Organes sensoriels

Jusqu'à 80 séances d'imagerie sous anesthésie, de quarante minutes chacune, réparties sur un an à raison de deux par semaine. 756 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour que leurs yeux soient prélevés et leurs cornées disséquées, 384 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 372 un niveau léger. Une partie subit une lésion de l'épithélium de la cornée, une autre une injection dans l'abdomen, l'objet étant de suivre comment les nerfs de la cornée se maintiennent et se régénèrent. Le porteur écrit que la lésion cornéenne est réalisée "dans des conditions qui n'engendrent pas de douleur à l'animal", et justifie le choix de la souris par un génome identique à celui de l'humain à plus de 98 %.

Objectifs

Les maladies de la cornée sont la deuxième cause de cécité dans le monde après la cataracte. Leur origine peut être génétique, dégénérative (vieillissement, diabète) et/ou environnementale. Il est donc essentiel de mieux comprendre la physiologie de la cornée pour proposer de nouvelles options thérapeutiques aux patients souffrant de défauts de la cornée. L'atteinte de l'innervation cornéenne se traduit par des symptômes allant d'une diminution de la sensibilité oculaire sans lésion cornéenne au syndrome de l'oeil sec en passant par la kératite neurotrophique et la perforation cornéenne. Actuellement, il n'existe aucun traitement disponible en routine pour la gestion de l'innervation cornéenne. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle des molécules de guidage axonal dans la maintenance de l'innervation cornéenne ainsi que la régénération axonale suite à des lésions. Grâce à des techniques d'imagerie en temps réel combinés à l'utilisation de souris transgéniques, nous sommes capables de suivre l'innervation de la cornée des souris au cours du temps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'acquérir des connaissances inédites sur les molécules spécifiques de guidage des axones dans la cornée au niveau physiologique. Ceci constitue une étape importante pour comprendre l'origine de la kératopathie neurotrophique. La compréhension des mécanismes de cette pathologie permettra de développer et tester des traitements pharmacologiques.

Procédures

Un partie des animaux recevra une injection unique par voie intrapéritonéale (réalisé sur animal vigile, l'acte dure moins de 1 min par animal). L'induction de la lésion de l'épithélium cornéen concerne également une partie des animaux du projet, l'acte est réalisé sous anesthésie générale et locale, par une personne expérimentée et dure moins de 5 min par animal. Chaque animal sera imagé 2x par semaine pour une durée allant de 1 mois jusqu'à 1an selon la procédure (soit entre 8 et 80 sessions d'imagerie, selon la procédure, réalisées sous anesthésie d'une durée maximale de 40min chacune). Les animaux seront euthanasiés en fin d'expérimentation par une méthode réglementaire en vue des prélèvements et analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux recevront une injection unique en intrapéritonéale. Au moment de la réaliser, la contention et l'introduction de l'aiguille peut être source de stress pour les animaux. Une légère douleur au moment de l’insertion de l’aiguille peut aussi être ressentie. Pour réaliser ce projet, nous allons induire une lésion de l'épithélium cornéen chez une partie des animaux. Cette étape est réalisée dans des conditions qui n’engendrent pas de douleur à l’animal. L'imagerie en temps réelle est non invasive et n'engendre pas de douleur à l'animal. La répétition des sessions d'imagerie peut également être source de stress pour les animaux. L'anesthésie peut dans de rare cas amener un stress thermique ou une potentielle détresse respiratoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de la période de maintien prévue, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques complémentaires (les yeux seront prélevés et l'ensemble des cornées des animaux sera disséqué).

Remplacement

Du fait de la complexité de la complexité de l’innervation cornéenne et des interactions avec le tissu épithélial de la cornée, l’utilisation de l’animal nous est indispensable. Il n’y a pas d’alternative par des modèles in vitro.

Réduction

Ce projet impliquera au maximum 756 souris. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre les objectifs scientifiques de ce projet. Un test de puissance a été réalisé (à l'aide d'un logiciel dédié) pour déterminer le nombre minimal d'animaux requis par groupe expérimental.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation standard avec enrichissement (bâtons en bois, coton), avec un cycle jour-nuit de 12h. La température des cages et l’hygrométrie sont contrôlées. Les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Des points limites ont été définis (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration). Pour l'étape d'induction de la lésion et pour les sessions d'imagerie, les rongeurs bénéficieront d'une analgésie ainsi que d'anesthésie gazeuse complémenté par une anesthésie locale de la cornée.

Choix des espèces

En ce qui concerne la cornée et son innervation, la souris présente l’avantage d’être très similaire à l’homme que ce soit anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. En effet plus de 98% de son génome est identique à celui de l’Homme. Par ailleurs, ce modèle permet la transgénèse et donc de pouvoir étudier in vivo les conséquences de la délétion d’un gène. La souris, et en particulier avec le fond génétique C57Bl6J, est un modèle utilisé depuis de très nombreuses années pour l’étude du système nerveux et de l’innervation cornéenne. De ce fait de nombreuses données sont déjà disponibles sur lesquelles notre étude peut se reposer. L'innervation de la cornée se termine autour du 45ème jour de vie des animaux. Nous utiliserons donc des animaux âgés de 6 semaines pour le suivi de l'innervation de la cornée. Cependant, une partie des animaux sera utilisé dès le 15ème jour de vie afin d'activer notre modèle expérimental.

Toutes tuées à l'issue, y compris les reproducteurs transgéniques tués à six mois puis remplacés, 8 132 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré pour tester des vecteurs de thérapie génique contre la surdité. Elles subissent cinq à six tests auditifs sous anesthésie, des injections intrapéritonéales de tamoxifène et une chirurgie intracochléaire de vingt minutes. Le porteur reconnaît que cette chirurgie peut léser l'oreille injectée et faire perdre l'audition, tout en indiquant qu'il ne s'attend à aucun signe de souffrance ni d'inconfort, la surdité provoquée restant unilatérale. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, faute de pouvoir mettre en culture les systèmes auditifs périphérique et central.

Objectifs

Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est ni compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitables par thérapie génique. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression de surdités génétiques. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif.

Bénéfices attendus

La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires ; elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais pas pour les déficits auditifs postnatales dont la presbyacousie. Cependant, il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétiques potentiellement traitable par thérapie génique. De plus, il a récemment été mis en évidence l’existence de forme génétique de presbyacousie. Le présent projet vise à établir la preuve de concept d’efficacité thérapeutique de certains vecteurs de thérapie génique que nous développons pour traiter/stopper la progression des surdités. La thérapie génique pourra être réalisée à tout moment, en fonction du modèle expérimental de surdité humaine auquel on s’adresse, précoce ou à développement tardif. Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.

Procédures

Les animaux des modèles de surdité seront soumis à des tests auditifs, au nombre de 5 à 6 maximum, avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque tests. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure des amplitudes de la réponse auditive du tronc cérébral et suivie d’une mesure des produits de distorsion des otoémissions acoustiques. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à P16. Des animaux seront soumis à des injections avec une dose unique ou fragmentée (3 fois maximum sur une même semaine) par voie intrapéritonéale avec 100µL d'une solution de tamoxifène (une injection prendra quelques secondes Les animaux seront soumis à des injections de vecteur de thérapie génique qui seront réalisées par voie intra cochléaire une seule fois sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables attendus sur les animaux sont l’induction de la surdité (surdité congénitale ou acquise, profonde ou modérée, selon le modèle) et les suites de la chirurgie nécessaire à l’administration des vecteurs viraux dans la cochlée. Concernant l’induction de la surdité chez l’animal, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Nous ne nous attendons pas à ce que l’injection du tamoxifène puisse engendrer des effets secondaires. Nous nous attendons à ce que la chirurgie de la cochlée puisse entrainer des lésions et donc une baisse/perte d’audition de l’oreille injectée. La surdité potentielle étant unilatérale, nous ne nous attendons pas à ce que les animaux développent des signes souffrance ou d’inconfort. Concernant les suites chirurgicales, l’état général des souris sera régulièrement suivi après l’injection des vecteurs AAV afin de détecter les signes potentiels de souffrance ou d’inconfort (infection ou problème de cicatrisation du site d’injection, souriceau cyanosé ou délaissé par la mère, cachexie, expression faciale de souffrance (yeux plissés, oreilles couchées vers l’arrière), prostration, immobilité, poil non toiletté).

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort. Animaux pour élevage : Les anciens reproducteurs sont des animaux transgéniques ne pouvant être adoptés, ils seront mis à mort au bout de 6 mois et renouvelés Animaux utilisés pour les expériences : Pour réaliser nos analyses histologiques sur les oreilles internes, les animaux seront mis à mort. Post mortem nous prélèverons donc les cochlées pour évaluer infra cliniquement performances de nos stratégies de vectorisation.

Remplacement

Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble (de l’oreille interne au cortex auditif). Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 10%. Nous utilisons classiquement les tests de student, de Mann-Whitney, test du Xhi2, et ANOVA pour tester la significativité de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Nous avons établi des tests de criblage de capsides in vitro pour réduire le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire. De plus nous nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.

Raffinement

Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies de souris adultes. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux entre 0 et 21 jours après la naissance. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans notre grille d’évaluation de référence.

Choix des espèces

Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance, le système auditif est immature, à 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, et à 30 jours après la naissance et au-delà, le système auditif est mature. En fonction des modèles de déficits auditifs (congénital ou induit), les animaux seront utilisés dès la naissance ou à l’âge adulte.

300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.

Procédures

Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.

Impact sur les animaux

Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).

Remplacement

Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).

Raffinement

Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.

1 512 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leurs yeux, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. 250 d'entre elles subissent deux ou trois examens de vingt minutes sous anesthésie générale, électrodes posées sur la cornée, avec un risque d'irritation et de cataracte transitoire, les autres relevant de l'élevage, du tatouage et des biopsies de génotypage. Le porteur qualifie la perte progressive de la vue de phénotype "dommageable" tout en affirmant que les souris aveugles se comportent normalement, "sans souffrance apparente". Les organoïdes de rétine sont envisagés puis écartés, leur obtention prenant environ 200 jours et la technique n'étant pas maîtrisée au laboratoire.

Objectifs

Le projet a pour objectif de comprendre la cécité due à des mutations dans un nouveau gène. En effet, il a été identifié des anomalies dans un gène qui pourrait être en cause dans une maladie sévère de la rétine chez des très jeunes enfants qui deviennent aveugles. Ce gène n’est pas connu comme ayant une fonction dans l'oeil. Il n’existe pas de technique de laboratoire permettant d’étudier la fonction rétinienne, c’est pourquoi la souris reste un modèle de choix. La rétine est très similaire entre l’humain et la souris. La création d’un modèle de souris permettrait alors de comprendre le rôle de ce gène dans la rétine normale et mutante.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus devraient permettre de comprendre le rôle de ce gène dans l'oeil et de pouvoir expliquer la cause de la cécité chez les enfants.

Procédures

Un examen de l'oeil sera réalisé sur 250 souris sous anesthésie générale, afin de les maintenir endormis, pour pouvoir évaluer l’état de fonctionnement de la rétine. Cet examen dure 20 minutes et sera réalisé deux ou trois fois chez chaque souris avec plusieurs mois d'intervalle. Les souris seront mises à mort à la suite de cet examen et les yeux seront prélevés et étudiés.

Impact sur les animaux

La maladie provoque une atteinte de la vue progressive allant jusqu'à la cécité. Ce phénotype est dommageable même si les souris aveugles ont un comportement tout à fait normal, sans souffrance apparente. Les biopsies et tatouages sont pratiqués en routine dans l’animalerie pour identifier les animaux. La douleur est légère au moment du geste et il n'y a pas de gêne à long terme observée. Une injection d’anésthésiant est faite avant les examens de la fonctions visuelle pour maintenir les souris immobiles. Ce geste est pratiqué en routine et il n'y a pas de gêne à long terme observée sur les animaux. L'anésthesie peut provoquer une hypothermie, c'est pourquoi les animaux sont déposés sur un tapis chauffant tout au long de l'examen. L'enregistrement de la fonction visuelle, avec la pose d'électrodes sur l'oeil, a un risque faible d’irritation, un risque de cataracte transitoire mais sans effets indésirables sévères sur les animaux.

Devenir

A l’issue de l'enregistrement de la fonction visuelle, les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes post-mortem pour analyses des tissus d'intérêts (les yeux).

Remplacement

Il n’existe pas de modèle de Remplacement cellulaire représentatif car il n'est pas possible de cultiver des cellules de photorécepteurs (rétine). La création d'organoides rétiniens (petit oeil en 3D) est envisagée mais la mise en place de cette technique n'est pas encore maitrisée dans le laboratoire et l'obtention d'organoides rétiniens prend en moyenne 200 jours. La culture cellulaire de cellules de peau de patients pour analyser certaines fonctions du gène est d'ores et déjà utilisée mais des différences mécanistiques existent entre les types cellulaires et l'étude du tissu rétinien serait sans conteste le plus relevant. La souris est un bon modèle pour étudier l'oeil et sa fonction puisqu’elle possède une rétine ressemblant à celle de l’humain.

Réduction

Pour réaliser les examens d'enregistrement de la fonction visuelle, nous sélectionnerons 5 types de souris différentes dont deux types devraient développer des problèmes de vue et nous les enregistrerons tous les mois pendant un an pour évaluer la progression de la maladie. Un nombre de 10 animaux sera nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement exploitables et les males et les femelles seront utilisés. Afin de Réduire le nombre d'animaux utilisés, l'enregistrement est standardisée sur les deux yeux et sera réalisée en étude longitudinale, le même animal sera enregistré plusieurs fois au cours du temps (2 ou 3 fois avec plusieurs mois d'intervalle). L'étude longitudinale permet de réduire le nombre de souris : besoin de 50 souris par âge soit 650 souris si on enregistre chaque souris une seule fois ; besoin de 250 souris pour le projet avec la mise en place de plusieurs enregistrements par souris. Les 250 souris seront mises à mort à la fin de cette étude pour prélever les organes d'intérêt (yeux).

Raffinement

Le développement d'une dégénerescence rétinienne chez certaines des souris est attendu sans altération comportementale, sans modification du poids et une reproduction possible. Tout au long du projet les animaux seront observés régulièrement (tous les jours par les animaliers) et toutes les semaines par les expérimentateurs pour controler leur bien-être. L'enregistrement de la fonction visuelle qui consiste à enregistrer l’activité électrique de la rétine par stimulation lumineuse en posant des électrodes sur la cornée de l'animal, sera réalisé sous anesthésie générale pour éviter toute souffrance et éviter que les animaux bougent. La procédure mise en place pour réaliser le projet est peu traumatique, de courte durée, elle peut néanmoins engendrer du stress. Les animaux seront observés régulièrement et des procédures seront mises en place afin de minimiser l’inconfort, la souffrance ou la détresse des animaux. Les animaux seront hébergés 5 par cage comprenant des enrichissements afin de limiter le stress et de favoriser la socialisation.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé pour l'étude de la vue. En effet, l'oeil de la souris est proche de celui de l'humain. Il est possible d'enregistrer la fonction visuelle grâce à des enregistrements par des électrodes adaptées au modèle murin. L'analyse de modèle murin permet de mieux comprendre le fonctionnement de l'oeil normal et de l'oeil atteint de maladie génétique. Les examens ophtalmologiques se feront à partir de 15 jours puis tous les mois : 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 mois et 1 an. 15 jours est l'âge minimum pour enregistrer la fonction visuelle car l'œil est ouvert et assez gros pour poser les électrodes. Les prélèvements d'organes se feront aux mêmes stades. Les différents stades permettent de mettre en évidence une dégénerescence de la fonction visuelle puisque nous attendons une atteinte progressive de la maladie.

Exposées de façon prolongée à des nanoparticules de polystyrène et à des phtalates, 3 336 souris seront toutes tuées, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Le protocole prévoit 72 heures en cage métabolique individuelle, 48 heures en cage d'observation, des tests d'anxiété en espace ouvert éclairé et sur surface surélevée, des mesures de seuils de sensibilité par stimulations thermiques chaudes ou froides et par stimulations mécaniques, une injection de carragénine dans la patte pour provoquer une inflammation cutanée, et pour certaines une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Le porteur attend chez les groupes exposés des troubles du comportement alimentaire, de l'anxiété et des hyperalgies de type fibromyalgie, et ouvre la même rubrique par la phrase "ce projet obéit à la règle des 3R". Il précise retenir des polluants "dont les effets sont avérés" sur la santé humaine et animale, ce qui situe l'apport attendu du côté des mécanismes plutôt que de la démonstration du danger.

Objectifs

Les matières plastiques sont omniprésentes dans notre environnement. Quand ils ne sont pas éliminés ou recyclés correctement, les plastiques perdurent dans l’environnement pendant des années car ils ne sont pas biodégradables. Ils se décomposent alors en particules de micro et nanoplastiques (respectivement inférieures à 5 et 0,1 µm) qui sont des sources de pollution environnementale. Cette forme de pollution a atteint un niveau record en Méditerranée où la concentration de plastique y est quatre fois plus élevée que dans "l'île de plastique" du Pacifique Nord. La Méditerranée représente 1% des eaux marines du globe mais abrite 7% de tous les microplastiques. Par ailleurs, les plastiques libèrent des additifs plastifiants (bisphénol A, phtalates, etc.) dans l'environnement dont les effets nocifs pour les animaux et les humains sont bien documentés. Les mesures récentes réalisées pour Santé Public France montrent que ces polluants sont présents dans l’organisme de l’ensemble des adultes et des enfants, avec des niveaux d’imprégnation plus élevés chez les enfants. Les phtalates sont des perturbateurs endocriniens et métaboliques, et des reprotoxiques, pour lesquels des effets néfastes sur l'asthme chez l'enfant, l'obésité juvénile et le diabète de type 2, les TDAH, et chez l'adulte sur l'endométriose, l'infertilité, ainsi que sur le développement neurologique ont été documentés. Les enquêtes épidémiologiques montrent une forte incidence de neuropathologies centrales, périphériques ou autonomes, chez les professionnels exposées. Si le diagnostique est clair, les mécanismes neurobiologiques impliqués sont inconnus. Il a été montré que les nanoplastiques traversent la barrière hématoencéphalique et provoquent un stress oxydatif dans le système nerveux. Dans ce projet, nous souhaitons mettre en évidence que l’exposition prolongée aux nano et microplastiques et adjuvants phtalates affecte les profils inflammatoires systémiques et induit une neuroinflammation dans les régions du système nerveux central impliquées dans la réponse au stress, l’anxiété et la prise alimentaire (hypothalamus, amygdale et hippocampe), et le système nerveux périphérique impliqué dans la nociception et la réponse autonome (ganglion sensoriels de la corne dorsale de la moelle épinière et ganglions autonomes), et que cette réponse neuroinflammatoire impacte le comportement animal en comparaison à des animaux sains non exposés.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnelle car il est clairement démontré que l’exposition aux particules de plastiques et aux adjuvants de phtalates, polluants environnementaux d'origine anthropique, affectent la santé humaine. L'étude apportera des connaissances sur l'impact de ces polluants sur la santé mentale et les comorbidités neuronales. Elle permettra de comprendre les mécanismes neurobiologiques fondamentaux responsables des effets toxiques de ces polluants. A ce titre, les connaissances acquises sur les animaux seront applicables pour les études sur la santé humaine et éclaireront les agences responsables de la définition des normes environnementales et industrielles pour la santé humaine.

Procédures

Le métabolisme des souris est mesuré dans des cages métaboliques individuelles pendant 72heures. L’activité spontanée des souris est mesurée dans des cages d'observation individuelles pendant 48heures. La mesure est répétée pour 3 stades de développement après la naissance. La répartition des masses grasses et maigres tissulaires est mesurée sous anesthésie générale gazeuse, pendant 5 minutes. Pour les souris engagées dans l’étude de l’anxiété, 3 tests sont réalisées d’une durée respective de 20, 20 et 30 minutes. Chaque souris subie ces 3 tests à 3 périodes de développement après la naissance. Pour l’étude de la sensibilité au toucher des souris, le seuil de sensibilité mécanique cutanée est mesuré par 2 tests réalisés dans des boxes individuels en plexiglas transparent d’une durée totale approximative d’1h. Le seuil de la sensibilité cutanée à la température est mesuré par des tests d’exposition à des stimulations thermiques chaudes ou froides. Les stimuli sont calibrés pour un délai moyen de réponse de l’animal de 10 secondes. Le temps maximum d’exposition au stimulus de température est de 30 secondes. Pour certains tests, les souris subissent une période d'habituation de 4 jours. Les souris qui subissent la perfusion intracardiaque sont sous anesthésie générale avec un anesthésique et un antalgique injectable. Elles sont perfusées par la circulation générale avec le tampon de rinçage et le fixateur pendant environs 30 min.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la rège des 3R. Toutefois, il est attendu que lors de l'exposition prolongée aux nanoparticules de plastiques de polystyrène et phtalates, les animaux des groupes tests pourraient développer des troubles métaboliques et du comportement (troubles du comportement alimentaire, perturbation du métabolisme glucidique, stress et anxiété, hyperalgie nociceptives et inflammatoires, hyperalgies généralisées de type fibromyalgie), en comparaison aux groupes témoins. Les effets indésirables sont évalués par des tests de comportements qui visent à en observer l’apparition et en mesurer l’intensité : Stress-anxiété : exposition à des situations anxiogènes, à savoir, déplacement dans un espace ouvert éclairé ou sur une surface surélevée. Hyperalgie nociceptives : mesure des seuils de sensibilité thermique et mécanique par l’exposition à des stimuli thermiques chauds ou froids ou mécaniques jusqu’au seuil de réponse des animaux. Hyperalgie inflammatoire : la nuisance est une réaction inflammatoire cutanée (œdème et chaleur) au niveau de la patte après injection de carragénine. Métabolisme glucidique : hypo- ou hyperglycémie transitoire provoquée par l’injection d’insuline ou de glucose.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques.

Remplacement

L'étude et la veille bibliographiques permanente de la littérature scientifique abondante sur le sujet nous permettent de choisir les polluants dont les effets sont avérés sur les organismes pour la santé humaine et animale. En parallèle, les études préliminaires sur des cultures cellulaires in vitro, menées dans un laboratoire du consortium européen Horizon Europe-MSCA-Staff Exchange-2022 Psycomed (cité précédemment) et en collaboration avec les équipes du projet PLASTICHEAL financé par l’union européen, sont réalisées pour définir le choix et les quantités des matériaux plastiques et phtalates qui seront utilisées sur les animaux. L’étude de l’impact des polluants micro-nanoplastiques et adjuvant phtalate sur la santé et le comportement (prise alimentaire, proprioception et nociception), impliquant possiblement des effets pro-inflammatoires et de perturbateurs endocriniens, affecte simultanément plusieurs organes (les organes périphériques : foie, tissus adipeux, tube digestif, pancréas, tissus lymphoïdes, les glandes endocrines, la peau) et les systèmes nerveux centraux et périphériques responsables des comportements de prise alimentaire, proprioception, nociception et réponses autonomes. De plus, l'effet des polluants dépend de leurs voies de pénétration dans l'organisme (per os ou volatil). Il est par conséquent impossible aujourd'hui de pouvoir réaliser notre étude d'impact des polluants autrement que dans un contexte in vivo global. Le développement des effets sur la santé psychique et neurologique (stress-anxiété, prise alimentaire, proprioception, nociception et autonome) fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car il n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Le nombre de souris a été réduit autant que possible, tout en étant suffisant pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables (basé sur nos expériences et un calcul statistique pour trouver un effet significatif). Nous adapterons les tests statistiques en fonction de la distribution des observables, qu’elle soit normale ou non. En cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques. En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques, même si ceux-ci sont moins sensibles. Un nombre minimum d'animaux sera utilisé dans nos procédures expérimentales en respectant strictement ces différents points: (i) Utilisation d’un groupe de souris contrôles commun pour plusieurs séries d'études chaque fois que cela est possible. (ii) multi-prélèvements et création d’une base d’échantillons (cerveau et sang après sacrifice).

Raffinement

Les animaux, en provenance d’élevages accrédités, seront hébergés dans une animalerie certifiée, dans des cages sur portoirs, avec nourriture et boisson ad libitum, dans le respect des règles d’hébergement en vigueurs (respect du nombre d’animaux par cage, condition de vie dans les cages…). Avant expérimentation, les souris seront acclimatées pendant plus d’une semaine durant lesquelles les expérimentateurs les habitueront à être manipulées, pour réduire toutes formes de stress au cours des expérimentations. Les souris sont suivies quotidiennement. A partir du début de l’expérience, les animaux seront pesés 2 fois par semaine afin de suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs évalueront aussi l’état général des souris quotidiennement afin de déterminer la présence ou non de signes de souffrances excessives (comportement d’isolement, attitude soumise, dos voûté, respiration difficile, extrémités pâles, démarche anormale, diarrhée, vocalises, agressivité…). En cas de souffrance, les animaux seront traités selon la sévérité du comportement observé et en cas où les signes de souffrance persisteraient, les animaux seront euthanasiés. Une fiche d'observation longitudinale et une grille d'évaluation de l'état de nos souris ont été établies. Nous utiliserons des souris mâles et femelles. Notre étude présente un intérêt translationnelle, étant donné que l’exposition aux plastiques polluants environnementaux affecte les humains, il est donc nécessaire de mesurer les effets des molécules étudiées sur les deux sexes. Par ailleurs, il est bien documenté que mâles et femelles peuvent avoir des différences notables dans la réponse inflammatoire et leur sensibilité aux polluants environnementaux

Choix des espèces

La souris est une espèce très utilisée dans les études précliniques et en recherche fondamentale pour analyser la relation entre l'exposition à des substances potentiellement toxiques et les effets sur le métabolisme, les états inflammatoires et le comportement des animaux. La proche similitude du patrimoine génétique de la souris avec l'homme nous permet dans la mesure du possible de tirer des conclusions extrapolables pour la santé humaine, dans une étude au potentiel translationnel important.