Organes sensoriels

Tuées au plus tard une semaine après l'irradiation de leurs deux yeux, pour que les lésions vasculaires de leur rétine passent en histologie, 341 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ce troisième volet appartient à un projet réparti sur trois établissements utilisateurs. L'irradiation se fait sous anesthésie générale, précédée d'une injection intrapéritonéale, et le prélèvement de sang terminal sous anesthésie profonde. Le porteur annonce un groupe contrôle unique pour toutes les conditions d'irradiation, sans indiquer combien d'animaux le composent ni comment les 341 souris se répartissent entre les doses testées.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

Une biopsie de l'extrémité de la queue pour le génotypage, puis une injection dans l'abdomen chaque jour pendant trois jours : 876 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles sont tuées quinze jours plus tard pour que leurs deux rétines soient mises en culture, le porteur présentant ce travail sur explants comme une façon d'éviter les injections dans l'œil sur animal vivant. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi la rétine des mammifères ne se régénère pas, avec l'espoir de stratégies thérapeutiques qui n'existent pas aujourd'hui. Les souris reproductrices, elles, sont gardées vivantes et utilisées pendant toute leur période de fertilité pour fournir les animaux du projet.

Objectifs

La rétine des mammifères n’a pas de capacité d’auto-réparation en cas de maladie neurodégénérative, contrairement à certaines espèces de grenouilles ou de poissons qui ont des capacités de régénération remarquables grâce à des cellules rétiniennes appelées cellules de Müller. Cependant, ces cellules de Müller ont conservé un certain potentiel de régénération chez les mammifères. En effet, dans certaines conditions expérimentales, elles sont capables de proliférer et de régénérer des neurones rétiniens, mais de façon très limitée. Notre objectif est donc de mieux comprendre ce qui empêche ou favorise les capacités régénératives des cellules de Müller afin de pouvoir efficacement activer ces cellules et ainsi proposer des pistes thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons montré que les microglies (cellules immunitaires de la rétine) sont des régulateurs de l’activité régénérative des cellules de Müller. La voie de signalisation Notch joue un rôle crucial dans divers processus cellulaires. Cependant, sa fonction dans la microglie en lien avec la régénération rétinienne n'a pas encore été étudiée. Pour comprendre le rôle de la voie Notch dans ces cellules, nous utiliserons des explants de rétines de souris cultivés dans des boîtes de Pétri. Ce modèle nous permet d’étudier le comportement des cellules de Müller en conditions de dégénérescence rétinienne dans divers contextes (plus ou moins d’inflammation, voie Notch activée ou inhibée). À terme, ce projet vise à améliorer notre compréhension des mécanismes par lesquels la microglie régule le potentiel de régénération rétinienne des cellules de Müller.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet devrait permettre de mieux comprendre le rôle d’une voie de signalisation majeure dans la régénération de la rétine et ses liens avec le contrôle de l’inflammation. La perte de vision chez l’homme est un problème de santé publique majeur. Ainsi, à long terme, nous espérons que ce projet contribuera au développement de stratégies thérapeutiques régénératives qui n’existent pas à l’heure actuelle.

Procédures

Biopsie de l’extrémité de la queue (2mm) pour génotypage, procédure qui dure 5 secondes, 1 fois par souris. Injection intrapéritonéale qui dure moins de 30 secondes, 1 fois par jour pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

La biopsie de l’extrémité de la queue peut générer une faible douleur de courte durée. La molécule injectée peut provoquer une perte de poids. Le maintien de l’animal lors de la biopsie et de l’injection (contention) peut provoquer un peu de stress.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés 15 jours après la procédure pour permettre les analyses sur les deux rétines des souris. Les animaux reproducteurs qui permettront de générer les souris qui subiront la procédure seront gardés en vie et utilisés tout au long de leur période de fertilité pour produire des souris pour ce projet.

Remplacement

La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones et de cellules gliales dont les interactions sont cruciales et l’objet même de notre étude. Des organoïdes de rétine existent mais elles ne présentent pas de cellules microgliales. Dans ce contexte on ne peut pas se passer de l’utilisation d’animaux pour produire les explants rétiniens.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Nous utiliserons des tests non paramétriques qui permettent d’aboutir à des conclusions statistiques avec un nombre faible d’échantillons. Nous utiliserons systématiquement les deux yeux de l’animal ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Nous avons planifié les croisements de manière à utiliser tous les animaux d’une portée (dont les animaux contrôles). Pour générer les animaux qui subiront la procédure d’injection, nous utiliserons des reproducteurs tout au long de leur période de fertilité ce qui diminuera le nombre d’animaux ayant à subir le prélèvement de la queue pour génotypage.

Raffinement

Dans le but de réduire le plus possible la douleur, souffrance ou angoisse, nous utilisons des méthodes d’évaluation avec une grille de suivi et avons établi des points limites précoces pour éviter la souffrance des animaux. Pour les injections de 4-hydroxytamoxifène, nous utiliserons des aiguilles qui sont les plus fines possible pour assurer une injection efficace tout en minimisant la douleur. Durant l’injection, les animaux seront maintenus par des chercheurs entraînés à ce geste pour minimiser le stress et les animaux seront habitués au préalable à ce type de contention. Dans le cas où nous constatons une perte de poids suite à l’injection du produit, nous disposerons dans la cage un aliment spécial nommé Booster qui permettra d’enrichir le lait maternel à destination des petits non sevrés. Grâce à l’utilisation des explants, nous évitons de créer de la dégénérescence rétinienne chez des animaux vivants et nous évitons de leur faire subir des injections intravitréennes qui nécessitent anesthésie profonde et analgésie.

Choix des espèces

La connaissance approfondie du génome et de l’expression des gènes chez la souris ainsi que l’existence de nombreux animaux transgéniques en font un modèle de choix. Les rongeurs sont les animaux couramment utilisés comme modèles de pathologies humaines y compris dans le domaine de l'ophtalmologie. Il existe en effet de nombreux modèles murins présentant de manière spontanée une dégénérescence rétinienne mimant les pathologies humaines qui pourront être utilisées dans la suite du projet. De plus, notre objectif est de comprendre pourquoi la régénération rétinienne ne se fait que très peu chez les mammifères contrairement à d’autres modèles de vertébrés tels que le poisson-zèbre ou le xénope. Ainsi, bien que la voie de signalisation que nous étudions soit conservée dans le règne animal, c’est son fonctionnement particulier dans la rétine des mammifères qui est l’objet de notre étude. Nous réalisons les expériences ex vivo sur les explants rétiniens prélevés sur des souris à 1 mois qui est le stade où la neurogénèse est terminée dans la rétine mais où un potentiel de régénération est toujours présent. Ce potentiel diminue fortement à des stades plus tardifs. Pour cela, nous devons injecter le produit activateur de l’expression de nos gènes d’intérêt 15 jours avant pour permettre l’accumulation des protéines codées par les gènes induits.

Les deux yeux de chaque souris reçoivent une irradiation destinée à reproduire la rétinopathie radique, une pathologie qui peut rendre aveugles les patients traités par radiothérapie. 341 souris vont être utilisées dans ce deuxième volet du projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Toutes sont tuées au plus tard une semaine après l'irradiation, pour que les lésions vasculaires et ischémiques soient recherchées sur leur rétine. Le porteur décrit une pathologie "sévère" de l'œil comme objet du modèle, et affirme dans le même document que l'irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l'animal.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

Avant de créer un modèle de rétinopathie provoquée par les rayons, il faut régler les machines : 341 souris vont être utilisées pour caler le ciblage et la dose reçue par l'œil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une irradiation des deux yeux, puis est tué au plus tard une semaine après, après un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. Le porteur indique que l'irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate, alors que la pathologie visée conduit chez les patients à une baisse de la vision et parfois à la cécité. Le suivi clinique est annoncé tous les trois jours au maximum, de quoi repérer l'apparition de points limites.

Objectifs

Les patients exposés à des radiothérapies anticancéreuses doivent faire face à un large spectre de pathologies rétiniennes. L’objectif de notre équipe est de modéliser, grâce à plusieurs outils d’irradiation à notre disposition, les toxicités de l’œil déclenchées par l’irradiation, en particulier la rétinopathie radique, chez la souris. La rétinopathie radique est une pathologie sévère de l’œil, qui chez les patients ayant subi une radiothérapie conduit à la baisse des capacités visuelles et peut entrainer leur cécité. Malgré des techniques de radiothérapie de plus en plus précises, la rétine est encore très souvent incluse dans le champ d’irradiation et cela peut entrainer cette pathologie sévère. Le développement de nouvelles techniques de détection, notamment l’imagerie, permet aujourd’hui un dépistage facilité mais qui reste relativement tardif. Dans ce projet, nous souhaitons développer plusieurs modalités d’irradiation, afin de pouvoir définir pour chaque condition expérimentale, 1) le ciblage et 2) la quantité de dose reçue par l’oeil. Une fois ces paramètres établis, nous pourrons utiliser ces conditions optimales pour modéliser la rétinopathie radique chez la souris. Ainsi, nous pourrons la caractériser par analyses histologiques en montrant les atteintes vasculaires et ischémiques sur le long terme.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet consiste en la validation de paramètres expérimentaux qui permettront, par la suite, de développer et d’étudier un modèle de rétinopathie radique, une pathologie qui affecte les patients après radiothérapie oculaire, cérébrale et de la face. A long terme, ce projet permettra de réaliser une étude de grande ampleur afin de mieux comprendre la physiopathologie de ces lésions rétiniennes dans le contexte de l’irradiation ; et d’identifier des traitements pouvant en limiter la progression.

Procédures

Chaque animal recevra une irradiation des deux yeux (excepté les animaux contrôles) au cours de ce projet. La mise à mort aura lieu au maximum une semaine après cette irradiation, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale, avant une surdose médicamenteuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront anesthésiés par injection intrapéritonéale (pour l’induction chimique). Cette injection entraîne une douleur légère de courte durée. L’irradiation seule ne provoque pas de nuisance immédiate chez l’animal mais peut engender un léger stress notamment lors de la contention pour l’anesthésie. Les déplacements vers l’irradiateur pourront provoquer un certain stress chez les animaux mais il sera de courte durée et il n’y aura pas de modifications des groupes sociaux. Le prélèvement de sang terminal sera réalisé sous anesthésie générale profonde.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour analyse histologique afin d'étudier les atteintes vasculaires et ischémiques.

Remplacement

Depuis de nombreuses années, notre équipe a développé de nombreux modèles de culture cellulaire afin de pouvoir étudier les effets de l’irradiation dans ces modèles in vitro. Ces modèles 2D ont été récemment complétés par le développement de modèles 3D complexes. Ces modèles 3D permettent de recréer des conditions tissulaires tout en limitant l’utilisation d’organismes vivants et de tester les effets d’irradiation, et ainsi de cribler certaines conditions expérimentales pour prédire les effets in vivo.

Réduction

L’utilisation des modèles in vitro 2D et 3D permet d’optimiser le design expérimental de nos études in vivo, et ainsi de limiter l’utilisation des animaux à leur strict nécessité. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, certains tests seront réalisés sur cadavres (conservés dans cet objectif) : validation de set-up (positionnement de l’animal), mesure de doses (à l’aide de sonde de mesure/chambres d’ionisation). Ainsi les mesures pourront être répétées à plusieurs reprises sans utilisation d’animaux supplémentaires. Une étude bibliographique a été réalisée afin d’optimiser la mise en place de notre modèle. Celle-ci nous a permis d’affiner les doses qui seront testées, mais également de valider le nombre d’animaux utilisés par groupe expérimental. En outre, un seul groupe d’animaux non irradiés sera utilisé comme groupe contrôle pour l’ensemble du projet et des conditions d’irradiation, afin de réduire l’utilisation des animaux au maximum. Enfin, comme lors de nos études précédentes, nous procéderons à une analyse statistique après chaque expérience, et l’expérience sera reproduite uniquement si la significativité (p< 0.05) n’est pas encore atteinte.

Raffinement

Les animaux seront hébergés selon des conditions d’hébergements réglementaires au sein de l’établissement utilisateur, à savoir : hébergement en groupe sociaux dans des cages de taille conforme sur portoir ventilé (avec hygrométrie, température et cycle jour/nuit 12h/12h contrôlés). Les animaux auront de l’eau et de la nourriture à disposition à volonté et auront également à disposition dans les cages, 2 éléments d’enrichissement à minima : papier kraft pour la constitution du nid, tunnel en polycarbonate rouge et/ou maison en cellulose pour l’abri. Les transports vers les irradiateurs seront anticipés au maximum pour laisser un temps d’acclimatation aux animaux. Les animaux recevront les mêmes conditions d’hébergements (cages identiques ou plus grandes, maintien de l’enrichissement et suivi de la sciure usagée pour limiter au maximum le stress lors de ces déplacements). Les irradiations seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse ou fixe. Les mises à mort seront réalisées sous anesthésie profonde. Le suivi clinique approfondi des animaux sera fait tous les trois jours maximum post-irradiation, ce qui permettra d’évaluer l’apparition de points cliniques limites.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal le plus répandu dans l’étude des rétinopathies vasculaires, et a fait l’objet de nombreuses études et publications scientifiques. Ce modèle est peu coûteux et facilement maintenu en captivité. Nous avons également à notre disposition différents modèles de souris à comparer sur la mise en place de cette pathologie : souris sauvages ou génétiquement modifiés afin d’étudier l’impact de l’angiogénèse sur la rétinopathie radique. Enfin, nous disposons d’irradiateurs adaptés à la souris et permettant l’étude de nouvelles modalités d’irradiation encore en développement chez l’homme. Les études seront menées sur jeunes adultes matures, c’est-à-dire des animaux de 6-8 semaines au moment de l’irradiation. Ce stade est privilégié car nous devons disposer d’un réseau vasculaire formé et mature. L’impact du vieillissement (souris agées) fera l’objet d’une étude ultérieure.

Un fragment de queue de moins de cinq millimètres est coupé aux ciseaux au moment du sevrage, et les phalanges sont tatouées pour identifier chaque animal. 5 200 souris vont être utilisées dans cet élevage de douze lignées génétiquement modifiées, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus faible. Le porteur décrit pourtant une rigidification progressive de la peau à partir de quarante semaines, avec perte de mobilité et démangeaisons, et, chez les lignées dépourvues de certaines cellules immunitaires, des infections pouvant évoluer vers une dégradation brutale de l'état général et une atteinte sévère de l'organe touché. Les souris de mauvais génotype sont tuées immédiatement, les reproductrices deux mois après leur dernière portée, les autres à vingt ou trente semaines selon le sexe, et celles qui conviennent partent vers d'autres protocoles expérimentaux.

Objectifs

Ce projet explore le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau en condition normale et au cours des maladies inflammatoires cutanées. Ces maladies, dont les causes sont mal connues, sont caractérisées par l’apparition d’une inflammation et d’une modification de la structure de l’organe. Ceci affecte la peau notamment, mais aussi possiblement d’autres organes comme les poumons, le cœur et les reins. Une dérégulation du système immunitaire est aussi souvent associée à cette maladie. Dans ce contexte, nous souhaitons utiliser des lignées de souris comme modèle d’étude de l’inflammation cutanée et les combiner avec des lignées de souris dépourvues de certains types de cellules immunitaires ou au contraire nous permettant de suivre ces cellules dans les souris. L'objectif de ce projet est donc la description des élevages de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées, des méthodes d’identification (tatouage aux phalanges) et de détermination des gènes modifiés par technique invasive (biopsie de queue) en deux temps nécessaires à la préservation de l’intégrité des oreilles (organe d’intérêt pour nos expériences), ainsi que des méthodes de raffinement mises en place. Les animaux produits dans ce projet seront utilisés dans d’autres projets de recherche fondamentaux mais aussi à visée thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre l’élevage des lignées de souris nécessaires pour étudier le rôle des cellules du système immunitaire dans la régulation de l’inflammation de la peau et comment ces cellules, lorsque dérégulées, peuvent participer à l’apparition de modification de la structure de la peau. Au-delà des aspects de recherche fondamentale, l’utilisation de ces lignées de souris pourraient nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour aider les patients souffrant de ce type maladie.

Procédures

Ce projet consiste en l'élevage de 12 lignées de souris génétiquement modifiées utilisées comme modèles d’étude de maladies inflammatoires de la peau et/ou dépourvues de certains types de cellules du système immunitaires. Un fragment de tissu sera prélevé au niveau de la queue (moins de 5mm) au moment du sevrage (à 3-4 semaine, âge de séparation d'avec la mère) à l’aide de ciseaux préalablement désinfectés (durée du geste: 10 secondes) pour déterminer les gènes modifiés dans chaque souris.

Impact sur les animaux

La coupure d’un bout de la queue nécessite de tenir les souris, source de stress, et peut conduire à un léger saignement. Le développement progressif des modifications de la structure de la peau peut entrainer un inconfort pour les souris et une perte de mobilité (phénomène observé 40 semaines après la naissance) dû à la rigidification progressive de la peau ; ainsi qu’une réaction inflammatoire locale source de démangeaison. L’absence de certains types de cellules du système immunitaire peut peut augmenter la vulnérabilité aux infections par des microbes, qui restent cependant très rare en condition d’élevage dans les laboratoires, puisque l’atmosphère est contrôlée pour éviter l’entrée des microbes. Dans certains cas les signes cliniques restent modérés, mais l’infection peut évoluer rapidement vers une dégradation brutale de l’état général, un amaigrissement et une réduction musculaire marquée, et une atteinte sévère de l’organe atteint puisque les souris ne sont pas capables de se débarrasser de l’infection.

Devenir

Les souris produites au cours de ce projet seront soit incluses dans d’autres protocoles expérimentaux, soit utilisées ou stockées pour générer de nouveaux accouplements. Les souris ne présentant pas les bonnes modifications de gènes seront immédiatement euthanasiées. Les souris utilisées pour des accouplements seront euthanasiées lorsqu'elles n'auront plus donné de portées depuis 2 mois. Les souris stockées pour de futurs accouplements seront euthanasiées lorsqu’elles seront âgées de plus de 20 semaines pour les femelles et de plus de 30 semaines pour les mâles (souris trop âgées pour être utilisées en accouplement).

Remplacement

L’étude à l’échelle du tissu et de l’organisme est indispensable pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent l’inflammation de la peau au cours des maladies inflammatoires de la peau. Cette approche globale et intégrative nécessite l’utilisation de modèles animaux qui ne peuvent être totalement remplacés par des approches in vitro. Cependant, dans les études que nous menons, des techniques alternatives (cocultures cellulaires, organes-sur-puce) sont largement employées et remplaceront l’utilisation d’un modèle animal dans la mesure et autant que possible. Ces techniques in vitro permettent de reconstituer dans des boites de culture au laboratoire des organes ou partie(s) d’organes en utilisant différents types de cellules afin d’étudier certains mécanismes sans utiliser d’animaux.

Réduction

Nous adapterons l'élevage au besoin des projets de recherche de l’équipe. Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées de souris en termes de nombre et taille des portées, ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Une attention particulière sera portée à génotyper et sélectionner les animaux de génotypes d’intérêt dès le sexage pour former les groupes expérimentaux dès le sevrage.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel. Ils seront hébergés en portoirs ventilés réglés avec une surpression (nourriture irradiée conditionnée en double emballage) et leur manipulation se fera systématiquement sous une hotte afin d'éviter leur contamination par des microbes. Les souris seront surveillées quotidiennement (par les animaliers) et une fois par semaine par les expérimentateurs afin de détecter des signes de souffrance liés à l’apparition progressive des modifications de la structure de la peau et/ou d’une infection en tenant compte de leur apparence et de leur comportement (activité/mobilité spontanée des souris sans manipulation/attitude prostrée). En cas de suspicion de dégradation de l’état de la souris, une stimulation de la souris (main dans la cage pour entrainer le déplacement de la souris) sera faite afin de vérifier sa mobilité, et d’identifier des réactions de défense/agressivité, signes de douleur). Les contrôles cliniques seront alors rapprochés (tous les 2 jours) et en cas de dégradation de l'état général, la souris sera immédiatement euthanasiée. Des contrôles sanitaires (3 à 4 fois par an) permettront de s'assurer du maintien de la barrière et de l'absence d'agents pathogènes dans leur pièce d'hébergement. Concernant la méthode pour déterminer les gènes modifiés dans les souris et qui nécessite de couper un petit bout de la queue des souris, nous surveillerons dans les minutes qui suivent le prélèvement l'absence de saignement. Dans le cas contraire, une compression sera réalisée afin de favoriser la coagulation sanguine.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. Les modèles murins de maladies inflammatoires de la peau sont largement décrits dans la littérature scientifique. Ils sont robustes et reproductibles et représentent d’excellents modèles des pathologies humaines. De plus, la bonne connaissance des modèles murins, notamment d’un point de vue génétique, permet le développement d’outils (souris génétiquement modifiées) permettant l’étude du rôle des cellules du système immunitaire in vivo, en prenant en compte le microenvironnement tissulaire. Enfin, nous avons une bonne connaissance du comportement de la souris et la possibilité de les prendre en charge facilement. Les souris seront mises en accouplement entre 6 et 8 semaines d’âge (maturité sexuelle), sans dépasser 20 semaines pour les femelles et 30 semaines pour les mâles au début du croisement.