Organes sensoriels

Dépourvues de système immunitaire pour ne pas rejeter des greffons faits de cellules humaines, 540 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit sous anesthésie l'ablation d'un disque de peau de 12 millimètres sur toute son épaisseur, au milieu du dos, puis la suture d'un substitut cutané dans la plaie. Les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie, et les souris greffées vivent seules en cage quatre à cinq semaines pour qu'elles ne s'arrachent pas mutuellement les greffons. Elles sont tuées par groupes de six à 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après la greffe, et celles qui perdent trop de poids ou dont la plaie s'infecte le sont avant ces termes.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés nouvellement développés afin de sélectionner celui ou ceux qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané et la revascularisation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite d’un projet précédemment autorisé au cours duquel nous avons évalué 15 premiers substituts cutanés. Les substituts cutanés, préparés à partir de cellules humaines, seront greffés sur des souris dépourvues de système immunitaire afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront utilisés "jeunes" = dès la fin de leur préparation, "âgés" = 5 jours maximum après la fin de leur préparation, ou "cryoconservés" = après congélation et décongélation selon un mode opératoire défini en collaboration avec des chirurgiens plasticiens spécialisés en chirurgie reconstructrice de la peau. Le but est d’évaluer les différentes conditions opératoires qui seront suivies pour la réalisation des greffes cutanées chez l’Homme. Des prélèvements seront effectués à différents temps précoces et prolongés après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors des phases précoces et tardives de la cicatrisation. Les substituts cutanés nouvellement développés vont en effet permettre d’accélérer le processus de cicatrisation grâce à l’ensemble de ces interactions complexes. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser in vivo au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés nouvellement développés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. De nombreux substituts cutanés produits par biosynthèse sont aujourd’hui disponibles. Ils sont constitués de cellules humaines vivantes ensemencées sur une matrice et nourries de protéines et des facteurs de croissance nécessaires pour mieux se développer et se multiplier dans le tissu souhaité. Ils sont utilisés pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, pour les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle ou des plaies chirurgicales, les ulcères du pied diabétique…, et également les maladies génétiques de la peau. Il est donc important de tester de nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation des plaies cutanées ou le remplacement de tissu cutané.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau circulaire de 12 mm de diamètre sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des pansements et compresse changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements et la compresse et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 4 à 5 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 4 à 5 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble pansements, compresse et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Les 540 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 3, 7, 14, 30, 60 et 90 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutanée, suivant les mêmes conditions expérimentales et selon les recommandations en vigueur (5 animaux minimum par condition). La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, l'anosmie leur étant provoquée au cours du projet. Dix d'entre elles subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode dans les bulbes olfactifs, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense, puis trois interventions chirurgicales, et portent une muselière rotative sur laquelle est fixée la partie externe de l'implant. Le porteur décrit des essais menés en laboratoire, un capteur de gaz exposé à un flux d'air odorant et une stimulation électrique enregistrée dans un verre d'eau, puis conclut que le recours aux animaux est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Dépourvues de système immunitaire pour que les greffons humains ne soient pas rejetés, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carré de peau de 20 mm de côté leur est retiré sur toute l'épaisseur au milieu du dos, un substitut cutané est suturé dans la plaie, et les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur attribue un stress à l'isolement en cage individuelle pendant trois à quatre semaines, isolement qu'il impose pour éviter que les souris ne s'arrachent entre elles les greffons. Elles sont tuées par groupes de six, quinze, trente, soixante, quatre-vingt-dix et cent vingt jours après la greffe, pour prélever la peau autour de la zone greffée.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés afin de sélectionner les formulations qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané, la revascularisation et la repigmentation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite de projets précédemment autorisés au cours desquels nous avons évalué les premiers substituts cutanés sur 3 modèles de plaie cutanée différents. Les substituts cutanés sont obtenus à l’aide de la première machine automatisée au monde à produire des greffes de tissu cutané personnalisées pour les adultes et les enfants présentant des lésions cutanées graves, telles que des brûlures profondes. Ce processus innovant implique la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle. Ces substituts cutanés, produits à partir de prélèvements de peau de différents donneurs (enfant, adulte, homme, femme, peau claire, peau sombre), et sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables, seront greffés sur des souris immunodéficientes afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront préparés à partir de cellules de peau jeunes, moyennement âgées et très âgées, avec une seule ou plusieurs couches de cellules, et comprenant ou non des cellules pigmentées. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier la fonctionnalité des différents substituts cutanés greffés, les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire, la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors de la cicatrisation, et la repigmentation du tissu cutané régénéré. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps. Les résultats obtenus permettront de déterminer les paramètres optimaux pour obtenir le substitut cutané idéal en fonction de chaque donneur.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre de révolutionner les traitements actuellement disponibles pour les lésions cutanées les plus sévères et plus particulièrement les grandes brûlures. Il s’agit d’un processus innovant impliquant la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle, évitant ainsi toute forme de rejet de cette auto-transplantation, et permettant de produire une surface de nouvelle peau très importante. Il est donc important de tester ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de grandes brûlures et de larges plaies cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des compresse et pansement changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les compresse et pansement et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble compresse, pansement et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 600 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30, 60, 90 et 120 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des substituts cutanés sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur différents modèles de greffe cutanée et suivant les mêmes conditions expérimentales. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

Jusqu'à trois chirurgies crâniennes sous anesthésie générale par animal, plus vingt séances d'entraînement à associer une odeur à une récompense : 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Une électrode leur est implantée dans le bulbe olfactif, la stimulation est ensuite testée sur animal vigile pendant trente minutes, puis une IRM fonctionnelle est réalisée sous anesthésie. Une muselière rotative portant la partie externe de l'implant leur est fixée. Le porteur affirme que le recours aux brebis est "irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif et justifie le choix des ovins par des dimensions de bulbe olfactif proches de celles de l'humain et par un crâne encore assez fin entre 12 et 18 mois, ce qui rend les chirurgies plus rapides.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Tuées à la fin du protocole pour prélever leur tissu nerveux, 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une chirurgie du genou d'environ trente minutes sous anesthésie générale pour y installer une arthrose, une partie recevant en plus une injection intra-articulaire de virus destinée à supprimer un gène ou à marquer des neurones. Un groupe passe cinq semaines de tests de sensibilité cutanée et de locomotion, par séances d'environ deux heures, alors que la douleur articulaire induite dure environ huit semaines. Le porteur écrit que ces souris devenues douloureuses chroniques seront tuées à la fin de la procédure "afin de leur éviter toute souffrance inutile".

Objectifs

L'arthrose, représente la forme la plus courante de rhumatisme touchant plus de 250 millions de personnes dans le monde. L'arthrose affecte principalement les articulations du genou, des hanches, des mains, des facettes vertébrales et des pieds. L'arthrose du genou est la forme la plus fréquente et se caractérise par la dégradation du cartilage et une inflammation de l’articulation. Ces symptômes évoluent souvent lentement et s'aggravent avec le temps. L'arthrose s'accompagne également d'une perte de mobilité due à une dégradation progressive des muscles. Néanmoins, la douleur demeure le symptôme prédominant chez les patients atteints d'arthrose. Aux stades avancés, l'arthrose se caractérise par des douleurs sévères, en faisant l'une des principales causes de douleur chronique dans le monde. Étant donné l'absence actuelle de traitements efficaces pour ralentir ou inverser la progression de la maladie, la prise en charge de l'arthrose repose principalement sur le soulagement des symptômes. A ce jour, les traitements pharmacologiques disponibles sont associés à une efficacité limitée et à de nombreux effets secondaires, soulignant l'urgence d'identifier les sources et les mécanismes de la douleur associée à l'arthrose dans le but d'améliorer la qualité de vie des patients. Les contraintes mécaniques jouent un rôle critique dans la genèse de la douleur associée à l'arthrose. L'identification récente de protéines capables de détecter les stimulations mécaniques du genou a fourni les premières indications des mécanismes physiologiques responsables de la détection des mouvements dans l'articulation du genou. Un nouveau canal ionique activé par des pressions intenses a récemment été identifié, appelé TACAN, et pourrait jouer un rôle dans la douleur associée à l'arthrose. Des études ont montré qu'une diminution de son expression dans un contexte inflammatoire était associée à une augmentation des seuils de douleurs mécaniques, soutenant l'idée que TACAN est serait impliqué dans la détection de la douleur mécanique. Ce projet vise à étudier le rôle de TACAN dans l'arthrose pour mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la douleur articulaire, en vue d'améliorer les stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à élucider le mécanisme par lequel la sensibilisation de la protéine TACAN par les médiateurs inflammatoires contenus dans le liquide synovial peut induire une hypersensibilité à la douleur mécanique, contribuant ainsi aux développements des douleurs associées à l'arthrose.

Procédures

Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale afin d'induire le modèle d'arthrose. L'induction du modèle de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Le modèle d'arthrose MIA induit une douleur modérée pendant environ 8 semaines et une perte de locomotion légère liée à la douleur de l'articulation.

Devenir

Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Pour ce projet, l'utilisation de souris transgéniques permettant de cibler spécifiquement notre protéine d'intérêt. Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique.

Réduction

Le nombre de souris par groupe est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements avec une différence de 50% entre les groupes, et calculé par des tests statistiques adaptés. Nous utiliserons un nombre équivalent d'animaux mâles et femelles, selon les recommandations actuelles.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant plusieurs mâles ou femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière régulier. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé. Les animaux seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les procédures expérimentales impliquant une anesthésie se feront à l'aide d'isoflurane. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet, et seront euthanasiés en cas de points limites atteints, après consultation de la SBEA.

Choix des espèces

Les souris transgéniques utilisées dans ce projet sont les seuls animaux permettant de supprimer le gène codant pour TACAN dans les nerfs innervant le genou. Adultes (P45-200) pour comparaison avec les autres données de la littérature.

Entraînées quatre à huit semaines à associer une odeur à une récompense, rendues anosmiques, puis opérées deux heures sous anesthésie générale pour implanter une électrode dans le bulbe olfactif, 20 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit un test de stimulation du bulbe sur animal vigile et une IRM fonctionnelle sous anesthésie, l'autre moitié deux chirurgies supplémentaires d'une heure, chaque animal servant de témoin à lui-même avant et après induction de l'anosmie et portant une muselière rotative qui supporte la partie externe de l'implant. Le porteur attend des saignements de nez, des fuites de liquide céphalo-rachidien, des infections, et de la frustration en cas d'échec au test, les brebis circulant en bétaillère entre quatre établissements utilisateurs. Toutes sont tuées pour prélever leurs deux bulbes olfactifs et des biopsies d'épithélium olfactif.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4) .10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2). • 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.

Commandées à sept semaines chez un fournisseur agréé, ou nées de lignées génétiquement modifiées comparées à leurs contrôles de portée, 1 940 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever peau, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions rachidiens. Le dos est dépilé puis exposé vingt minutes aux ultraviolets sous anesthésie, et la sensibilité mécanique de la zone brûlée est mesurée dix minutes par jour sur animal éveillé. Une partie subit l'ablation des glandes surrénales sous anesthésie profonde à l'âge de quatre semaines, d'autres reçoivent du LPS pour déclencher une inflammation aiguë, de la toxine diphtérique ou du tamoxifène jusqu'à trois fois par semaine. Le porteur affirme que ces interactions entre système nerveux et système immunitaire ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, tout en annonçant l'emploi de cocultures de neurones et de cellules immunitaires déjà maîtrisées au laboratoire.

Objectifs

Lors d’un coup de soleil, les cellules immunitaires orchestrent la réparation cutanée. La peau est aussi densément innervée par des neurones sensoriels qui communiquent avec les cellules immunitaires pour optimiser la cicatrisation, puis transmettent les informations vers le cerveau. Nous avons récemment observé qu’une zone particulière du cerveau appelée hypothalamus était sollicité suite aux coups de soleils et induisait la libération de neurohormones, les glucocorticoïdes, aux propriétés anti-inflammatoires. Notre objectif dans ce nouveau projet est de caractériser comment la peau et le cerveau dialoguent pour assurer un processus de cicatrisation optimal. Notre modèle de lésion cutanée aux ultraviolets est idéal pour étudier les échanges entre le système nerveux et le système immunitaire. En effet, il permet de suivre à la fois le processus de cicatrisation et la transmission nerveuse des messages de toucher et de douleur vers la moelle épinière jusqu’au cortex cérébral. Notre équipe a déjà démontré l’importance des neurones sensoriels au cours de la réparation de la peau, cependant, comment le cerveau perçoit les lésions cutanés et y réponds, reste encore mal compris. Ainsi, le projet a pour but de répondre aux objectifs suivants : (1) identifier les étapes clés de la réparation cutanée après lésion chez des souris de type sauvage, et sa perception par le système nerveux périphérique et central. (2) Déterminer les rôles respectifs des neurones sensoriels et de l’hypothalamus dans la réparation cutanée. (3) Déterminer les mécanismes moléculaires, médiés par le cerveau, qui orchestrent la réponse immunitaires de réparation cutanée. Comprendre ces mécanismes nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les pathologies inflammatoires, prévenir les douleurs chroniques et favoriser la régénération tissulaire.

Bénéfices attendus

L’orchestration du processus de régénération tissulaire après lésion, par le système nerveux périphérique et central, reste encore très inexplorée. L’un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des cibles pharmacologiques qui pourraient simultanément soigner les pathologies inflammatoires, et prévenir les douleurs qui y sont associées. Outre son aspect fondamental, la compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents, permettrait d’identifier de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’inflammation et favoriser la réparation tissulaire tout en traitant les douleurs associées. Cette approche est particulièrement intéressante pour des personnes souffrant de défaut de cicatrisation telles que les personnes âgées ou bien atteintes de diabète. Nous proposons d’étendre nos résultats précédents à l’étude des interactions bidirectionnelles entre la peau et le cerveau. La douleur et le stress associé à une blessure (invalidité, chirurgie) constituent un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment ces deux processus modulent le système immunitaire au cours de la cicatrisation est primordial pour améliorer à terme le confort des patients, prévenir l’escalade de la douleur vers un stade chronique et approfondir notre compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour traiter la douleur inflammatoire tout en minimisant les potentiels effets secondaires.

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux ultraviolets pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons ensuite des études de comportement pour tester l’évolution de la perception de la douleur (mesure de sensibilité mécanique ; 10 min/jour) suite à l’exposition aux ultraviolets sur animaux vigiles. Plusieurs des injections à réaliser (1 min) sont faites en intrapéritonéal, en sous cutané, ou en intradermique, sur animaux vigiles. Des prélèvements sanguins seront faits sur la veine sous-mandibulaire (2 min). Certaines procédures nécessiteront une chirurgie (ablation des glandes surrénales ; 10 min) sous anesthésie profonde (45 min), après laquelle la plaie sera suturée et les souris suivies quotidiennement et traités avec des analgésiques, crème cicatrisante et anti-inflammatoires.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux ultraviolets (20 minutes) sur une petite zone de la peau du dos qui pourraient induire une perte de poids (sur 2 jours), des modifications de comportement en plus de l’inflammation cutanée. La procédure pourra aussi provoquer une sensibilité mécanique ainsi qu’un potentiel prurit (démangeaisons) au niveau de la peau irradiée. Les mesures de sensibilité mécanique (5 min.) peuvent engendrer du stress. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. Les injections, en intrapéritonéale ou sous cutanée, réalisées sur animaux vigiles peuvent générer un stress de courte durée (5 min.). Les modèles génétiques utilisés ne présentent pas de phénotypes dommageables. L’effet principal des déplétions génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (perte de sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). Le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane (5 min.) jusqu’à 3 fois par semaine, ce qui induira du stress à l’animal. De même, certaines méthodes de traçage génétique nécessiteront une injection de tamoxifène jusqu’à 3 fois par semaine. La déplétion de certaines cellules immunitaires nécessitera une injection intrapéritonéale unique de toxine diphtérique. Pour notre approche pharmacologique, les traitements (injection ou application topicale) seront effectués journalièrement pendant 4 jours sous isoflurane et pourront engendrer du stress. La procédure (No3) chirurgicale visant à enlever les glandes adrénales (20 min/souris) nécessitera un traitement pré- et post-opératoire analgésique pour minimiser la douleur et le stress des animaux avant, pendant et après la chirurgie. Les souris traitées au LPS subissent une inflammation aigue pour une période de temps très courte (6 heures) au bout de laquelle les souris seront sacrifiées et analysées. La dose utilisée (100ng/10g) n’induit pas de choc septique. Cependant, il se peut que ces souris subissent une baisse transitoires (45 min.) de leur température corporelle. Nous utiliserons un tapis chauffant (37C) ainsi qu’un milieu enrichi pour prévenir cette hypothermie avant analyse.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures et les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) seront prélevés post mortem pour analyse. Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

Le modèle animal (in vivo) est indispensable pour étudier les interactions entre système immunitaire et système nerveux sensoriel. En effet, ce sont des événements progressifs et multifactoriels qui dépendent des interactions tissulaires, cellulaires et moléculaires, localement sur le site inflammatoire mais également à distance dans les ganglions rachidiens de la racine dorsale (DRG) qui innervent la peau. Ces interactions ne peuvent pas encore être modélisées in vitro ou in silico, en particulier l’étude de l’innervation dans un tissu donné. Cependant, pour la recherche de mécanismes d’interaction neurone/cellule immunitaire ou des neuropeptides produits par ces neurones sensoriels, nous veillerons à utiliser dès que possible des techniques ex vivo déjà maîtrisées au laboratoire, telles que la coculture de neurones et de cellules immunitaires.

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de manière à limiter le nombre de souris au maximum. Sur la base de nos résultats précédents, pour une différence biologiquement pertinente, nous avons estimé que 10 souris par expérience sont nécessaires : Des groupes de 5 souris seront générés en adéquation avec l’âge, le sexe et le fond génétique contrôle à chaque lignée murine (5 souris dites « test » et 5 souris « contrôles », soit 10 souris par expérience) pour chaque procédure. Chaque expérience sera répétées au moins une fois, soit 20 souris pour chaque condition testée pour répondre aux exigences statistique. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles dans nos expériences, pour éviter de produire des animaux sans les utiliser. Tous les paramètres quantifiables seront vérifiés (poids, score d’inflammation, comportement) et tous les organes nécessaires à notre étude seront prélevés (peau, rate, et ganglion rachidien de la racine dorsale, moelle épinière et cerveau) afin d’éviter des expériences inutiles. Nous avons choisi de comparer les groupes de souris génétiquement modifiées avec leurs contrôles de portée respectifs et non avec des souris de type sauvage. Le contrôle des paramètres environnementaux et le statut sanitaire des animaux permettront de limiter la variabilité des résultats expérimentaux, et de réduire le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

Nous avons optimisé le modèle UV dans notre Apafis précédent pour minimiser le stress et la souffrance liée à la lésion tissulaire. Seule une zone tres restreinte de la peau du dos des souris sera exposée aux ultraviolets. Les animaux utilisés dans ce projet sont élevés en groupes sociaux, la présence d’objets permet le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages. L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé tous les jours. Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV. Une planification fine des procédures expérimentales est effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation d’une semaine minimum des animaux aux pièces d’expérimentation et l’animalerie) pour diminuer le stress des animaux. Notamment lors du test comportemental par Von Frey les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant les mesures pour minimiser le stress. Enfin l’établissement des points limites selon les grilles en annexe sera suivi au quotidien (vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux) pour decider de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids sera systématiquement euthanasiée. Ces stratégies seront mises en place dans le but de réduire/supprimer la souffrance animale. Les modèles génétiques, ainsi que les déplétions chimiques ne présentent pas de phénotype dommageable. Les procédures incluant une chirurgie suivront un protocole strict pour réduire la souffrance de l’animal avant, pendant et après la chirurgie. Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération et des soins pré-(Buprénorphine), per- (lidocaïne localement) et post-opératoires (Buprénorphine) adéquats sont administrés en plus de creme cicatrisante et nourriture humide pour éviter toute carences hydrique/alimentaires). Un tapis chauffant (37C) est utilisé pour éviter toute hypothermie pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la Souris et l’Homme. De plus, l’existence de modèle murins génétiquement modifiés fait de la souris un modèle animal de choix pour étudier ces phénomènes physiologiques. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et de développement du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine. Pour l’adrénalectomie, des souris de 4 semaines sont utilisées pour leur donner une période de rétablissement de 4 semaines avant induction de la lésion cutanée aux UV et étude de la réparation tissulaire.

Pour montrer qu'un implant posé sur les bulbes olfactifs peut restaurer des sensations d'odeur, 20 brebis vont être rendues anosmiques puis utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs bulbes olfactifs. Dix subissent une chirurgie de deux heures pour la pose d'une électrode, un test de stimulation de trente minutes sur animal vigile et une IRM fonctionnelle d'une heure sous anesthésie. Les dix autres passent vingt sessions d'apprentissage associant une odeur à une récompense sur quatre à huit semaines, avant une chirurgie de deux heures puis deux autres d'une heure. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"irremplaçable" pour évaluer la tolérance du dispositif, annonce des douleurs post-opératoires, des saignements de nez et des fuites de liquide céphalo-rachidien possibles, et prévoit de tuer les brebis dont les complications seraient sévères.

Objectifs

L’anosmie est une perte totale et irréversible de l’odorat. Les données épidémiologiques estiment que 10 à 15% de la population mondiale souffre d’une altération de l’odorat, et que 5% de la population mondiale est totalement anosmique. C’est un symptôme fréquent de la Covid-19, mais qui survient aussi après d’autres infections virales, ou après un traumatisme, ou qui peut être lié à des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer) ou à des tumeurs cérébrales. La plupart des anosmies sont liées à un déficit de détection des odeurs dans la cavité nasale au niveau de l’épithélium olfactif, qui a tendance à dégénérer pendant le vieillissement et dont la fonction peut être altérée dans le cas d’infections. A terme l’anosmie altère le plaisir de manger, entraîne une perte d’appétit et de poids et réduit également la capacité à détecter des dangers. Elle affecte l’humeur, la santé, le travail et le bien-être. Elle est fréquemment associée à une détérioration de la qualité de vie perturbant la relation des patients à eux-mêmes et aux autres, menant très souvent à la dépression. Et il n'existe à ce jour aucun traitement pour corriger l’anosmie. Dans la plupart des cas d’anosmie, la première structure cérébrale recevant les informations olfactives, localisée au niveau des bulbes olfactifs (BO), reste fonctionnelle. La solution thérapeutique que nous proposons, consiste en un implant olfactif combinant un nez électronique (capteur olfactif externe) et un réseau d’électrodes, placé au niveau des bulbes olfactifs pour une stimulation électrique directe mimant l’information olfactive qui arrive au niveau du système nerveux central lorsque le système olfactif est fonctionnel. L’implant olfactif est une solution prometteuse pour les patients anosmiques. Notre objectif est de développer un implant qui serait à l’olfaction ce que l’implant cochléaire est à l’audition. Une étude pré-clinique sur l’animal est un prérequis indispensable avant d’envisager une implantation olfactive chez des patients. Ce projet consiste donc à fournir une preuve de la faisabilité chez le mouton, choisi pour ses similitudes d’organisation et de taille du système olfactif par rapport à l’humain. Pour la première fois, des tests de stimulations et de comportements olfactifs générés via un implant seront réalisés sur un animal éveillé. Ce projet se déroulera dans 4 établissements utilisateurs qui y collaborent.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de développer un implant olfactif qui aidera les patients anosmiques à retrouver des sensations olfactives, et d’apporter la preuve que cette stratégie produirait effectivement des sensations reconnues comme des odeurs. Ce projet constitue une étape clé dans l'amélioration de la qualité de vie et de la sécurité de nombreux patients anosmiques qui ne récupèrent pas leurs sensations olfactives. L’impact médical attendu est la réduction des complications associés à l'anosmie (malnutrition, dépression, accidents domestiques). En outre, les modèles animaux d'anosmie montrent qu'en l'absence d'apport olfactif, les signaux nerveux liés à la respiration (et aux émotions) disparaissent. Nous souhaitons développer un nez électronique capable de rétablir à la fois la détection des odeurs la perception des saveurs et l’apport respiratoire dans le bulbe olfactif imitant la détection naturelle du flux respiratoire par les neurones olfactifs. Cette restauration aurait un impact thérapeutique sur les états dépressifs, apportant un réel bénéfice aux patients anosmiques. Le projet permettra d’évaluer une approche chirurgicale originale pour la stimulation électrique du cerveau qui pourrait en outre promouvoir la régénération des neurones olfactifs. Cela pourrait aider les patients souffrant d'un dysfonctionnement olfactif, comme lors de maladies neurodégénératives (Alzheimer, accidents vasculaires cérébraux). L’impact scientifique attendu est une meilleure compréhension de l’interprétation des odeurs par le cerveau.

Procédures

10 animaux seront soumis à : • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie pour la pose de l’électrode de stimulation, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 1 test de stimulation du bulbe olfactif, sur animal vigile, d’une durée de 30 minutes (EU1). • 1 IRM fonctionnelle par stimulation du bulbe olfactif, sous anesthésie générale, d’une durée de 1 heure (EU3). • 1 euthanasie (EU4). 10 animaux seront soumis à : • 20 sessions d’entraînement à l’association d’odeur à une récompense de quelques minutes en tout, reparties pendant 4 à 8 semaines (EU1). • 1 intervention chirurgicale, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée totale estimée à 2 heures (EU2). • 2 interventions chirurgicales, sous anesthésie générale et analgésie, d’une durée de 1H chacune (EU2).• 1 euthanasie (EU1)

Impact sur les animaux

Après les différentes interventions chirurgicales, les animaux sont susceptibles de ressentir des douleurs post-opératoires, d’avoir un léger saignement de nez, une fuite de liquide céphalo-rachidien ou une infection,. Ces risques sont considérés comme très limités étant donné les précautions chirurgicales appliquées pour toutes les interventions. Les différentes injections (analgésie, anesthésie, antalgie, antibiotiques...) réalisées au cours du projet, peuvent provoquer un léger stress lié à la manipulation de l’animal et une légère douleur liée à la piqure. Un inconfort dû aux pansements peut être également ressenti pour certains animaux au début de la phase de récupération (2 ou 3 jours), ainsi que lors du changement de ces pansements (10 minutes au maximum). Lors du test de stimulation du bulbe olfactif, les animaux seront placés individuellement dans une case de dimensions réduites, à proximité des autres brebis, ce qui peut générer un léger stress. Les entrainements au test olfactif et la manipulation des animaux peuvent entrainer du stress ou de la frustration en cas d’échec au test pour certaines brebis au début de l’entrainement. La mise en place d’une muselière rotative permettant donc de s’alimenter normalement et sur laquelle sera fixée la partie externe de l’implant olfactif des brebis, va probablement demander un temps d’adaptation aux animaux, donc un léger stress de quelques jours.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des prélèvements de tissus post-mortem : les deux bulbes olfactifs de chaque brebis, ainsi que des biopsies d’épithélium olfactif, seront réalisées sur tous les animaux afin d’évaluer, par analyses histologiques et biochimiques, la réaction inflammatoire et la perte neuronale au sein de ces tissus.

Remplacement

Le développement et le test de l’implant olfactif seront réalisés avant tout démarrage de l’expérimentation animale. Ainsi, plusieurs tests se feront en laboratoire par les ingénieurs, sans recourir à l’animal. Le nez électronique sera ainsi exposé à une simulation de flux inspiratoire amenant l’odeur test sur le capteur de gaz. La stimulation électrique découlant de la détection de l’odeur sera quant à elle effectuée dans un milieu conducteur (verre d’eau) afin d’enregistrer la réponse électrique à la stimulation olfactive. Le but ultime de ce projet étant de développer un implant olfactif, le recours aux animaux est irremplaçable afin d’évaluer la tolérance et l'efficacité du dispositif.

Réduction

Les techniques chirurgicales ont été raffinées en amont sur le modèle animal de ce projet lors de dissections post-mortem de 5 brebis destinées à la réforme, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à la mise au point de la technique. Le nombre de brebis choisis (20) a été défini sur la base des résultats obtenus sur des protocoles similaires sur brebis, qui ont montré qu’un tel effectif était nécessaire et suffisant pour mettre en évidence des différences statistiquement significatives lors des tests de comportement. Trois stratégies permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet : i) La combinaison successive des différentes approches (chirurgie, électrophysiologie, imagerie par IRM fonctionnelle, comportement) sur les mêmes animaux ; ii) l’utilisation des animaux comme leur propre contrôle, avant et après induction de l’anosmie, avant et après entraînement comportemental olfactif ; iii) la comparaison entre les deux bulbes olfactifs d’un même animal (côté implanté, versus côté non-implanté).

Raffinement

Les brebis seront hébergées en groupe pour conserver les relations sociales, s’acclimater à leurs différents environnements, avec surveillance accrue du personnel, conditions d’élevage optimisées (boisson, nourriture ad libitum, litière), enrichissements de milieu (brosses, ballons, mobiles suspendus, pierres à sel) et manipulations régulières pour les habituer aux interactions humaines et aux tests comportementaux. Les brebis soumises à des tests de stimulation électrique du bulbe olfactif ou sélectionnées pour les tests comportementaux olfactifs ne seront jamais placées en situation d’isolement. En fonction des besoins (situation post-opératoire, soins, tests, …) les animaux seront placés temporairement dans des loges d’hébergement individuelles, simplement séparés des autres par une barrière à clairevoies qui limite la taille de la loge, mais les laissent au contact visuel, olfactif, et auditif de leurs congénères. Les animaux sont habitués à ce genre de cloisonnement nécessité par certains soins (parage, prélèvements, échographies, …). Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec une gestion adaptée de la douleur et du risque infectieux ; suivi de la température ; tapis chauffant, réveil en cage individuelle, sous lampes infrarouge pour limiter l’hypothermie ; enrichissement de milieu, contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La surveillance post-opératoire implique un traitement analgésique systématique et antibiotique si nécessaire. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur basée sur les mimiques faciales. S’il y avait des complications sévères, sans alternative thérapeutique, les brebis concernées seraient euthanasiées. D’une manière générale, si une brebis montre des signes d’inconfort (prostration, manque d’appétit, arrêt des relations sociales animal/animal, soigneur/animal), un vétérinaire sera consulté et son avis sera suivi (traitements, sortie du protocole pour une situation extrême). Tous les transports/transferts des animaux entre les différents sites se feront en bétaillère agrée, paillée et toujours en groupe pour limiter le léger stress lié au transport. Des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure.

Choix des espèces

Les ovins ont été choisis car c’est une espèce dont l’organisation de la cavité nasale et les dimensions du bulbe olfactif sont quasi-similaires à celles de l’humain. Des brebis de 12 à 18 mois, c’est-à-dire ayant achevé leur puberté, et avant l’apparition d’une épaisseur d’os crânien trop importante, de manière à permettre des chirurgies plus aisées et rapides, pour une meilleure récupération des animaux.