Organes sensoriels
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Acquisition et maintien des compétences techniques en chirurgie expérimentale et analyse comportementale
- Formation professionnelle
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie crânienne d'une heure pour implanter un dispositif de mesure, puis des tests d'équilibre, de motricité et des mesures auditives et vestibulaires dont le nystagmus post-rotatoire. Ces procédures ne visent pas à produire des connaissances mais à maintenir les compétences techniques du personnel, dont la validité expire tous les six mois dans l'établissement. Le porteur décrit le remplacement comme "difficilement applicable" puisque l'objectif est l'entraînement au geste lui-même.
Objectifs
La bonne réalisation d’un projet scientifique utilisant des animaux de laboratoire requiert que le personnel appliquant les procédures expérimentales soit parfaitement formé aux gestes techniques nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Ce projet est dédié au maintien des compétences des personnels maîtrisant les gestes techniques impliqués dans ces 2 procédures. Ceux-ci ayant une durée de validité de 6 mois dans notre établissement, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux spécifiquement pour ce maintien de compétence. Ainsi, la bonne formation du personnel permet 1) d’améliorer le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal effectués, et 2) d’éviter de refaire des expérimentations en raison du manque de reproductibilité des résultats scientifiques et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Cette demande d’autorisation de projet a un double objectif : 1. Former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permettra une montée en compétence des expérimentateurs et donc in fine une diminution probable des mauvaises manipulations pouvant conduire à des mises à morts inutiles ou à des reproductions d’expérimentation. 2. Raffiner les procédures expérimentales, notamment évaluer la possibilité de réaliser diverses procédures fonctionnelles et comportementales sur le même animal et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de former les personnes impliquées dans la mise en oeuvre des procédures afin 1) d’améliorer la santé et le bien-être des animaux en prévenant les gestes mal pratiqués et 2) d’optimiser les procédures expérimentales afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Procédures
Procédure 1 : Mesure de l'activité cérébrale et analyse comportementale de la fonction motrice chez le rat. La procédure comporte une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispostif de mesure de l’activité du cerveau. Ensuite, des tests de comportement (30min au total) sont effectués pour évaluer la motricité et l’équilibre de l’animal. Procédure 2 : Mesure du nystagmus post-rotatoire et évaluation des fonctions vestibulaire et auditive. La procédure inclut une chirurgie crânienne sous anesthésie gazeuse (1h) permettant la mise en place d’un dispositif de fixation pour réaliser le test du nystagmus post-rotatoire (10min). Ensuite, des tests de comportement (10min au total) sont effectués pour évaluer l’équilibre de l’animal. Enfin, des mesures auditives sous anesthésie médicamenteuse sont pratiquées (20 secondes de mesure ; 1h pour le reveil de l’animal dans une armoire chauffante).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux sont principalement dues aux chirurgies crâniennes.
Devenir
La totalité des animaux prévus dans ce projet sont mis à mort à la fin de la procédure les concernant, afin de récupérer les tissus biologiques d’intérêt pour les analyser.
Remplacement
Difficilement applicable à ce projet puisqu’il vise à garantir le niveau de compétence du personnel dans la réalisation des gestes en expérimentation animale. Les mesures fonctionnelles, comportementales et de mises à mort n’offrent pas cette possibilité.
Réduction
Ce projet vise à former le personnel aux diverses méthodes expérimentales réalisées dans l’établissement utilisateur. Elle permet une montée en compétence des expérimentateurs et donc une diminution probable des mauvaises manipulations. Une approche de formation « centralisée » sera mise en œuvre afin que plusieurs personnes puissent assister simultanément aux procédures. L’utilisation de chaque animal est optimisée autant que possible pour réaliser à la fois des explorations fonctionnelles et comportementales : - Les animaux dont l'activité cérébrale est mesurée sont également utilisés pour les tests comportementaux et mis à mort pour l’analyse histologique. - Les animaux dédiés à la mesure du nystagmus post-rotatoire sont également utilisés pour les tests comportementaux, la mesure des produits de distorsion acoustiques, les dosages sanguins et mis à mort pour l’analyse histologique. Ceci permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures.
Raffinement
- Les animaux seront surveillés quotidiennement par les expérimentateurs ou les zootechniciens de façon à évaluer leur état physiologique et leur comportement. Après chaque procédure invasive, un suivi renforcé des animaux sera réalisé afin d’identifier toute forme de souffrance ou d’atteinte de point limite ; - Les animaux seront hébergés à plusieurs par cage à chaque fois que cela est possible ; - Un enrichissement varié (tunnel, éléments de nidification, briquettes en bois) leur sera apporté ; des friandises issues de fournisseurs d'aliments pour animaux de laboratoire leur seront données après la réalisation des gestes ; - Si possible, les animaux seront habitués progressivement aux divers dispositifs au moins une semaine avant le début des tests.
Choix des espèces
Le choix du modèle animal s’est porté sur le rat Long Evans. Le rat est un des modèles recommandés dans les lignes directives de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques, domaine d’expertise du laboratoire. La souche Long Evans a été choisie car il est possède une oreille interne plus proche de l’Homme que celle des rats Albinos. Les procédures sont réalisées sur des rats adultes afin que la croissance du crâne soit terminée, et permettre ainsi les chirurgies crâniennes.
Albinisme et développement du système visuel de modèles murins
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
1833 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés, une partie étant opérée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des injections dans le cerveau ou dans l'œil, une électroporation in utero sur les embryons, puis des tests visuels comme le test de la falaise visuelle et l'électrorétinogramme, avant d'être tuées pour prélever leurs yeux et leur cerveau. Le porteur étudie des mutations responsables de déficits visuels congénitaux et renvoie les retombées thérapeutiques au "long terme". Il décrit un recours à des cellules et des organoïdes pour une partie des expériences, mais indique que la souris reste "le modèle de choix" pour reproduire ces mutations.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mieux comprendre quelles sont les altérations structurelles et fonctionnelles du système visuel dans différents modèles murins de maladies génétiques causant des déficits visuels provenant d’un mauvais développement de l’œil aux stades embryonnaires. Ce projet a l'avantage de combiner des approches variées de génétique de la souris ou permettant l'expression de molécules d'intérêt dans la rétine ou dans le cerveau, des méthodes histologiques et de traçage neuronal permettant d’observer les projections visuelles.
Bénéfices attendus
L’étude de ces souris modèles murins de pathologies visuelles héréditaires permettra de caractériser précisément les défauts visuels (anatomiques, structurels et fonctionnels) et de déterminer ainsi l’impact de chaque mutation afin de comparer leur effet délétère. Ceci nous permettra notamment d’établir des liens de cause à effet et de déterminer un ordre hiérarchique de ces différentes mutations dans les mécanismes à l’origine des divers défauts visuels. De plus, ce projet nous permettra d’identifier les conséquences de ces mutations et de trouver les mécanismes impliqués afin de pouvoir proposer des nouvelles voies thérapeutiques à long terme.
Procédures
1833 animaux seront soumis aux différentes interventions suivantes : - Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux - une injection stéréotaxique cérébrale (procédure chirurgicale, 45 min) ou une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - une électroporation in utero (procédure chirurgicale, 30 min) suivie d’une injection intraoculaire (procédure chirurgicale, 20 min) - des tests comportementaux : test de la taille relative (5x5min en 1 jour), test de la falaise visuelle (10x5min en 3 jours) à suivre, puis 3 jours au moins après au test optomoteur (animal vigile, 2,5 min) et à nouveau 3 jours après au moins à un electrorétinogramme (procédure chirurgicale, 30min) -Pour tous les animaux, une euthanasie sous anesthésie et analgésie générale est réalisée pour prélèvement de tissus (yeux et cerveaux). -Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie et analgésie générale avec une prise en charge analgésique post-opératoire.
Impact sur les animaux
Une biopsie prélevée au niveau de la queue pour déterminer le profil génétique des animaux peut causer de la douleur. Suite à l’anesthésie, il peut survenir de manière rare une réaction de détresse respiratoire ou de mort immédiate. Suite aux actes chirurgicaux, les plaies (crâne ou abdomen) ou site d’injection (œil) peuvent être inflammés ou infectés. Suite à l’électroporation in utero, des problèmes au niveau de la mise bas pourraient survenir du fait de la manipulation des embryons lors de la procédure. Après tous les actes chirurgicaux, une douleur post-opératoire est possible. Les tests comportementaux peuvent induire un stress chez les animaux.
Devenir
Tous les animaux de chaque procédure seront euthanasiés afin de réaliser des analyses histologiques sur les tissus.
Remplacement
Certaines des expériences pour étudier la fonction des gènes impliqués dans ces maladies congénitales visuelles seront réalisées sur des lignées cellulaires ou des cellules rétiniennes ou organoïdes issus de cellules souches pluripotentes induites afin de remplacer l’utilisation de modèles animaux par des modèles cellulaires.
Réduction
Le nombre total d’animaux utilisés est 1833. L'électroporation in utero pour marquer les axones rétiniens et également inactiver ou surexprimer des gènes a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaires par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris mutantes. Les différentes procédures comportementales pour mesurer la vision binoculaire et l’acuité visuelle ainsi que l’enregistrement des cellules rétiniennes seront faites sur les mêmes animaux afin de diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Ces mêmes animaux seront utilisés pour des prélèvement de cerveau et de rétine afin de diminuer le nombre d'animaux utilisés pour le prélèvement de tissu fixé. La taille des effectifs a été établie grâce à des tests statistiques sur des lignées similaires. Plus spécifiquement sur la procédure d’électroporation in utero, des femelles gestantes additionnelles sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés et donc de réduire le nombre de souris sur lesquelles des procédures chirurgicales seront effectuées.
Raffinement
Les expérimentateurs sont formés par des personnes compétentes en respectant les réglementations en vigueur (formation d’expérimentation animale et de chirurgie). La Structure chargée du Bien Etre des Animaux et les personnels de l’animalerie veillent au respect des règles et assurent une surveillance quotidienne, ainsi que le maintien du statut sanitaire. Les animaux sont hébergés selon la législation en vigueur. Les animaux provenant d’un autre établissement utilisateur auront une période d'acclimatation d’au moins 5 jours avant le début des procédures expérimentales. Un suivi post-opératoire ainsi que des points limites ont été définis pour chaque procédure (tels que la surveillance du poids des animaux, l'absence de locomotion, l'état du pelage, la prostration) conduisant à l’euthanasie après consultation du SBEA ou d’un vétérinaire. Toutes les procédures chirurgicales sont accompagnées d’anesthésie et d’analgésie générale. L’anesthésie gazeuse est privilégiée car elle permet un réveil quasi immédiat après chirurgie, ce qui permet à l’animal de récupérer plus vite. Pendant la chirurgie, les animaux sont maintenus sur un coussin chauffant. Pour l’électroporation in utero, des femelles gestantes sont utilisées comme mères adoptives car les femelles s’occupent moins bien de leur portée et encore plus après un contexte d’opération au niveau de l’abdomen. Aucune procédure expérimentale ne sera réalisée sur ces mères adoptives, mais cela permet d’augmenter la survie des petits électroporés.
Choix des espèces
L'organisation des voies visuelles est bien conservée entre la souris et l'humain. Le développement de la rétine et du cerveau est bien caractérisé chez la souris, permettant d’étudier les anomalies dans des modèles de souris de pathologies visuelles congénitales. La souris reste le modèle de choix pour la génération de lignées transgéniques et la plupart des mutations humaines à l’origine des différentes pathologies que nous étudions n’ont été reproduites que dans des modèles murins. Plusieurs stades seront analysés: nous nous intéressons au développement du système visuel en étudiant majoritairement les stades postnataux et adultes pour étudier la connectivité neuronale entre la rétine et le cerveau. Les âges étudiés, jour de naissance (P0), puis 3ème jour postnatal (P3) et 7ème jour postnatal (P7), correspondent différentes étapes de développement du système visuel et il est important de savoir à quel moment les défauts apparaissent chez les modèles murins de maladies. Quand ce n’est pas nécessaire, notamment pour étudier la fonction visuelle, nous utiliserons des souris adultes.
Développement d’un protocole d’IRM fonctionnelle à 1,5 T pour évaluer la stimulation corticale des aires auditives dans un modèle chirurgical d’implantation cochléaire électro-acoustique chez le porc juvénile
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
40 porcs juvéniles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 14 d'entre eux et modéré pour 26. Vingt-six subissent une chirurgie d'implantation cochléaire guidée par scanner, dont treize une opération témoin dite sham, suivie d'examens d'IRM sous anesthésie. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer des douleurs prises en charge par une analgésie morphinique, et que le transport et l'anesthésie sont sources de stress. Il vise à optimiser un dispositif de stimulation cochléaire proposé comme traitement de la surdité et affirme que l'IRM fonctionnelle ne peut être réalisée chez les patients implantés.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont 1) de cartographier les activations cérébrales de porcs en réponse à des stimulations auditives de différentes fréquences, puis 2) de tester un dispositif de stimulation cochléaire bimodale (acoustique et électrique) implanté chirurgicalement chez des porcs, de manière à comparer les réponses cérébrales à des stimulations auditives sonores, acoustique ou électroacoustique.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre de comprendre la manière dont le cerveau traite différents types de stimulation cochléaire par implant chirurgical et de comparer différents types de stimulation sonore (acoustique ou électroacoustique). Les résultats de ce projet permettront d'optimiser le dispositif de stimulation cochléaire proposé comme traitement de la surdité partielle ou totale.
Procédures
L’étape 1 sera réalisée sur 14 porcs juvéniles. Les animaux seront soumis à une évaluation objective de leur audition. Ils passeront initialement une IRM anatomique de référence puis une IRMf sous stimulation auditive à différentes fréquences. L’étape 2 sera réalisée sur 26 porcs juvéniles. Les animaux seront soumis à une évaluation objective de leur audition via l’enregistrement de potentiels évoqués acoustiques (PEA = réponse électrophysiologique spontanée des voies nerveuses auditives) ainsi qu’à une IRM anatomique de référence. Il sera ensuite réalisé une chirurgie d’implantation cochléaire guidée par scanographie (CT-Scan), avec 2 groupes incluant un groupe expérimental et un groupe contrôle : groupe 1 (implant cochléaire, n=13) et groupe 2 (témoin/procédure contrôle, appelée sham, n=13). Après chirurgie, réalisation d’une IRM anatomique et fonctionnelle en conditions de stimulation auditive sonore, acoustique ou électro-acoustique (modalité EAS) pour exploration des réponses cérébrales.
Impact sur les animaux
L'implantation chirurgicale d'un dispositif de stimulation cochléaire au niveau de l'oreille interne peut induire des douleurs, mais celles-ci seront prises en charge par une anesthésie et une analgésie morphinique adaptées, durant la chirurgie et en post-opératoire. Les nuisances propres à l'imagerie cérébrale sont de deux types : le premier type de nuisance concerne le transport de l'animal vers la plateforme d'imagerie, qui est réalisé dans un véhicule climatisé et spécifiquement adapté au transport d'animaux, ainsi que l'hébergement dans une animalerie inconnue qui peut induire un stress (mais les animaux sont toujours hébergés au moins par deux pour permettre les contacts sociaux) ; le second type de nuisance concerne l'anesthésie nécessaire à l'imagerie, cependant cette procédure est rapide et totalement indolore, similaire à celle précédemment réalisée pour la chirurgie (l'imagerie ne nécessite cependant aucune analgésie).
Devenir
Tous les animaux (implantés ou non avec un dispositif de stimulation cochléaire) seront mis à mort à l'issue des procédures expérimentales. Ces animaux ne seront pas réutilisés pour d'autres projets car des prélèvements biologiques seront réalisés post-mortem.
Remplacement
Ce travail ne peut être réalisé chez l’Homme. Il n’existe pas de méthode d’imagerie fonctionnelle qui permette l’enregistrement de l’activité corticale avec une discrimination spatiale et temporelle satisfaisante chez des patients implantés cochléaires. La TEP (tomographie par émission de positons) a une résolution temporelle faible et la NIRS (Spectroscopie proche infrarouge) a une résolution spatiale insuffisante. L’IRM fonctionnelle ne peut pas être utilisée chez les patients implantés car l’implant est à l’origine d’un cône d’ombre qui ne permet pas l’étude du cortex temporal et risque de démagnétiser l’implant.
Réduction
Les effectifs animaux utilisés pour cette étude (40 animaux au total, 14 pour l'étape 1 et 13 par groupe pour l'étape 2) correspondent à un effectif raisonnable pour bénéficier d’une puissance statistique appropriée aux mesures réalisées. Un effectif de 10 correspond à un minimum et nous avons prévu 3 à 4 animaux surnuméraires par groupe pour pallier d'éventuels problèmes lors de la chirurgie ou de l'imagerie.
Raffinement
Les approches d’imagerie et de chirurgie ont été choisies et optimisées de manière à être le moins invasif possible (i.e. imagerie in vivo sur animaux anesthésiés, anesthésie chirurgicale guidée par scanographie et analgésie pré- et post-opératoire pour le protocole d’implantation chirurgicale). La réduction de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse sera effectuée de la façon suivante : - Réduction de la douleur par des approches minimalement invasives en chirurgie et imagerie (IRMf) ; - Les animaux ne seront présents dans des cages qui limitent leur mobilité que durant un temps très bref (en l’occurrence au maximum 24h lors de leur(s) passage(s) sur la plateforme d’imagerie) et des enrichissements de milieu seront fournies (jouets adaptés) ; - Lorsqu’une analgésie sera nécessaire, notamment au cours ou après la chirurgie, celle-ci fera appel aux morphiniques avec un suivi complet des fonctions vitales ; - Des observations quotidiennes de l’état général des animaux (état sanitaire, posture, refus alimentaires, etc.) seront réalisées tout au long de l’expérimentation. Les points limites suivants autorisent le personnel animalier à pratiquer une euthanasie afin de prévenir une douleur chez les animaux sans en référer au préalable au responsable de l’expérience : - Plaies et escarres suintantes toujours présentes après 5 jours de traitement - Perte musculaire significative des membres postérieurs entrainant une difficulté motrice - Difficultés motrices associées à un trouble du rythme cardiaque au repos - Douleur comprise entre un score de 10 et 15 ET (grille utilisée en interne pour évaluer la douleur sur des critères physiologiques et comportementaux – score de 0 à 15) ne disparaissant pas après un traitement morphinique - Arrêt du transit intestinal durant plus de 3 jours - Hypothermie de 37,5 ou moins - Hyperthermie ne disparaissant pas après deux antibiotiques successifs Déshydratation supérieure à 35% - pli de peau supérieur à 20 secondes - Comportement prostré et arrêt d’alimentation durant plus de 3 jours
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc juvénile en raison d’une similarité structurelle par rapport à l’humain et d’un modèle d’étude d’imagerie comparable à l’Homme. De nombreuses études ont montré que la structure de l’oreille moyenne était similaire à celle de l’humain. De plus, la cochlée du jeune porc a fait l’objet de nombreuses études ayant permis de mettre en évidence des similarités permettant l’étude de la fenestration cochléaire et la réalisation d’examen tomographique des structures cochléaires. De nombreuses études ont aussi exploré le cortex cérébral du porc, mettant en évidence des similarités de structures notamment au niveau de l’anatomie des circonvolutions et de la vascularisation. Les animaux utilisés seront des porcs juvéniles (2 mois en début d’expérience) puisqu’il s’agit du meilleur compromis en termes de taille d'animaux et de résolution spatiale. Des porcs juvéniles de 30-40 kg sont plus petits et donc plus facilement manipulables que des porcs conventionnels adultes, mais la taille de leur crâne et de leur cerveau est suffisante pour les imageries et la mise en place de l’écouteur dans le conduit auditif externe. L’âge suffisamment jeune permettra aussi de s’affranchir des problèmes de presbyacousie.
Complément alimentaire et rétine
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles subissent des gavages quotidiens pendant cinq jours et un enregistrement de l'activité de la rétine sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs rétines. Le projet cherche à vérifier in vivo l'effet d'un complément alimentaire pour les yeux déjà largement vendu en ophtalmologie. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer cette confirmation dans un "contexte physiologique complexe".
Objectifs
Ce projet a pour objectif de compléter des expérimentation mener in-vitro sur les cellules de Muller et des cellules d'épithélium pigmentaire rétinien (RPE). En effet nous avons pu mettre en évidence que l'apport d'un complément alimentaire à visée oculaire, enrichi en acide gras polyinsaturés, antioxidants et vitamines, induit des modifications du métabolimse glutamatergique et présente un effet protecteur contre le stress oxydant in-vitro en culture de cellules. La question est donc maintenant de savoir si ces effets sont similaires in-vivo.
Bénéfices attendus
Les compléemnts alimentaires à visée oculaire sont largement utilisés en ophtalmologie sans que leurs effets soient clairement identifiés. Par conséquent, ce projet permettra d'éclaircir le mécanisme d'action de ce complément et de mettre en évidence ses éventuelles limites.
Procédures
Les animaux seront soumis à des gavages quotidiens de complément alimentaire ou d'eau pour les animaux contrôles pendant 5 jours. Le gavage est un geste durant moins d'une minute. Les enregistrements électrorétinographiques sur animal anesthésié durent maximum 30 minutes, mise en place comprise.
Impact sur les animaux
Lors du gavage il peut se faire que les animaux bougent et s'irritent au niveau de la trachée ce qui conduirait alors à un défaut d'alimentation et une perte de poids. Toutefois, notre expérience de gavage nous permet de maitriser cet acte de manière à être confiant sur l'absence d'effet indésirable sur les animaux. Toutefois, le comportement des animaux sera évalué quotidiennement et ils seront pesés quotidiennement afin de vérifier une prise de poids adéquate au cours de l'expérimentation.
Devenir
Après les électrorétinogrammes réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés pour prélever les rétines et réaliser des analyses de biologie moléculaire et biochimiques
Remplacement
A ce stade aucune méthode alternative actuelle ne permet de remplacer les protocoles et procédures décrits ci-dessous. En effet, il est nécessaire de confirmer que les observations faites in-vitro sont similaires chez l’animal in vivo dans un contexte physiologique complexe.
Réduction
Les enregistrements électrophysiologiques seront réalisés sur les animaux avant de les euthanasier. Les analyses de biologie moléculaire seront réalisées sur le même échantillons dans la mesure du possible afin de limiter le nombre de souris à euthansier pour le prélèvement des échantillons. Effectuer les enregistrements électro physiologiques et les prélèvements pour analyses sur le même échantillon, dans la mesure du possible, permet de limiter le nombre de souris. Nous travallions avec un nombre d'animaux le plus faible possible mais de manière à ne pas compromettre la pertinence des résultats.
Raffinement
Afin d’assurer le bien-être et le confort des animaux, les souris seront surveillées et manipulées tous les jours par l’expérimentateur et les personnes compétentes. Elles ne seront jamais isolées dans leur cage, et auront un environnement enrichi (des rouleaux en carton et des bandes de papier pour réaliser leur nid) avec accès libre à la nourriture et l’eau. Leur état physique sera évalué avant chaque et après chaque manipulation expérimentale pour détecter toute lésion, signe clinique ou comportemental traduisant l’inconfort, le stress, ou une maladie (liés ou non à l’étude). Un tableau d'évaluation avec les critères suivants permettra d'objectiver la décision : dégradation de l’état physique, manque de toilettage, piloerection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, maigreur (perte de plus de 15% du poids) ou obésité, et présence de tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue). Dans le cas où l’animal montre au moins un de ces signes cliniques, soit il pourra être soigné (administration des antalgiques contre la douleur, désinfection des blessures, réhydratation par administration de saline sous-cutané, etc.) sans compromettre les résultats et il sera gardé dans l'étude, soit il ne peut pas être soigné, alors sa manipulation sera arrêtée et nous procèderons à sa mise à mort. Dans le cas où l’animal présente trois ou plus des signes cliniques nous procèderons à sa mise à mort. Des points limites seront mis en place pour chaque procédure.
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet nous utilisons des souris car c'est cette espèce qui a été utilisée pour les cultures primaires de RPE et de cellules de Muller.
Etude de l’effet du mir155 sur l’intégrité vasculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
41 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs yeux, afin d'étudier le rôle du micro-ARN mir155 dans la formation des vaisseaux de la rétine. Le bénéfice avancé reste conditionnel, un futur médicament qui préserverait l'intégrité des vaisseaux si le mir155 les déstabilise. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'angiogenèse de la rétine et qu'aucune culture 3D n'est envisageable.
Objectifs
L'angiogenèse est un processus biologique qui consiste en la formation de nouveaux capillaires sanguins à partir de vaisseaux préexistants. Ce processus est conduit par les cellules endothéliales. Il est fondamental pour la cicatrisation des tissus et le développement embryonnaire. Cependant, l’angiogenèse aggrave de nombreuses maladies telles que le cancer et les pathologies inflammatoires chroniques. Une dérégulation de ce processus est responsable des rétinopathies. Les micro-ARN (mir) sont des petits acides ribonucléiques produits par la cellule qui ne sont pas traduits en protéines. Leur rôle est de réguler l’expression de gènes en bloquant la traduction des ARN messagers en protéines. Des études chez l’humain ont révélé la présence de plus de 500 mir différents pouvant cibler potentiellement près de 30 % des ARNm humains. Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures. L’accessibilité du réseau vasculaire à la surface de la rétine permet une quantification précise de différents paramètres comme la fraction de tissu vascularisé, la densité de vaisseaux et le niveau de ramification du réseau vasculaire, et cela sur l’intégralité de la surface de la rétine. Il existe déjà des protocoles standardisés pour la quantification de ces paramètres dans ce modèle. Ceci est réalisable en injectant d’une part, un inhibiteur (anti-miR-155 ou antagoMir) pour évaluer sa capacité à bloquer le processus, et d’autre part en injectant un activateur (miR-155 mimic) pour stimuler le processus. L’analyse des paramètres d’angiogenèse sera effectuée par microscopie confocale après immunofluorescence réalisée sur les rétines entières, à l’aide d’un protocole déjà établi.
Bénéfices attendus
Si le Mir155 déstabilise les vaisseaux sanguins matures, il sera possible d'utiliser un medicament qui l'inhibera pour que les vaisseaux restent intacts (intégrité vasculaire préservée)
Procédures
Nous souhaitons dans un premier temps, administrer localement (injections intraoculaires sous anesthesie générale par inhalation d'isofluorane ) deux doses différentes de ces molécules couplées à un fluorochrome afin d’évaluer la quantité de molécules que nous retrouverons dans les cellules endothéliales de la rétine. Dans un deuxième temps, nous administrerons ces deux molécules non marquées, à la concentration la plus efficace (d’un point de vue de la demi-vie et du ciblage des cellules endothéliales) , afin de déterminer leurs effets sur l’angiogenèse (ce qui nous permettra ensuite de réduire le nombre d’animaux). L'intervention dure 20 min. Le prélèvement de la rétine ne peut se faire sans éviter l'euthanasie de l’animal .
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, les sources de douleur et de stress pourraient provenir de la procédure d’injection intraoculaire. Il n’y pas d’inconfort ou d’effets indésirables connus causés par cette procédure comme déjà décrit dans la bibliographie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale . Il est impossible d'étudier l'angiogenese de la rétine sans euthanasier l'animal puisque nous devons prélever les yeux pour l'extraire.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro permettant d’étudier la croissance et l’intégrité des vaisseaux sanguins dans un environnement complexe (cultures comprenant les cellules du sang, les péricytes (autres composants cellulaires des vaisseaux sanguins), la matrice extracellulaire, le flux sanguin.....). La mise au point de certains paramètres (dose-réponse, toxicité, demi-vie du composé à injecter…) de l’expérience peut être réalisée sur cellules endothéliales d’origine commerciale mais il est impossible de « mimer » l’angiogenèse de la rétine et d’étudier son intégrité en culture 2D. Aucun protocole de culture 3D n’est envisageable.
Réduction
Basé sur notre expérience du modèle, nous devons prendre en compte que les étapes d’injection et dissection peuvent induire la perte de 10% des échantillons (1 œil) et que le traitement pourrait échouer sur 10% des animaux (1 œil). Par conséquent, nous avons pu réduire le nombre d’animaux à 5 animaux par sous-condition pour que l’analyse soit statistique ceci pour chacun des 3 groupes expérimentaux. D’autre part, l’avantage d’étudier l’œil est que chaque animal constitue son propre contrôle car nous étudierons aussi l’œil non injecté (contralateral) qui constituera un contrôle interne permettant d’évaluer les effets du composé injecté (animaux traités au miR ou antimiR) et également les effets de la procédure d’injection en elle-même (animaux injectés avec la version contrôle du miR ). Ceci permet de réduire le nombre d’animaux en évitant de sacrifier une autre série d’animaux juste pour collecter des yeux sains.
Raffinement
Les souris adultes sont hébergées en groupe sociaux, la plupart du temps entre frères ou entre sœurs dans un environnement approprié (litière, boisson et alimentation, dôme) L’élevage est supervisé par le personnel compètent de l’animalerie conventionnelle Pour limiter une éventuelle douleur liée à l’injection, un anesthésique local en gel ophtalmique sera appliqué sur la paupière avant et après l’injection. De plus, nous délivrerons un anti-inflammatoire non steroidien qui permettra une couverture de la douleur sur 24h, soit jusqu'à l'euthanasie des animaux Nous veillerons à ce que la phase de réveil se fasse dans les meilleurs conditions (surveillance accrue, température de la cage...). Nous veillerons à ce que les animaux s’alimentent et s’hydratent normalement. Nous surveillerons leur comportement et l’apparition d’éventuelles blessures.
Choix des espèces
En se basant sur la bibliographie dans le domaine, il apparait que le modèle de rétine postnatale de souris C57Bl6J est le plus approprié pour l’étude de l’angiogenèse in vivo. Ce modèle présente l’avantage d’être peu invasif . Il a été démontré dans des souris nouveaux nés que le Mir155 est un nouveau facteur angiogénique qui génère des vaisseaux anormaux ressemblant à des vaisseaux tumoraux. Il est nécessaire de confirmer ces observations dans des souris adultes (P21) sur des vaisseaux sanguins matures.
Méthode d’identification et de caractérisation génétique chez les rongeurs
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Rats : 1000
75 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est contenu quelques secondes pour un tatouage et une biopsie d'oreille destinée au génotypage, sous isoflurane au-delà de quatorze jours. Le porteur réutilise environ 1 100 animaux pour d'autres projets ou pour la formation, et fait tuer les autres, notamment les génotypes non souhaités et les animaux d'élevage trop âgés. Il caractérise génétiquement quatre-vingts lignées de son animalerie et affirme qu'identifier les individus est "nécessaire" à leur utilisation scientifique.
Objectifs
L'objectif est de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre animalerie pour gérer nos élevages et être utilisés dans des projets scientifiques (ex: identifier des biomarqueurs de l'hypoxie, étudier des gènes de l'infertilité, étude de l'arthrite, étude de cancérologie pour trouver et mettre au point des traitements, ...).
Bénéfices attendus
Notre établissement utilise en routine pour l'élevage des lignées génétiquement altérées: l'identification par tatouage des phalanges et la biopsie d'oreille pour le génotypage. Ce projet permettra de caractériser génétiquement les 80 lignées de notre élevage de souris et rats génétiquement altérées nécessaires à différents projets de recherche.
Procédures
L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
La contention pouvant engendrer un stress et des douleurs légères au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d'oreille), nous serons vigilant à effectuer cette méthode d 'identification de façon rapide et avec précision. L’anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés. Le geste sera réalisé par du personnel dûment formé ayant suivi un tutorat relatif à ce geste technique.
Devenir
Mise à mort des animaux pour les génotypes non souhaités, les animaux d'élevage trop âgés, les animaux au cours de leur élevage fin d'éviter des situations de souffrance. Gardés en vie pour une utilisation continue pour l'élevage ou vers les projets prévus pour ces animaux et réutilisation vers les projets non prévues pour ces animaux pour la formation.
Remplacement
L’utilisation de rongeurs à des fins scientifiques nécessite de pouvoir identifier les individus et de les caractériser d’un point de vue génétique le cas échéant. L’identification permet de repérer un animal parmi ses congénères et de le suivre tout au long de sa vie expérimentale. En plus de cette identification, une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. De plus ,il n'est pas possible dans le cadre de l'expérimentation des chercheurs de la plateforme de remplacer le modèle animal par un autre (in vitro, in silico,..)
Réduction
Une caractérisation génétique moléculaire est nécessaire lorsque l’on utilise des lignées de rongeurs génétiquement modifiées afin de s’assurer de la présence ou de l’absence d’une mutation d’intérêt dans leur génome ou pour suivre une sélection sur marqueurs génétiques par exemple. Seuls les animaux ayant besoin d'etre génotypés subiront une biopsie d 'oreille , les autres seront identifiés uniquement par technique du tatouage aux phalanges. La gestion des élevages se fait de façon raisonnée afin d'éviter au maximum la génération d'animaux surnéméraires non utilisés par la suite dans les expérimentations.
Raffinement
Le geste technique sera réalisé rapidement à l'extrémité de l'oreille ,afin de réduire supprimer ou soulager leur douleur ou leur détresse nous pratiquerons une anesthésie gazeuse par inhalation d'isoflurane lors du tatouage et de la biopsie de tissu pour les animaux agés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de produire et d'identifier des lignées de souris et rats génétiquement modifiées par croisement et ceci afin de répondre à de nouvelles questions scientifiques en lien avec les thématiques de recherche des instituts comme par exemple en oncologie, sur les maladies neurodégénératives , sur des pathologies de la grossesse ou sur des modèles de différentes pathologies touchant les organes. Les animaux seront identifiés à partir du 5ème jours jusqu'au 14ème jour, au dela la biopsie et l'identification par tatouage pourra se faire uniquement sous anesthésie volatile à l'isoflurane.
Suivi de la pigmentation cutanée et de la fonctionnalité de mélanocytes après injections intradermiques de mélanocytes humains chez la souris Nude
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
24 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées de système immunitaire, elles reçoivent sous anesthésie un tatouage puis des injections intradermiques de mélanocytes humains, avant un suivi photographique de la pigmentation puis leur mise à mort à deux et quatre semaines pour prélever la peau. Cette étude pilote vise seulement à fixer le nombre de cellules à injecter en vue de futurs essais sur un modèle de vitiligo, maladie décrite comme "bénigne" mais lourde psychologiquement. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable" car aucun modèle in vitro ne suivrait la fonctionnalité des mélanocytes dans le temps.
Objectifs
Les objectifs de ce projet constituant une étude pilote, sont d’évaluer in vivo chez la souris l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps suite à l’injection intradermique de différentes quantités de cellules responsables de la pigmentation cutanée appelées mélanocytes. Il s’agit d’un nouveau produit de thérapie innovante en cours de développement qui utilise des mélanocytes obtenus par différenciation de cellules souches humaines. Ce nouveau produit permettrait de repigmenter des zones cutanées dans le cadre d’une maladie appelée vitiligo au cours de laquelle des taches blanches, parfois des poils blancs, apparaissent sur la peau. Pour effectuer l’évaluation de ce nouveau produit de thérapie innovante, une suspension de mélanocytes à différentes concentrations, sera injectée en différents points dans une zone préalablement délimitée par tatouage sur des souris immunodéficientes, c’est à dire dépourvues d’un système immunitaire fonctionnel, afin d’éviter tout rejet. Un suivi de la pigmentation cutanée sera effectué de façon hebdomadaire à l’aide d'une caméra. Des prélèvements des sites d’injection des mélanocytes seront effectués à 2 temps différents mais relativement précoces après injection des mélanocytes humains afin de réaliser des analyses qui permettront de caractériser la présence et la fonctionnalité des mélanocytes. Cela permettra notamment de définir le nombre de mélanocytes à injecter dans le cadre d’études d’efficacité futures sur un modèle de vitiligo.
Bénéfices attendus
Le vitiligo est une maladie auto-immune, liée à un dysfonctionnement du système immunitaire, au cours de laquelle des taches blanches (parfois des poils blancs) apparaissent sur la peau. Elle concerne 0,5 à 1,0 % de la population mondiale selon des données de 2017. Ces dépigmentations peuvent survenir à n’importe quel moment de la vie, n’importe quel âge, et quelle que soit la couleur de la peau. Bien qu’il soit considéré comme une maladie bénigne, le vitiligo n’est pas anodin : il a des répercussions psychologiques importantes qui peuvent altérer la qualité de vie des personnes qui en souffrent (dépression, angoisse, isolement…). Des traitements existent, à base de crèmes, en association ou non avec un traitement par la lumière (photothérapie), traitements par voie orale ou sous-cutanée, mais la repigmentation est un phénomène long, 6 à 24 mois de traitement sont nécessaires pour obtenir des résultats satisfaisants, avec des effets secondaires plus ou moins importants, et une récidive dans 40 à 50% des cas. La greffe de mélanocytes provenant du patient lui-même est une solution mais elle nécessite de prélever de la peau dans une zone pigmentée, engendrant la création de cicatrices pouvant elles-mêmes être peu ou pas pigmentées. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter et de repigmenter plus rapidement les zones atteintes de dépigmentation, d’en évaluer la fonctionnalité et la stabilité au cours du temps par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge et la qualité de vie de personnes atteintes de vitiligo.
Procédures
Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront tout d’abord soumises à un tatouage de 4 points effectués sur le dos en arrière des omoplates, sous anesthésie générale, réalisés en 10 minutes environ. Une semaine plus tard, les 24 souris seront soumises chacune à 4 injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, à l’intérieur de la région délimitée par les 4 points de tatouage. Ces injections seront réalisées sous anesthésie générale, en 10 minutes environ. Pour chaque souris, les sites d’injection seront observés et photographiés chaque semaine afin de suivre l’évolution de la pigmentation cutanée au cours du temps. Ces observations et photographies seront effectuées sous anesthésie générale, en 5 à 10 minutes environ.
Impact sur les animaux
La douleur induite lors de la réalisation des points de tatouage puis des injections intradermiques des mélanocytes sera très limitée du fait de leur exécution sous anesthésie générale en un temps relativement court (moins de 10 minutes). Le suivi de l’évolution de la pigmentation cutanée effectué de façon hebdomadaire au cours de l’étude, nécessitant la mise sous anesthésie générale afin de positionner correctement la caméra au niveau de la région délimitée par les 4 points de tatouage, n’engendrera pas de douleur et sera réalisé en un temps très court (5 à 10 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.
Devenir
Les 24 souris seront euthanasiées pour moitié 2 semaines après injections dans la peau de cellules responsables de la pigmentation cutanée ou du milieu dans lequel elles seront mises en suspension, et pour l’autre moitié au bout de 4 semaines, avec 3 souris de chacun des 4 groupes expérimentaux par temps de prélèvement, par injection d’une surdose d’euthanasique sous anesthésie générale profonde. Un prélèvement sera effectué au large des sites d’injections pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la fonctionnalité des cellules injectées au cours du temps.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de mélanocytes injectés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané et réaction immunitaire). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet constituant une étude pilote mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. La réalisation de 4 sites d’injection intradermique par souris permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires mais de fournir suffisamment d’échantillons par temps de mesure pour la réalisation des analyses envisagées. Une analyse statistique sera réalisée à partir des résultats des analyses effectuées.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des points de tatouage, des injections intradermiques et des prises de photos hebdomadaires avec la caméra, effectuées sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’infection des sites d’injection ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 2 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm équipées d’un couvercle filtrant dans une animalerie dédiée au souris immunodéficientes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des bâtonnets d’ouate étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière. De la nourriture irradiée et de l’eau filtrée seront mises à disposition pour chaque cage.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant la réalisation d’injections intradermiques. D’autre part, l’utilisation de souris immunodéficientes, très peu pigmentées, permettra d’éviter le rejet des mélanocytes humains injectés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines), l’injection intradermique de mélanocytes humains étant considérée comme une greffe cutanée.
Etude du potentiel régénératif de sous populations de cellules souches cutanées
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
2062 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles subissent des blessures cutanées créées par biopsies au dos, des greffes posées à l'aide d'un punch, des injections et le port d'une attelle, pour étudier le potentiel régénératif d'une sous-population de cellules souches de la peau. Le porteur indique que ces atteintes provoquent une douleur limitée par des antidouleurs et une gêne au déplacement. Il affirme que le processus de cicatrisation "ne peut donc pas être réalisé in vitro", la peau restant impossible à reconstituer dans sa complexité.
Objectifs
Les mécanismes de régénération chez les mammifères adultes représentent un enjeu de santé publique majeur. En effet, lors d’une blessure cutanée la réponse par défaut est une réparation rapide de la barrière avec défaut de formation des annexes. La cicatrice est donc un marqueur de la réparation restaurant la seule fonction de barrière. La régénération qui se produit au cours de la vie restaure elle toutes les fonctions cutanées (sensorielles, thermorégulatrices etc…). La compréhension des mécanismes fondamentaux qui régissent la régénération par opposition aux mécanismes de réparation représente de nouvelles perspectives de thérapies régénératives dans le cadre du traitement des grands brulés et des blessures chroniques. L’épiderme constitue un modèle de choix afin d’étudier ces processus. En effet, l’épiderme se régénère tout au long de la vie grâce à la présence de cellules souches (bien caractérisées et très hétérogènes) en son sein et se répare après blessure avec formation d’un épiderme dépourvu d’annexes (c’est à dire sans follicule pileux ni glande sébacée) grâce à la participation de ces mêmes cellules souches. Ce projet concerne l’étude du potentiel régénératif d’une sous population de ces cellules souches de l’épiderme. Nous avons identifié au laboratoire une sous population cachée qui pourrait constituer un réservoir régénérateur. Pour l’étudier, nous combinerons des modèles de traçage génétique à des tests de cicatrisation et de greffes permettant d’évaluer le potentiel régénératif des cellules souches d’intérêt.
Bénéfices attendus
L’identification d’une sous population au potentiel régénératif puissant ouvrant des nouvelles perspectives thérapeutiques en médecine régénérative pour les grands brulés et les patients souffrant de blessures chroniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie afin de créer des blessures dorsales par biopsies, la durée de la chirurgie sera de 7 à 10 minutes par souris. Les souris recevront aussi des injections sous cutanées d’analgésiques ou de composants pharmacologiques au cours de l’anesthésie d'une durée de quelques secondes (2 ou 3 secondes). Les injections d’analgésiques sous cutanées seront poursuivies les 3 jours suivant la chirurgie.
Impact sur les animaux
Toutes les procédures sont de classe sévère mais réalisées sur des animaux à phénotype non dommageable. Les biopsies cutanées représentent une atteinte à l’intégrité de l’animal toutefois la cicatrisation est un mécanisme rapide donc la douleur est limitée. Les animaux recevront des antidouleurs afin de limiter la souffrance pour les 3 jours qui suivent la blessure. L’attelle ralentit le processus de cicatrisation en limitant la contraction dermique mais ne produit pas d’autres effets. Pour ce qui concerne les grandes blessures, des pansements seront positionnés et changés tous les jours pendant 5 jours. Cette période peut entrainer la gêne du déplacement et éventuellement des démangeaisons. En ce qui concerne les expériences de greffes, la nuisance attendue est comparable aux autres procédures de cicatrisation car la nuisance repose sur le punch réalisé pour implanter la chambre de greffe et qui fait lui aussi l’objet d’une injection d’analgésique.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de prélever les échantillons et réaliser les analyses histologiques nécéssaires à l'analyse des résultats.
Remplacement
Le processus de cicatrisation nécessite tous les compartiments cutanés et ne peut donc pas être réalisé in vitro car il est aujourd’hui impossible de reconstituer la peau dans sa complexité hypoderme/derme/épiderme.
Réduction
Nous utiliserons à la fois les mâles et les femelles, ce qui permet d’utiliser la totalité́ des animaux générés. Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs d'après des calculs de statistiques prédictives. Certaines parties de cette procédure pourront être annulées en fonction des résultats obtenus. Il est donc fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inferieur à la fin du projet.
Raffinement
Les animaux seront traités avec un inducteur pharmacologique tous les deux jours afin d’éviter le dessèchement cutané car le traitement appliqué est resuspendu en éthanol absolu. De plus, après chirurgie, les animaux seront rassemblés en accordance avec leur genre. Durant toute la procédure, les animaux seront suivis en s’appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer et d’objectiver les éventuelles souffrances, et de mettre en œuvre des points limites précoces et adaptés. La bonne santé́ ou la souffrance des animaux seront observés selon des grilles d'évaluations indiquées. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnement enrichi (maisonnettes et buchettes). Lorsque les souris sont isolées nous veillerons à ce que l'enrichissement (buchettes, maisonettes, patchs de coton) soit bien présent dans la cage d'hebergement.
Choix des espèces
Nous utiliserons des modèles murins car ils sont plus simples à manipuler que d’autres modèles cutanés tels que les mini-cochons. De plus, les modèles murins génétiquement modifiées permettent de réaliser des expériences de traçage génétique qui donnent un accès unique au devenir des cellules au cours de processus intégrés et complexes dans un contexte in vivo. Nous utiliserons des souris âgées de 8 à 10 semaines. Ainsi nous utiliserons des souris adultes mais en phase de repos pour l’activation des cellules souches du follicule pileux. De plus, dans la procédure 7 nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines mais aussi des souris à P2 (soit des souriceaux agés de 2 jours Post natal jour2=P2) afin d’utiliser leur potentiel morphogénique puissant. Nous utiliserons des mâles et des femelles au cours de ces procédures. Notre expérience dans le domaine cutané nous a permis de déterminer que le genre à cet âge-là n’influence pas la réponse et le potentiel des cellules souches épidermiques.
Evaluation des effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées ischémiques chez le rat
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une plaie cutanée chronique est provoquée sur leur dos par arrêt de l'irrigation sanguine lors de deux chirurgies, puis traitée par plasmas froids trois fois par semaine jusqu'à cicatrisation, chaque rat étant isolé en cage individuelle pour l'empêcher d'arracher ses sutures. Le porteur reconnaît que cet isolement peut être source de stress et qu'un excès de traitement pourrait nécroser les tissus. L'objectif déclaré est de tester ces plasmas froids en vue d'une future thérapie des plaies chroniques chez l'humain, sain ou diabétique.
Objectifs
Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmasfroids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.
Bénéfices attendus
La réalisation de cette seconde étude menée dans le cadre d’un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat et de les comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées, en utilisant un gaz rare différent de celui utilisé lors d’une précédente étude, ainsi qu’un nouveau dispositif médical breveté permettant la diffusion des plasmas froids générés. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.
Procédures
Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.
Impact sur les animaux
L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats sera nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur le modèle expérimental de plaie cutanée chronique et sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc à nouveau 2 groupes expérimentaux de 10 rats.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie préopératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celleci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.
Choix des espèces
Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue (plusieurs semaines). Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.
Modele preclinique de neuropathie – souris DIO-STZ
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
2 550 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, 2 250 étant classées en souffrance sévère. Rendues obèses puis diabétiques par injection de streptozotocine, molécule que le porteur décrit comme "particulièrement toxique", elles subissent des prélèvements sanguins répétés et divers tests avant mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que ce projet "n'est pas le plus adapté en termes de réduction" et qu'un nombre important d'animaux est prévu du fait d'une mortalité attendue après l'injection. Il conclut que la culture cellulaire ne peut se substituer à la souris pour reproduire l'atteinte multi-organique du diabète.
Objectifs
Le diabète de type 2, associé à l’obésité, est associé à des atteintes nerveuses et rénales. Les atteintes nerveuses sont des conséquences invalidante du diabète détériorant la santé et la qualité de vie des patients. Elle se traduit par de l’incontinence, des désordres gastrointestinaux, des douleurs chroniques, des sensations de froid ou de chaud continues, une transpiration excessive, des défauts sexuels, une intolérance à l’effort ou encore des malaises. La conséquence la plus grave étant les altérations nerveuses au niveau cardiaque pouvant entrainer la mort. Les atteintes rénales touchent 20 à 40% des patients atteints de diabète. Elles peuvent entrainer une dialyse à vie dont le seul traitement consiste en la transplantation de nouveaux reins. Ces atteintes ont également des conséquences très importantes sur les fonctions cardiovasculaires augmentant le risque de maladies cardiovasculaires. Aujourd’hui, aucune stratégie thérapeutique efficace n’est envisagée dans le cadre de ses conséquences du diabète. Les seules stratégies envisagées sont le contrôle de la glycémie par les anti-diabétiques classiques et des recommandations diététiques et/ou le traitement par antidépresseurs dans le cas de la neuropathie. Ainsi, la mise en place d’un modèle animal diabétique présentant ces atteintes nerveuses et rénales permettrait aux clients de tester des molécules anti-diabétiques sur ces atteintes nerveuses et rénales ou bien de tester des molécules protégeant les reins et les nerfs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra le développement de nouveaux médicaments ciblant les complications rénales et nerveuses du diabète. Ce projet permettra également un gain de connaissance sur le développement de ces complications associées au diabète.
Procédures
- Les animaux subiront des prélèvements répétés de sang à la veine caudale, en vigile et au sinus retroorbitaire sous anesthésie gazeuse ou locale au cours de l’étape de screening, en milieu de traitement, au cours du test de tolérance au glucose et de la mesure de la vidange gastrique, en respectant les recommandations éthiques. Les prélèvements de sang effectués en cours d'étude se feront en respectant les volumes ciculant et les périodes de récupérations pour les prélèvements uniques et répétés. - Les animaux subiront diverses types d’injection notamment lors de la phase d’induction avec la streptozotocine, molécule induisant le diabète, la phase de traitement, le test oral de tolérance au glucose, la mesure de l'éléctrocardioagramme et du débit de filtration glomérulaire. Les volumes d’administration respecteront les recommandations éthiques. -Les animaux seront stimulés au niveau des pattes arrières lors du test de sensibilité mécanique. Le nombre de mesures n'ira pas au delà de 5, avec une minutes de repos entre chaque mesure. Une phase d'habituation sans stimulation de 30 minutes sera prélalablement effectuée - Les animaux subiront des mise à jeun notamment avant le test de tolérance oral au glucose, la mesure du débit de filtration glomérulaire et l’euthanasie. - Les animaux seront isolés 2 à 18 heures lors de la mesure du débit de filtration glomérulaire et lors de la mise en cage à métabolisme. Enfin, lors de leur mise à mort, dans le but de récupérer leur cerveau, un prélèvement sanguin maximal sous anesthésie générale sera réalisé et les animaux seront perfusés avec de la saline et/ou de la formaline par injection intracardiaque sur coeur battant et la confirmation de la mort se fera par l’arrêt permanent de la circulation.
Impact sur les animaux
La molécule utilisée pour induire le diabète et les complications associées est particulièrement toxique et peut altérer l’état général de l’animal les quelques jours qui suivent l’injection. Une fois, l’état stabilisé il ne se détériore part au cours des 2 mois d'étude. Notre équipe SBEA ainsi que le personnel formé a mis en place la surveillance des signe cliniques afin d'anticiper la mort de l'animal et éviter sa souffrance prolongée et réaliser l'euthanasie dans les conditions éthiques. L’augmentation de la prise hydrique, de la production d'urine et des niveaux de glucose sanguins sont les caractéristiques du diabète. Le traitement testé sur ce modèle préclinique aura pour but d’améliorer leur diabète et les atteintes nerveuse et rénale. Aucun effet indésirables est attendu au cours de la phase de traitement . Aucun effet indésirable est attendu après le test de tolérance au glucose et les prélèvements de sang associés ou l’électrocardiogramme. L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau des pattes peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de la fonction rénale nécessitant une anesthésie isoflurane et une injection intraveineuse a des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil, modifie la vision dans le cas de l’injection au sinus rétro-orbitaire, ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de réaliser la collecte d'organe nécessaire aux analyses qui permetrront de valider ou non l'efficacité des traitements testés.
Remplacement
Le diabète est une pathologie touchant de nombreux organes et la neuropathie et la néphropathie sont des conséquences de ce dérèglement multi organique qui se passe de façon séquentiel dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. La culture de neurones et de cellules rénales peut être envisagée dans un premier temps et constitue un des axes de recherche et développement de la société. Cependant cette méthode, bien qu'elle puisse diminuer l'utilisation d'animaux à des fins de recherche, ne pourra pas se substituer à l'utilisation de ces derniers puisque les commorbidités citées sont la conséquence de ce déréglement multi-organique. L'utilisation de la streptozotocine pour induire le diabète peut être également remplacé par l'utilisation d'animaux spontanément diabétique grâce à des mutations génétiques et sont des modèles auxquels la société s'attarde dans ses axes de recherche et développement.
Réduction
Ce projet n’est pas le plus adapté en termes de réduction. En effet, pour le modèle de souris obèses puis injectées à la streptozotocine, un nombre important d’animaux doit être envisagé pour l’injection de streptozotocine puisqu’un taux de mortalité et d’absence de réponse est attendu. Cependant, nous optimisons le nombre d’animaux utilisé en proposant de réaliser toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie ou sa résolution le cas échéant sur un même animal. De plus, nous réduisone également le nombre d'animaux utilisé dans le groupe dit sain, non malade puisqu'aucune mortalité n'est attendu dans ce groupe.
Raffinement
En termes de raffinement, les animaux obèses sont hébergés par 3 ou par 4 pour respecter les normes d’hébergement compte-tenu du poids et puisque la souris est un animal social. De l’enrichissement est également ajouté dans les cages d’hébergement afin que la souris puisse y faire son nid. Suite à l’injection de streptozotocine, l’état physique des souris est monitoré et scoré 2 fois par jour les 14 jours suivant l’injection de streptozotocine, c’est-à-dire jusqu’à stabilisation du phénotype diabétique. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution saline est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Dans le cas d’atteintes sévères, l’animal est euthanasié. L’injection de solution saline en cas de déshydratation se fera selon les volumes d’injection saccepté éthiquement. Ces mêmes volumes seront utilisés lors de la phase de traitement.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète.
Anomalies rétiniennes dans le syndrome DYRK1A
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Modifiées pour reproduire le syndrome DYRK1A, elles subissent des imageries rétiniennes et une électrorétinographie sous anesthésie, avec pose d'électrodes, puis sont tuées avant réveil pour prélever cerveau et rétines. Le porteur présente les imageries comme sans contact et indique que la principale gêne tient au stress du transfert et à l'anesthésie. Il écarte le poisson zèbre, porteur de deux gènes proches, et conclut que la souris est l'espèce "la mieux adaptée".
Objectifs
Si l’augmentation d’expression d’un des gènes du chromosome 21 humain est considérée comme la cause de nombreux symptômes affectant les sujets atteints de trisomie 21, la diminution de son expression / de l'activité de la protéine codée par ce gène induit également des défauts de développement et de fonctionnement du système nerveux central. Le syndrome associé, initialement appelé MRD7, pour Retard Mental autosomal Dominant de type 7, a récemment été renommé syndrome DYRK1A. Il combine une déficience intellectuelle, une microcéphalie, des crises épileptiques et des troubles du spectre autistique. Trisomie 21 et syndrome DYRK1A sont également associés à des symptômes ophtalmologiques. Parmi eux, un épaississement rétinien a été observé chez les sujets trisomiques, et est retrouvé dans les modèles rongeurs. Aucune étude structurelle n’a encore été publiée en ce qui concerne les patients atteinst du syndrome DYRK1A, mais une pâleur du nerf optique a été rapportée. Elle pourrait être causée par un amincissement de la rétine, comme celui qui a été observé dans un modèle murin de la maladie. Dans ce dernier, une des deux copies du gène a été inactivée, ce qui conduit à une baisse d’expression de la protéine de 50%. Or chez les patients, on retrouve de nombreuses mutations ponctuelles n’affectant pas forcément le niveau d’expression de la protéine, ce qui peut influencer les symptômes – il y a de plus en plus d’indications que la quantité de protéine peut influencer sa répartition dans les cellules et/ou la répartition des protéines avec lesquelles elle interagit. Nous proposons donc d’étudier les conséquences de plusieurs mutations identifiées chez les patients, à travers la caractérisation ophtalmologique de modèles murins dans lesquels ces mutations ont été introduites.
Bénéfices attendus
Les données moléculaires disponibles pour certaines des mutations identifiées chez les patients atteints du syndrome DYRK1A laissent envisager des conséquences hétérogènes sur l’activité et/ou la stabilités des protéines mutées. Au niveau clinique, si nous mettons en évidence que ces différentes mutations conduisent à des changements rétiniens distincts et facilement détectables chez les patients, notamment à travers un examen rapide et non invasif (imagerie sans contact), on peut escompter une prédiction plus précise des conséquences de mutations nouvellement identifiées et donc une prise en charge adaptée plus précoce. Au niveau fondamental, disposer de données structurelles et fonctionnelles globales sur les rétines des différents modèles aidera à déterminer sur lesquels porter en premier nos efforts pour identifier l’impact sur les différentes populations neuronales de la rétine, une partie du système nerveux central dont la structure fine et régulière facilite les approches histologiques et fonctionnelles.
Procédures
La totalité des animaux (192) sera examiné par deux techniques d’imagerie rétinienne sans contact, la tomographie par cohérence optique (OCT) et le fond d’œil, qui sont complémentaires. Ces deux modalités seront pratiquées, après dilatation des pupilles (application d’une goutte de mydriatique par œil) sur une même anesthésie gazeuse (maximum de 15 minutes), destinée à obtenir l’immobilité durant l’examen. Deux tiers des animaux (128) seront examinés par électrorétinographie, qui permet d’évaluer la fonctionnalité de la rétine (durée de l’examen < 30 minutes). Après dilatation de la pupille, les animaux seront endormis par une injection intrapéritonéale d’anesthésique. Des électrodes de référence sous-cutanées seront insérées au niveau des joues et de la base de la queue, et des électrodes DTL (fins filaments souples conducteurs) placées sur les cornées. Pour les différents examens, les animaux seront placés sur des coussins chauffants pour maintenir leur température corporelle, et du gel ophtalmique appliquée sur les cornées pour les maintenir hydratée.
Impact sur les animaux
Les deux modalités d’imagerie, toutes deux sans contact, sont réalisées sur une courte anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum), utilisée uniquement afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. La seule nuisance en découlant est donc le stress lié au transfert de la souris de sa cage d’hébergement à la cage d’induction et l’exposition au gaz anesthésiant. L’euthanasie étant effectuée avant le réveil, la seule nuisance associée à l’électrorétinographie découle également de l’anesthésie (contention et injection intra-péritonéale).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort avant leur sortie d’anesthésie, soit à l’issue de l’imagerie (64), soit à l’issu de l’électrorétinographie (128), pour prélever cerveau et rétines pour les études histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il est impossible à l’heure actuelle d’obtenir une rétine complète in vitro. Obtenir des données structurelles et fonctionnelles facilement transposables à la clinique ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Le poisson zèbre ne peut être considéré ici, car il existe chez cette espèce deux orthologues de notre gène d’intérêt, ce qui rend délicat de reproduire l’impact d’une perte d’une copie ou de mutations ponctuelles. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. De plus, plusieurs lignées portant des mutations ponctuelles sont d’ores et déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet.
Réduction
Au cours d’une étude précédente portant sur des groupes de 12 mâles, nous avions constaté, chez les souris n’ayant qu’une copie fonctionnelle de notre gène d’intérêt, un net amincissement de la rétine ainsi qu’une réduction du nombre des vaisseaux sanguins, et un léger allongement des segments externes, effet miroir de ce que nous avons observé chez des souris ayant trois copies de ce gène. Un effectif de 12 mâles et 12 femelles par génotype permettrait de confirmer ces observations en ayant autant de femelles que de mâles pour chacun des génotypes, et de pouvoir détecter des variations d’amplitude des différents effets entre mutants. Nous n’avons encore effectué aucun enregistrement avec l’équipement électrorétinographique qui vient d’être récupéré auprès d’un autre laboratoire. En absence de données nous permettant d’estimer la dispersion des mesures dans nos conditions d’enregistrement, nous nous orientons vers les effectifs classiquement utilisés pour les études électrorétinographiques, avec 8 souris par génotype et par sexe. Afin de tirer au mieux parti des données acquises, nous utiliserons un test statistique permettant de considérer séparément les mesures obtenues sur les deux yeux d’un même animal, plutôt que leur moyenne, afin d'augmenter la puissance statistique.
Raffinement
Les animaux seront stabulés avec l’enrichissement classiquement utilisé dans notre animalerie (matériel de nidification). Les tests consistent en deux modalités d’imagerie non invasive (OCT et fond d’œil), ainsi que des enregistrements électrorétinographiques. Les deux premières procédures seront effectuées sur une même anesthésie gazeuse (15 minutes au maximum) afin d’obtenir l’immobilité de l’animal. Du gel ophtalmologique sera appliqué sur les deux cornées dès que l’animal sera endormi, ainsi qu’à la fin de la séance d’imagerie, afin d’éviter tout desséchement cornéen. L’animal sera placé sur un coussin chauffant pendant l’imagerie et jusqu’à son réveil, qui intervient très rapidement après une anesthésie courte comme ici. L’électrorétinographie nécessite une anesthésie plus longue et sans mouvements oculaires pouvant nuire à la stabilité des enregistrements, comme parfois observés sous isoflurane. Les animaux seront donc anesthésiés à travers l’injection intra-péritonéal d’un mélange de kétamine et de médétomidine, et maintenus sur un coussin chauffant avec du gel ophtalmique appliqué sur les deux cornées. Des électrodes DTL (fins filaments souples) seront préférés aux anneaux d’or souvent utilisés chez l’animal. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil par dislocation cervicale soit à la fin de l’imagerie (4 animaux par génotype et par sexe), soit après les enregistrements électrorétinographiques (8 animaux par génotype et par sexe).
Choix des espèces
Obtenir des données structurelles et fonctionnelles sur la rétine, facilement transposables à la clinique humaine, ne peut se faire que sur des modèles vertébrés, l’œil de invertébrés étant très différent dans son organisation. Parmi les espèces dans lesquelles l’inactivation ou la mutation ponctuelle d’un gène peuvent être facilement obtenues, le poisson zèbre ne peut être retenu, car il possède deux autres gènes très proches du gène d’intérêt, rendant délicat la modélisation d’une perte de copie ou d’une mutation ponctuelle de ce gène. Le modèle murin hétérozygote est par contre bien caractérisé et reproduit de nombreux symptômes des patients atteints du syndrome DYRK1A. Plusieurs lignées avec des mutations ponctuelles sont déjà disponibles. La souris nous semble donc l’animal modèle le mieux adapté pour mener à bien le présent projet. Les souris devant être sacrifiées à 8 semaines pour des prélèvements histologiques, l’évaluation ophtalmologique sera réalisée au cours de la 8ème semaine, les animaux étant euthanasiés avant le réveil de l’anesthésie. A cet âge, la morphologie de la rétine est bien établie et les réponses électrorétinographiques stables.
Modulation de l’inflammation pour augmenter l’efficacité des stratégies de thérapie génique de la perte d’audition
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux reçoivent dès deux jours de vie l'injection chirurgicale d'un vecteur de thérapie génique dans l'oreille, puis des injections répétées de corticoïdes, deux mesures auditives sous anesthésie avec pose d'électrodes sous la peau et des prises de sang, pour tester si un anti-inflammatoire améliore une thérapie génique de la surdité. Le porteur indique que la chirurgie, les injections et la pose d'électrodes provoquent des douleurs légères à modérées. Il affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'expérimentation animale", faute de pouvoir mettre en culture ou simuler le système auditif dans son ensemble.
Objectifs
Entendre, c’est pouvoir identifier et localiser les sources sonores dans l’espace, de jour comme de nuit ; l’audition contribue ainsi à la sécurité des individus. L’audition est devenue chez l’homme le sens prépondérant sur lequel repose la communication inter-individuelle. Or, l’importance de l’audition continue d’être fortement sous-estimée : le risque que la perte de l’audition fait peser sur les individus, risque qui inclut le déclin des fonctions cognitives, n’est pas compris, ni anticipé et les campagnes d’information et de prévention ont été jusqu’ici peu fructueuses. Par leur ampleur et leurs conséquences, les atteintes de l’audition constitueront, avant 2030, la 7ème cause la plus importante d’invalidité au quotidien, selon l’organisation mondiale de la santé. On estime que plus de la moitié des cas de surdité congénitale sont attribués à des causes génétiques et les mutations d’un gène sont les causes les plus fréquentes. La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies génétiques. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds mais également tardifs et progressifs. Nous avons obtenu des résultats prometteurs de preuve de concept d’efficacité thérapeutique pour le traitement des surdités causées par le gène en utilisant des vecteurs viraux codant pour le gène (thérapie de remplacement). Le présent projet consiste à évaluer la possibilité d’améliorer l’efficacité de nos stratégies de thérapie génique.
Bénéfices attendus
La thérapie génique est une approche thérapeutique de choix pour le traitement de maladies héréditaires. Elle représente une piste de plus en plus explorée pour le traitement des déficits auditifs précoces et profonds. Il a récemment été montré que plusieurs cas surdité liée à l’âge sont des troubles génétique donc potentiellement traitable par thérapie génique. Cependant de nombreuses études ont montré que l’injection d’un produit de thérapie génique dans l’organisme est susceptible d’entrainer une réponse inflammatoire et immunitaire. De plus cette réponse inflammatoire et immunitaire pourrait être potentialisée par le traumatisme chirurgical ce qui limiterait d’autant plus l’efficacité de la thérapie. Les bénéfices attendus de l’administration de produit anti inflammatoire de type corticoïdes seront l’augmentation de l’efficacité thérapeutique de vecteur à savoir une récupération de l’audition plus forte et plus durable (via une augmentation de la transduction et/ou la persistance du transgène). Si les résultats sont probants, ce projet pourrait poser les bases d’un développement clinique.
Procédures
L’injections du vecteur de thérapie génique se fera sous anesthésie gazeuse. L’ensemble de la chirurgie ne durera pas plus de 20 minutes. Les animaux seront soumis à des tests auditifs au nombre de 2 avec un intervalle minimal d’au moins un mois entre chaque test. Le test complet correspond à une anesthésie fixe puis une mesure de la réponse auditive. L’ensemble de la procédure prend entre 30 et 45 minutes. Les tests auditifs seront réalisés au plus tôt à 1 mois. Un échantillon de sang sera prélevé (quelques secondes pour chaque prélèvement) à chaque temps d’analyse (15 jours, 1 mois et 2 mois après la naissance).
Impact sur les animaux
Pour ce projet, les nuisances et effet indésirables potentiellement attendus sur les animaux sont les douleurs légères à modérées consécutives aux actes de chirurgie, d’injections intrapéritonéales répétées, de pose d’électrodes sous cutanées au niveau de la face et du dos lors des tests auditifs et de prises de sang répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’unique procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car nous prélevons des tissus pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les gènes responsables de surdité chez l’homme sont aussi responsables de déficits auditifs chez la souris, et l’architecture des systèmes auditifs périphérique et central de rongeurs, similaire à celle de l’homme, permet d’étudier chez ces animaux l’audition. Aujourd’hui, il n’existe aucune alternative à l’expérimentation animale, car nous avons besoin d’étudier le système auditif dans son ensemble. Il n’est pas possible aujourd’hui de mettre en culture les systèmes auditifs périphériques et centraux. De plus, aucun modèle informatique n’existe pour simuler le fonctionnement du système auditif dans son ensemble.
Réduction
Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment, et génotypons les animaux afin de ne pas maintenir inutilement les animaux qui ne portent pas les modifications génétiques d’intérêt pour ce projet. Ils seront donc mis à mort. Nous appuyons sur les données obtenues dans nos précédentes expériences pour le nombre de vecteurs candidats à tester in vivo et ainsi limiter le nombre d’animaux utilisé à son strict nécessaire.
Raffinement
Les animaux du projet seront suivis quotidiennement. Ce projet ne concerne que des procédures dont la mise en œuvre ne devrait se traduire ni par une dégradation de l’état de santé de l’animal ni par des douleurs importantes. Si nous observions un comportement anormal en termes de santé (perte de poids, du pelage, etc.) dès l’initiation de l’intégration dans un groupe expérimental, l’animal serait immédiatement mis à mort. Un bâtonnet de coton sera ajouté dans les cages d’hébergement pour faciliter la nidification, ainsi qu’un igloo pour les femelles avec portée. L’emploi d’analgésiques sera systématique tout comme l’application d’un gel ophtalmique lors des anesthésies des animaux. Nous utiliserons un matériel miniaturisé pour l’anesthésie gazeuse des animaux qui subiront la chirurgie. Les animaux anesthésiés seront gardés sur un tapis chauffant jusqu’à leur réveil complet puis remis dans une cage propre et pourvue d’une coupelle de gel nutritif hydratant pour la maman. Les animaux opérés seront surveillés tous les jours pendant une semaine après chirurgie puis deux fois par semaine minimum la semaine suivante pour détecter et traiter les éventuels signes d’inconfort tels que décrits dans la grille d’évaluation fournie par la structure du bien-être animal.
Choix des espèces
Nous souhaitons recourir aux souris de laboratoire dont le système auditif est similaire à celui de l’homme. De plus, la souris de laboratoire est le seul mammifère modèle pour lequel on dispose d’outils génétiques conséquents. L’audition se met en place chez la souris autour de 10 jours après la naissance ; avant 8 jours après la naissance le système auditif est immature, 16 jours après la naissance le système auditif est fonctionnel, 30 jours après la naissance et au-delà,le système auditif est mature. L’administration du vecteur de thérapie génique se fera 2 jours après la naissance .