Organes sensoriels

Chaque rat reçoit une seule molécule par une seule voie, soit dix injections sous la conjonctive en un mois, soit six injections dans le vitré étalées sur six mois, soit une injection unique sous la rétine. 3 000 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'électrorétinogramme final dure quarante minutes, avec des électrodes plantées sous la peau des joues et du bas du dos et des lentilles posées sur l'œil, après une nuit passée dans le noir. Le porteur estime que dix rats traités et dix témoins suffisent par molécule, et retient le rat parce que la taille de son cristallin rend l'abord chirurgical de l'œil plus commode.

Objectifs

La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie neurodégénérative de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine, des couleurs et du contraste. S’ils dégénèrent, le sujet perd l’information visuelle centrale. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays développés. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif efficace pour la forme sèche, qui représente 80 pourcents des cas de DMLA. De nouveaux traitements sont actuellement en essai clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ne cible spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs. Ainsi, le but de ce projet est de trouver des molécules protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissu rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets neuroprotecteurs potentiels de certaines molécules. Les molécules qui ont démontré un sauvetage des photorécepteurs à cônes ont été sélectionnées. Ces molécules seront testées in vivo sur différents modèles de rat présentant une dégénérescence de la rétine, et seront administrées selon différents modes d’injections oculaires déjà pratiqués en clinique. En fin de traitement, un examen électrorétinographique sera réalisé afin de mesurer l’activité des photorécepteurs à cônes après un stimulus lumineux. La réponse obtenue à cet examen permet une première évaluation de l’éventuel effet neuroprotecteur sur les cônes in vivo. Suite à cet examen, les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés afin de corréler les résultats du premier examen avec une analyse histologique des photorécepteurs à cône ex vivo.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou plusieurs molécule(s) sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), de rétinopathie pigmentaire autres dystrophies rétiniennes.

Procédures

Etape 1 : administration des molécules Nous allons administrer des molécules aux rats, par différentes voies oculaires selon leur pharmacologie. Chaque animal se verra administrer 1 seule molécule par 1 seule voie d’administration au cours de la procédure. -Collyres (sans anesthésie, animal vigile) : 1 goutte 1 à 3 fois par jour en fonction des molécules, pendant 3 mois -Injection sous-rétinienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 15 minutes) -Injection supra-choroïdienne : sous anesthésie générale, 1 seule injection par animal (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections intravitréennes : sous anesthésie générale, 1 injection mensuelle pendant 6 mois (soit 6 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 10 minutes) -Injections sous-conjonctivales : sous anesthésie générale, 1 injection tous les 3 jours pendant 1 mois (soit 10 injections au total par animal) (durée de la procédure chirurgicale : 5 minutes). Suite aux administrations, un examen électrorétinographique (fonctionnement de la rétine sur animal vivant) sera réalisé, sous anesthésie générale, après mise en chambre noire pendant 1 nuit. Etape 2 : électrorétinogramme Des électrodes seront placées lors de l’électrorétinogramme en sous-cutané dans les joues et dans le bas du dos du rat comme prise de terre. Des lentilles cornéennes placées sur l’œil de l’animal enregistreront les réponses rétiniennes. Les électrodes sous cutanées se retirent comme une aiguille. La durée d’un examen électrorétinographique est de 40 minutes par animal. Suite à cet examen, l’animal sera directement euthanasié par une méthode règlementaire, puis des prélèvements oculaires seront réalisés.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir de la peur/détresse au moment des injections intra-péritonéales d’anesthésiants. Les animaux subiront un stress physique/thermique au moment des interventions chirurgicales. Dans les suites post-opératoires, une douleur oculaire du côté de l’intervention pourra survenir et la vision pourra être altérée, pendant quelques jours au maximum.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, par une méthode réglementaire, puis les yeux seront prélevés pour permettre des analyses histologiques complémentaires.

Remplacement

Les molécules qui seront administrées in vivo ont préalablement été sélectionnées in vitro sur cultures cellulaires et explants de rétines de porc. Ces modèles présentent une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles, nous avons sélectionné des molécules ayant une double action : 1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant permettant un abord thérapeutique local facilement accessible et contrôlable (œil de rat). Dans le cas présent, les tests seront effectués sur un modèle de rat présentant des signes de dégénérescence similaires à celui de l’homme, induite ou congénitale.

Réduction

Dans un souci de réduction, nous avons établi préalablement à l’étude la taille des effectifs utilisés grâce à un calcul de puissance. Nous estimons ainsi que 10 rats traités et 10 rats contrôles seront suffisants. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet. Toujours dans un esprit de réduction, nous regrouperons les témoins pour les molécules ayant le même véhicule si les expérimentations ne sont pas trop asynchrones. Au total, 3000 animaux seront nécessaires à notre étude sur 5 ans.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, rouleaux en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des injections oculaires et des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale appliquée directement sur le site opératoire (œil). Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les rats seront placés sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’intervention et en chambre thermostatée de 32 degrés Celsius jusqu’à leur réveil complet. Une nouvelle aiguille stérile sera utilisée pour chaque animal afin de limiter la douleur induite lors des injections. Les animaux seront réveillés de l’anesthésie par administration d’un antidote en fin d’intervention. Nous appliquerons une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne suite aux injections intra et péri-oculaires et à l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les rats resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, rouleaux en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière pour les animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

L’anatomie oculaire chez le rat (notamment taille et volume du cristallin) est beaucoup plus favorable à un abord chirurgical pour délivrance intra- et péri-oculaire des molécules testées, permettant de réduire le nombre d’animaux et d’expérimentations étant donné une diminution du nombre d’échecs. Nous utiliserons des rats chez qui nous induirons une dégénérescence rétinienne et d’autres présentant une dégénérescence congénitale. Les administrations oculaires seront réalisées entre le 6ème et la 8ème semaine de vie pour les rats chez qui nous induisons la dégénérescence. Les administrations oculaires chez les rats avec dégénérescence congénitale auront lieu entre P21 et P45 ou entre 1 et 8 mois de vie en fonction de la lignée (âges respectifs correspondant à la dégénérescence des cônes dans ces modèles).

Les souris utilisées appartiennent à des lignées dont la rétine dégénère rapidement, l'une perdant sa réponse électrophysiologique dès quatre mois. 540 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune reçoit une injection sous la rétine, qui peut provoquer un décollement rétinien, une opacification de la cornée ou des saignements dans l'œil, puis passe des séances d'électrorétinographie et de tomographie sous anesthésie à six âges différents, une partie subissant en plus un test de réflexe optomoteur de trois fois vingt minutes à cinq âges et un test clair-obscur. La mise à mort sert à prélever les rétines pour des marquages histologiques et des analyses transcriptomiques, l'ensemble visant à documenter une thérapie génique avant un éventuel essai clinique.

Objectifs

Plus de 200 gènes sont actuellement associés à la cécité congénitale. Bien que la thérapie génique ait été proposée pour un grand nombre de ces gènes, cette approche présente des limites. Nous avons la preuve que l'introduction d'une copie saine d'un gène spécifique impliqué dans le développement des photorécepteurs (cellules de détection de la lumière dans l'œil) peut retarder la perte de vision. Pour explorer plus avant cet effet thérapeutique, nous utiliserons deux modèles murins différents de cécité congénitale causée par des mutations dans différents gènes. Notre objectif est d'établir l'effet thérapeutique et d'élucider les mécanismes à l'origine de cet effet.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle, peu de thérapies sont proposées aux patients atteints de rétinopathies. La plupart permettent uniquement de ralentir la dégénérescence. Certaines, plus efficaces, sont uniquement proposées en fonction de votre mutation. Nous réalisons ce projet afin de développer une thérapie génique efficace pour de rétinopathies. Nous espérons par ce projet démontrer l’efficacité de notre traitement sur plusieurs modèles animaux, qui serviront de preuves de concept, ou d’études précliniques, nécessaires à réaliser en amont d’essais chez les patients. Le but est de poursuivre vers un essai clinique.

Procédures

Toutes les souris recevront une injection sous rétinienneous. Par la suite, les animaux seront soumise a ERG (mesure non invasive de la réponse électrique de la rétine à un stimulus lumineux) et un OCT (visualisation non invasive de la rétine en coupe chez la souris) sur les deux yeux (environ 20/30 minutes) à 6 âges diffeérents. Une autre partie des souris passeront un test de reflexe optomoteur (3 x 20 minutes espacés d’1 heure minimum) à 5 âges diffeérents. Ce test permet de quantifier les reflexes oculaires de la souris et se fait donc sur animal vigil. Elles pourront également réaliser un test comportemental appelé clair/obscur (5 minutes), ou la souris est filmée en train d’explorer une boite soit noire soit éclairée.

Impact sur les animaux

Les anesthésies répétées peuvent être dommageables pour les souris, mais elles sont espacées de 14 jours minimum. L’injection sous rétinienne peuvent provoquer un décollement rétinien qui se résorbe en 48h. Une opacification de la cornée peut être observée malgré l’ajout systématique de gel ophtalmique. Si une cataracte apparait néanmoins, elle se résorbe normalement d’elle-même rapidement. Si les animaux présentent des saignements anormaux dans l’œil lors de l’injection ou avant leur réveil.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, afin de récupérer les rétines et réaliser des marquages immunologiques sur les coupes histologiques, ou analyser les effets de notre traitement au niveau transcriptomique et protéique.

Remplacement

Le projet visant la validation d’une stratégie thérapeutique pour le traitement de maladies rétiniennes, une validation de ces approches in vivo est un prérequis des agences réglementaires avant la mise en place d’essais cliniques. Il est également fondamental de travailler sur des modèles animaux présentant des pathologies comparables à celles développées chez l’Homme. La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie également par le fait que la rétine est un tissu complexe composé de nombreux types de neurones dont les interactions sont cruciales pour générer un signal visuel correct. Dans ce contexte il est essentiel de travailler in vivo car les processus de mort cellulaire, de neuroprotection, ou de réparation sont totalement dépendants de l’environnement cellulaire. Pour ces différentes raisons, des méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

L'étude préclinique s'étendra sur une période de deux ans et a pour but d'évaluer l'efficacité d'une nouvelle approche thérapeutique pour une maladie ophtalmique. Cette thérapie sera expérimentée sur deux lignées de modèles animaux. L'objectif est de confirmer l'efficacité du traitement sur un vaste panel de patients et de comprendre son mode d'action. La première phase de l'étude consistera à identifier la dose optimale à administrer à chaque modèle animal. Par la suite, une comparaison de l'efficacité du traitement sera effectuée. Seuls les animaux ayant reçu la dose la plus efficace seront soumis aux étapes ultérieures. L'objectif de cette étude est d'obtenir entre 7 et 10 yeux par traitement, afin de garantir des résultats statistiquement pertinents. Ce chiffre a été établi sur la base de données scientifiques. Seuls les animaux ayant été correctement injectés dans au moins un œil seront pris en compte dans l'analyse. Il est également possible que le nombre de modèles animaux soit réduit en fonction des résultats obtenus. Si, après un certain temps, le traitement s'avère inefficace, l'étude sera interrompue.

Raffinement

Durant l’injection sous-rétinienne, une anesthésie locale sera effectuée en plus de l’anesthésie générale. Une goutte de gel oculaire hydratant sera déposée sur l’œil des animaux pour préserver la cornée. Les animaux seront ensuite surveillés jusqu’au réveil. Afin de prévenir une éventuelle douleur, les animaux recevront un anti-inflammatoire suite à l’opération. Ils seront observés quotidiennement pour surveiller l’apparition éventuelle d’infection oculaire. Une grille de score adaptée est utilisée pour apprécier l’état des animaux, ce système comprend des points limites précoces qui permettent de détecter les premiers symptômes de douleur ou d’inconforme et d'intervenir rapidement.

Choix des espèces

La thérapie génique que nous souhaitons développer nécessite d’être validée in vivo avant d’être testée chez l’homme. Afin d’être le plus proche des pathologies humaines que nous souhaitons traiter, et ainsi évaluer les bénéfices/risques de notre approche thérapeutique, nous prévoyons d’utiliser des souris comme modèle d’étude. L’existence de lignées de souris atteintes naturellement ou non de dégénérescence rétinienne en fait un excellent organisme modèle pour notre projet. Nos modèles sont bien établis en recherche ophtalmologique. Chaque modèle est différent, et les temps choisis pour les injections correspondent aux contraintes imposées par la dégénérescence rétinienne. Comme nous connaissons les modèles animaux que nous allons utiliser, nous pouvons définir le temps auquel il est plus pertinent d’injecter nos AAV, ainsi que les temps auxquels il faudra réaliser les expériences. Les rétines des souris utilisées dégénèrent très rapidement. Nous injectons donc à 14 jours aprés naissance et regarderont 21 jours plus tard les effets de l'injection. Les souris d'une autre lignée présentent une faible réponse électrophysiologique (ERG) dès l'âge de 4 mois, c'est pourquoi nous réaliserons les injections 30 jours après la naissance et examinerons l'efficacité de ces injections 30 jours plus tard. Nous observerons ensuite les effets de notre traitement entre 3 semaines et 1 an après injection.

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 900 d'entre elles reçoivent pendant douze semaines un régime gras destiné à provoquer un diabète de type 2, les 108 autres étant diabétiques par modification génétique, puis chacune subit sous anesthésie l'ouverture d'une plaie dans la peau du dos, avec un dispositif de recueil implanté autour et un suivi de quinze à vingt jours. Le porteur signale que le régime gras rend souvent les souris agressives envers leurs congénères et que la plaie devient douloureuse quand l'animal doit s'étirer. Sur le remplacement, il décrit des tests sur cellules ayant servi à présélectionner les traitements, sans indiquer ce qui empêche d'aller plus loin sans animaux.

Objectifs

De nos jours, la cicatrisation des patients diabétiques et des sujets agés demeure un enjeu social et économique crucial. De précédents travaux ont démontré un retard dans la vitesse de cicatrisation chez différents modèles murins diabétiques, causé par un état inflammatoire persistant. Aucune stratégie thérapeutique n’a encore permis d’apporter de véritables solutions efficaces, dans l’amélioration de la vitesse de cicatrisation chez le patient diabétique de type 2. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente donc un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le dispositif placé sur le dos de l'animal permet de récolter in situ la totalité de l’exsudat présent sur la plaie. Cette méthode de prélèvement préserve l’intégrité morphologique et fonctionnelle de différentes populations cellulaires et de différents médiateurs contenus dans l’exsudat, permettant de suivre l’évolution de la phase inflammatoire et de sa résolution. Notre dispositif nous donne ainsi une vraie « image de la plaie » et de son environnement. Ce dispositif permet l’administration de solutions à travers un septum directement sur la plaie et plus particulièrement de nouveaux principes actifs pouvant agir sur la vitesse de cicatrisation. Ainsi, les avancées récentes sur la compréhension de la dérégulation de la cicatrisation chez les patients diabétiques, notamment sur l’implication des macrophages, et notre savoir-faire sur ces cellules, ouvrent de nouvelles perspectives quant aux stratégies expérimentales à développer. L’exploitation de nos résultats de recherche et l’utilisation de notre dispositif expérimental innovant rendent possibles : i) le test de nouvelles molécules par application topique et; ii) la caractérisation des populations cellulaires présentes aux différentes étapes de ce processus (phase inflammatoire, phase de résolution, phase de réparation) sur un même animal, et iii) l’étude de nouveaux mécanismes d’actions favorisant la cicatrisation chez le patient diabétique en déterminant des cibles thérapeutiques(animaux génétiquement modifiés, administration de cellules pro-resolutives ).

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 pendant 12 semaines (900 souris). Les animaux diabétiques soumis au régime gras (900) ou génétiquement diabétiques (108) subiront ensuite une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant de créer une lésion cutanée dorsale et un dispositif non invasif sera implanté sur le pourtour de la plaie (1008 souris). La durée de l’anesthésie et de l’intervention est de 10min par animal. Les animaux seront suivis pendant 15-20 jours (observations de leur état général et suivi de la fermeture de la plaie par photographie). Les traitements cicatrisants seront administrés soit par injection intrapéritonéale (durée de quelques secondes), soit dans l’eau de boisson ad libitum ou par gavage (durée de quelques secondes), ou directement sur la plaie (durée de quelques secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux soumis à un régime gras afin d’induire un diabète de type 2 présentent très souvent un comportement agressif vis-à-vis de leurs congénères. La formation de la plaie peut induire de la douleur et l’animal peut modifier son comportement en réduisant ces mouvements. Le traitement par voie topique commencera 3 jours post-lésion. Il sera appliqué une fois par jour jusqu’à la cicatrisation complète. Ce mode d’administration sera privilégié car le dispositif facilite le traitement topique et ne génère aucune souffrance à l’animal. Pour le traitement par gavage ou dans l’eau de boisson peuvent altérer la prise hydrique.

Devenir

A l’issue du régime hyperlipidique et du suivi de la plaie, les animaux seront sacrifiés afin de prélever les tissus cicatriciels à différents temps post-lésion.

Remplacement

Nous testerons plusieurs types de traitements par voie topique et par voie orale qui sont susceptibles de pouvoir améliorer la cicatrisation chez les patients diabétiques. Ces traitements, auront été présélectionnées via des résultats préliminaires réalisés en amont de ces études. Ces études sont basées sur des tests in vitro qui permettent d’appréhender les effets potentiels des traitements sur les processus cicatriciels (contraction, migration et prolifération cellulaires, différenciation…). Les cellules pro-résolutives auront également été sélectionnées en amont grâce à des tests in vitro au laboratoire (cellules myéloides et mesenchymateuses).

Réduction

Les résultats actuels ont permis de valider, en fonction des différents et nombreux paramètres à évaluer, qu’un nombre de 9 souris par lot est nécessaire afin d’acquérir des données suffisantes et permettre d’effectuer des tests statistiques fiables. L’expérience et les données déjà acquises sur des souris contrôles nous permettrons de comparer la fiabilité de nos données et d’éviter l’utilisation inutile d’animaux (éviter le double emploi).

Raffinement

Au cours du régime gras, les animaux seront pesés 1x/semaine. Au cours du processus de cicatrisation, une surveillance journalière sera effectuée afin de suivre le poids par une pesée mais aussi le comportement des animaux. La perte de poids (20% maximum), le changement de posture (recroquevillée, tremblement...), la modification d’activité (isolement, difficulté respiratoire) et l’aspect des poils sont des signes de douleurs qui seront des critères d’arrêt de l’étude. Bien que le dispositif n’entrave pas le mouvement des animaux, la plaie peut être douloureuse lorsque l’animal doit s’étirer. Suite à la création de la lésion cutanée pratiquée sous anesthésie sur le dos des animaux, des biberons avec embouts longs, ainsi que des croquettes humidifiées permettront de faciliter l’hydratation et la prise de nourriture de ces souris. Ces aménagements permettront de limiter les déplacements et les redressements des animaux pour se nourrir. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures sur l’état de santé global des animaux.

Choix des espèces

Les souris représentent le modèle préclinique idéal. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés. Cette approche permettra d'étudier des mécanismes moléculairesafin de définir des cibles thérapeutiques. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, etc …) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. De plus, le modèle de souris diabétique mime la physiopathilogie du diabète observée chez l'homme avec une inflammation chronique à bas bruit altérant les mécanismes de cicatrisations. Le diabète de type 2 est essentiellement observé à l’âge adulte. Des souris présentant un état diabétique spontané et une obésité caractéristique du diabète de type 2, comme rencontré chez l’homme, seront utilisées entre 7 et 12 semaines. Le modèle du diabète de type 2 sera induit chez des souris mâles âgées de 6-7 semaines (stade adulte) par un régime riche en graisses (régime diabétogène) pendant 12 semaines minimum. L’âge influençant la cicatrisation, les expérimentations pourront être effectuées sur des animaux âgées entre 12-20 mois.

Dépourvues de poils par sélection, les souris SKH-1 laissent voir et mesurer les tumeurs de la peau sans rien raser. 80 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois fois par semaine pendant deux, quatre ou six mois, elles sont exposées aux UVB, en continu aux radiofréquences 5G à 26 GHz, ou aux deux, jusqu'à ce qu'apparaissent vers la seizième semaine de multiples tumeurs cutanées sur le dos, que le porteur décrit comme pouvant gêner leurs déplacements et les empêcher d'atteindre la nourriture dans la mangeoire. Toutes sont tuées pour prélever les tumeurs et la peau du dos.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'effet d'une exposition à la fois aux ondes radiofréquences (RF) émises par les systèmes de communications sans fil et au rayonnement solaire ultraviolet (UV) sur le développement des tumeurs cutanées chez la souris. Au cours de sa vie, l'homme est quotidiennement exposé à ces 2 types de rayonnement, possiblement cancérogène ou cancérogène connu, ce qui peut avoir des effets néfastes sur sa santé. De ce fait, l'exposition combinée et consécutive à ces deux agents physiques omniprésents dans notre environnement pourrait jouer un rôle important dans l'apparition de cancers cutanés. Avec l’arrivée de la nouvelle technologie 5G et ses fréquences plus élevées comme 26 GHz, il est crucial de savoir comment cela pourrait affecter la santé humaine, en particulier la peau. Bien qu’il soit connu que l'exposition au soleil, en particulier aux rayons UVB, endommage l'ADN et produit des substances nocives telles que des radicaux libres, nous n'avons pas encore suffisamment d'informations sur l'impact des ondes de téléphones portables à 26 GHz. Notre idée est donc que l'exposition quotidienne à ces deux facteurs pourrait potentialiser l'apparition des cancers cutanés chez l'homme.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de déterminer l'impact des RF sur les cancers cutanés UVB induits. Grâce à ce projet, nous espérons obtenir une réponse claire sur les RF : i) elles n'ont pas d'effet ii) elles jouent un rôle protumoral ou au contraire iii) un rôle antitumoral. Les données obtenues permettront d’améliorer la prévention concernant la survenue des cancers cutanés et diminuer leur mortalité si les RF amplifient l’effet délétère des UV. Les cancers cutanés sont visibles, affligeants, induisant un stress psychologique important. Limiter l’apparition des cancers cutanés et leurs effets secondaires, améliorera la qualité de vie des personnes touchées et diminuera le coût en terme de santé publique.

Procédures

Les animaux sont exposés aux rayons UVB 3 fois par semaine pendant moins d'une minute et/ou aux radiofréquences (RF) en continu et cela pendant 2, 4 ou 6 mois. A l'apparition des premières tumeurs, le volume tumoral est mesuré 1 à 2 fois/semaine au pied à coulisse sur souris vigile et cela jusqu'à la fin de la phase expérimentale.

Impact sur les animaux

L'exposition répétée aux UVB provoque de multiples petites tumeurs cutanées sur le dos des souris qui vont apparaitre aux alentours de 16 semaines d'irradiation. Ces tumeurs peuvent devenir gênantes pour se déplacer ou se redresser pour attraper la nourriture dans la mangeoire. Il est également possible que la co-exposition aux RF accentue le niveau de nuisance, si comme nous le supposons les RF potentialisent les effets des UVB.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et la peau du dos pour les différentes analyses biochimiques et histologiques.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires in vitro ainsi que des modèles d'épidermes pigmentés humains reconstruits in vitro pour répondre à ces questions. Cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que la formation d’une tumeur, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. De nombreux articles ont mis en évidence l'importance du microenvironnement dans le processus de carcinogènése cutanée et malheureusement, il est à ce jour, très difficile de reproduire ce microenvironnement tumoral in vitro. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire à la réalisation de ce projet a été scrupuleusement réduit au minimum en tenant compte de nos 10 ans d’expériences en matière de cancérogénèse UVB induite. En effet, les souris ne sont pas consanguines et par conséquent, nous avons toujours 2 ou 3 souris qui ne répondent pas aux irradiations ou peuvent avoir des réponses complétement atypiques par rapport au reste du groupe (croissance tumorale trop rapide ou trop lente), ce qui a été bien constaté au cours de nos précedentes expérimentations. Pour ces raisons, nous avons déterminé via des tests statistiques qu'un lot de 20 souris par condition était nécessaire pour avoir des données statistiquements exploitables à la fin de l'étude. Nous utiliserons également des lots témoins communs afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les animaux qui ne répondent pas favorablement seront néanmoins utilisés pour des prélèvements de peau et serviront de contrôle pour des analyses ultérieures.

Raffinement

Des études pilotes ont été réalisées pour raffiner l’ensemble de nos procédures expérimentales sur les animaux de manière à réduire au minimum les temps d’exposition, les temps de contention et d’isolement afin de prévenir toute douleur ou inconfort chez nos animaux. De plus, nous réalisons une surveillance quotidienne de nos animaux et nous avons mis en place des mesures conservatoires (ajout de croquettes dans les cages, biberons à longue pipette) et des points limites qui nous permettent d'agir rapidement en cas d'inconfort ou de douleur observés chez nos animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. C'est un modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain. Les souris SKH-1 sont bien connues pour l'étude de la cancérogénèse UVB-induite. Elles sont immunocompétentes et totalement dépourvues de poils ce qui rend la mesure et l'observation des tumeurs cutanées bien plus facile que sur d'autres modèles de souris. Les souris seront inclues dans le protocole expérimental à l'âge de 6 à 8 semaines. Ages auxquels elles sont considérées comme de jeunes adultes ayant atteint un poids de 20-25g, une maturité hormonale et un état métabolique stable.

Pour constituer le dossier préclinique d'un pansement liquide avant son marquage CE, 18 lapins subissent chacun quatre plaies cutanées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale de trente à quarante-cinq minutes, chaque lapin reçoit quatre plaies et quatre pansements, et quatre anneaux de silicone sont suturés à sa peau au fil non résorbable pour empêcher la rétraction, anneaux qui restent en place les trente jours de l'étude. Les deux semaines précédant l'opération, les lapins sont habitués à porter un gilet de protection, jusqu'à dix heures consécutives le dernier jour. Tous sont tués à trente jours pour prélever la plaie cicatrisée, le porteur affirmant que "3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement" dans une étude qu'il présente par ailleurs comme pilote et destinée surtout à de l'imagerie.

Objectifs

La peau est le plus étendu des organes du corps humain qui assure plusieurs fonctions vitales pour l’organisme. Cet organe est soumis tout au long de la vie à de nombreux dommages, provoqués par des facteurs extérieurs d’origine physique (coupures), mécanique (ulcères), thermique (brûlures) et/ou chimique (radiations). La sévérité des dommages couplés à d’autres facteurs, tels que l’âge, le diabète et la nutrition, peuvent conduire à une mauvaise voire non-cicatrisation des plaies, appelées les plaies chroniques. Elles impactent fortement la qualité de vie des patients, jusqu’à engager leur pronostic vital. Ce problème de santé publique est amené à s'accroître avec le vieillissement de la population et l'augmentation de la prévalence du diabète et de l'obésité. L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes solutions de pansement liquide nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) le soin de plaies cicatrisant par seconde intention (plaies chronique ou aigüe) 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel : un prélèvement histologique sera réalisé à J30 à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatrisation de la plaie. Parmi les modèles de cicatrisation cutanée qu'on retrouve dans la littérature, nous avons retenu celui faisant appel à une biopsie cutanée suivie de la mise en place de disque de silicone permettant d’éviter la rétraction spontanée de la peau. Ce modèle présente l’avantage de refléter au mieux le phénomène de cicatrisation humaine. Par ailleurs, les tests précliniques sont indispensables à l’évaluation d’un dispositif médical avant le passage aux tests cliniques chez l’Homme. La formule sélectionnée pourra alors passer à l’étape suivante du marquage CE : l’étude clinique

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude, nous espérons observer une diminution du temps de cicatrisation avec nos formulations comparativement aux pansements standard. Mais également une amélioration de la qualité de la cicatrise via une observation histologique en fin de cicatrisation. Par ailleurs, ces essais nous permettrons d’obtenir des preuves précliniques qui seront utilisées dans le cadre de la demande d’autorisation de mise sur la marché.

Procédures

Procédure chirurgicale induction des plaies et pansement sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min. 1 injection d’anesthésique 4 injections d’anti-inflammatoire 4 plaies cutanées 4 poses de pansement Suture de 4 anneaux sur la peau au fil non résorbable. Ces anneaux resteront en place durant toute la durée de l’étude

Impact sur les animaux

Hypothermie liée à l'anesthésie Douleur post opératoire Perte d’appétit, deshydratation

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 30 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et un prélèvement de la plaie cicatrisée sera réalisé pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies cicatrisants par seconde intention sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Par ailleurs, les méthodes d’analyse in vitro ne prennent pas en considération l’environnement locale et systémique impliqués dans le processus de cicatrisation. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. De plus, dans le développement d’un dispositif médical innovant, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité et l’efficacité des dispositifs avant le passage chez l’Homme. .

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de pansement utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture. 3 animaux par groupe est le minimum acceptable pour pouvoir conclure statistiquement sur l’étude. 4 plaies seront réaliser sur le dos d’un animal afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude.

Raffinement

Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux de bois à ronger dans leur environnement de vie. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne de la naissance à la mort par le personnel animalier. Ainsi qu’une visite quotidienne la première semaine post opératoire puis deux fois par semaine de la part de l’opérateur de l’étude. Au cours de l’étude, l’animal devra porte un gilet de protection des pansements. Les 2 semaines précédant la chirurgie, les animaux sont progressivement habitués au port du gilet. Jour 1 : le gilet est déposé dans la cage quelques minutes, Jour 2 : le gilet est mis en place sur l’animal 2 minutes. La durée augmente graduellement sur 2 semaines. Le dernier jour de l’habituation, l’animal porte le gilet 10 heures consécutives. L’animal sera placé sous anesthésie générale lors de la chirurgie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis quotidiennement durant environ 30j (le temps de la cicatrisation) puis seront mis à mort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie, jusqu’à son réveil.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de pansement de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans sollicitations de l’animal. Animaux choisis : adulte, 2.5kg Poids des animaux adaptés au gilet de protection fait sur mesure pour des animaux matures. Surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des 4 pansements. Animal mature avec structure anatomique de la peau et système immunitaire adaptés au besoin de l’étude.

Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.

Objectifs

Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.

Bénéfices attendus

La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine