Organes sensoriels

Tous tués au terme de l'étude pour analyse de leur œil, 104 rats aveugles et immunodéprimés reçoivent une greffe de cellules rétiniennes humaines, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sept anesthésies en trois mois pour la chirurgie intraoculaire, l'imagerie et l'enregistrement de l'activité électrique de la rétine. Le porteur signale des décollements localisés de rétine et de petites hémorragies oculaires possibles après injection, une perte de poils liée à la lignée qui s'accumule sous les paupières, et une mise à mort immédiate en cas d'inflammation ou d'infection de l'œil. Il retient un taux d'échec de 20 à 30 % lié à la chirurgie, au rejet de greffe ou à l'opacification du cristallin, chiffre intégré au calcul des effectifs.

Objectifs

Les rétinites pigmentaires (RP) entrainent des pertes sévères et rapides de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité et affectent des millions de personnes dans le monde. Les RP sont d’origine monogénique et affectent environ 200.000 personnes en France. Jusqu’à présent aucun traitement n’est disponible dans la plupart des cas. Dans ce contexte, la thérapie cellulaire visant à remplacer l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dysfonctionnel ou perdu constitue une piste déjà très avancée avec l’incroyable potentiel thérapeutique des cellules souches pluripotentes induites (cellules iPS). le projet consiste à greffer des cellules de patients RP modifiées génétiquement pour corriger la mutation à l'origine de la pathologie. Ainsi, cela permettra de démontrer que les cellules de patients sont devenues fonctionnelles.

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les rétinites pigmentaires ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à partir de cellules souches pluripotentes humaines différenciées en cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) pour préserver la vision dans ces maladies.

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. Cette opération consistera en la transplantation intraoculaire (sous la rétine) de trois types de cellules de la rétine différentes assemblée en un feuillet de cellules. Pour ces études une lignée de rats modélisant la rétinite pigmentaire et avec une immunodéficience (pour éviter les rejets de greffe) sera greffée avec les cellules. Cette opération sera rapide et durera 15 à 20 minutes. Elle ne sera réalisée qu’une seule fois par rat. Tous les animaux seront examinés par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (15 minutes par rat) et feront également l'objet d’un examen de l'activité électrique de la rétine (30 minutes par rat) qui permettra l’étude de la fonction de ce tissu. Ces examens qui nécessitent l’immobilité de l’animal se feront sous anesthésie générale. Les animaux seront également évalués avec un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière. Ce test de la fonction visuelle est rapide (5 à 10 minutes environ). Tous ces examens seront réalisés une fois par mois (pendant 3 mois). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur les animaux vivants. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'oeil.

Impact sur les animaux

-Anesthésies : 7 fois par animal au cours de l’étude qui dure 3 mois (risque cardio-respiratoire et d’hypothermie) -Les injections sous-rétiniennes/greffes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. -Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’electroretinogramme). -Le phénotype nude entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statut immunodeficient.

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologiques) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration au tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d'évaluer que des paramètres isolés de culture et non des interactions avec une rétine. Il n'est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d'un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul oeil ; l’oeil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..)) lors de nos précédentes études aux approches similaires. Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, Les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques adaptés aux petits effectifs. Au total, 104 animaux sont prévus pour cette étude.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation (cages de stabulation avec enrichissement (bâtons à ronger, lambeaux de papier kraft), nourriture et boisson à volonté). Dans ce modèle de rat, le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'oeil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Le phénotype aveugle ne gêne pas l'accès à l'eau et à la nourriture qui sont facilement accessibles et à volonté dans la cage. Les rats bénéficieront d’une anesthésie générale fixe. Pour les injections intraoculaires, une anesthésie préalable de la cornée sera réalisée. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré- et post-opératoire par l’injection d'analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24 heures suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’ inflammation ou d’infection de l’œil entraînera l’euthanasie.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques permettent une comparaison des résultats avec ceux de la littérature. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats modèlisant la rétinite pigmentaire et immunodéficient : Ces rats portent une mutation spontanée qui conduit à la perte rapide de la vue et une autre mutation qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Comme la perte des cellules de la rétine débute dès 3 semaines après la naissance, les rats seront opérés à 4 ou 5 semaines (début de la dégénérescence des photorécepteurs). L'ensembles des autres actes des différentes procédures seront réalisées au plus tôt un mois après la transplantation : à 2, 3 et 4 mois, le stade le plus tardif prévu par l’étude.

Enduites de crème Aldara provoquant une dermatite proche du psoriasis, 936 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements de tissus. Elles reçoivent en plus des injections intrapéritonéales quotidiennes, une semaine sur deux pendant neuf semaines, et présentent stress et grattage. Le projet cherche le rôle de certaines enzymes dans l'inflammation cutanée, en vue de futures cibles thérapeutiques. Le porteur affirme avoir limité le nombre d'animaux par des travaux in vitro préalables, mais juge l'étape animale "indispensable".

Objectifs

Notre laboratoire étudie le rôle des médiateurs de l’inflammation au cours des pathologies inflammatoires chroniques de la peau telles que le psoriasis. La description de l’activité de ces médiateurs proinflammatoires permet d’identifier celles qui jouent un rôle primordial dans la physiopathologie de la maladie et de les cibler en thérapie. Bien que quelques médiateurs proinflammatoires constituent des cibles thérapeutiques validées en clinique, des mécanismes d’échappement sont toujours observés, nécessitant l’identification de nouvelles cibles originales. Dans le cadre d’une collaboration scientifique nationale, nous étudions le rôle de certaines enzymes du microenvironement inflammatoire. Les rôles respectivement pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de ces molécules sont décrits dans un contexte tumorale et des outils de blocages de ces enzymes sont en cours de validation chez l’animal. Néanmoins, leurs expressions par les cellules résidentes cutanées (kératinocytes, fibroblastes) ou par les cellules immunitaires et leurs activités biologiques sont peu caractérisées dans les maladies inflammatoires chroniques cutanées. Des résultats préliminaires montrent que l’expression de ces enzymes est modifiée dans les lésions psoriasiques humaines et que les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules immunes peuvent produire ces enzymes in vitro dans un contexte inflammatoire. Le but de notre projet est de démontrer les roles régulateurs de ces enzymes dans la dermatite psoriasiforme chez la souris en utilisant des animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes et des inhibiteurs originaux spécifiques de ces enzymes.

Bénéfices attendus

Ces résultats nous permettront de mieux comprendre le rôle joué par certaines enzymes dans la régulation de l’inflammation cutanée. A terme, le développement des inhibiteurs testés dans notre projet pourrait améliorer la prise en charge des patients présentant des lésions chroniques en ciblant l'inflammation induite par ces enzymes.

Procédures

-Injection intrapéritonéale tous les jours pendant 5 jours, sur animal vigile (n=72 souris). -Anesthésie générale par injection intra-péritonéale (n=936 animaux). -Application quotidienne en vigile de crème Aldara ou de vaseline sur l’oreille et sur le dos de l’animal une semaine sur 2 pendant 9 semaines (n=936 animaux). -Injection quotidienne par voie intrapéritonéale une semaine sur 2 pendant 9 semaines (uniquement pour les animaux traités, n=468 animaux). -Administration une fois par semaine des inhibiteurs enzymatiques ou des excipients par application sur l’oreille et le dos, ou par injection intrapéritonéale pendant 9 semaines. (n=468 animaux).

Impact sur les animaux

-injections intrapéritonéales: douleur et stress légère et transitoire -Anesthésie fixe : incomfort léger et transitoire au réveil -Application de crème sur le dos et l’oreille : stress léger et transitoire. Phénomènes de grattage.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements tissulaires et analyses histologiques et moléculaires

Remplacement

Nous avons limité le nombre d’animaux utilisés dans notre projet en réalisant en amont des expériences sur des modèles in vitro de kératinocytes, fibroblastes, monocytes et leucocytes. Ces données nous ont permis de cibler ces 4 types cellulaires et d’analyser les expressions et fonctions de ceraines enzymes dans l’inflammation. L’intégration de ces types cellulaires dans le tissu cutané in vivo est maintenant indispensable pour vérifier les profils d’expression et les fonctions identifiées in vitro. L’utilisation d’animaux génétiquement modifiés n’exprimant pas ces enzymes dans les types cellulaires cités est indispensable pour démontrer le rôle clé de ces molécules dans l’inflammation. De même, le blocage d’activité par des inhibiteurs originaux seront testés en amont sur des cultures in vitro. Seuls les outils validés in vitro et sans toxicité seront testés sur les souris. A ce jour, il n'existe pas de modèle in silico permettant de réaliser ce projet. La modélisation in vitro ou in silico n’est pas envisageable au vu de la complexité de la réponse inflammatoire cutanée étudiée.

Réduction

L’expérience du laboratoire sur ce modèle d’inflammation chronique et la variabilité mesurée des différents paramêtres de l’inflammation nous ont permis d’utiliser un test de puissance et de calculer un effectif pour avoir des données interprétables statistiquement et robustes. Afin de limiter le nombre d'animaux, une analyse intermédiaire sera effectuée. Si aucune différence n’est observée entre les lots, l’expérience sera stoppée. Si une différence est observée nous procéderons à la réalisation des expériences sur le dernier groupe d’animaux. De même, le test des inhibiteurs enzymatiques ne sera effectué que si un phénotype est observé chez les souris génétiquement modifiées.

Raffinement

Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues avec contrôle de la température par tapis chauffant. Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupe de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées leur permettant de se cacher (nid, tunnel, matériel à ronger). Dans certains modèles d’inflammation, une perte de poids temporaire, liée à une déshydratation de l’animal, peut être observée. Afin de compenser cette déshydratation une réhydration sera effectuée de façon préventive, un gel hydraté mis à disposition dans les cages et le poids des animaux mesuré quotidiennement pendant le traitement. Des points limites gradés précis et adaptés sont proposés et feront l’objet d’une surveillance quotidienne. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocemment en cas de besoin.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris décrit et étudié depuis des décennies, autorise des comparaisons avec le système immunitaire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’inflammation cutanée et évitent d’avoir recours à des espèces animales supérieures. De plus, le projet de recherche inclut des expériences utilisant des modèles animaux modifiés génétiquement disponibles uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 à 14 semaines lorsque leur système immunitaire est bien développé.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des yeux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation dégradant les photorécepteurs dès la naissance, elles reçoivent une injection quotidienne pendant trente-deux jours puis un électrorétinogramme sous anesthésie, pour cribler jusqu'à quarante molécules censées protéger la vision. Le porteur indique que les injections répétées peuvent provoquer une inflammation et une douleur, l'animal étant tué s'il souffre. Il précise avoir testé les molécules sur cellules et tissus mais affirme que leur fonctionnalité "ne peut être évaluée que sur un modèle vivant".

Objectifs

La dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) est une maladie chronique de la macula, zone centrale de la rétine où sont concentrés les photorécepteurs à cônes. Ces derniers sont indispensables à la vision fine et centrale. S’ils dégénèrent, le patient perd l’information visuelle et aperçoit des scotomes (tâche noire) qui comble ce manque d’information. La DMLA est la première cause de handicap visuel chez les personnes de plus de 50 ans dans le monde. Il existe deux formes de DMLA : sèche et humide. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif, seulement quelques traitements permettant de ralentir la propagation de la forme humide. Pour la forme sèche, qui représente 80pourcents des cas de DMLA, de nouveaux traitements sont actuellement en phase clinique. Ces traitements sont des antioxydants (vitamine E) ou bien des traitements agissant sur le système immunitaire, mais aucun de ces traitements ciblent spécifiquement le mécanisme de mort cellulaire des photorécepteurs à cônes. Ainsi, le but du projet est de trouver une/des molécule(s) protégeant les photorécepteurs à cônes de la dégénérescence lorsqu’un patient est atteint de DMLA. Avant de passer sur un modèle vivant, des tests préalables in vitro (photorécepteurs en culture et explants de tissus rétinien) ont été réalisés pour évaluer les effets potentiels neuroprotecteurs des molécules.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’identifier des molécules qui préviennent la dégénérescence des photorécepteurs à cône. Si une ou des molécule(s) est, sont identifiée(s), un traitement pourra ensuite être envisagé pour soigner les millions de patients atteints de DMLA (dégénérescence maculaire lié à l'âge) dans le monde.

Procédures

Injection intrapéritonéale : Nous allons procéder à des injections intrapéritonéales quotidiennement sur animal vigile, pendant 32 jours. Chaque injection dure moins d’une minute par animal. Anesthésie générale : Au bout du 33ème jours, une anesthésie générale sera effectuée sur chaque animal afin de réaliser l’ERG. L’anesthésie générale sera injectée en intrapéritonéale. Electrorétinogramme (ERG) : Cet examen clinique permet de mesurer l’activité des photorécepteurs suite à un stimulus lumineux. Ainsi, cet examen nous permettra de déterminé si l’animal à une vision restauré ou non selon les molécules injectées. Pour cela, la cornée sera anesthésiée localement et la pupille sera dilatée par médication. Des électrodes seront placées afin d’enregistrer l’activité électrique généré par la rétine suite à un stimulus lumineux. Les deux yeux seront soumis à cette procédure. L’ERG dure environ 40 minutes par animal. Les souris passeront 1 fois par cette étape expérimentale. Les souris seront placées en chambre de réveil chauffée à 32 degrés et seront surveillées jusqu’à leur complet réveil après l’anesthésie. Les souris seront euthanasiées par une méthode réglementaire à la fin de la période de maintien afin de réaliser le prélèvement des yeux et les analyses nécessaires.

Impact sur les animaux

Une inflammation peut être entraînée par les injections intrapéritonéales au niveau abdominal ainsi qu’un léger stress et une douleur de courte durée lors de l’introduction de l’aiguille. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme). Risque faible de mauvaise réaction à l’anesthésie générale lors de l’électrorétinogramme.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les yeux prélevés (après euthanasie) pour permettre des analyses histologiques complémentaires. Tous les animaux des procédures seront euthanasiés par une méthode réglementaire.

Remplacement

Les molécules qui seront injectées in vivo ont été préalablement sélectionnées. En effet, celles-ci ont été testées sur deux modèles différents : l’un cellulaire et l’autre tissulaire dont tous deux présentaient une dégénérescence des photorécepteurs à cône. Grâce à ces modèles nous avons sélectionné des molécules ayant une double action,1) de protection contre la mort cellulaire et 2) de préservation de la structure des photorécepteurs à cône. La fonctionnalité des photorécepteurs ne peut quant à elle être évaluée uniquement sur un modèle vivant. Dans le cas présent nous effectuerons les tests sur un modèle murin présentant une dégénérescence similaire à celle de l’Homme.

Réduction

Suite à un calcul de puissance, nous estimons que 10 souris par groupe (1 groupe correspondant à 1 molécule ou 1 véhicule) est suffisant pour réaliser des tests statistiques. Nous prévoyons de tester un maximum de 40 molécules sur les 5 ans. Soit un total de 800 souris. Les lots seront composés de la manière suivante : souris et molécule ou souris et véhicule (témoin). Pour une interprétation fiable des résultats, ces derniers seront soumis à des tests statistiques. De plus, dans un esprit de réduction du nombre d’animaux, nous regrouperons les témoins pour les molécules aillant le même véhicule.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton pour le nid, maison en carton), alimentation et abreuvement à volonté. Pour la réalisation des électrorétinogrammes, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale associée à une anesthésie locale de la cornée. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant la procédure. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intrapéritonéale. Nous appliquerons une noisette de pommade anti-inflammatoire et antibactérienne à la fin de l’électrorétinogramme. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (coton pour le nid, maison en carton), ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux utilisés dans ce projet naissent dans notre animalerie. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire une douleur chez les animaux. Si cela se produit, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris utilisée dans ce projet est un modèle lié à une mutation spontanée induisant une dégénérescence précoce des photorécepteurs. Ce modèle est très utilisé par la communauté scientifique dans le cadre de rétinopathie pigmentaire récessive très utilisé par la communauté scientifique. Ces molécules seront injectées sur ces sourisqui , présentent une dégénérescence précoce des photorécepteurs dès leur naissance.. La dystrophie des photorécepteurs à cône débute aux alentours de 14 jours après la naissance (P14) des animaux et se termine à 90 jours après leur naissance. D’après une étude, nous pouvons réduire la fenêtre de dégénérescence de P14 à P45, où moins de 50 pourcents des corps cellulaires et moins de 25 pourcents des segments externes sont encore présent chez les photorécepteurs à cônes. Donc, nous injecterons les animaux entre P14 à P45, soit la période à laquelle les photorécepteurs à cône dégénèrent.

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation de bactéries de peau humaine par voie sous-cutanée ou dans une plaie créée au poinçon de 4 mm, avec prélèvements de sang rétro-orbitaires, avant mise à mort par dislocation cervicale au cinquième jour d'infection. Le porteur indique que l'injection peut provoquer des abcès ou une infection systémique "possiblement douloureuses" et surveille la douleur au moyen d'une grille de score. Il affirme qu'un processus impliquant autant de types cellulaires est "impossible à reproduire in vitro" et que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet.

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne. AMENDEMENT : Les nouvelles souches de souris qui seront utilisées permettront de mieux déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections bactériennes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort à J5 de l'infection pour analyse histologique de la peau et quantification du nombre de bactéries.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales. Le nombre d'animaux a été détermié par une approche statistique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.

24 souris Hairless vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois formulations à principe actif leur sont appliquées quotidiennement sur le dos pendant 14 jours, ce qui "pourrait induire avec le temps le développement de rougeur (érythème) ou de gonflement (œdème)". La peau est prélevée après mise à mort pour évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement cutané sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la tolérance cutanée et la biodistribution dans la peau de 3 formulations différentes appliquées quotidiennement sur le dos des souris pendant 14 jours consécutifs. Chacune des 3 formulations à évaluer possédera un pricincipe actif différent mais avec les mêmes composants permettant une meilleure diffusion et distribution dans le tissu cutané. Pour effectuer l’évaluation de la tolérance de ces 3 formulations, en comparaison avec une formulation neutre dépourvue de principe actif, une observation quotidienne de la zone traitée sera effectuée avec un scorage de différents paramètres. Un suivi pondéral régulier des souris et une observation de leur comportement seront effectués au cours des 14 jours de traitement. A l’issue des 14 jours de traitement, un prélèvement cutané au niveau de la zone d’application des différentes formulations sera effectué afin de réaliser un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la tolérance, par le tissu cutané, des traitements effectués, et la biodistribution dans la peau des produits appliqués. Cette étude permettra ainsi de sélectionner la formulation ayant la meilleure tolérance cutanée et la meilleure biodistribution au niveau du tissu cutané pour la réalisation d’une étude d’efficacité sur un modèle de lésion précancéreuse de la peau (kératose actinique).

Bénéfices attendus

La kératose actinique est une lésion cutanée développée à partir de cellules constituant 90 % de la couche superficielle de la peau (épiderme), est dont les deux facteurs de risque principaux sont l’exposition solaire avec les rayonnements ultraviolets, ainsi qu’une peau sensible, personnes ayant une peau et des yeux clairs. En France, il s’agit d’une des premières causes de consultation chez le Dermatologue et son incidence double tous les 10 ans proportionnellement au vieillissement de la population. Une kératose actinique se traduit par un épaississement de la surface de la peau aux endroits du corps exposés au soleil pendant une période prolongée. Elle est considérée comme précancéreuse et peut évoluer de différentes manières : elle peut se résorber spontanément, persister ou augmenter de volume plus ou moins rapidement. Dans 16 à 20 % des cas, elle peut évoluer vers un cancer cutané. Différents traitements locaux sont possibles en fonction de la localisation, des caractéristiques du patient et de celles de la kératose actinique. Cependant les effets indésirables varient en fonction du type de kératose actinique et de la durée des traitements nécessaires. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter ces lésions précancéreuses avant qu’elles ne se transforment en lésions cancéreuses, avec la meilleure tolérance possible, par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge de personnes atteintes de kératose actinique.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à une application cutanée quotidienne sur le dos pendant 14 jours d’une formulation neutre ou d’1 des 3 formulations contenant chacune un principe actif différent. Ces applications cutanées effectuées sur animal vigile seront effectuées en 1 minute environ chaque jour. Pour chaque souris, la zone d’application des formulations sera observée quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin de suivre la tolérance cutanée au cours du temps. Ces observations seront effectuées sur animal vigile, en 1 à 2 minutes environ chaque jour.

Impact sur les animaux

Les applications cutanées quotidiennes des formulations effectuées sur animaux vigiles pourront engendrer un léger stress mais qui devrait s’estomper progressivement au cours des 14 jours de traitement, celles-ci étant réalisées en moins d’une minute par du personnel expérimenté et en limitant le nombre de personnes manipulant les animaux et réalisant les traitements. Ces applications cutanées répétées des formulations à évaluer pourraient induire avec le temps le développement de rougeur sur la peau (érythème) ou de gonflement de la peau (œdème) mais avec une douleur induite très limitée du fait des propriétés anti-inflammatoires des principes actifs qui la composent. Les observations quotidiennes effectuées avant chaque traitement n’engendreront pas de douleur et seront réalisées en un temps très court (1 à 2 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 24 souris seront toutes euthanasiées après les 14 jours de traitement cutané. Un prélèvement de peau sera effectué au niveau de la zone traitée pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la tolérance cutanée et la biodistribution des 3 formulations évaluées.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles cellulaires permettant de caractériser sur un temps prolongé la tolérance cutanée et la biodistribution de formulations (influence du microenvironnement cutané et processus immunitaire), et ses effets éventuels sur le comportement. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. L’utilisation de souris mâles et femelles permettra d’obtenir suffisamment de données et d’échantillons pour la réalisation des analyses envisagées. S’agissant d’une étude observationnelle et le nombre d’animaux étant limité, aucune analyse statistique ne sera effectuée.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des traitements quotidiens. Les animaux et la région d’application des formulations à évaluer seront observés chaque jour tout au long de l’expérimentation. Le poids sera relevé 3 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 10% entre 2 pesées ou 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’intolérance cutanée (érythème ou œdème important, ulcération de la peau) ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, prostration, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 3 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm dans une animalerie dédiée au souris immunocompétentes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des morceaux de papier absorbants étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris et plus particulièrement la souris Hairless, dépourvue de poils, est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet. Elle est très utilisée pour les études dans le domaine de la Dermatologie notamment pour les études de tolérance cutanée et d’efficacité sur différents modèles de pathologies dont la kératose actinique. C’est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce projet afin d’évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution de nouvelles formulations. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de tolérance cutanée et de biodistribution (généralement 6 à 8 semaines).

1962 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil et, pour 606 d'entre elles, quatre lésions au laser de la rétine sur un œil, avant récupération des yeux après mise à mort. Le porteur classe l'injection intravitréenne en gravité modérée par précaution et affirme que les lésions laser sont indolores et compensées par le cerveau en moins d'une semaine. Il conclut qu'aucune alternative in silico ou in vitro ne donne accès aux "grandes fonctions physiologiques des mammifères", et prévoit d'arrêter si un vecteur atteint 80 % de neutralisation du VEGF.

Objectifs

Les maladies de la rétine sont des troubles neurologiques majeurs pour lesquels aucun traitement efficace n’existe, et ce malgré les découvertes mettant à jour certains mécanismes liés à leur progression. Pour la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age (DMLA) seuls existent des traitements palliatifs visant à réduire la prolifération de nouveaux vaisseaux immatures dans la rétine avec des anticorps administrés en Injection Intravitréenne (IVT) et qui sont dirigés contre un facteur de croissance des vaisseaux sangins : le VEGF. Ces nouveaux vaisseaux immatures ne sont pas étanches et laissent passer un liquide qui crée un œdème rétinien responsable de la perte de la vision. Ces traitements ne sont que palliatifs et ne ciblent en aucun cas les mécanismes à l’origine du développement de la pathologie. L’approche visant à bloquer en amont la fabrication du VEGF (avant sa synthèse) via des petits bouts d’ARN interférents (siARN) prend donc tout son sens. En effet dans la cellule, des petits bouts d’ARN quittent le noyau (ARN messagers) pour initier la fabrication du VEGF. Les siARN dirigés contre le VEGF entrent dans les cellules et viennent neutraliser les ARN messagers bloquant ainsi la fabrication du VEGF. Depuis plusieurs années notre société et ses partenaires ont mis en place un consortium permettant le développement de vecteurs (V) améliorant la délivrance de siARN dans le Système Nerveux Central (SNC) dont la rétine. Ces vecteurs se présentent sous la forme d’anticorps modifiés et ciblent les récepteurs impliqués dans le transport au travers des barrières biologiques, par exemple pour passer du sang vers le cerveau ou la rétine, ou pour rentrer directement dans les cellules. A ces vecteurs nous venons y accrocher des molécules thérapeutiques comme des siARN dirigés contre le VEGF. Issus du savoir-faire de notre société, nos candidats médicaments sont couplés à nos vecteurs (V-siARN) et transformés dans le but d’améliorer le transport vers la rétine pour augmenter le pouvoir d’action du traitement.

Bénéfices attendus

L’objectif principal de ce projet est donc de combattre plus efficacement les rétinopathies à prolifération vasculaire (la DMLA mais aussi la rétinopathie diabétique) au moyen de vecteurs combinées à des brins d’ARN interférents pour bloquer les messagers cellulaires responsable de la synthèse du VEGF et donc lutter contre la pousse de nouveaux vaisseaux dans la rétine. La valeur ajoutée consiste à tester de nombreux de siARN dirigés contre le VEGF et à améliorer leur délivrance grâce à notre technologie (nos Vecteurs). Cette première phase expérimentale nous permettra de sélectionner les meilleurs couples siARN-Vecteurs pour passer, dans une deuxième étape, aux tests d'efficacité sur des modèles animaux pathologiques. Les bénéfices attendus pour de futures applications chez l'homme sont multiples par rapport à l'utilisation d'anticorps actuellement administrés en IVT. En effet notre technologie autorise nos vecteurs à se lier qu’à un seul type de récepteur sur les membranes des cellules de la rétine, ce qui nous permet de cibler précisément les cellules à l'origine de la surproduction pathologique de VEGF. D'autre part, il est connu que l'utilisation de siARN permet de rallonger significativement l'efficacité d'un traitement dans le temps par rapport aux simple anticorps classiques dirigés contre le VEGF, ce qui en théorie permettrai aux patients d'espacer la fréquence (mensuelle) des injections qu'ils reçoivent ; administration IVT qui reste un geste chirurgical particulièrement anxiogène et porteur de potentielles complications.

Procédures

Les animaux anesthésiés seront soumis à des administrations dans l’œil (IVT) (1440 animaux, durée de l’acte : 5 min par œil) et à 4 lésions laser de la rétine sur un seul œil (606 animaux, durée 30 min environ). Ils seront ensuite hébergés de 4 jours jusqu'à 3 mois maximum (4, 7, 14 jours, 1 et 3 mois pour un petit sous-groupe seulement) avant leur mise à mort pour récupération des yeux. Dans la partie concernant la mise en place du modèle pathologique de pousse de nouveaux vaisseaux immatures induit par lésion laser un groupe restreint d'animaux (30) subira 4 contrôles en imagerie rétinienne des lésions (le jour de la lésion, puis à, 4, 7 et 14 jours, durée 30 min) sous anesthésie générale. Lors de ces contrôles les animaux recevront à chaque fois une injection d’un traceur vasculaire fluorescent (1 min) pour la visualisation des vaisseaux rétiniens. En point final tous les animaux seront mis à mort dans nos expériences.

Impact sur les animaux

La procédure d'administration IVT est considérée comme légère chez l'homme mais pour plus de sureté nous la classons en modérée. Seule une désinfection du pourtour de l’œil est requise avant de commencer. Pour éviter de stresser les animaux, cette procédure sera effectuée sous anesthésie générale avec des antidouleurs. Avec une très faible fréquence, les nuisances pouvant être rencontrées dans ce type d’administration seront surveillées attentivement tous les jours (infections notamment). Pour éviter ce type de complication une pommade antibiotique sera systématiquement déposée sur la cornée. Concernant nos composés, nos données issues de projets précédents avec les mêmes molécules ne montrent pas de réaction du système immunitaire, ni de toxicité apparente. L'autre aspect susceptible d'affecter les animaux concerne les lésions rétiniennes par laser. Ces dernières, indolores, aboutissent à des déficits visuels qui correspondent à des tâches noires dans le champs visuel (< 15° d'angle visuel, ce qui correspond à peu près à des cercles de 10 cm de diamètre à un mètre de distance de l’œil). Au nombre de 4 par animal (en haut, en bas, à gauche et à droite), ces lésions couvrent au total moins de 10% du champ visuel des animaux et ceci sur un seul œil. De plus il est connu que des mécanismes corticaux au niveau des aires visuelles du cerveau compensent une partie de cette perte en moins d'une semaine (la lésion dans la rétine est toujours présente mais l’animal ne voit plus ces tâches sombres : mécanisme de remplissage perceptif). De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux mais nous nous contenterons d'effectuer ces lésions sur un seul œil pour plus de sureté.

Devenir

Dans la procédure 1, un groupe de 720 animaux est inclus pour étudier le potentiel de nos vecteurs couplés au siARN. Si les analyses montrent qu'un couple de nos Vecteur/si ARN atteint plus de 80% de neutralisation des ARN messagers du VEGF-A alors le reste des animaux ne sera pas utilisé. Sinon le reste des animaux inclus sera mis à mort car il est nécessaire pour les analyses de les perfuser pour enlever le sang et nous récupérons les deux yeux pour analyse. Etant donné que nous commandons les animaux pour chaque expérience individuellement, les animaux inclus dans le projet et non utilisés ne seront pas à replacer. Dans la procédure 2 tous les animaux seront mis à mort car ils doivent être perfusés avant récupération des yeux pour analyse.

Remplacement

Toutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifToutes études de mesures physiologiques, de tests de molécules thérapeutiques, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l’heure actuelle aucune alternative (in silico ou in vitro) qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.ères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille, de petite taille, facile d'utilisation, facile à reproduire et disposant d'une large panoplie de modèles génétiquement modifiés est idéale pour la mise en place de premières approches visant à développer de nouveaux médicaments. L’évaluation de l’efficacité de nos vecteurs couplés à une molécule thérapeutique ne peut être réalisé que par une approche in vivo pour réellement mesurer le bénéfice des molécules développées. A noter que la présélection des siARN qui vont être testés passe par une phase de sélection in sillico sur des bases de données informatiques ce qui permet d'éviter d'avoir recours aux animaux et ces derniers sont ensuite testés in vitro sur des cellules en culture avant de passer chez l’animal pour en mesurer l’efficacité.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Pour réduire d'avantage le nombre d'animaux nous avons opté pour des injections IVT bilatérales chez l’animal sain pour la sélection des différents siARN couplés à nos vecteurs car le geste, bien que classifié ici comme modéré, est à considérer comme une procédure légère sans composante douloureuse, ni impact au niveau de la vision. Le fait d'injecter les deux yeux dans cette phase de sélection nous permet donc de réduire le nombre d’animaux de moitié. Le nombre total d'animaux dans cette procédure fait l'hypothèse de l’échec des précédents V-siRNA testés. Si un des composés atteint plus de 80% de neutralisation du VEGF (observation systématiquement quantifiée dans chaque expérience) alors notre objectif sera atteint et le reste des animaux inclus dans le projet ne sera pas utilisé.

Raffinement

Les animaux seront soumis à un protocole anesthésique et analgésique rigoureux. Dans ce projet nous avons remplacé notre précèdent anesthésique par un de nouvelle génération car il permet un réveil plus rapide des animaux et n'entraine pas d'augmentation de la pression intra-oculaire (problématique pour l'IVT). Une couverture analgésique générale et locale permet d'éviter toute souffrance pendant l'expérimentation. Etant donné le court laps de temps d’exposition de nos V-siRNA dans l’œil (en moyenne 14 j et jusqu'à 3 mois pour un petit sous-groupe), ce type d’action n’est pas à même d’entrainer l’apparition de problèmes dommageables chez les animaux (observation effectuée dans nos précédentes études). Pour des questions de raffinement et de bien-être animal les groupes de lésions rétiniennes au laser passeront de 4 à 8 individus : en effet un seul œil sera lésé pour affecter le moins possible leur vision. De fait, ces lésions n’affecteront que très peu la fonction première de cette voie sensorielle et donc le bien-être des animaux. Enfin Le fait de choisir une administration IVT pour combattre les pathologies rétiniennes permet d’utiliser des doses largement revues à la baisse par rapport à une injection intra-veineuse avec une diminution des risques toxiques et immunitaires associés ainsi qu'une distribution dans tout le corps qui n’est pas voulue. Pour éviter toute souffrance animale, nous avons mis en place une grille d'évaluation de la condition des animaux avec toute une série de points limites et les actions y étant associées. Enfin les souris seront hébergées par 4 sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 21°C (portoirs ventilés) et dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglas et dômes en papier, accompagné de nids en coton, de la frisure de papier craft et nous mettrons également à l’intérieur des cages quelques croquettes).

Choix des espèces

Dans ce projet nous avons choisi des souris saines adultes et pigmentées pour 3 raisons : En ophtalmologie il est indispensable d’utiliser des espèces pigmentées (non albinos) car elles ne sont pas dépourvues d’un type de photorécepteur dans la rétine. De plus leur utilisation est indispensable car nos Vecteurs ont été développés pour cibler la version « souris » du récepteur auquel ils se lient. Certains de nos Vecteurs ciblent également la version humaine de ce même récepteur d'où le choix d'une deuxième espèce, des souris adultes, pigmentées et humanisées pour le récepteur ciblé par nos vecteurs et ceci pour évaluer le potentiel de transfert de nos avancées chez l'homme. Enfin nous utiliserons ici uniquement des souris mâles et adultes car il a été prouvé que le modèle de lésion de la rétine que nous allons utiliser est beaucoup plus variable chez les jeunes individus et chez les femelles.