Organes sensoriels

Implantation d'un casque sur le crâne sous anesthésie, port prolongé d'un cache ou d'une lentille, treize anesthésies gazeuses en trois semaines, une heure d'anesthésie par injection pour l'électrorétinographie : 330 souris vont être utilisées, dont 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'étant génétiquement modifiées elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction, et leurs yeux sont prélevés. Le projet cherche à comprendre le rôle d'un gène dans la cécité nocturne congénitale stationnaire, maladie qui s'accompagne souvent d'une forte myopie. Un test comportemental est annoncé, décrit seulement comme un "changement de milieu sur une courte durée", sans que sa nature soit précisée.

Objectifs

La cécité nocturne congénitale stationnaire (CNCS) est un groupe de pathologies rétiniennes cliniquement et génétiquement hétérogène. La plupart des personnes atteintes ont une acuité visuelle basse, associée à des difficultés d’orientation en condition de faible luminosité. De nombreux patients présentent également d’autres anomalies oculaires telles qu’une forte myopie (inférieure à moins 6 dioptries), un strabisme ou un nystagmus. Parmi les différentes formes de CNCS, la forme complète, CNCSc, se caractérise par un dysfonctionnement de la transmission du signal entre les photorécepteurs et une classe de cellules bipolaires. Ce mécanisme n’est actuellement toujours pas bien compris. Dans ses études précédentes, notre équipe a identifié que des mutations dans différents gènes étaient associés à la CNCSc. Nous avons aussi pu mettre en évidence que les modèles murins de CNCSc présentent des déficiences génétiques communes dans certains gènes. Le rôle précis de ces gènes dans la rétine et leur impact sur la CNCSc et la myopie sont encore mal connus. Dans ce projet, nous proposons d’élucider le rôle de l'un de ces gènes par une analyse fonctionnelle in vivo et ex vivo d’un modèle de souris privée dudit gène

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire est une maladie visuelle handicapante provoquant des symptômes variés pour laquelle aucun traitement n’existe à ce jour. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) plus 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) plus Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Certains animaux seront soumis à un test comportemental impliquant un changement de milieu sur une courte durée. Anesthésie par injection le jour de l’électrorétinographie (une fois/animal, pendant une heure). Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). Les animaux seront répartis en 3 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe se verra analysé par électrorétinographie, le troisième groupe verra son environnement lumineux changé.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront soumis à des contentions manuelles répétées et relativement longues, entrainant un stress. Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-œil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Durant les tests comportementaux, certains animaux seront placés sur une plateforme durant une heure. L’arrivée dans un milieu inconnu peut stresser l’animal. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés selon la procédure réglementaire car il s'agit d'animaux OGM ne pouvant être réutilisés pour d'autres projets ou pour l'accouplement. De plus les yeux des animaux seront récupérés pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie ainsi que la caractérisation phénotypique nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir des yeux en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique. Aucune étude n’a montré d’influence claire du sexe sur la Cécité Nocturne Congénitale Stationnaire et la myopie. Nous allons utiliser les animaux mâles et femelles indistinctement. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés, possédant donc le gène testé sur leurs 2 chromosomes. Nous comparerons aussi les résultats avec des animaux contrôles hétérozygotes afin de renseigner le potentiel impact de la perte du gène sur un chromosome. Le nombre d’animaux indiqué dans chaque procédure a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (taux de réussite des expériences), des contraintes de contrôles. Nombre total d’animaux nécessaires : 330 animaux.

Raffinement

Les animaux utilisés naîtront et seront hébergés en animalerie extérieure jusqu’à expérimentation. Ils seront alors hébergés dans notre animalerie où ils observeront une période d’acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 au maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés des animaleries seront conformes aux normes réglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site web commun. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’œil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’œil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents. Certaines expériences consistent en la caractérisation phenotypique (ie les symptômes)des animaux, nous travaillerons sur des animaux sur 2 stades adultes différents (6 semaines, 6 mois) pour documenter un possible phénotype progressif.

700 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à dix anesthésies gazeuses en trois semaines, trois contentions manuelles de dix minutes et trois semaines d'isolement en cage individuelle. 540 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance modéré, et toutes sont tuées pour prélèvement des rétines. Trois ou quatre jours après leur naissance, une partie reçoit une injection de virus dans le sang, éveillée, puis un dispositif à lunette est implanté par une chirurgie de 45 minutes pour provoquer la myopie. Le porteur annonce des douleurs aiguës aux injections, des pertes de sang et des infections possibles après chirurgie, et de l'agressivité liée à l'isolement, en regard d'un bénéfice formulé comme une meilleure compréhension des mécanismes de la myopie.

Objectifs

La myopie implique des questions optiques, génétiques, mais aussi neuronales. La rétine, tapissant le fond de l’œil, est un réseau de neurones connectés de manière complexe et dont la fonction est impactée par la lumière environnante. La rétine est donc l’acteur responsable de la réception et transformation du signal lumineux en signal nerveux. Les études précédentes montrent que la rétine est impliquée dans la croissance de l’œil et l’apparition de la myopie, notamment en repérant le manque de contraste. La rétine peut donc capter le flou lumineux et envoyer aux tissus voisins les messagers chimiques nécessaires à l’accélération ou l’arrêt de la croissance de l’œil. Les mécanismes précis par lesquels la rétine y parvient sont encore sujets à débat. Durant ce projet, nous étudierons les mécanismes rétiniens intervenant dans le développement de la myopie. Ce projet a pour objectif de vérifier l’hypothèse selon laquelle une modification de l’activité neuronale de certains neurones rétiniens spécifiques a un impact sur l’apparition de la myopie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie, qu’elle soit syndromique ou non. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcents sera atteint d’une forte myopie). Une myopie forte peut entrainer des complications telles que des glaucomes et détachements rétiniens pouvant mener à la cécité. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant la myopie permettrait de proposer des traitements plus précoces, moins invasifs que l’opération chirurgicale.

Procédures

Certains animaux se verront administrer un virus non pathogène à un âge très précoce via une injection dans la circulation sanguine (une fois par animal), ce geste dure 5 minutes et est effectué sur animal vigile Certains animaux seront soumis à une technique chirurgicale consistant en l’implantation d’un dispositif à lunette par chirurgie effectuée sous anesthésie générale et locale avec prise en charge de la douleur avant/pendant/après la chirurgie (une fois par animal), ce geste dure 45 minutes. Les animaux seront soumis à des anesthésies gazeuse répétées (10 fois maximum par animal, étalées sur 3 semaines, chacune durant 10 minutes maximum). Certains animaux seront placés en hébergement individuel pendant 3 semaines. La myopie sera mesurée par des techniques d'imagerie et de réfractométrie non invasive mais pouvant nécessiter l'anesthésie de l'animal. Certains animaux verront leur condition d’hébergement modifiées : des flashs lumineux réguliers leur seront soumis. Contention manuelle prolongée et répétée : 3 fois/animal pendant 10 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les injections peuvent entrainer des douleurs aigues. Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Les anesthésies répétées peuvent causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Le port prolongé du dispositif implanté peut induire une gêne et un assèchement oculaire. De nombreux animaux seront isolés, avec un enrichissement réduit, ce qui peut induire un stress caractérisé par de l’agressivité. Enfin, les animaux seront placés en cage à illumination contrôlée, dans lesquelles une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement sera imposée.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés selon la méthode réglementaire et les rétines seront récupérées pour analyses post-mortem.

Remplacement

L’induction de la myopie nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, cristallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir un oeil en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littérature scientifique et nos expériences passées. De plus, nous utiliserons uniquement des animaux issus d’accouplements homozygotes. Ainsi, nous éviterons les faux/mauvais génotypes et pourrons contrôler exactement le nombre d’animaux à naître et à faire passer dans les procédures. Les accouplements seront contrôlés pour éviter les naissances d'animaux en trop. Les résultats seront soumis aux tests statistiques adéquates. Le nombre d’animaux nécessaire est obtenu en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques et des contraintes de contrôles. De plus, nous nous sommes basés sur la littérature scientifique préexistante et nos expériences passées. Nombre total d’animaux nécessaires : 700

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet naîtront et seront hébergés dans notre animalerie. Des couples seront achetés puis seront hébergés dans notre animalerie. Les animaux en provenance de l'extérieur observeront une période d'acclimatation de 5 jours avant toute manipulation. Les accouplements seront constitués d’un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevrés à 21 jours après la naissance. Les paramètres environnementaux contrôlés de l’animalerie sont : cycle 12h jour – 12h nuit, hygrométrie 55 pourcent plus ou moins 10 pourcent et une température 22 degrés celsius plus ou moins 2 degrés celsius. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. Les animaux adultes seront placés à 5 maximum par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à manipuler les animaux. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Les informations concernant les animaux seront mutualisées sur un site internet commun. Des points limites précoces et suffisament prédictifs ont été mis en place pour épargner aux animaux toute douleur ou détresse évitable.

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin de modèles génétiques particuliers présent uniquement dans cette espèce. De plus, les méthodes d’induction de myopie sur ce modèle sont bien renseignées et validées par la communauté scientifique. L’induction de la myopie est bien plus efficace si elle commence lorsque l’œil est encore en phase de croissance critique, au cours du développement de l'animal. Nous devons stimuler les neurones étudiés en parallèle de l’induction de myopie. Il est donc nécessaire que la construction virale ait eu le temps de s’intégrer au génome de l’animal avant l’induction de myopie. Les virus peuvent mettre 3 semaines à s’intégrer au génome, raison pour laquelle nous devons procéder à l'infection par la construction virale 3 ou 4 jours après la naissance afin de laisser le temps au virus de s'exprimer avant d'induire la myopie.

Un casque est implanté sur le crâne sous anesthésie, puis une lentille ou un cache posé devant l'œil pour forcer la myopie. Suivent jusqu'à treize anesthésies gazeuses en trois semaines pour nettoyer les lentilles et passer les scanners, et une contention manuelle de dix minutes par semaine pendant six semaines. 280 souris porteuses d'une rétinopathie pigmentaire vont être utilisées ainsi, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie hébergée seule et une autre placée en lumière basse. Toutes sont tuées à la fin, le porteur précisant qu'étant génétiquement modifiées elles ne peuvent être ni réutilisées ni mises à la reproduction, et leurs yeux sont prélevés.

Objectifs

La myopie implique des questions optiques, génétiques, mais aussi neuronales. La rétine tapisse le fond de l’œil et est un réseau de neurones connectés de manière complexe et dont la fonction est impactée par la lumière environnante. La rétine est donc l’acteur responsable de la réception et transformation du signal lumineux en signal nerveux. Les études précédentes montrent que la rétine est impliquée dans la croissance de l’œil et l’apparition de la myopie. Les mécanismes précis d’apparition de la myopie ne sont pas encore totalement compris. Ainsi, nous proposons d’utiliser un modèle de souris présentant des déficiences rétiniennes afin de mieux comprendre ces mécanismes. La Rétinopathie Pigmentaire (RP) est une maladie d’origine génétique causant la cécité par la dégénérescence des photorecepteurs. Les patients atteints de RP développent aussi une forte myopie. Il nous a paru intéressant d’étudier les mécanismes communs à ces deux pathologies. Ce projet vise à proposer des pistes concernant les mécanismes impliqués dans la myopie liée à la RP en mesurant divers paramètres liés à la myopie dans le modèle animal de RP

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet incluront une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires menant à la myopie et à la Rétinopathie Pigmentaire. La myopie étant l’affection oculaire handicapante la plus courante actuellement et avec une incidence en constante augmentation (les prédictions nous disent que la moitié de la population mondiale sera myope d’ici 2050, et 10 pourcent sera atteint d’une forte myopie). La Rétinopathie pigmentaire mène à la cécité en quelques années. Une meilleure compréhension des mécanismes induisant ces pathologies permettrait de proposer des traitements plus précoces, plus efficaces et moins invasifs que ceux déjà existant.

Procédures

Pour induire et étudier la myopie, une technique chirurgicale, effectuée sous anesthésie et analgésie, se résumant par l’implantation d’un casque sur le crâne de certains animaux est nécessaire. Pour mesurer la myopie : contention manuelle régulière et répétée de certains animaux: une fois par animal et par semaine pendant 6 semaines au total, 10 minutes par animal maximum à chaque fois. Anesthésies gazeuses répétées: Une anesthésie le jour de la chirurgie (durant 45 minutes maximum) plus 3 anesthésies maximum par semaine pour le nettoyage des lentilles et des yeux des animaux (10 minutes maximum/animal) plus Anesthésies le jour des scanners (3 fois, 15 minutes par animal maximum) soit 13 anesthésies maximum sur 3 semaines. Modification de l’environnement lumineux de certains animaux : abaissement de la luminosité pendant 4h à un niveau dit « de lumière basse). En résumé , les animaux seront répartis en 2 groupes distincts : le premier groupe se verra induire et mesurée la myopie, le deuxième groupe verra son environnement lumineux changé pendant 4h.

Impact sur les animaux

Certains des animaux seront soumis à des chirurgies : Les techniques chirurgicales peuvent mener à des pertes de poids, des infections, douleurs post-opératoire, perte de sang. Ces mêmes animaux subiront des anesthésies gazeuses répétées pouvant causer un risque léger d’hypothermie, d’insuffisance respiratoire et arrêt cardiaque. Port du cadre à lunette: qu’il s’agisse du cache-oeil ou d’une lentille, le port prolongé de l’appareil peut induire une gêne et un assèchement oculaire. Certains animaux seront placés en hébergement individuel, ce qui peut entraîner des détresses sociales. Une partie des animaux seront utilisés dans le cadre de différents tests fonctionnels afin de caractériser le modèle qui implique soit une immobilisation manuelle pouvant induire un stress soit une anesthésie par injection d’anesthésiques pouvant induire un stress thermique ou des risques cardio-respiratoires. L’un de ces tests peut entrainer une cataracte temporaire. Enfin, certains animaux seront placés en illumination contrôlée sont dans une ambiance lumineuse différente de celle de leur hébergement. L’enrichissement sera réduit pendant cette procédure, ce qui peut induire un stress.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés à la fin des expériences car il s'agit d'animaux OGM et que nous ne pourrons les réutiliser pour des accouplements ou d'autres projets. L'euthanasie sera effectuée selon la méthode réglementaire. Les yeux des animaux seront ensuite prélevés pour études histologiques et de biologie moléculaire

Remplacement

L’induction et l’étude de la myopie nécessite un œil complet, en 3D, avec sa rétine et ses tissus environnant (Choroïde, Sclère) ainsi qu’un trajet optique complet (cornée, lentille, crystallin, iris, humeur aqueuse). Aucune méthode alternative ex vivo ne permet d’obtenir des yeux en 3D.

Réduction

Afin de générer le moins d’animaux possible, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaires pour le projet en nous basant sur les données de la littértature scientifique. La Retinopathie Pigmentaire (RP) étant une pathologie liée à l’X, le phénotype peut différer selon le sexe. Nous allons donc devoir distinguer les animaux mâles des femelles. Nous utiliserons comme témoins des animaux contrôles non modifiés (appelés WT) et les comparerons aux animaux modélisant la RP. Les résultats seront soumis à des tests statistiques standards qui nécessitent de répéter plusieurs fois chaque expériences sur des animaux distincts. Le nombre d’animaux indiqué dans le projet a été estimé sur la base d’expériences similaires effectuées dans notre équipe et en tenant compte des contraintes statistiques (nombre d’échantillon par groupe), des contraintes techniques (taux de réussite des expériences ). Nombre total d’animaux nécessaires : 280 animaux

Raffinement

Les animaux utilisés dans ce projet naîtront et seront hébergés dans des animaleries agrées. Les animaux en provenance de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours sera observée si nécessaire. Pour les accouplements, les parents seront placé un mâle avec deux femelles. Les nouveaux-nés seront sevré à 21 jours après la naissance. Les animaux adultes seront placés à 5 max par cage (hors accouplement), possèderont une maison et des morceaux de cellulose ainsi que des morceaux de bois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les paramètres environnementaux contrôlés de l’animalerie sont conformes aux normes rêglementaires. De l’hydrogel nutritif sera mis à disposition si nécessaire. De l'enrichissement sera implémenté: maisons, nids, morceaux de bois. Seul le personnel qualifié en zootechnie sera habilité à gérer l’hébergement des animaux. Seul le personnel compétent dans la manipulation des animaux sera autorisé à manipuler les animaux. Seul du personnel formé aux techniques chirurgicales du petit animal sera autorisé à procéder aux techniques chirurgicales. Le personnel de zootechnie change les cages chaque semaine et sera en charge de la surveillance de la santé des animaux. Une communication rapide entre les chercheurs et les membres de la zootechnie est assurée par la proximité géographique entre l’animalerie et le laboratoire et permettra une prise de décision rapide en cas de problème de santé des animaux. Les procédures nécessitant une anesthésie et/ou l’application d’analgésiques seront effectuées par du personnel habilité. Un système d’étiquettes et de pastilles assurera le suivi du bien être des animaux. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs permettant de limiter toute douleur inutile aux animaux ont été mis en place

Choix des espèces

Nous utilisons le modèle souris car nous avons besoin d’un modèle génétique particulier qui n’existe que dans cette espèce. Certaines expériences visent à étudier le développement naturel de l'oeil. Le développement de l'oeil se mesure par réfractométrie. Les mesures de réfractométrie ne commencent à être fiables qu’à partir de 3 semaines d’âge, lorsque l’animal est sevré. Avant cela, l’oeil est trop petit. En général, le développement de l'oeil des souris se termine autour de 6 semaines d’âge. Pour nous assurer d’avoir dépassé la période critique du développement, nous poursuivrons la mesure du développement jusqu’à 9 semaines d’âge. Certaines expériences nécessitent d'induire la myopie. L’induction de la myopie est plus efficace si elle débute entre 3 et 4 semaines d'âge car l’oeil y est encore en phase de croissance critique. Certaines expériences consistent en la mesure post-mortem des taux de dopamine rétiniens. Pour éviter tout impact de la croissance de l'animal sur la mesure de Dopamine, nous effectuerons l’expérience à l’âge adulte. Dans un souci de cohérence, nous nous fixons sur 80 jours après la naissance car il s’agit de l’âge auquel nous avons fait des analyses similaires lors de projets précédents.

Applications répétées de molécules irritantes sur la peau, blessures cutanées, inoculations virales, gavages, injections intrapéritonéales et chirurgies de trente minutes : 3 579 souris vont être utilisées, dont 3 425 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Neuf protocoles s'étalent sur huit semaines, certains animaux étant anesthésiés à l'isoflurane jusqu'à cinq fois par semaine. Le porteur écrit que les souris génétiquement modifiées utilisées ici le sont "sans nuisances", leur principale modification étant une sensibilité à la douleur diminuée, et attribue les seules nuisances aux modèles d'inflammation. Toutes sont tuées à la fin, peau, ganglions nerveux, cerveau, moelle épinière, rate et ganglions lymphatiques étant prélevés.

Objectifs

En réponse à une coupure, une dermatite ou une infection virale, le système immunitaire déclenche une réponse inflammatoire locale impliquant le recrutement de cellules immunitaires. Cette action du système immunitaire protège des infections, mais peut aussi promouvoir la réparation et la cicatrisation. La peau, barrière de protection et tissu de contact avec l’environnement externe, est aussi innervée de capteurs sensoriels. Ces neurones sensoriels sont localisés dans les ganglions nerveux spinaux (DRG), près de la colonne vertébrale. Ils disposent de longs axones qui s’étendent jusqu’à la peau ce qui leur permet de détecter des stimulations telles que la chaleur, le froid, le toucher. Ils envoient ensuite cette information par signal électrique jusqu’au cerveau, pour déclencher des sensations variées, du plaisir à la douleur. Les neurones sensoriels sont très hétérogènes, et c’est leur diversité qui permet de détecter différentes stimulations pour déclencher des sensations distinctes. En cas d’inflammation ou de blessure de la peau, ces neurones sont activés et peuvent déclencher douleurs, inconfort ou démangeaisons, et ils participent à la défense et à la réparation de l’organisme. En revanche, on ne sait pas encore quel est le rôle précis des différents types de neurones dans ces interactions complexes. De plus, les parties du cerveau activées par ces neurones dans ces situations ne sont pas connues. Le but de ce projet est de déterminer le rôle des différents sous types de neurones sensoriels dans le cadre d’une inflammation de la peau.

Bénéfices attendus

L’inflammation en général, et les douleurs chroniques associées à l’inflammation (hypersensibilité, démangeaisons), sont encore imparfaitement comprises, et les traitements sont à la fois peu nombreux et comportent des risques de dépendance (ex : opioïdes). Ce projet vise à identifier les neurones sensoriels impliqués dans les douleurs associées à l’inflammation. Un des avantages majeurs de la neuro-immunologie est d’identifier des possibilités de traitements qui pourraient simultanément soigner la pathologie, et limiter les douleurs qui y sont associées. Par ailleurs, notre approche permet de cibler les neurones sensoriels de manière plus précise que ce qui a été fait par le passé, pour mieux comprendre comment sont générées les sensations, mais également dans l’optique de développer des thérapies plus précises en cas de dysfonctionnements. Enfin, les parties du cerveau qui traduisent les diverses stimulations en sensations sont encore mal connues, et notre approche apportera des éléments nouveaux dans ce domaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à des modèles d’inflammation cutanée, avec réponse immunitaires localisées, qui seront suivis pendant une à trois semaines sur ces souris. Plusieurs injections seront réalisées sur les souris, selon les règles éthiques en vigueur. Des injections intrapéritonéales et sous cutanées se feront sur souris immobilisées en vigiles et prennent une dizaine de seconde par animal. Des gavages oraux sont aussi réalisés sur certaines souris immobilisées et prennent jusquà 20 secondes par animal. Les injections intrapéritonéales et les gavages sont espacés d'au moins deux jours. L'application cutanée de molécule irritantes, ou la création d'une blessure cutanée, se feront sous anesthésie et prennent jusqu'à une minute par souris. Un prélèvement sanguin pourra être réalisé sur certains animaux immobilisés en vigiles, et prennent jusqu'à une minute par animal. Certaines procédures nécessiteront une chirurgie sous anesthésie, après laquelle la plaie sera suturée, et la souris traitée avec un antalgique immédiatement après et surveillée quotidiennement pour s’assurer de son rétablissement. Le temps estimé pour ces procédures chirugicales est estimé à 30 minute par animal, à la suite de quoi l'animal est maintenu sous surveillance jusqu'à son réveil. La procédure 2 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d'une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 3 requiert 1 injection intrapéritonéale, trois gavages, un prélèvement sanguin, et 7 applications cutanée d'une molécule inflammatoire, sur une durée de 8 semaines. La procédure 4 requiert 6 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une blessure cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 5 requiert 5 injections intrapéritonéales, trois gavages, un prélèvement sanguin, et une inoculation virale cutanée, sur une durée de 8 semaines. La procédure 6 requiert une inoculation virale cutanée, 5 injections intrapéritonéales, et trois gavages, sur une durée de 8 semaines. La procédure 7 requiert une procédure chirugicale, et 4 injections sour-cutanée, sur une semaine. La procédure 8 requiert 2 injections péritonéales, 3 gavages, une injection sous cutanée, et une intervention chirurgicale, sur une période de 8 semaines. La procédure 9 requiert une injection sous cutanée, une injection intrapéritonéale, et une intervention chirurgicale, sur une période de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées sans nuisances pour les animaux. L’effet principal des modifications génétiques que nous réalisons est une diminution de la sensibilité à la douleur chez ces animaux (sensibilité à la chaleur, ou aux stimulations mécaniques). On utilise également un modèle génétique pour activer les neurones sensoriels impliqués dans les sensations de plaisir. En revanche, ce sont les modèles d’inflammation utilisés qui peuvent causer des nuisances chez les animaux, avec le développement de réactions immunitaires sur une zone définie de la peau. Par ailleurs, le suivi de certaines souris impliquera une anesthésie légère à l’isoflurane jusqu’à 5 fois par semaine, ce qui pourra induire du stress à l’animal. Enfin, certaines méthodes d’étude du cerveau nécessiteront des chirurgies sous anesthésie, pour lesquelles un traitement post-opératoire et un suivi rigoureux sont nécessaires pour s’assurer du bon rétablissement de l’animal et limiter les conséquences post-opératoires.

Devenir

L'ensemble des animaux utilisés sera euthanasié à l'issue de la procédure. Les organes d'intérêts (peau, DRG, cerveau, moelle épinière, rate, ganglion lymphatique) pourront alors être prélevés pour des études d'histologie, d'ARN, ou de cytométrie en flux.

Remplacement

Les interactions entre neurones et cellules immunitaires sont complexes et impliquent de nombreuses interactions, pour laquelle l’étude d’organismes entiers est requise. Les neurones sensoriels ne peuvent pas être étudiés sur des biopsies de patients humains (sauf post-mortem), et il n’y a pas encore les connaissances disponibles pour produire in vitro des cultures de neurones proches de ceux qui existent dans l’organisme. Seuls les modèles animaux permettent d'étudier ces neurones de manière rigoureuse et fiable. Nous utilisons également plusieurs approches ex vivo dans ce projet, qui ne sont pas décrites dans cette demande pour prélever et étudier les neurones et cellules immunitaires dans des cultures en boite de pétri (ex : culture des neurones sensoriels). Cette méthode est notamment utile pour observer des mécanismes moléculaires spécifiques .

Réduction

Le plan de nos expériences est construit de sorte à limiter le nombre de souris. Nous avons mené une étude statistique pour pouvoir déterminer les nombres d’animaux minimum pour répondre à chaque question scientifique posée. Après la mise à mort, un maximum d’organes seront prélevés afin d’obtenir le plus d’information possible pour chaque souris, et afin d’éviter d’avoir à répéter inutilement des expériences. Enfin, nous utiliserons des souris particulières, dites « congéniques », permettant de limiter la variabilité d’un individu à l’autre , et ce qui permet d’utiliser un nombre réduit de souris pour chaque expérience.

Raffinement

Pour réduire le stress des animaux, un temps d'acclimatation d'au minimum une semaine sera respecté après un transfert d'une animalerie à l'autre ainsi qu'avant toute procédure expérimentale. Les souris seront hébergées en cage standard avec toit filtrant au nombre de 5 souris par cage, avec de la sciure de bois utilisée comme litière, des lanières de papier kraft comme matériau de nidification et des maisons en dôme. Les souris sont nourries et sont libres de leurs déplacements. Les souris génétiquement modifiées utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Certaines procédures nécessitant une chirurgie sur les souris, suivront un protocole strict visant à réduire la souffrance de l’animal pendant et après la chirurgie (traitements pré et post-opératoires). Les souris seront maintenues profondément anesthésiées lors de l’opération puis traitées avec des analgésiques (et anti-inflammatoires si nécessaire). Si les animaux montrent des signes de souffrance, des doses supplémentaires d’analgésiques seront fournies. Dans le cas où ces signes perdurent, les animaux seront mis à mort. Une surveillance quotidienne est réalisée lorsque la souris a subi une intervention, pour surveiller notamment son poids, son comportement, et la zone d’inflammation. Si l’animal a un état général qui se dégrade à cause de la procédure, il sera mis à mort et l’expérience arrêtée. De la nourriture humide sera déposée systématiquement dans la cage des animaux pendant 2 jours suivant l'infection pour faciliter au maximum l'alimentation.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle idéal pour notre étude. Le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme (dans notre cas, les schémas des systèmes immunitaires et neuronaux sont très similaires entre l’homme et la souris), l’état actuel des connaissances, les outils et structures disponibles pour sa manipulation et un temps de génération court font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaire et nerveux. De plus, le modèle murin est un modèle de choix par l'existence de souris génétiquement modifiées.