’un surcroit de coton pour renforcer l’enrichissement. Après infection à dose sévère, chaque souris est mise à mort 3 jours après infection, de façon anticipée à toute dégradation clinique de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire proches de ceux de l’homme ; ainsi, les résultats expérimentaux et la compréhension des mécanismes immunitaires mis en place lors de l’infection par les leptospires seront très probablement transférables à l’Homme. L’étude de la leptospirose implique un hôte et les bactéries qui l’infectent. La complexité des mécanismes d’induction des réponses immunitaires et de l’interaction hôte-pathogène ne peut pas être appréhendée dans sa globalité in vitro. La souris, hôte naturel, est idéale pour pouvoir mieux comprendre la leptospirose. Le cobaye, est décrit comme un modèle crucial pour étudier le système immunitaire humain car ses gènes immunologiques sont plus proches encore de l’Homme que ceux de souris. C’est donc une espèce animale particulièrement appropriée pour générer des sérums enrichis en immunoglobulines, utiles à des essais de neutralisation avec du sang humain. Toutes les expériences utilisant des souris sont réalisées avec des animaux adultes (âgés de minimum 6 semaines à l’achat, et de maximum 12 semaines pour entrer en expérimentation). A cet âge, le système immunitaire est considéré mature, condition nécessaire pour pouvoir interpréter de façon fiable les données. Les cobayes utilisés dans la procédure 2 sont des animaux adultes (250-350 g), au système immunitaire mature de façon à garantir une quantité maximale de sérums avec le minimum d’animaux.
Service de génération rat Transgéniques, Knockout (KO) ou Knock-in (KI)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
6 530 rats sur cinq ans pour produire jusqu'à trente lignées génétiquement modifiées commandées par des clients : 3 600 femelles donneuses d'embryons, 1 800 femelles receveuses, 300 mâles reproducteurs et 80 mâles vasectomisés. 3 980 d'entre eux sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 1 800 subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 750 un niveau léger, 250 femelles seulement étant conservées pour servir de pseudogestantes ou pour des prélèvements d'organes. Les donneuses reçoivent deux injections hormonales de superovulation puis sont tuées pour que leurs embryons soient récoltés après la mort, les receveuses subissent un transfert d'embryons sous anesthésie générale de vingt minutes et sont tuées ensuite, un second transfert leur étant refusé. Le porteur écrit pourtant que les procédures du projet sont classées en gravité modérée, quand la majorité des rats déclarés relève de la mise à mort sans réveil.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à générer des rats génétiquement modifiés dans le cadre de prestation de services afin de répondre aux différentes demandes des chercheurs. Ces lignées génétiquement modifiées peuvent devenir des modèles de maladies humaines et vont permettre de mieux comprendre leurs processus de développement. Ces modèles peuvent également répondre à d’autres intérêts scientifiques tout aussi importants (comme par exemple devenir des modèles de choix pour la recherche fondamentale). Cela rentrant dans le cadre des différentes thématiques de recherche des utilisateurs (immunologie, cardiovasculaire, détermination de l’effet d’un gène).
Bénéfices attendus
La création de lignée génétiquement modifiés, qui sont non disponibles commercialement, permet d’avoir un modèle unique afin de mieux comprendre un processus biologique ou une pathologie. Cela reste à ce jour des outils indispensables pour l’étude des maladies humaines (cancer, maladies neurodégénératives, maladies génétiques, …). Cela contribuera à faire avancer les connaissances scientifiques et voire à l’établissement de nouveaux traitements thérapeutiques.
Procédures
Ce projet vise à créer jusqu’à 30 nouvelles lignées de rats génétiquement modifiés sur une période de cinq ans afin de développer des modèles utiles à la recherche biomédicale. La création de ces lignées nécessite l’obtention d’embryons. Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, les femelles destinées à produire ces embryons reçoivent un traitement hormonal qui stimule temporairement leur production naturelle d’ovocytes avant l’accouplement. Cette procédure consiste en deux injections de courte durée (30 secondes/injection) et permet d’obtenir davantage d’embryons à partir d’un nombre réduit de femelles (3600 femelles pour 5 ans). Il est aussi à noter qu’une partie des femelles (250 femelles sur 5 ans) pourra être conservée afin de servir ultérieurement comme femelles pseudogestantes ou pour des prélèvements d’organes, contribuant ainsi à optimiser l’utilisation des animaux. Les embryons obtenus sont ensuite modifiés génétiquement à un stade très précoce de leur développement. Cette modification est réalisée soit par microinjection, soit par électroporation, une technique plus récente qui permet souvent une meilleure survie des embryons. Après cette étape, les embryons sont transférés dans des femelles receveuses (1800 femelles pour 5 ans) préparées pour la gestation. Cette intervention est réalisée sous anesthésie générale (durée de 20 minutes) et s’accompagne de l’administration de médicaments anti-douleur (administrée au préalable mais également après l’intervention afin de limiter au maximum toute douleur ou gêne durant 48h en injection sous cutanées). Une fois la gestation confirmée, les femelles sont hébergées individuellement dans un environnement adapté jusqu’à la naissance des petits. Il est à noter qu’un nombre limité de mâles reproducteurs (300 mâles pour 5 ans) et de mâles vasectomisés (80 mâles pour 5 ans) seront utilisés. Les ratons nés de ces femelles sont identifiés précocement et un échantillon biologique est prélevé afin de déterminer quels individus portent la modification génétique recherchée. Sur l’ensemble des cinq années, le projet nécessitera au maximum environ 6 530 rats. Les procédures réalisées dans ce projet sont classées dans la catégorie de gravité « modérée ». Toutes les procédures ont été conçues afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés, de limiter les contraintes imposées aux animaux et d’améliorer leur prise en charge.
Impact sur les animaux
Durant ce projet de création de nouvelles lignées de rats génétiquement modifiés, certaines procédures peuvent entraîner des nuisances temporaires pour les animaux. La production d’embryons nécessite une synchronisation du cycle reproducteur et une stimulation hormonale, réalisées par deux injections intrapéritonéales. Ces injections peuvent provoquer une douleur légère et de courte durée, sans entraîner d’effet significatif durable sur le bien-être des animaux. La réimplantation des embryons est réalisée sous anesthésie générale, associée à une prise en charge analgésique adaptée. Malgré ces mesures, l’intervention chirurgicale peut occasionner une douleur modérée et un inconfort transitoire liés à la cicatrisation. Par ailleurs, des effets indésirables liés aux modifications génétiques réalisées peuvent apparaître. Selon le gène ciblé, ceux-ci peuvent se traduire par une mortalité embryonnaire (in utero) ou postnatale, ou par l’apparition de phénotypes délétères chez les animaux nés, tels qu’une perte de poids, des troubles de la mobilité, des comportements anormaux ou d’autres altérations de l’état de santé et du bien-être.
Devenir
Les mâles vasectomisés et les mâles reproducteurs en situation d'isolement seront mis à mort via un système dédié. Les femelles donneuses sont mises afin de récolter les embryons post-mortem. Les femelles receveuses ne peuvent pas être sujettes à un deuxième transfert d'embryons, elles sont donc mises à mort par inhalation de CO2 via un système dédié en fin de procédure.
Remplacement
Dans le cadre de remplacement, des études préalables peuvent être effectués par le demandeur avant le contact avec la plateforme (tels que des études in vitro, utilisation d’organoïdes). Le demandeur se rapproche alors de la plateforme pour la création de nouvelles lignées de rats dans le cadre des prestations de service et la création de nouvelle lignée d’animaux génétiquement modifiées cela se justifie par différentes raisons : - Que le modèle rat est plus amène à répondre aux questions souhaitées. - Que le modèle rat présente de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l’homme que la souris.
Réduction
Avant la mise en œuvre du projet, nous nous assurons qu’il n’y a pas de modèles disponibles ayant la modification génétique souhaité (que cela soit à travers des publications scientifiques ou alors via des bases de données). Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de la génération d’animaux génétiquement modifiés, nous appliquons à chaque projet un nombre maximum d’embryons pouvant être microinjectés ou électroporés. En ce qui concerne la transgénèse, cela dépend du type de construction (plasmide classique : 400 embryons (taux d’efficacités 1-3%) ou en fonction de la taille de celui-ci 800-1000 embryons car les taux d’efficacités sont de 0.1%). Il est également appliqué un protocole de superovulation aux femelles donneuses d’embryons afin de pouvoir augmenter le nombre d’embryons par femelle et ainsi pouvoir diminuer le nombre de femelles immatures utilisées. Il est également à noter que pour ces stratégies, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous effectuons dans un premier temps une première série de microinjections avec environ 200 embryons puis nous attendons de voir le génotypage. Cela nous permet de savoir si nous avons un nombre suffisant de fondateurs nécessaires au projet de notre demandeur. Les femelles immatures ayant été superovulées mais non accouplées pourront être conservées afin de servir en tant que femelles pseudogestantes ou alors comme animaux servant aux prélèvements d’organes.
Raffinement
Durant la création des animaux génétiquement modifiés, les injections sont réalisées avec un faible volume (0,1 ml). Après chaque injection sur les femelles sous contention, une observation est effectuée pour vérifier la reprise normale de leur activité. Les chirurgies sont pratiquées sous une anesthésie et analgésie complètes à toutes les étapes de l’intervention. Des points limites spécifiques sont définis, notamment pour les jours suivant la chirurgie, afin d’assurer un suivi optimal. Sur les animaux nés après modification génétique afin de détectés tous problèmes liés à celle-ci, ce suivi se fera de manière non invasive (animaux prostrés, ayant un poids inférieur aux autres, poils hérissés…) et les animaux seront élevés en communauté.
Choix des espèces
Dans le cadre de demande de prestation service effectuée par le demandeur auprès de la plateforme, il apparait que le modèle rat présente de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l’homme que la souris. Ce type de modèle animal est plus amène de répondre aux questions souhaitées. Il est aussi à noter que pour la suite des expérimentations du demandeur le modèle rat pourrait permettre des chirurgies plus faciles en sachant que cela dépendra du type d'expérimentations qui sera réaliser par la suite par le demandeur. Les animaux utilisés lors de ce type de prestation seront utilisés à différents stades : Les femelles immatures sexuellement utilisées pour le protocole de superovulation auront un poids de 75-100g car c'est à ce moment précis où ce protocole fonctionne le mieux et où nous arrivons à avoir le maximum d'embryons. Les femelles matures sexuellement servant de femelles pseudogestantes auront un âge >70j car c'est un bon âge pour avoir des femelles susceptibles de faire de "Bonne mère" et accepter le transfert d'embryons. Les mâles fertiles et les mâles vasectomisés auront entre 8 et 12 semaines, âge de la maturité sexuelle. Les animaux surveillés, pour lesquels une attention particulière est nécessaire, seront suivi de leur naissance à 3 mois maximum et cette procédure sera détaillé dans la partie bien-être animal.
Etudes des mécanismes cellulaires et moléculaires régulés par les cellules dendritiques plasmacytoïdes et promouvant l’immunopathologie pulmonaire associée à l’infection grippale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Des souris de fond génétique pur, choisies pour leur faible variabilité, et des lignées génétiquement modifiées pour supprimer une population de cellules immunitaires portent ce projet sur la grippe. 2 370 souris sont utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Le virus leur est administré goutte à goutte dans le nez sous anesthésie, et selon les groupes s'ajoutent une irradiation de neuf minutes, des injections de cellules par voie intraveineuse et des injections de toxine dans l'abdomen sur animal vigile, avec pelage ébouriffé, respiration saccadée et perte de poids annoncés. Les souris qui survivent aux procédures sévères sont tuées elles aussi, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées.
Objectifs
Les cellules du système immunitaire sont nécessaires pour combattre les virus. Lorsqu’elles réconnaissent les cellules infectées par le virus, elles produisent des molécules, dites cytokines, qui orchestrent la défense contre le virus et son élimination. Ces cytokines sont indispensables pour la résistance aux infections virales, mais, lorsque leur production est trop prolongée ou excessive, elle devient délétère pour l’hôte. En effet, elles provoquent une inflammation et des lésions pulmonaires parfois fatales pour l’hôte, comme observé dans les poumons des individus infectés par le virus responsable de la pandémie du COVID-19 ou le virus de la grippe. Nous étudions une population de cellules immunitaires qui, lorsqu’elles détectent un virus, produisent en grande quantité ces cytokines à effet double tranchant. Ces cellules sont ainsi réputées essentielles pour l’immunité anti-virale. Cependant, lorsqu’elles sont absentes ou incapables de produire ces cytokines, cela n’affecte pas la résistance à la majorité des infections virales qui est assurée par d’autres cellules immunitaires. En absence de nos cellules d’étude, les souris tolèrent même mieux l’infection par le virus de la grippe et développent une forme moins sévère, en montrant que nos cellules et leurs cytokines sont en réalité délétères. Eliminer spécifiquement les cellules que nous étudions ou inhiber leurs fonctions permettrait donc de reduire la sévérité de la pathologie pulmonaire induite par l’infection par le virus de la grippe. Nous déterminerons quel est le temps le plus tardif auquel on observe un effet délétère des cellules en étude chez les souris infectées par le virus de la grippe. Nous définirons le temps optimal pour administrer des médicaments qui inhibent les fonctions délétères des cellules étudiées. Nous identifierons aussi les cellules ciblées par les cytokines produites par les cellules étudiées et étudierons leurs fonctions délétères. Nous utiliserons deux souches de virus de la grippe choisies comme les plus fréquentes dans les épidemies grippales. Nos résultats permettront d’envisager le développement de nouveaux médicaments pour soigner les patients développant de formes sévères de pathologie pulmonaire induite par des virus respiratoires, comme celui de la grippe.
Bénéfices attendus
Lors d’infection par des virus respiratoires, tels que celui de la grippe ou le Covid-19, les cellules immunitaires, intervenues pour contrôler l’infection, peuvent provoquer une inflammation pulmonaire sévère, si activées de manière excessive et prolongée. Cela dépend en particulier de molécules produites par ces cellules, dites cytokines. Ces cytokines sont nécessaires pour éliminer le virus, mais, lorsque produites en quantité excessive ou sur un temps trop long, elles provoquent des lésions pulmonaires et affectent la capacité respiratoire. Actuellement, la majorité des médicaments administrés pour limiter cette pathologie des poumons rend l’hôte plus vulnerable à l’infection par de nombreux autres pathogènes. Nous avons identifié une population de cellules immunitaires qui est une source délétère de ces cytokines, mais qui n’est pas requise pour éliminer le virus. Nos travaux visent à comprendre quand et comment les cellules que nous étudions et les cytokines qu’elles produisent favorisent les lésions des poumons chez les souris infectées par le virus de la grippe. Pouvoir éliminer au temps le plus opportun uniquement ces cellules ou inhiber leur production de cytokines permettrait de limiter les lesions des poumons sans altérer la capacité de l’hôte à se defendre contre d’autres pathogènes. Cela representerait une avancée majeure pour développer de nouveaux médicaments pour soigner les patients qui développent des pathologies pulmonaires sévères sans compromettre leurs défénses immunitaires.
Procédures
Dans toutes les Procédures Infection une fois sous anesthésie en administrant goutte à goutte dans le nez la solution contenant le virus (durée 30 secondes). Si desydratation, injection une fois dans l’abdomen d’une solution saline. Les gestes suivants seront réalisés uniquement dans les Procédures indiquées Procédure 1 Injection une fois dans l’abdomen d’une toxine sur 80 souris vigiles ou par voie gastrique d’un produit(durée 1 minute). Injection une fois dans l’abdomen sur 60 souris vigiles de médicaments (durée 1 minute). Procédure 3 Irradiation pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveineuse, une fois sous anesthésie ; Procédure 5 Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie, 260 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 6 Infection en administrant goutte à goutte dans le nez, deux fois à 35 jours d’interval sous anesthésie, 20 souris, (durée 30 secondes). Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang, une fois sous anesthésie, 240 souris (durée 1 minute). Administration d’une solution une fois sous anesthésie goutte à goutte dans la gorge, 40 souris (durée 1 minute). Procédure 7 Irradiation une fois sous anesthésie pendant 9 minutes, puis injection de cellules par voie intraveinuese. Injection intraveineuse d’anticorps et prelévément de sang une fois sous anesthésie générale, 240 souris, durée 1 minute. Administration d’une solution goutte à goutte dans la gorge une fois sur souris anesthésiées durée 1 minute. Procédure 8 Injection intraveineuse de cellules une fois sous anesthésie, durée 1 minute.
Impact sur les animaux
L’infection par le virus de la grippe s’effectue par instillation dans les narines et sous anesthesie, ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’infection peut induire des changements de l’aspect (pelage ébouriffé, réduction du toilettage), du comportement (réduction de la mobilité et de l’activité) et du rythme de la respiration (respiration lente ou saccadée), une perte d’appetit et de poids que nous monitorerons de façon très précise pour détecter le plus précocément une aggravation de l’état des souris si elle a lieu. L’administration par injection dans l’abdomen de la toxine par voie intraperitoneale sur souris vigiles induit un stress et une douleur legère et transitoire. L’administration de reactif par voie gastrique sur souris vigiles induit un stress et une douleur de courte durée. L’administration des inhibiteurs sera effectuée par injection dans l’abdomen sur souris vigiles, ce qui comporte un stress et une douleur legère et transitoire. Avant irradiation, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen L’administration d’anticorps et les prélèvements de sang seront effectués sur souris anesthesiées ce qui peut provoquer un stress et une douleur légèrs et transitoires. L’injection de cellules sera effectuée par voie intraveineuse sous anesthésie générale, les souris subiront un stress et une douleur légère lors de l'administration de l’anesthésique par injection dans l’abdomen.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure moderée pour effectuer les prelevements et les expérimentations prévus. Mise à mort de tous les animaux survivants à la fin de chaque procédure sévère car les animaux ne peuvent pas être reutilisés dans d'autres procédures.
Remplacement
Ce projet nécessite d’étudier la réponse immunitaire et la réparation des tissus pulmonaires au cours d’une immunopathologie suite à l’infection par le virus de la grippe. La complexité des interactions établies entre les cellules ne peut pas être reproduite in vitro dans son intégralité et nécessite donc l’utilisation de modèles d’étude vivants. L’intégration d’un système vivant et complet est donc indispensable pour reproduire l’ensemble de ces processus dans leur complexité. La souris répresente le modèle d’étude optimale car elle permet de générer et utiliser de modèles génétiquement modifiés ciblant les cellules et/ou les molécules en étude. De plus, les similitudes entre système immunitaires murin et humain ont déjà permis le développement de nombreux traitements de maladies chez l’homme. Dans le cas spécifique de ce projet, nous nous attendons à obtenir des indications médicales pour limiter et inhiber les effets néfastes de l’immunopathologie pulmonaire chez les patients souffrant de formes sévères d’infection grippale.
Réduction
Les effectifs d'animaux nécessaires seront réduits au minimum. Nous utiliserons des souris de fond génétique pur, ce qui nous permet de limiter la taille des groupes expérimentaux à 10 souris (5 x2 réplicats) par souche et par condition, en raison d’une variabilité inter-individuelle moindre par rapport aux animaux de fond génétique mixte. Ces nombres ont déjà été validés dans des expériences effectuées précedemment par notre équipe, comme suffisantes pour produire des analyses statistiques fiables dans les procédures utilisées.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des animaleries protégées, conçues dans le respect de la réglementation et des principes éthiques liés à l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques). Les conditions d’hébergement sont contrôlées et régulées. Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Le poids, le comportement, la mobilité et la respiration seront suivis quotidiennement dès le début de chaque traitement. En cas d’affaiblissement des souris, de la nourriture sous forme de paté et de l’eau sous forme de gélée seront mises à l’intérieur de la cage afin d’en faciliter l’accès. Si nécessaire, les souris seront réhydratées par injection dans l’abdomen d’une solution saline. Les points limites et des grilles de score ont été définis dans chaque procédure. Sur la base de ces points limites la douleur sera scrupuleusement mésurée pour évaluer les signes de souffrance relatifs à l’expérimentation en cours, de manière à mettre en place le plus précocement possible des mesures pour réduire au maximum la souffrance des animaux. Les animaux atteignant les critères d’arrêt seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Des souris âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Un écart type de maximum 2 semaines au sein d’un même groupe expérimental est défini afin de limiter les variabilités qui pourraient exister entre des souris d’un écart d’âge plus important.
Génération de chimères hématopoïétiques murines pour l’analyse du rôle de facteurs de transcription dans le développement et la fonction de lymphocytes
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Tuées pour qu'on prélève la moelle de leurs os, 150 souris donneuses fournissent les cellules souches injectées à 450 souris receveuses, elles-mêmes tuées à la fin de la reconstitution pour analyse de leurs organes. Les 600 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les receveuses sont irradiées une fois pendant une vingtaine de minutes, ce qui détruit leurs cellules souches et provoque une immunodéficience transitoire, couverte par deux semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson. Le porteur annonce que les connaissances produites permettront, à terme, de reconstituer le développement de ces cellules immunitaires in vitro et donc de s'affranchir du recours au vivant.
Objectifs
Les cellules lymphoïdes innées (CLI) ont été récemment découvertes et jouent des fonctions très importantes et uniques dans l’immunité et l’homéostasie. Les CLI pourraient également jouer un rôle bénéfique dans la lutte contre les tumeurs solides. La compréhension des mécanismes contrôlant le développement des CLI permettrait de moduler et optimiser ce processus à des fins immuno- thérapeutiques. Dans ce but, nous souhaitons examiner le rôle de facteurs de transcription dans le développement des CLI chez la souris. Pour cela, nous allons modifier génétiquement les facteurs d'intérêt dans les cellules souches hématopoïétiques de souris, et examiner l'effet de ces modifications sur le développement des CLI. Les cellules souches hématopoïétiques seront isolées à partir de « souris donneuses », modifiées génétiquement "in vitro", puis injectées dans des « souris receveuses » dans lesquelles elles se développeront ou non en CLI.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes contrôlant le développement des CLI chez la souris in vitro et in vivo, et d’identifier des moyens d’optimiser la génération de populations spécifiques de CLI chez l’Homme in vitro. Les connaissances générées par ce projet permettront, à terme, de récapituler le développement des CLI in vitro, et donc de s’affranchir du modèle in vivo.
Procédures
Les souris donneuses de cellules souches hématopoïétiques (150 souris) recevront une injection (une minute environ). Les souris receveuses de cellules souches hématopoïétiques (450 souris) seront irradiées une fois en début de procédure (20 minutes environ) ou recevront deux injections, en plus de l'injection de cellules souches hématopoïétiques (une minute environ par injection).
Impact sur les animaux
La destruction des cellules souches hématopoïétiques des souris receveuses induit une immunodéficience transitoire. Pour pallier à cet effet, les souris seront traitées avec des antibiotiques à large spectre dans l’eau de boisson. Le traitement commencera le jour précédant l’irradiation, pour accommoder les souris au gout des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation, le temps que les cellules immunitaires innées soient reconstituées.
Devenir
Les souris donneuses seront mises à mort afin d'isoler leurs cellules souches hématopoïétiques présentes dans la moëlle osseuse. Les souris receveuses seront mises à mort à la fin de la reconstitution hématopoïétique, afin d'analyser en détail le développement des CLI dans différents organes (ex. moëlle osseuse, thymus, poumon, intestin, foie,...).
Remplacement
Les facteurs de transcription dont nous souhaitons examiner le rôle dans le développement des CLI ont déjà été impliqués dans ce processus, ou sont prédits comme jouant des fonctions importantes par des modélisations bioinformatiques du développement des CLI. Leur rôle sera tout d’abord examiné in vitro, puis confirmé in vivo. Le passage in vivo est nécessaire pour récapituler tous les stades de développement des CLI et identifier précisément les stades nécessitant les facteurs de transcription d’intérêt.
Réduction
Le modèle de chimères hématopoïétiques pour étudier le développement des CLI donne des résultats très robustes. Le nombre de souris nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs est donc faible (n=5 par groupe).
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages enrichies. Tous les actes douloureux seront effectués sous anesthésie générale. Après chaque acte, les souris seront réintégrées dans leurs cages et groupes d'origine pour éviter le stress. Les souris déficientes pour le développement de CLI ne développent pas de pathologies. Les chimères hématopoïétiques de cette étude ne devraient donc pas développer de pathologies. Les souris seront donc suivies quotidiennement, et en cas d’apparition du moindre signe clinique, les souris concernées seront sorties du protocole et mises à mort.
Choix des espèces
Les processus développementaux sont très conservés entre l’homme et la souris, donc la souris est un bon modèle d’étude pour comprendre le développement de cellules humaines. De plus de nombreux outils permettant l’analyse du développement des CLI ont été générés chez la souris et seront utilisés dans cette étude (anticorps, souches génétiquement modifiées). Les souris seront utilisées à l’âge jeune adulte (6-12 semaines) pour une meilleure récupération des souris après la procédure.
Cartographie fonctionnelle du système immunitaire du Nothobranchius furzeri avec l’âge
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Filmés trente minutes dans un bac pour classer leurs performances de nage, traités par un antalgique, endormis, puis injectés dans la cavité abdominale avec un vaccin, 270 killis turquoise d'Afrique sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces poissons vieillissent vite, six mois de vie en captivité, et le porteur attend chez eux une perte de pigmentation, une émaciation, une baisse de la prise alimentaire et des changements de comportement qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation. Les individus sont observés entre 2 et 6 mois, par groupes de 6 à 10, pour relier des populations immunitaires à la perte de mobilité au cours du vieillissement. Tous sont tués et disséqués à l'issue, afin d'extraire les cellules immunitaires de leurs organes.
Objectifs
Aujourd’hui, les personnes âgées de plus de 60 ans représentent 1/4 de la population française et pourraient en représenter 1/3 en 2050. Si l’espérance de vie en France après 50 ans s’avère élevée, le nombre d’années vécues en bonne santé reste inférieur à celui de plusieurs pays de l’UE. Il est donc urgent d’intervenir pour ralentir cette progression défavorable et améliorer la qualité de vie au cours de l’avancée en âge. Dans ce contexte, l'OMS a identifié 5 domaines, la mobilité, la vitalité, les capacités neurosensorielles, le psycho-social et la cognition, qui doivent être préservées ou restaurées chez la personne âgée pour promouvoir son "bien vieillir". L’objectif de ce projet est de caractériser les modifications du système immunitaire associées à la perte de mobilité spontanée, une des grandes fonctions à préserver pour vieillir en bonne santé, en utilisant un modèle animal présentant un vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu au cours du vieillissement. Nous pourrons évaluer quelles populations immunitaires sont associées à la diminution de la locomotion. Les outils développés dans ce projet pour cartographier les réponses immunitaires avec l’âge seront mis à disposition de la communauté scientifique. A plus long terme, les résultats permettront d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de proposer de nouvelles approches d'immunomodulation afin de préserver la mobilité et favoriser le "bien vieillir".
Procédures
Nous utiliserons des poissons mâles pour caractériser les populations immunitaires modifiées avec la perte de mobilité associée au vieillissement. Les principales populations identifiées chez le mâle seront testées chez les femelles. Puis, nous évaluerons la réponse à une vaccination chez les poissons en comparant les réponses immunitaires induites par l'injection intrapéritonéale de vaccin contenant ou non un composé pro-inflammatoire. Les poissons seront traités par un antalgique avant d’être endormis pour prévenir la douleur liée à l'injection et réduire l’angoisse associées à cette intervention. Les poissons injectés seront également traités par un antalgique après l’injection. Les poissons seront filmés au préalable (trois jours à une semaine avant la vaccination) pendant 30 min dans un bac pour enregistrer les mouvements de nage spontanés et permettre de classer les individus âgés en fonction de leur performance physique.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent l’injection du vaccin et les conséquences de la vaccination. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
Au terme des procédures, tous les animaux (n=270) seront mis à mort et disséqués afin de récupérer différents organes pour extraire les cellules immunitaires ou pour procéder à des analyses histo-pathologique et transcriptomique.
Remplacement
Le processus de vieillissement est très variable d'un individu à l'autre. Pour mieux comprendre ces différentes trajectoires de vieillissement à l'échelle individuelle, il est nécessaire d'étudier l'évolution des fonctions, comme la mobilité, chez des organismes vivants. Les individus âgés nous permettront d’étudier les réponses immunitaires dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement in vivo. Le Turquoise Killifish est un modèle unique et indispensable pour étudier, de manière intégrée, à l'échelle de l'organisme entier, les réponses immunitaires en fonction de la qualité du vieillissement des individus.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’individus, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les poissons sont observés aux âges extrêmes de la vie (2 mois à 6 mois) et leur capacité de locomotion est évaluée. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques et fonctionnels généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 à 10 individus au total seront constitués pour mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction). Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles pour un même individu.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire) ou l'amaigrissement (creusement de la partie ventrale du poisson). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à un suivi du poids sur 1 semaine. Si la perte de poids est trop importante, le protocole expérimental sera interrompu. La surveillance du poids se poursuivra jusqu'à stabilisation ou atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort de l'individu.
Choix des espèces
Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce de choix, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur en terme de tissus et de cellules présents. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un vieillissement systémique, là aussi comparable à celui des rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d’une exploration fonctionnelle in vivo couplée à des études biologiques intégrées et à la caractérisation de sous-populations cellulaires ex vivo. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.
Rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
9 156 souris vont être utilisées sur cinq ans, chacune recevant par gavage une suspension bactérienne en trois minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur précisant que les animaux ne peuvent être "ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés" puisque l'objectif est de prélever l'estomac ou l'intestin. Il attend de l'infection gastrique aucune souffrance et de l'infection intestinale un inconfort léger épisodique, sur la foi de son expérience et de celle de ses collègues. Le même résumé annonce 9 156 souris au titre du "cas pessimiste" où chaque souche mutante et chaque temps d'observation feraient l'objet d'expériences indépendantes.
Objectifs
Le répertoire des récepteurs de l’immunité innée inclus des protéines capables de reconnaître virtuellement tous les différents composants de la paroi bactérienne. Cette détection de ces composants de paroi permet à l’hôte et aux bactéries d’établir une symbiose bénéfique aux deux partenaires. Cet équilibre est rompu dans le contexte d’une bactérie pathogène. De nombreux pathogènes ont développé des stratégies d’échappement à l’hôte en modifiant ou masquant leur surface au système immunitaire inné. Nous avons fait dans le passé la preuve de principe en étudiant certains mécanismes de modification de certains composants de la paroi bactérienne qui permettent au pathogène d’échapper à la reconnaissance par le système immunitaire inné de l’hôte. Néanmoins, il reste encore à découvrir beaucoup de nouveaux mécanismes de régulation de la paroi bactérienne permettant à des pathogènes d’échapper à la surveillance de l’hôte. Nous étudions ces mécanismes dans deux pathogènes du tractus gastrointestinal : responsable de pathologies gastriques sévères comme le cancer de l’estomac, et responsable de gastroentérites et souvent associé à des maladies chroniques inflammatoires de l’intestin. Ainsi, nous étudierons la capacité de souches mutantes pour des gènes impliqués dans la modification et/ou régulation de la paroi bactérienne à coloniser leur niche naturelle (estomac et intestin). Grâce à ces nouvelles connaissances, nous espérons pourvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces fonctions importantes pour la survie de ces deux pathogènes dans leur niche.
Bénéfices attendus
La souris est un mammifère avec une physiologie et un système immunitaire très proches de l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignées murines mutantes, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité, permettant par la suite, en fonction des résultats obtenus sous ce projet, des études mécanistiques approfondies de la réponse immunitaire de la souris face à l’infection de l’estomac par l’une des bactéries étudiéesi. Ces nouvelles connaissances permettraient d’améliorer les stratégies vaccinales contre cette bactérie qui pour l’instant ne sont pas efficaces. De plus, le fait de se focaliser sur des mutants du métabolisme de la paroi chez cette bactérie nous pourrons identifier des cibles prometteuses pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre cette bactérie. Ainsi, les résultats expérimentaux seront très probablement transférables à l’homme.
Procédures
L’administration des suspensions bactériennes par gavage sur animal vigile est très rapide (3 min par individu).
Impact sur les animaux
Le gavage entraine un inconfort et une douleur légère de courte durée. Suivant la littérature, l’infection de l’intestin par les souches pathogènes de l’une des 2 bactéries étudiées peut entrainer épisodiquement un inconfort léger de la souris avec de la diarrhée. Néanmoins, nous n’avons jamais observé avec nos souches de d’inconfort ou de diarrhée. Par contre, l’infection de l’estomac par l’autre bactérie étudiée n’entraine aucune souffrance pour la souris suivant notre expérience et celle de nos collègues nationaux et internationaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, pour toutes les procédures, l’objectif final est de prélever certains organes pour l’observation de la colonisation bactérienne de l’estomac ou de l’intestin. Ces prélèvements d’organes vitaux sont, par définition, réalisés sur animaux morts.
Remplacement
Pour ce projet, aucun système alternatif au modèle animal n’est possible pour répondre à la question scientifique du rôle des protéines du métabolisme de la paroi bactérienne dans la virulence. Des systèmes cellulaires ou d’organoïdes ne permettent pas d’étudier la réponse immunitaire. De plus, avec ces systèmes in vitro, il y a absence complète de l’environnement complexe de : 1) l’estomac notamment l’acidité produite par les cellules pariétales qui ont un impact très fort sur la survie de l’une des 2 bactéries étudiée ; 2) de l’intestin, notamment, la production d’acides biliaires ou la compétition avec la flore commensale qui impactent fortement la capacité de l’autre bactérie étudiée à coloniser cette niche. Ainsi, le comportement de mutants dans des systèmes cellulaires ne reproduit pas le stress rencontrer dans le tractus gastrointestinal.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utiles à ce projet a été débattue avec les biostatisticiens. Nous utiliserons ici 9156 souris sur une période de 5 ans dans le cas pessimiste où chaque souche mutante et chaque temps d’observation ferait l’objet d’expériences indépendantes. Lorsqu’une expérience permettra l’observation de plusieurs mutants en même temps, ou de plusieurs temps avec une même souche mutante, un seul groupe contrôle sera produit.
Raffinement
Durant les deux semaines précédant toute expérimentation, les expérimentateurs rendront visite aux souris pour les habituer aux manipulations avant toute procédure expérimentale. Pendant le protocole, les expérimentateurs rendront visite tous les jours aux souris lors des deux premières semaines d’infection. Après les 15 premiers jours, si aucun signe visible de détresse est observé, les visites se feront deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. En cas de diarrhée, nous mettrons du gel hydrique dans les cages à dispositions des souris. En cas
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité des précédents projets menés au laboratoire. C’est le modèle pour lequel nous avons le plus d’outils moléculaires pour étudier la réponse de l’hôte à l’infection. De plus, nous avons à notre disposition des modèles murins génétiquement modifiés, transgéniques ou invalidées pour des gènes de l’immunité qui permettrons une suite en cas de résultats intéressants avec certains des mutants à tester. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront âgées de 5 ou 6 semaines. Cet âge défini est basé sur nos précédents projets internes et externes qui ont fait appel au modèle murin.
Utilisation d’un modèle murin sensible aux souches virales émergentes et ré-émergentes transmises par les moucherons culicoïdes.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Choisies pour leur sensibilité accrue aux agents pathogènes, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont saignées à la joue, à la queue ou au sinus rétro-orbitaire, et le résumé présente ces prélèvements comme les seules procédures prévues, tout en annonçant par ailleurs des souris vaccinées puis inoculées avec des virus transmis par les moucherons culicoïdes. Toutes sont tuées au dernier jour expérimental, pour mesurer la quantité de virus et d'anticorps dans leurs organes et leur sang. Le porteur revendique un "immense avantage" à recourir à ces souris, celui de réduire l'utilisation de moutons, de bovins, de chèvres et d'équidés, et fixe l'effectif de 300 souris sur cinq ans d'après la moyenne des années précédentes.
Objectifs
Les nombreuses émergences et ré-émergences de virus transmis par les culicoides (moucherons) ces dernières années, touchant les animaux (maladie hémorragique épizootique, fièvre catarrhale ovine, …) ont été responsables d’une forte mortalité chez les ruminants et responsables de fortes pertes économiques. Dans le but de limiter les conséquences de ces émergences, la caractérisation des nouvelles souches virales circulantes et la vaccination des animaux est le meilleur moyen de protéger les animaux et de limiter la diffusion de ces maladies. De ce fait, il est nécessaire de bénéficier d’un modèle rongeur adapté pour tester des approches prophylactiques efficaces. De par leur sensibilité accrue à de nombreux agents pathogènes, les souris sensibles constituent un modèle de choix pour des études préalables à des essais sur l’espèce naturellement ciblée par ces agents pathogènes (mammifères de taille importante). Le but de ce projet est de caractériser la virulence de souche virale et d’évaluer la capacité des souris à produire des anticorps dirigés contre les virus d’intérêt. Un total de 300 souris pour 5 ans sera utilisé (ce qui correspond au nombre moyen d’animaux utilisés ces dernières années durant les différents projets).
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes d’infection de multiples virus émergents et ré-émergents. Ils pourraient permettre également le développement et la mise au point de nouveaux vaccins.
Procédures
Seuls des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles pratiqués à la joue (veine submandibulaire), ou à la queue ou en dernier recours au sinus rétro-orbitaire, après pose d’un collyre anesthésiant par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement ne dure que quelques secondes par souris. Les souris seront contrôlées tous les jours.
Impact sur les animaux
Une surveillance quotidienne de tous les animaux vaccinés et / ou infectés sera réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée sera effectuée avant chaque inoculation de virus, puis quotidiennement. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance sera augmentée à deux observations quotidiennes, y compris les week-ends. L’adjuvant utilisé a fait l’objet de tests toxicologiques qui ont conclu à la non-toxicité et à la tolérance favorable.
Devenir
Les souris seront mises à mort le dernier jour expérimental, pour permettre la récupération d’organes et de sang, pour l’analyse de la quantité de virus et d’anticorps dans ces différents prélèvements.
Remplacement
Le modèle des souris s’avère particulièrement pertinent pour l’étude des virus et présente l’immense avantage de réduire l’utilisation de grands animaux (ovins, bovins, caprins, équidés…).
Réduction
Six souris par groupe permet d’avoir des résultats solides et statistiquement fiables. En moyenne, 2 souches virales et 2 essais d’efficacité de nouvelles molécules étant testées par année, 60 souris / an seront utilisées (soit 300 souris au maximum sur 5 ans).
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier, coton ...). Elles sont abreuvées et nourries ad libitum. Une surveillance quotidienne des animaux est réalisée dès le début de l’expérimentation, y compris les week-ends et jours fériés, conformément à la réglementation. Une pesée est effectuée avant chaque inoculation d’une souche virale (infectieuse), puis une pesée quotidienne est ensuite effectuée. En cas d’apparition de signes cliniques ou durant la période attendue de développement clinique après infection virale, la fréquence de surveillance est augmentée à deux observations quotidiennes. Le score clinique de chaque souris est établi quotidiennement et permet de poursuivre ou non la procédure pour chaque souris. Un collyre anesthésiant sera appliqué pour les prélèvements de sang au niveau du sinus rétro-orbitaire. Les prélèvements sont effectués par du personnel expérimenté et formé et ne dure que quelques secondes par souris.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée comme modèle d’infection pour les virus, de par sa grande sensibilité à l’infection virale. Elle développe généralement des signes cliniques quelques jours post-inoculation. La souris représente donc le modèle idéal en laboratoire pour cette étude. Les souris utilisées seront âgées de 10 semaines minimum afin de disposer d’animaux adultes présentant un système immunitaire mature et permettant la réalisation des prélèvements dans de bonnes conditions expérimentales.
Évaluation de thérapies anti cancer dans des modèles de greffe orthotopique de cellules tumorales par voie rectale
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Des cellules tumorales sont injectées dans la muqueuse intestinale par voie rectale sous endoscopie, geste répété chaque semaine pour suivre la croissance de la tumeur. 2 752 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever rate, ganglions, intestins et tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des traitements anticancéreux par voie orale, rectale, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse ou par gavage, avec des prélèvements de sang à la veine faciale jusqu'à une fois par semaine. Le porteur affirme que l'effectif est calculé "au plus juste" à partir d'expériences antérieures en greffe sous-cutanée, sans donner un seul chiffre à l'appui de ces 2 752 animaux.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans la continuité de projets déjà existants et ayant donné des résultats très prometteurs. Il consiste à mettre au point des modèles de greffe de cellules tumorales dans la muqueuse intestinale afin de se rapprocher au plus près de ce qui se passe chez l’homme dans le cas de personnes atteintes de cancer digestif. En effet des expériences préliminaires ont été réalisées en greffant des cellules tumorales sous-cutanées afin de développer et de tester de nouvelles approches de thérapies de vaccination anti-cancer. Afin de continuer et d’optimiser ces thérapies, il est intéressant et judicieux d’améliorer les modèles d’études. La localisation des cellules tumorales est un paramètre important à prendre en compte dans nos études. En effet, celle-ci peut modifier la réponse aux thérapies due à un différentiel de biodistribution du médicament selon les organes, le microenvironnement, une réponse immunitaire différente selon les organes. C’est pour cela qu’il est important de développer des modèles murins de greffe de cellules tumorales au niveau de l'instestin. De plus dans le cancer colo-rectal les immunothérapies sont peu efficaces, cette étude a pour objectif de tester un traitement local in-situ afin d’augmenter les efficacités de traitements. La stratégie de vaccination des lésions in-situ permettrait d’empêcher les lésions pré-cancéreuses de se développer.
Bénéfices attendus
Malgré les progrès importants dans la prise en charge des patients atteints de cancer digestifs, un certain nombre ne répondent pas aux différente de traitement ou récidivent. Il est donc essentiel de développer de nouvelles thérapies ou d’optimiser les traitements existants. Pour cela, nous avons besoin de modèles se rapprochant au plus près de la pathologie humaine. L’utilisation du modèle murin de greffe de cellules tumorales issues de cancer digestifs au niveau de l'intestin permettra de créer un environnement au plus proche de celui des cancers digestifs chez l’Homme et pourra ainsi répondre à des interrogations auxquelles nous ne pouvons pas répondre dans les modèles traditionnels de greffe tumorale en sous-cutané.
Procédures
Les animaux subiront une endoscopie sous anesthésie afin d'injecter des cellules tumorales dans la muqueuse intestinale. Ces animaux subiront ensuite d'autres endoscopies sous anesthésie afin de suivre l'évolution de la tumeur (une par semaine). Pour les animaux ayant reçu une lignée cellulaire dont le suivi peut être réalisé par imagerie une fois par semaine, une injection intra-péritonéale de produit de traçage sera réalisée suivi par une anesthésie gazeuse pour le placement dans l’appareil d’imagerie. Les animaux recevront ensuite différents traitements anti-cancer (un traitement par animal). Ceux-ci seront administrés soit par voie orale, rectale sous endoscopie, intra-musculaire, intra-péritonéale, inra-veineuse ou par gavage. Les animaux, au cours de la procédure pourront subir des prélèvement de sang veineux périphérique au niveau de la veine faciale après anesthésie gazeuse à l’isoflurane au maximum une fois par semaine.
Impact sur les animaux
La greffe des cellules tumorales sera réalisée sous anesthésie gazeuse par endoscopie dans la muqueuse intestinale ce qui peut induire un stress de l’animal. Le développement des tumeurs peut être à l’origine de souffrance et de gênes qui seront évaluées par observations fréquentes des animaux (poids, état général) 3 fois par semaine et estimation de la prise tumorale par imagerie de bioluminescence après injection IP de luciférine lors de l’utilisation de lignées cellulaire possédant la luciférase ou par endoscopie.
Devenir
A l'issu de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever certains organes (rate, ganglions, intestins, tumeurs...) et ainsi réaliser des analyses immunologiques complémentaires. Ces analyses sur les organes permettront de mieux comprendre les mécanismes de développement tumoral ainsi que les mécanismes d'actions et les conséquences des traitements.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans le cancer. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire in vitro, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu. Préalablement à ces expériences in vivo des études in vitro ont été réalisées afin de définir des conditions optimales de croissance tumorale et de conditions d’administration des traitements.
Réduction
Ces expériences in vivo sont réalisées pour soutenir et compléter des résultats qui ont été obtenus in vitro. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de pouvoir montrer des différences significatives ainsi que la reproductibilité et la répétabilité des résultats obtenus. Ces effectifs sont calculés à partir des résultats que l’on a pu obtenir par le passé sur des expériences utilisant des modèles de greffe sous cutanée ainsi que les données de la littérature sur le sujet.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation, les souris seront habituées au geste de la contention et à la pesée dès leur arrivée dans l’établissement utilisateur. Des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi (abris, matériaux de nidification, contrôle du cycle lumineux, de l’hygrométrie et de la température). Ils bénéficient d’un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont manipulés exclusivement par du personnel formé et habilité. Les animaux seront suivis de façon adaptée à l’intensité de la pathologie afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. Les procédures expérimentales potentiellement douloureuses seront encadrées par une anesthésie. L’apparition d’une potentielle douleur en lien avec les procédures expérimentales sera appréciée par une échelle d’évaluation de la douleur. Lorsque cela sera possible, des techniques d’imagerie par bioluminescence seront privilégiées pour le suivi de la maladie à la place des endoscopies. Enfin, des points limites seront mis en place, prenant en compte plusieurs paramètres tels que la perte de poids, l’état du pelage, la capacité de locomotion et la présence d’une douleur qui sera évaluée grâce à une grille de score précise. Ces points limites permettront, lorsqu’ils sont atteints, de mettre à mort immédiatement les animaux.
Choix des espèces
La souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Des souris âgées de 4 à 12 semaines seront utilisées. Ce stade de développement a été retenu car le système immunitaire est pleinement mature permettant d'obtenir une réponse inflammatoire reproductible après implantation de la tumeur. L'utilisation d'animaux adultes limite également les variations physiologiques observées au cours de la croissance ou liées au vieillissement, susceptibles d'influencer les paramètres étudiés. Par ailleurs, la majorité des données publiées concernant le modèle de greffe orthotopique de cellules tumorales au niveau de l’intestin a été obtenue chez des souris jeunes adultes, ce qui permet de comparer les résultats générés dans ce projet avec ceux de la littérature scientifique et d'assurer la reproductibilité des expériences.
Etude du système immunitaire dans un contexte tumoral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Chaque souris est irradiée sous anesthésie générale, greffée par voie intraveineuse avec des cellules immunitaires modifiées, puis injectée avec des cellules tumorales sous la peau ou dans la veine de la queue, cette dernière injection sans anesthésie. 1 440 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever rate, moelle osseuse et foie. Le porteur reconnaît que les tumeurs diffuses peuvent provoquer une douleur ou un inconfort modéré dans plusieurs organes, et que les tumeurs solides gêneraient les déplacements si les animaux n'étaient pas tués avant. Il présente pourtant cet enchaînement comme "plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux".
Objectifs
Les cellules immunitaires sont capables de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses. Elles ont besoin d’énergie pour remplir efficacement leur rôle, et plusieurs mécanismes à l’intérieur de la cellule régulent cette utilisation d’énergie. Ce projet cherche à comprendre comment ces mécanismes influencent l’activité des cellules immunitaires, leur activation, leur déplacement et leur capacité à combattre les tumeurs, qu’elles soient localisées (tumeur solide) ou diffuses dans l’organisme (métastases).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment l’énergie disponible dans les cellules immunitaires influe sur leur capacité à agir contre les cellules cancéreuses. Le rôle des cellules immunitaires étant primordial, les résultats pourraient aboutir à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à renforcer la réponse immunitaire anti-tumorale. Le projet permettra également d’évaluer l’intérêt potentiel d’un médicament déjà utilisé pour traiter le diabète dans la prise en charge du cancer. Si son efficacité est démontrée, son utilisation en thérapeutique pourrait être facilitée et plus rapide, car ce médicament est déjà autorisé et utilisé chez l’humain.
Procédures
Chaque souris sera soumise à plusieurs manipulations simples, réalisées dans des conditions assurant le confort et la sécurité des animaux. Chaque animal recevra : • Une anesthésie générale suivi d’une irradiation (30 minutes) • Une greffe de cellules immunitaires par injection intraveineuse (durée : 1 min) sous anesthésie volatile (durée : 5 min) • Un prélèvement sanguin sous anesthésie afin d’évaluer la prise de greffe (durée : 5 min) • Une injection de cellules tumorales sous la peau (durée : 30 s), sera effectuée sous anesthésie volatile (durée : 5 min) pour la moitié des animaux ou une injection dans la veine de la queue sans anesthésie (inaccessible avec anesthésie), (durée : 1 min) pour l’autre moitié. • Une injection dans l’abdomen ne nécessitant pas d’anesthésie (30 s) ou en sous-cutanée (30 s) après une anesthésie volatile (durée : 5 min)
Impact sur les animaux
Les procédures peuvent provoquer une douleur légère et temporaire lors des injections. L’irradiation aux rayons X n’induit qu’un faible stress et une faible douleur car les animaux seront anesthésiés profondémment. L'injection des cellules de la moelle osseuse et les prélèvements sanguins ne provoquent pas de douleur ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. Nous n’attendons pas de souffrance suite à la greffe. En effet, la prise de greffe se déroule bien dans >90% des cas, d'autre part, les cellules immunitaires modifiées au cours de ce protocole ne sont pas strictement nécessaires à la survie de l’animal et ne sont pas connues pour induire de pathologie. Le développement des tumeurs, notamment dans le modèle de tumeur diffuse, peut entraîner une douleur ou un inconfort modéré en raison de la présence des tumeurs dans différents organes (rate, moelle osseuse, foie). En revanche, la croissance des tumeurs solides n’affecte pas les mouvements ni ne provoque de gêne locomotrice au cours du protocole, les animaux étant euthanasiés avant l’apparition de ces gênes. Tout animal présentant une réaction anormale ou une souffrance non contrôlable sera immédiatement euthanasié conformément aux critères de fin d’expérience établis.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes post mortem pour des analyses sur les cellules immunitaires modifiées et mises en compétition.
Remplacement
Les cellules du système immunitaire modifiées ont été testées in vitro notamment face à des cellules tumorales. Cependant, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité de la réponse anti-tumorale. De ce fait, la mise en place d’expériences in vivo sur un modèle animal est pertinente. Pour des raisons éthiques et de praticité cela ne peut être effectué directement chez l'homme avant preuve chez l'animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été calculé au strict minimum nécessaire pour permettre une analyse fiable des résultats. Des calculs statistiques simples montrent qu’il faut au moins cinq animaux par groupe pour pouvoir détecter des différences réelles et solides entre les conditions testées, sans augmenter inutilement le nombre d’animaux. De plus, des expériences préliminaires déjà réalisées nous confortent dans ce choix et confirment que cet effectif est suffisant pour obtenir des données solides. La procédure a été conçue pour obtenir le plus de données possibles à partir d’un seul individu, en réalisant plusieurs analyses sur les mêmes animaux. Enfin, la co- injection dans un même animal permet une comparaison directe de nos conditions expérimentales et limite la variabilité, réduisant ainsi le nombre total d’animaux nécessaires à la réalisation du projet. Cette organisation permet de réduire la répétition d’expériences indépendantes et donc de limiter l’utilisation d’animaux tout en garantissant la qualité scientifique du projet.
Raffinement
L’équipe possède une expertise solide se traduisant par la mise en place de plusieurs mesures visant à garantir au maximum le bien-être des animaux : • Utilisation d’une armoire chauffante pour assurer une bonne récupération de l’animal suite à l’irradiation • Contrôler précisément le nombre de cellules injectées, afin d’éviter une croissance tumorale trop rapide ou imprévisible. Données déterminées suite à l’expertise de l’équipe (8 ans d’utilisation du modèle tumorale) • Assurer une surveillance régulière, tous les deux jours, en observant notamment la motricité, le comportement, la posture et la réponse aux stimulations • Définir des points limites stricts (perte de motricité, perte de réponse aux stimulations) et précoces : si l’un de ces seuils est approché, la fréquence de surveillance est augmentée pour intervenir au bon moment et éviter toute souffrance inutile. • En cas d’apparition de signes d’irritation ou d’inflammation des lavages au sérum physiologique sera effectué deux fois par jour pendant 48h. Si cela ne s’améliore pas un vétérinaire sera alors contacté.
Choix des espèces
Le choix du modèle souris est imposé par la nécessité de pouvoir utiliser des animaux génétiquement modifiés. Les souris seront âgées de 8-9 semaines le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.
Identification et études de cibles thérapeutiques potentielles dans l’allergie de la peau
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Un hypersensibilisant est appliqué sur le ventre rasé sous anesthésie, puis un second sur l'oreille droite pour déclencher une réaction proche d'une dermatite atopique : 1 236 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 432 d'entre elles reçoivent en plus une injection sous-cutanée de cellules immunitaires triées, et toutes subissent un prélèvement de sang à la veine mandibulaire en fin d'expérience. Le porteur ne décrit que des démangeaisons légères et passagères et un épaississement de la peau, tout en prévoyant des points limites au-delà desquels un animal est retiré de l'étude et tué. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs tissus, onze lignées étant mobilisées afin de trier des cellules dendritiques qui représentent moins de 1 % d'un ganglion.
Objectifs
Dans ce projet, l’objectif est de mieux comprendre le rôle des cellules dendritiques du système immunitaire, soupçonnées d’avoir une fonction apaisante dans une forme expérimentale d’inflammation de la peau. Pour cela, plusieurs approches complémentaires seront utilisées. D’abord, des animaux recevront une substance irritante sur la peau afin de déclencher une réaction ressemblant à une dermatite atopique. Les chercheurs analyseront ensuite les cellules immunitaires stimulées au cours de l’inflammation induite. Dans un second temps, La production d'autres cellules immunitaires seront induites à partir d’animaux traités avec un hypersensibilisant. Ces dernière cellules seront ensuite injectées dans la peau d’animaux afin d’observer si elles modifient l’intensité ou la nature de la réaction inflammatoire. Plusieurs quantités de cellules seront testées pour identifier la dose la plus efficace. Une fois cette étape validée, les chercheurs compareront l’effet de cellules activées ou non activées, afin de comprendre ce qui leur confère un potentiel anti inflammatoire. Les analyses utiliseront différentes techniques seront utilisées. L’ensemble de ces expériences permettra de déterminer si ces cellules immunitaires peuvent réellement atténuer l’inflammation cutanée, comment elles agissent et quelles conditions favorisent leur apparition. À terme, ces connaissances pourraient contribuer au développement de stratégies visant à mieux contrôler les réactions inflammatoires de la peau.
Bénéfices attendus
La mise en évidence de la fonction de cellules immunitaires spécialisées dans la modulation des réponses inflammatoires constituerait une nouvelle cible thérapeutique intéressante dans le traitement de pathologies en lien avec le système immunitaire, comme les maladies auto-immunes ou le cancer. En effet, la modulation de la réponse immunitaire de l'atténuer ou de la restreindre dans un contexte d'allergie ou de maladie auto-immune, ou de l'amplifier dans un contexte de cancer. De plus, l'utilisation de cellules immunitaires spécialisées générées ou modifiées ex vivo/in vitro est une stratégie thérapeutique innovante qui peut s'appliquer à l'homme et qui est déjà étudiée, notamment dans un contexte de lutte anticancéreuse.
Procédures
Les animaux vont être sensibilisés avec l'application unique topique d'un hypersensibilisant sur le ventre préalablement rasé sous anesthésie gazeuse (durée : 1min pour la survenue de la narcose et 1min pour l'application de l'haptène). 432 animaux vont être injectés en sous-cutanée au niveau du ventre avec les cellules immunitaires triées et présensibilisées (durée : 30s) et ces animaux vont etre soumis à une phase de déclenchement au niveau de l'oreille droite par un autre haptène hydrophile, sous anesthésie gazeuse . A la fin de l'expérience, un prélèvement sanguin à la veine mandibulaire sera effectué.
Impact sur les animaux
L’administration de l'haptène pour la sensibilisation se fait par application cutanée sur le ventre rasé sur 1cm2. Cette application peut être accompagnée de légères démangeaisons qui s'estompent quelques heures après le traitement. On constate un épaississement localisé de la peau du ventre. L’administration de l'haptène pour le challenge se fait sur l’oreille droite. On constatera une augmentation de l’épaisseur de l’oreille traitée ainsi qu’une légère démangeaison locale et passagère. L'application de l'haptène engendrera un léger stress d'une courte durée sur les animaux. L'injection de cellules engendrera un léger stress et douleur d'une courte durée sur les animaux injectés et sur les animaux ayant subi une application topique et unique de l’haptène sur l’oreille où une inflammation accompagnée de démangeaisons et d'une rougeur, pourraient survenir de manière passagère.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort pour permettre les prélèvements de tissus pour analyses (cytométrie en flux, histologique, ...).
Remplacement
Les phénomènes à l'oeuvre dans cette réaction immunitaire nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.
Réduction
Le protocole de sensibilisation sera appliqué à un total de 11 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. 12 souris par groupe seront suffisantes pour obtenir des résultats interprétables des modifications des sous-types de populations de cellules dendritiques entre les lignées mutantes et la lignée sauvage. Le protocole de traitement à l’haptène sera appliqué à un total de 6 lignées murines afin de mettre en place différentes stratégies d'identification et d'obtention des cellules dendritiques ou d'étudier l'implication de différentes molécules dans l'induction des réponses pro- et anti-inflammatoires. Cependant, les cellules dendritiques d'intérêts représentent moins de 1% de la population cellulaire totale d'un ganglion lymphatique après traitement et, d'après l'expérience sur de précédents projets, nous savons qu'il est nécessaire d'avoir 10 animaux dans chaque lignée murine pour avoir un nombre de cellules suffisant pour la suite du projet. Seul un groupe traité sera nécessaire dans l'obtention des cellules dendritiques ex vivo, donc nous n'inclurons pas de groupe non traité comme contrôle. Le protocole d'injection des cellules dendritiques sera réalisé sur un total de 5 lignées afin d'étudier la réponse immunitaire résultante de l’injection des différentes populations de cellules injectées issues des 7 lignées murines transgéniques. 8 animaux par groupe seront nécessaires pour arriver à des conclusions significatives. Les analyses statistiques seront réalisées à l'aide de plusieurs formules en fonction du nombre de paramètres et du nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe et auront un accès constant à de l'eau et de la nourriture pendant toute la durée de l'expérience. L'application topique de l'haptène ou l'injection unique de cellules immunitaires spécialisées au niveau du ventre seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter le stress et/ou la douleur des animaux pendant les procédures. Pendant l'expérience, il pourrait être possible d'observer une inflammation au niveau du ventre, accompagné de démangeaisons et d'une rougeur, mais n'impactera pas le comportement des animaux (soin du pelage, posture, activité normale, ...). Le dépôt de l’hypersensibilisant sur le ventre rasé provoquera une augmentation de l’épaisseur de la peau et une légère démangeaison localisée et limitée dans le temps. Cependant, si un animal vient à dépasser les points limites fixés par la grille de score de chaque procédure expérimentale, il sera retiré de l'étude et euthanasié.
Choix des espèces
Les phénomènes à l'oeuvre dans la réaction immunitaire étudiée nécessitent deux phases distinctes, de sensibilisation et de déclenchement, et mettent en jeu différents organes et plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse inflammatoire et identifier et étudier les cibles thérapeutiques. Les souris C57BL6/J utilisées seront agés de 10 à 12 semaines afin que leur système immunitaire soit mature.