Organes sensoriels
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de l’effet d’inhibiteurs de cytokines, d’interleukines et d’intégrines sur des modèles de rétinopathies prolifératives murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1621 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des rétinopathies leur sont induites par une exposition des mères et des portées à 75 % d'oxygène, par impacts laser sur l'œil ou par ultrasons, suivis d'injections intraoculaires répétées de composés à tester. Le porteur reconnaît une détresse respiratoire des mères, euthanasiées dès le retour à l'air normal, les souriceaux étant confiés à une mère adoptante. Il affirme que la néovascularisation de la rétine ne peut être modélisée in vitro et justifie ainsi le recours à la souris.
Objectifs
Les pathologies ophtalmiques tel que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (RD) sont les premières causes de handicap visuel chez les personnes adultes. Ces pathologies, sont caractérisées dans leur forme tardive par l’apparition de néovaisseaux pathologiques, de fuites vasculaires et d’une inflammation chronique qui peuvent mener à une cécité définitive. Actuellement la prise en charge des patients est composée d’injections intraoculaire répétées d’anti-VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Cependant, certains patients restent ou deviennent résistants à ce traitement. Dans ce contexte, nous proposons de tester l’effet de molécules inhibitrices de l’inflammation et/ou de la vascularisation dans divers modèle murin mimant la DMLA et la RD.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en évidence l’effet anti-angiogénique de certaines molécules dans les différents modèles de rétinopathie et de dégénérescence maculaire lié à l’âge (DMLA) chez la souris, ce qui pourrait par la suite bénéficier aux patients atteints de rétinopathie diabétique proliférante ou de DMLA humide.
Procédures
Dans le cas de la rétinopathie induite par l’oxygénation : Les femelles et leurs portées seront vigiles et seront soumises à une concentration d’oxygène de 75 pour cent pendant 5 jours. Les souriceaux vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1 min/souris). Dans le cas de la sonication : Les souris seront anesthésiées pendant 5 mins et vont être soumises à une injection intrapénienne et à des ondes ultrasons au niveau de l’œil pendant 60 secondes. Par la suite, des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont être réalisées 1 fois par jour pendant 7 jours sur souris anesthésiées afin d’évaluer l’évolution des fuites vasculaire causé par la sonication. Enfin, deux injections intraoculaires de composé thérapeutique (1min/souris) seront réalisées sur souris anesthésiées. Dans le cas de la néovascularisation choroïdienne induite par le laser : Les souris seront anesthésiées et vont recevoir 4 impacts laser par œil, la durée de ce traitement est d’environ 1 min par souris. Des imageries de l’œil (15 mins/souris) vont ensuite être réalisés 1 fois par jour pendant 7 jours chez ces souris anesthésiées afin d’évaluer la croissance vasculaire liée aux impacts laser. Les souris vont ensuite recevoir deux injections intraoculaires de composé thérapeutique sous anesthésie (1min/souris). Après la réalisation des actes décrits, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Le modèle de rétinopathie induit par l’oxygène (OIR) peut induire chez les femelles un stress physique et une douleur causer par une détresse respiratoire. Ceci peut donc engendrer chez les souriceaux une malnutrition ainsi qu’un stress thermique. La sonication, le laser ainsi que les injections intra oculaires peuvent engendrer un stress thermique ainsi qu’une détresse respiratoire dû à l’anesthésie mais également une légère douleur au niveau de l’œil causé par une neuro-inflammation.
Devenir
A l’issu des expérimentations les souris vont être euthanasiées, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem, cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
La néovascularisation caractéristique de la rétinopathie diabétique et de la dégénérescence maculaire liée à l'age (DMLA) ainsi que les fuites vasculaires sont le résultat d’une interaction complexe entre les vaisseaux de la rétine de la choroïde et de leur environnement. Ceci ne peut pas être modélisée complètement in vitro
Réduction
Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire (1621) pour avoir une puissance statistique suffisante afin d’obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences. Les variabilités interanimal et inter-expériences ont pu être déterminées au cours d’expérimentations précédentes avec des protocoles identiques autorisés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par 5 ou par portée dans des cages ventilées. Pour les femelles et leurs portées, les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Pour les mâles, les cages comportent plusieurs cotons et un bâton à ronger. Les animaux sont examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou par le personnel de l’animalerie. Les animaux auront une période de 5 jours d’acclimatation avant l’expérimentation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. L’âge des animaux est suivi par rapport à leurs dates de naissance (fournies par le fournisseur) qui sont indiquées sur les étiquettes de leurs cages. Les animaux sont numérotés par des bagues à l’oreille. Si nécessaire et en cas d’agressivité les mâles seront séparés et isolés (seul par cage). Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasirons les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante à la sortie du caisson. Lors des procédures expérimentales les souris seront sous anesthésie général, sous anesthésie local pour les injections intraoculaires et sur un tapis chauffant pour prévenir tous risquent d’hypothermie. Toute atteinte oculaire inattendue (inflammation, gonflement) entrainera l’euthanasie de l’animal).
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé dans les maladies oculaires. En effet, le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène (OIR), de néovascularisation choroïdienne induite par laser (CNV) et de sonication sont 3 modèles qui ont été établie chez la souris. La souris est un petit animal facile à manipuler et qui comporte beaucoup de similitude physiologique avec l’homme. Dans le cas de l’OIR les animaux seront utilisés dès 7 jours de vie. La mise en place des vaisseaux rétiniens se fait lors des 3 premières semaines de vie de la souris, l’hyperoxygénation entre le 7ème et le 12ème jour de vie de la souris nous permet d’induire une rétinopathie. Dans le cas du CNV et de la sonication les souris seront utilisées à partir de la 8 semaines de vie, en effet c’est l’âge ou le système visuel et inflammatoire de la souris est établi.
Evaluation de la réponse inflammatoire de la peau d’animaux génétiquement modifiés
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
2100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une crème inflammatoire est appliquée chaque jour pendant onze jours pour induire un psoriasis, après tonte ou épilation, avec deux prélèvements sanguins, avant la mise à mort pour analyser peau, rate et ganglions. Le porteur précise qu'aucun analgésique ne sera administré car il fausserait la réponse immunitaire étudiée, alors que l'inflammation peut provoquer des plaques cutanées et, dans les cas les plus graves, une atteinte articulaire gênant les déplacements. Il décrit ces expériences comme des prestations réalisées pour des laboratoires privés et publics cherchant à valider des modèles génétiquement modifiés.
Objectifs
Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact d’une inflammation cutanée sur le système immunitaire suite à la modification de gènes cibles. Les maladies inflammatoires de la peau telles que la dermatite atopique et le psoriasis touchent près de 3% de la population mondiale. Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui se manifeste par des plaques rouges présentant des squames. Il s'agit le plus souvent d'une maladie bénigne, mais il existe des formes sévères (environ 20% des cas), associées à une atteinte généralisée et/ou à des douleurs articulaires. Bien que la pathogenèse ne soit pas entièrement comprise, d'intenses recherches sont en cours pour explorer les mécanismes sous-jacents impliqués. L’objectif de ce projet est d’évaluer la réponse immunitaire après l’induction de psoriasis de souris contrôles ou d’animaux génétiquement modifiés. Le modèle de souris traité via une crème inflammatoire est l’un des modèles les plus largement utilisé pour étudier le psoriasis. Ainsi, nous utiliserons ce modèle et nous appliquerons localement de la crème inflammatoire sur la peau des souris au niveau du dos ou des oreilles afin d’induire une dermatite de type psoriasis pour évaluer la réponse immunitaire suite à la modification de gènes cibles.
Bénéfices attendus
Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative la capacité d’un modèle murin à répondre à une inflammation cutanée.
Procédures
Pour induire une inflammation cutanée de type psoriasis, les souris seront soumises à plusieurs interventions : 1) La préparation de la peau par tonte d’une durée de 30 secondes en vigile ou par épilation d’une durée de 15 minutes par anesthésie générale gazeuse en fonction de la demande du partenaire. La préparation de la peau se fait qu’une seule fois au début de l’expérimentation. 2) L’application quotidienne de crème inflammatoire d’une durée de 3 minutes par anesthésie générale gazeuse, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 3) Deux collectes de sang d’une durée de 30 secondes sur souris vigiles par voie submandibulaire à l’aide d’une lancette pour recueil du sérum. 4) Des pesées un jour sur deux d’une durée de 30 secondes, et ce, sur une période de 11 jours maximum. 5) A la fin de l’expérimentation les souris sont mises à mort pour l’analyse de la peau, la rate et les ganglions.
Impact sur les animaux
L’induction de psoriasis par application quotidienne de crème inflammatoire cause une inflammation localisée sur la peau des souris. Cette inflammation se reflète par des érythèmes (léger à très marqué) ainsi que des plaques cutanées, et ce, sur une durée de 11 jours maximum. Dans les cas les plus grave, une atteinte articulaire peut être observée pouvant causer des difficultés à se déplacer pour se nourrir et s’hydrater. Ces signes cliniques ne pourront être soulagés par la prise d’analgésique car nous étudions la réponse immunitaire et toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Lors de l’expérimentation les animaux sont suivis quotidiennement et une grille de score et des points limites sont préalablement établis afin de réagir rapidement face aux premiers signes de souffrance chez la souris. L’ajout de Gel Diet / pâtée SAFE Energy et d’hydrogel pourront améliorer les conditions de vie des animaux. Les manipulations des souris pour la tonte, le recueil de sang ou pour l’application quotidienne de la crème inflammatoire peuvent générer du stress chez la souris mais sont indolores. Nous veillerons dans chacun de nos actes au respect du bien-être animal.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’experience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire ou pour l’histologie.
Remplacement
Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.
Réduction
Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.
Raffinement
Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.
Blocage de l’interaction du tPA avec les récepteurs NMDA : Caractérisation phénotypique de la souche KI-L178A en conditions inflammatoires
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée génétiquement modifiée (KI-L178A), elles subissent un modèle d'inflammation systémique ou centrale, un modèle de sclérose en plaques, puis un examen par IRM sous anesthésie, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. Le porteur indique des pertes de poids, des douleurs post-opératoires et des déficits fonctionnels possibles, sans détailler de test comportemental. Il affirme que ces procédures ont un caractère de 'stricte nécessité' et ne peuvent être remplacées par des méthodes sans animaux, l'étude devant selon lui porter sur des modèles in vivo.
Objectifs
Le tPA est une sérine protéase principalement connue pour être synthétisée par les cellules endothéliales, puis libérée dans la circulation sanguine pour intervenir dans la fibrinolyse grâce à sa capacité à activer le plasminogène en plasmine. Ces propriétés font que le tPA est utilisé comme traitement pharmacologique de la phase aigüe des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques. Le tPA est également considéré comme un neuromodulateur au sein du système nerveux central (SNC). Il est produit par les neurones, les cellules gliales. Il est impliqué dans de nombreux processus physiologiques dont le développement cérébral, la plasticité synaptique, ainsi que dans des processus d’apprentissage et de mémoire. Grâce à ses différents domaines, le tPA interagit avec différents récepteurs tels que les récepteurs N-methyl-D-aspartate (NMDAR). Cette interaction (tPA/NMDAR) est impliquée dans certains processus physiologiques tels que la plasticité synaptique, la corticogenèse et pathologiques (AVC, sclérose en plaques/SEP, inflammation). Afin de mieux comprendre le rôle spécifique de cette interaction et de pouvoir élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à celle-ci, nous avons généré, avec la clinique de la souris une nouvelle souche de souris. La spécificité de cette nouvelle souche est une mutation entrainant le blocage de l’interaction du tPA avec les NMDAR. Ainsi, dans ce projet, nous allons caractériser phénotypiquement ces souris et leurs contrôles en conditions inflammatoires (inflammation centrale, périphérique et modèles auto-immuns).
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales mais aussi translationnelles ou appliquées menées pour différentes pathologies où cette interaction joue un rôle (SEP et processus inflammatoires). Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude phénotypique de cette interaction doit s’effectuer sur des modèles in vivo. De plus, les méthodes in vitro de ce projet seront réalisées en parallèle afin de réduire le nombre d’animaux et pour mieux caractériser cette interaction entre le tPA et les NMDAR.
Procédures
Un premier lot d’animaux seront soumis à un modèle d’inflammation systémique, (n=160, durée de la procédure :20 secondes) ou centrale, (n=160, durée de la procédure :30 minutes). 24 heures après, chaque animal fera l'objet d’un examen par Imagerie par Résonnance Magnétique (IRM) (n=320, durée de la procédure :30 minutes). Un second lot d’animaux seront soumis à un modèle de sclérose en plaques (EAE-MOG ; n=100, durée de la procédure : 20 secondes).
Impact sur les animaux
L’hébergement des animaux s’effectue au moins 7 jours avant le début des procédures pour leur habituation et la gestion de leur stress. Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître chez les animaux seraient : Pour l’ensemble des procédures : une perte de poids, des douleurs post-opératoires, du stress, des déficits fonctionnels. Tous les animaux auront un suivi attentif et régulier par l’expérimentateur et le personnel animalier qualifié (prise journalière du poids des animaux, observation des animaux dans la cage en s’assurant de leur bien-être (Mouse Grimace Scale, prise alimentaire et boisson).
Devenir
L'ensemble des animaux utilisés dans ce projet feront l'objet d'une mise à mort à la fin de chaque procédure afin de générer des tissus permettant des observations histologiques ou par quantification du traceurs injectés de l'intégrité anatomique et vasculaire du SNC.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soin et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour respecter le bien-être de l’animal. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement de différentes pathologies humaines (SEP, inflammation).
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans chaque phase du projet, le nombre minimum d’animaux a été défini à partir de nos données sur chaque modèle, de nos expériences précédentes et des données disponibles dans la littérature.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur, une couverture analgésique suffisante en période pré et post opératoire, un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine du neurodéveloppement, les AVC, les modèles de SEP et les techniques employées sont bien connues. L’anatomie du SNC murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Les expériences envisagées nécessitent l’utilisation d’animaux transgéniques, les souris KI-L178A déficientes pour le site d’interaction du tPA sur la sous-unité GluN1 du NMDAR. Ce modèle transgénique ne peut être réalisé que chez la souris (Mus musculus). Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 6 à 8 semaines correspondant à un stade jeune adulte seront nécessaires. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de pathologies (AVC, sclérose en plaques/SEP) et notamment en conditions inflammatoires (inflammation centrale, périphérique et modèles auto-immuns).
Etude des mécanismes de l’hypoxie intermittente et de son effet sur un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène chez le souriceau
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Les souriceaux sont soumis à des variations d'oxygène pour reproduire la rétinopathie du prématuré, certains recevant une injection dans l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que les mères supportent mal le retour à un air normal et développent une détresse respiratoire, ce qui conduit à les tuer dès la sortie du caisson et à confier les petits à des mères adoptantes. Il justifie l'usage de la souris par l'impossibilité de reproduire la maladie sur des cellules isolées.
Objectifs
La rétinopathie du prématuré (ROP) est un trouble oculaire potentiellement cécitant qui affecte les prématurés. Elle survient lorsque les vaisseaux sanguins de la rétine, la couche de tissu nerveux à l'arrière de l'œil responsable de la vision, se développent anormalement. Chez les prématurés, les vaisseaux sanguins de la rétine ne sont pas complètement formés à la naissance et, par conséquent, ils peuvent être perturbés par des facteurs tels que l'oxygénothérapie et d'autres traitements médicaux. Dans certains cas, des vaisseaux sanguins anormaux peuvent se développer dans la rétine, provoquant des cicatrices et pouvant entraîner un décollement de la rétine et la cécité. La ROP est une maladie grave qui peut entraîner des problèmes de vision à vie ou la cécité si elle n'est pas traitée. Cependant, une détection et un traitement précoces peuvent aider à prévenir la perte de vision dans la plupart des cas. Notre objectif est de révéler et comprendre le mécanisme de l'hypoxie intermittente chronique (CIH) et son influence sur la rétinopathie induite sur des souriceaux par l'oxygène (OIR) (modèle animal normalement utilisé pour la rétinopathie du prématuré), comprenant l'angiogenèse rétinienne, la néovascularisation rétinienne et l'inflammation rétinienne. L'hyperoxie fait référence à un état d'augmentation des niveaux d'oxygène ou à une concentration d'oxygène supérieure à la normale. L'hypoxie se caractérise par des niveaux d'oxygène réduits ou une concentration d'oxygène inférieure à la normale. La concentration normale d’oxygène dans l’air ambiant (normoxie) est de 20.9%. La rétinopathie est toute lésion de la rétine des yeux pouvant entraîner une déficience visuelle. La rétinopathie fait souvent référence à une maladie vasculaire rétinienne ou à des lésions de la rétine causées par un flux sanguin anormal. L'angiogenèse est le processus physiologique de formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux sanguins préexistants. La néovascularisation fait référence à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins, en particulier à une croissance anormale ou excessive des vaisseaux.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes de l’hypoxie intermittente et son interaction dans un modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, ainsi que de connaître les expressions géniques qui entrent en jeu. Cela permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation dans l’œil et soigner la rétinopathie du prématuré.
Procédures
Dans ce projet il n’y a pas de chirurgie. Les animaux seront soumis à des variations de concentrations d’oxygène (hyperoxie pendant 5 jours et hypoxie intermittente pendant 4 ou 10 jours). Pour le protocole d’hyperoxie, la concentration en oxygène est maintenue à 75% (la montée se fait en 15-20 minutes). Lors du protocole d’hypoxie, la concentration en oxygène passe de 20,9 % à 7 % en 45 secondes. Elle se maintient à 7 % pendant 30 secondes puis revient à 20,9 % en 15 secondes. Ensuite, la concentration en oxygène se maintient à 20,9 % pendant 45 secondes. C'est un cycle d'hypoxie intermittente, répété 10 heures par jour de 10h00 à 20h00. Certains recevront des injections intravitréennes (qui dure entre 2 et 3 minutes) sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à une stabulation dans un environnement non adapté (hyperoxie ou hypoxie). Le modèle d’hyperoxie peut induire chez les femelles une difficulté de réadaptation en normoxie qui se traduit par une détresse respiratoire. En revanche l’hyperoxie n’a pas d’impact sur les souriceaux. Certains souriceaux subiront une injection intraoculaire. Dans de rare cas, cela peut induire une inflammation.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés à l’issu de chaque procédure. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem sur les souriceaux, cela implique donc leur euthanasie. Les mères ne peuvent pas entrer dans une nouvelle procédure après leur passage dans le caisson d’hypoxie/hyperoxie et seront donc également euthanasiées.
Remplacement
Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’oeil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus.
Réduction
Pour cette étude nous utiliserons un total de 2400 souris. Nous devons induire plusieurs expériences (5 expériences/groupe expérimental) en raison de la grande variabilité dans le développement de la pathologie entre les souris d'un même lot. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables selon nos précédentes expériences (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 6 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés par portée dans des cages ventilées. Les cages comportent plusieurs cotons et une petite maisonnette pour pouvoir faire leur nid. Les animaux sont hébergés avec alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Lors des expériences de d’hyperoxie et d’hypoxie, les animaux sont stabulés dans des cages ayant les mêmes dimensions qu’en stabulation normale, avec les mêmes enrichissements. Suite à l’hyperoxie, le retour en condition de normoxie est mal supporté par les mères et peut induire une détresse respiratoire, afin d’éviter cela nous euthanasions les mères dès le retour en normoxie. Les souriceaux bénéficieront d’une mère adoptante swiss à la sortie du caisson. En effet, les souris Swiss sont connues pour être de bonnes mères adoptantes. Certains souriceaux subiront une injection intravitréenne sous anesthésie générale et anesthésie locale. L’animal est placé sur tapis chauffant durant pour prévenir le risque d’hypothermie.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la rétinopathie, l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. La souris est un animal petit, facilement manipulable, qui se reproduit bien. En outre, l’étude des mécanismes physiopathologiques conduisant à la dégénérescence rétinienne sur la souris a été validée par de nombreuses publications, et ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. De plus, notre projet nécessite l'utilisation de souris car c'est l'espèce dans laquelle a été développé le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène et l’hypoxie intermittente. Pour le modèle de rétinopathie induite par l’oxygène, les animaux seront utilisés dès 8 jours de vie. En effet, chez la souris la vascularisation rétinienne se développe à la naissance jusqu’à 21 jours. Les variations d’oxygénation déclenchent une néovascularisation que pendant la vasculogenèse rétinienne qui a lieu les 3 premières semaines de vie de la souris. L’hyperoxygénation entre 8 et 13 jours de vie entraine une perte des vaisseaux (phase de vaso-oblitération). Au retour en normoxie à 13 jours l’hypoxie relative mène à une angiogenèse compensation et pathologique ce qui correspond à la phase de néovascularisation.
Contrôle neural de la réponse autoimmune dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'ablation du nerf vague, d'ablation ou de dénervation de la rate, puis, après trois semaines, des injections déclenchant une inflammation auto-immune de l'œil, suivie d'une imagerie quotidienne du fond d'œil sous anesthésie. Le porteur indique attendre une douleur post-opératoire et une inflammation oculaire réversible en 24 à 48 heures. Il affirme que ces mécanismes auto-immuns impliquent une interaction complexe de types cellulaires qui ne peut être étudiée qu'au sein d'un organisme entier.
Objectifs
Les maladies auto-immunes sont liées à l’activation du système immunitaire. De récentes avancées en neurosciences et en immunologie ont révélé que les réflexes neuronaux régulent le système immunitaire. L'activation du nerf vague atténue les maladies auto-immunes. Notre projet vise à étudier les mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse autoimmune par le système nerveux via le nerf vague, en particulier dans l’uvéite une pathologie inflammatoire intraocculaire.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre le rôle du système nerveux dans le contrôle de la réponse autoimmune et permettra de mettre en évidence de potentielles cibles thérapeutiques chez l’Homme pour réguler l’inflammation en particulier dans l’œil.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie une seule fois : vagotomie (ablation du nerf vague) ou splénectomie (ablation de la rate) ou dénervation de la rate ou contrôle. Chacune des interventions dure 15 à 20 minutes par animal. Les animaux recevront des injections d’anesthésique et d’analgésie en pré et post opératoire. Après 3 semaines de récupération, les souris recevront sous anesthésie 1 fois 3 injections sous-cutanées pour induire une uvéite autoimmune expérimentale (EAU) (inflammation dans l’œil) active ou bien une injection intraveineuse de lymphocytes T pour induire une EAU passive. Chaque injection se fait sous anesthésie en moins d’une minute. La rétine sera évaluée par imagerie du fond d’œil tous les jours pendant 1 à 2 semaines et par Tomographie à Cohérence Optique 1 ou 2 fois par animal (actes non invasifs mais sous anesthésie volatile pour éviter tout mouvement de l’animal, durant environ 5 minute par animal). Les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire en fin de parcours.
Impact sur les animaux
Pour les chirurgies : -Risque de mauvaise réaction à l’anesthésie (stress physique) -Stress thermique lié à l’anesthésie -Problème post-opératoire : lésion comme réouverture de la plaie (rare) et saignement (rare) -Douleur Pour les injections intraoculaires : -Risque d’inflammation localisée de l’œil réversible au bout de 24 à 48h après injection
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et que cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans nos études nous nous intéressons aux mécanismes autoimmuns qui impliquent une interaction complexe de nombreux types cellulaires ne pouvant être étudiée qu’au sein d’un organisme entier car ne peut pas être reproduit en utilisant des cultures de cellules isolées provenant de différents tissus. Les études in vitro sur les animaux invertébrés ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est donc une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude.
Réduction
Nous prévoyons 1500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 10 animaux défini par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet, selon nos expériences antérieures.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe de 5 dans des cages ventilées avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Les animaux en provenance de l’extérieur auront une période d'acclimatation de 5 jours avant expérimentation. Si nécessaire et en cas d'agressivité des mâles, les animaux seront séparés. Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés dans les conditions conformes à la règlementation. Pour éviter toute souffrance ou détresse animale, les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale lorsque nécessaire. Pour les expériences d’EAU (uvéite autoimmune expérimentale), des anesthésies gazeuses par inhalation seront établies pour chaque acte. La respiration de la souris sera surveillée et en cas de début de détresse respiratoire, le pourcentage d’anesthésique sera largement diminué jusqu’à la reprise d’une respiration normale. Il sera ensuite ajusté afin de n’être ni trop faible (réveil de la souris) ni trop fort (détresse respiratoire). Pour les chirurgies, les animaux bénéficieront d’une anesthésie. En prévention de la douleur, nous administrerons un analgésique le jour de la chirurgie ainsi que le lendemain. Un gel ophtalmologique est appliqué sur les yeux des animaux pour éviter l’assèchement de la cornée durant l'anesthésie. Application d’un antiseptique au niveau du champ opératoire. Pour éviter une hypothermie, l’opération se fait sur tapis chauffant à 37°C. Réveil en chambre thermostatée à 30°C. Les animaux ayant subi une chirurgie sont observés avec attention particulièrement les 3 premiers jours qui suivent la chirurgie par l’expérimentateur et par le personnel qualifié de l’animalerie. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Les animaux auront une période de récupération de 3 semaines entre la chirurgie et l’entrée en procédure d’induction d’uvéite.
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. De plus, ce modèle offre l’avantage de multiples options pour les analyses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie.
Etude comparative de la perception de la voix chez les primates — Volet Macaque EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
12 macaques rhésus vont être utilisé·es, gardés en vie et réintroduits dans leur groupe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une puce radiofréquence, est capturé la veille puis transporté et placé sous anesthésie environ trois heures pour un examen en IRM du cerveau. Le projet, de recherche fondamentale, compare la perception de la voix entre macaques, ouistitis et humains. Le porteur indique qu'aucun individu ne sera tué et affirme que cette comparaison entre espèces ne peut se faire sans recourir à des animaux.
Objectifs
Ce projet vise à étudier les mécanismes cérébraux et comportementaux de la perception de la voix chez les ouistitis (callithrix jacchus), le macaque (rhesus) et l’humain. La description du projet concerne les macaques. Les macaques sont hébergés dans des volières extérieures et intérieures en groupe sociaux dans l’EU2/2. Les performances comportementales à des tâches de cognition auditive sont mesurées via des modules de tests automatiques accessibles à volonté. Nous utilisons également l’IRMf pour mesurer l’activité cérébrale dans des conditions d’écoute passive et la comparer entre les groupes de sujets de taille comparable entre ouistitis, macaques et humains. Les macaques sont scannés en IRM 3T sous anesthésie. Deux expériences seront réalisées : la localisation d’un patch vocal (neurones sensibles et spécifiques au traitement des vocalisations des macaques) et comparaison inter-espèce.
Bénéfices attendus
Nous espérons que cette recherche fournira de nouvelles informations cruciales sur les bases cérébrales du traitement de l'information vocale chez les macaques. En particulier, nous mesurerons la localisation anatomique et la variabilité interindividuelle des patchs vocaux des macaques avec une taille d'échantillon et une puissance statistique comparables à celles des études humaines, pour une comparaison optimale entre espèces.
Procédures
Pose d’une puce RFID en position sous-cutanée dans chaque avant bras : celle-ci se réalise dans l’EU2/2 lors du contrôle sanitaire des animaux qui dure en moyenne 40 minutes, la pose de puces en elle-même ne dure pas plus de 10 minutes. La capture des animaux se réalise la veille de l’IRM et dure en moyenne une heure (avec ou sans anesthésie). Le transport des animaux jusqu’au centre IRM de l’EU1/2 se décompose en deux trajets (aller et retour) d’une heure et demie chacun. La session de scanning dure environ 3 heures incluant la sédation et l’anesthésie de l’animal, son positionnement dans le scanner, l’acquisition des séquences anatomiques et fonctionneles, puis sa sortie et son réveil.
Impact sur les animaux
Mise à jeun 12 heures avant les anesthésies (pose puce RFID, transport IRM). Anesthésie lors du transport au centre d'imagerie et pendant la session de scanning. Isolement du groupe pour les animaux participants à l'IRM anesthésié.
Devenir
Le projet ne prévoit la mort d'aucun individu, ils seront tous réintroduits dans leur groupe sociaux.
Remplacement
Il s’agit d’une étude comparative : par définition celle-ci compare des résultats obtenus chez l’humain à ceux obtenus chez d’autres espèces existantes, afin d’inférer des mécanismes potentiellement présents chez un ancêtre commun, ici les mécanismes comportementaux et neuronaux de la perception de l’information vocale. Il n’est pas possible d’utiliser cette approche expérimentale sans avoir recours à des animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera minimal pour réduire autant que possible le nombre de singes impliqués, mais sera suffisant pour permettre une puissance statistique importante pouvant rendre les données interprétables. Le nombre d'animaux doit pouvoir permettre de comparer un groupe de macaques à un groupe humain.
Raffinement
Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la la structure en charge du bien-être animal. Les animaux seront seulement anesthésié une fois pendant la durée de l'étude pour la pose des puces RFID. Pour certains animaux, comme les males adultes, une deuxième anesthésie par technique de téléanesthésie pourra etre réalisé pour le transpor des animaux au centre d'imagerie.
Choix des espèces
Cette étude comparera les données observées chez l’humain à celles mesurées chez deux espèces de primates nonhumains: macaques et marmousets. Les raisons justifiant le choix des macaques comme espèce de comparaison sont les suivantes : -Ils sont relativement proches de nous sur le plan phylogénétique de sorte que les résultats nous renseigneront sur l'histoire de l'évolution relativement récente ; -Ils utilisent des vocalisations complexes et variées, bien caractérisées acoustiquement ; -Il s'agit d’un modèle neuroscientifique largement étudié, en particulier pour les neurosciences auditives, de sorte que les résultats obtenus seront interprétables en relation avec une grande quantité de données complémentaires ; -Enfin, ils peuvent être scannés en IRMf sur le même scanner que les humains, ce qui constitue un pont unique entre l'IRMf humaine et la littérature électrophysiologique sur les singes. Nous constituerons un groupe formé de sub-adultes afin de faciliter la gestion et l’entraînement dans les premières phases du projet, et afin qu’ils soient à un âge de jeune adulte pendant le durée du projet, pour comparaison optimale avec les groupes d’humains aussi constitués de jeunes adultes.
Identification des réseaux neuronaux impliqués dans la douleur cornéenne grâce à l’imagerie fonctionnelle ultrasonore, chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
260 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère. On leur induit une douleur cornéenne chronique, soit par excision des glandes lacrymales sous anesthésie, soit par dépôt répété de chlorure de benzalkonium, avant imagerie fonctionnelle du cerveau et prélèvement. Le projet vise à identifier les réseaux neuronaux de la douleur cornéenne, que le porteur décrit lui-même comme provenant du "générateur de douleur le plus puissant" de l'organisme. Il affirme que cette douleur chronique ne peut être modélisée qu'au niveau de l'animal entier.
Objectifs
La cornée est le tissu le plus innervé de l’organisme et le générateur de douleur le plus puissant. La sécheresse oculaire est une pathologie liée à une diminution de la production de larmes. Elle engendre des douleurs, picotements, sensation de brûlure oculaire et sensibilité à la lumière (photophobie) avec des atteintes cornéennes. C’est une douleur chronique qui affecte de façon dramatique la qualité de vie des patients (anxiété, dépression) et qui en fait l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Les douleurs oculaires sub-aigües et chroniques sont les plus difficiles à traiter notamment car les circuits neuronaux impliqués sont encore très mal identifiés en raison des difficultés techniques en recherche préclinique où l’étude des réseaux neuronaux chez le petit animal reste complexe. Ce projet a pour but de mettre en évidence et mieux comprendre les réseaux de neurones et leurs dysfonctionnements en lien avec une douleur cornéenne chronique et sub-aigüe. A cette fin, nous enregistrerons les activités cérébrales suite à des stimulations cornéennes, dans des modèles murins d’une douleur oculaire sub-aigüe ou d’une douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
La prise est charge de la douleur oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces notamment dans le cadre de douleurs sub-aigües ou chroniques. Le bénéfice attendu de ce projet est d’aboutir à une meilleure caractérisation des circuits neuronaux de la douleur cornéenne et de permettre d’améliorer notre compréhension de ses mécanismes d’initiation et de maintien, encore largement inconnus, afin de faire le lien entre manifestations cliniques et mécanismes neurologiques fin de développer des traitements réellement efficaces.
Procédures
Les animaux subiront soit une chirurgie pour le modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes soit le dépôt d’une goutte de chlorure de benzalkonium pour le modèle de douleur oculaire inflammatoire. Ils seront ensuite passés en imagerie fonctionnelle ultrasonore puis les cerveaux seront prélevés. Deux modèles animaux seront utilisés dans ce projet : 1) Modèle de sécheresse oculaire par défaut de production de larmes Les animaux développant une sécheresse oculaire sont des modèles d’une maladie humaine. Elle sera induite chez l’animal par excision des glandes lacrymales. Il s’agit d’une douleur cornéenne difficile à soigner. Les animaux sham subiront la chirurgie sans excision et donc ne développeront pas la maladie. Les animaux « naïfs » ne subiront aucune chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie générale avec une analgésie appliquée en pré-, per- et post-opératoire. La chirurgie ne se fait que sur un des deux yeux. Elle dure 15 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois par animal. Les animaux seront suivis régulièrement après la chirurgie pour vérifier leur état général (poids) et l’état de la plaie. 2) Modèle de douleur oculaire inflammatoire par instillation du chlorure de benzalkonium Les animaux contrôles de ce modèle recevront une goutte deux fois par jour de tampon phosphate salin (solution neutre) dans l’œil droit durant 7 jours. Les animaux modèles recevront une goutte de chlorure de benzalkonium deux fois par jour dans l’œil droit durant 7 jours. Le dépôt de la goutte se fait sur un animal vigile en contention manuelle et le temps pour réaliser le dépôt et la contention de l’animal est de 20 secondes. Ces animaux modèles développeront une douleur oculaire. - IMAGERIE fUS : L’ensemble des animaux auront une session d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui durera 2h par animal et qui se fera sous anesthésie générale. L’ensemble des tests réalisés durant l’imagerie seront donc fait sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie.
Impact sur les animaux
- Dans le modèle de sécheresse oculaire, Les nuisances attendues seront celles observées dans la sécheresse oculaire à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. Toutes ces manifestations sont imputables à la composante inflammatoire de la maladie. La chirurgie qui permet de mettre en place le modèle de sècheresse oculaire entrainera une douleur post-opératoire qui disparaitra en quelques jours. La douleur post-opératoire sera prise en charge par un traitement adapté. - L’instillation topique bi-quotidienne du chlorure de Benzalkonium durant 7 jours correspondent classiquement aux traitements (collyres) donnés aux patients en clinique humaine. C’est un conservateur. Son application topique sur le long terme est connue en clinique humaine pour être toxique pour la surface oculaire et engendrer des gènes ou des irritations : sensation de corps étranger, de picotement ou brûlure, d’œil sec voir une inflammation d’intensité variable. - Imagerie fUS : l’anesthésie prolongée des animaux pourrait induire des effets indésirables notamment sur les constantes vitales de l’animal : température, fréquences cardiaques et respiratoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux par une procédure réglementaire à la fin de chaque procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux vivants se justifie par la nécessité de mettre en évidence des circuits neuronaux complexes impliqués dans la douleur cornéenne et qui impliquent l’ensemble de l’encéphale. Le modèle que nous utilisons ne peut pas être remplacé par une approche alternative in-vitro car la douleur cornéenne chronique est une pathologie complexe qui ne peut être modélisée qu’au niveau de l’animal entier. Une approche intégrative sur l’animal entier reste incontournable. Notre projet de recherche porte sur les l’étude de réseaux neuronaux complexes présents dans un cerveau entier. Bien que ces questions soient posées pour aider à une meilleure compréhension des pathologies humaines et l’amélioration de leur traitement, une première étape nécessite l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Nous utiliserons 260 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ce nombre sera gardé le plus petit possible et a été estimé grâce aux outils disponibles de calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à 22+/-2 degrésCelsius et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour et 12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites (grille de suivi). Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin de mettre à mort l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Si un animal anesthésié (chirurgie ou imagerie fonctionnelle ultrasonore fUS) présente une détresse respiratoire ou cardiaque ou s’il se trouve en hypothermie, nous procéderons à un arrêt immédiat du protocole en cours et en l’absence de rétablissement l’euthanasie de l’animal sera envisagée par l’administration d’une dose létale d’euthanasiant chimique.
Choix des espèces
Dans la littérature, les modèles de douleur oculaire ont majoritairement été développés chez des souris mâles et femelles adultes. Ce projet de recherche portant sur la douleur oculaire nécessite d’utiliser des animaux adultes, âgés de plus de 6 semaines dont les circuits neuronaux sont établis. Les animaux arriverons donc à l’âge de 7 semaines dans notre animalerie. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation de 7 jours. Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis.
Génotypage invasif des lignées transgéniques
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
100 000 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, la plupart tuées et environ 5 000 réutilisées. Chaque animal subit le prélèvement d'un fragment d'oreille ou de queue pour établir son génotype dans le cadre de la gestion d'un élevage de lignées génétiquement modifiées. Le porteur décrit une douleur "légère et très passagère" et affirme qu'une anesthésie serait plus stressante que le geste lui-même. Il indique qu'au moins la moitié des souris n'ont pas le génotype recherché et sont mises à mort, l'objet de l'élevage étant de produire les animaux destinés à l'expérimentation.
Objectifs
L'objectif est la caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Bénéfices attendus
Nécessité d'une caractérisation génétique des individus dans le cadre de la gestion d’élevage d'animaux génétiquement altérés
Procédures
prélèvement d'une biopsie (auriculaire ou caudale) par animal (contention et biopsie < 1 minute, prélèvement en lui-même < 1s, taille du prélèvement < 5mm)
Impact sur les animaux
Aucune nuisance supplémentaire n'est attendue par rapport à des techniques de marquage et génotypage non-invasives, c'est à dire une douleur légère et très passagère (quelques secondes) lors du prélèvement de la biopsie
Devenir
Les animaux génotypés sont utilisés soit pour l'élevage, soit pour l'expérimentation. Dans le cas de l'expérimentation, les animaux sont euthanasiés à l'issue d'un projet scientifique autorisé par le ministère. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Les animaux qui n'ont pas le génotype nécessaire pour les expérimentations ou le maintien de la lignée seront euthanasiés lorsqu'ils ne peuvent pas être réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype.
Remplacement
Les animaux produits dans l'animalerie sont nécessaires pour des projets scientifiques validés par différents organismes scientifiques, projets pour lesquels il n'existe aucune méthode alternative in vitro ou in silico. Avant de déposer cette demande, une alternative non-invasive (arrachage de bulbe pileux) a été testée mais n’a pas donné de résultats exploitables. De plus, cette méthode, ainsi que d’autres méthodes non-invasives (analyse de fécès, prélèvement buccal) entraînant toutes un niveau de stress équivalent à la biopsie invasive caudale ou auriculaire, n’ont pas été retenues.
Réduction
L'animalerie élève de nombreuses lignées transgéniques au phénotype non dommageable pour prélèvement de tissus ou pour des protocoles d'expérimentation animale. L'élevage a pour but de produire les animaux nécessaire à l'expérimentation. Le maintien des lignées par croisement nécessitant un génotypage est nécessaire pour éviter une dérive génétique par croisement consanguin, et pour la production de contrôles dans la même portée. Cela contribue à diminuer la variabilité du fond génétique des animaux et donc des résultats, permettant la réduction du nombre d’animaux nécessaires aux expériences. Selon les lignées et les projets, au moins la moitié des animaux n'ont pas le génotype nécessaire à l'expérimentation, environ un quart est utilisé pour prélèvement de tissu, et un autre quart dans des projets scientifiques validés par le ministère. Lorsque c'est possible, les animaux qui n'ont pas le génotype adéquat sont réutilisés dans des projets indépendants de leur génotype (estimé à 5000 animaux sur 5 ans).
Raffinement
Les méthodes de prélèvement (biopsie auriculaire ou caudale) et de marquage (boucle d'oreille lors du sevrage, ou tatouage digital avant sevrage) ont été choisies pour minimiser l'inconfort en fonction de l'âge des animaux (et donc du développement de la queue et de l'oreille). La biopsie auriculaire prélevée lors du marquage au sevrage des animaux n'induit pas de stress supplémentaire par rapport au marquage. Cette méthode n'induit pas de signes majeurs d'incomfort, et du fait que l'oreille est très peu vascularisée, n'engendre pas de saignement. Dans le cas de biopsies précoces, quand l'oreille n'est pas assez développée, la biopsie est prise sur l'extrémité de la queue, qui n'est pas ossifiée dans les 15 jours après la naissance. Le saignement est minime (moins d'une goutte) et s'arrête immédiatement. Le marquage comme le prélèvement sont réalisés avec du matériel adapté, le geste est rapide et sûr, réalisé en routine par du personnel formé. La mise en place d’un anesthésique et/ou analgésique serait plus stressante que le geste lui-même. Les animaux sont surveillés quotidiennement par les animaliers. Ainsi, de même que pour tous les animaux de l'élevage, biopsiés ou non, si une infection ou signe d'inconfort est observé, un incident est rapporté concernant l'animal. Un traitement adapté est alors décidé, en accord avec l'utilisateur et sur la base de point-limites pré-établis. Si l'utilisateur n'est pas joignable, la décision est prise par le soigneur, avec le vétérinaire si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour l'utilisation de lignées transgéniques permettant l'étude ciblée de systèmes biologiques complexes. La majorité des animaux est utilisée au sevrage (entre 20 et 30 jours après la naissance), pour minimiser le stress de contention : ainsi sevrage, sexage, marquage et biopsie sont réalisés en même temps. 5 à 10% des animaux sont utilisés avant sevrage lorsqu'un génotypage précoce est nécessaire.
Etude de neurophysologie chez la souris pour étudier les interactions entre le système vestibulaire et la voie spino-extraoculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de la tête, implantation de dispositifs ou craniotomie, puis des tests de course sur tapis et sur roue et des tests visuo-vestibulaires, la tête maintenue fixe et sous restriction hydrique pour le motiver, avant sa mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique que certaines souris subissent une atteinte vestibulaire pouvant s'accompagner de déficits auditifs, et met en avant l'analgésie. Il présente ce projet de recherche fondamentale sur l'équilibre et le regard comme ne pouvant être mené que sur animal vivant et éveillé.
Objectifs
Le système vestibulaire est responsable de la stabilisation de la posture et du regard. Dans le cas de pathologies touchant le système vestibulaire, les patients souffrent de déséquilibres et d’oscillopsies liées à une mauvaise stabilisation du corps et du regard au cours des mouvements. Se mettent alors en places des substitutions sensorielles qui visent à permettre le rétablissement de l’équilibre grâce aux informations visuelles et proprioceptives. Ces mécanismes diffèrent selon que la perte vestibulaire est congénitale ou acquise. Les patients rapportent également des perturbations différentes selon la locomotion réalisée : de manière contre-intuitive, l’instabilité est parfois moindre lors de locomotions plus dynamiques. Il a été récemment démontré chez le xénope et la souris l’existence lors de la locomotion d’un signal nerveux provenant de la moelle épinière (copie efférente spinale), générée par des neurones spinaux générateurs de rythme, qui participe au contrôle du regard. Le but de ce projet est de caractériser comment ce signal interagit avec les réflexes responsables du contrôle du regard qui dépendent des entrées vestibulaires et visuelles : les réflexes vestibulo-oculaires et optocinétiques. Nous évaluerons également dans quelle mesure ce signal participe à la substitution sensorielle lors de pertes vestibulaires plus ou moins marquées. À l'aide de techniques comportementales, pharmacologiques et électrophysiologiques, l’influence des paramètres locomoteurs sur l’intégration des signaux visuels, vestibulaires et spinaux sera étudiée, en particulier au niveau des neurones vestibulaires centraux. Ce projet utilisera un maximum de 480 souris.
Bénéfices attendus
Le projet constitue un projet de recherche fondamental qui vise à une meilleure compréhension des signaux sensoriels et nerveux qui permettent le sens de l’équilibre et de l’orientation, par l’étude d’une voie nerveuse non encore décrite, potentiellement importante lors de situation pathologiques conduisant à des substitutions sensorielles. Bien que conduit chez l’animal, les retombées sociétales du projet concernent la recherche translationnelle chez l’homme et notamment la question de la réhabilitation motrice chez des patients atteints de pertes des fonctions sensorielles et de fonctions locomotrices.
Procédures
-Les animaux seront tous soumis à une chirurgie unique permettant l'implantation de dispositifs sur la tête d'une durée comprise entre 20 minutes, ou d'une craniotomie d'une durée de 60 minutes. -Certains animaux seront utilisés lors de tests comportementaux de type course sur tapis motorisé (durée 45min), à raison de 3 tests par semaine pendant 2 semaines. D'autres seront utilisés pendant des tests comportementaux de type course sur roue non motorisée (durée 30min) pendant 2 seaines et des tests sensorimoteurs visuo-vestibulaires (durée 45min) pendant 2 semaines. -Une partie des animaux recevra une injection unique (durée
Impact sur les animaux
Des chirurgies potentiellement douloureuses nécessaires au projet sont réalisées ; afin de minimiser le stress et la douleur, des traitements analgésiques et antalgiques adaptés sont mis en place. Le protocole d’apprentissage de la tâche de locomotion sur roue nécessite une restriction hydrique afin de motiver les souris à la course. Une fois la tâche acquise, son maintien pourra être le cas échéant effectué à l’aide de récompense (eau sucrée) permettant de lever la restriction. Lors de ces apprentissages et lors des tests, les souris sont maintenues tête fixe pendant le temps expérimental qui n’excède jamais 60min. Les souris déficientes vestibulaires peuvent présenter des déficits auditifs associés.
Devenir
L'ensemble des animaux seront euthanasiées à la fin des procédures. Les cerveaux feront l'objet de prélèvements post-mortem et seront utilisés pour préciser la neuroanatomie des voies spino-oculaires étudiées ainsi que la localisation des neurones enregistrés au cours du projet.
Remplacement
L’intégration des signaux sensorimoteurs issus de l’oreille interne et de la moelle implique de nombreuses régions du cerveau et différents réseaux de neurones. Afin de comprendre les interactions entre systèmes, il est nécessaire de travailler sur un animal vivant et éveillé. Il s’agit d’un projet de Neurophysiologie intégrative qui ne peut être conduit que sur animal vivant.
Réduction
Des tests statistiques seront effectués en cours de protocole afin de réduire le nombre nécessaire d’animaux au minimum nécessaire pour atteindre des différences significatives entre les différents groupes testés. Le nombre de souris estimé l’a été en considérant que 20% des souris pourraient échouer à atteindre la vitesse minimale de 25cm/s lors de la tâche comportementale. Le nombre de souris pourra être diminué si cette estimation est supérieure à la réalité. L'électrophysiologie ne sera effectuée que sur souris contrôles et sur 1 unique groupe de souris, déterminé en fonction des résultats obtenus. Cette approche séquentielle permet de réduire de 120 le nombre de souris demandées.
Raffinement
Les souris sont maintenues par groupes de 4. Les cages sont enrichies avec des roues et rouleaux. Les animaux sont suivis individuellement, leur poids est controlé régulièrement pendant les phases de tests. Des traitements antalgiques et anesthésiques adaptés sont utilisés. Des points limites adaptés sont définis afin le cas échéant d’adapter les soins ou de mettre fin à l’expérimentation.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle reconnu pour les expériences de neurophysiologie intégrative visant à mieux comprendre le fonctionnemnt du cerveau des mammifères. Les animaux seront utilisés à l’âge où les réflexes sensorimoteurs étudiés sont matures, soit à partir de 6 semaines et jusqu’à 12 semaines (3 mois) pour les plus âgées.
Entretien du caractère de virulence de souches de Mycobacterium ulcerans chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
123 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal reçoit une injection sous-cutanée de Mycobacterium ulcerans dans la queue, la bactérie de l'ulcère de Buruli, avant le prélèvement de son tissu cutané après sa mise à mort à 45 jours. Le porteur indique que ce protocole n'est pas de la recherche mais l'entretien de la virulence de souches bactériennes, les souris étant utilisées pour régénérer des bactéries que la culture artificielle rend incapables de produire leur toxine. Il qualifie ce recours d'"indispensable" et décrit l'infection comme indolore, en s'appuyant sur trente ans de pratique.
Objectifs
L’ulcère de Buruli ou infection à Mycobacterium ulcerans est la troisième mycobactériose dans le monde. Cette maladie handicapante causée par M. ulcerans sévit principalement dans les zones tropicales humides de l’Afrique de l’ouest et centrale. Pour lutter contre cette maladie aux conséquences socio-économiques dramatiques, il est nécessaire de développer des approches prenant en compte les spécificités de cette maladie. Elles exigent le développement de projets globaux intégrant différentes facettes de la biologie du bacille. M. ulcerans sécrète une toxine appelée mycolactone. La mycolactone est une toxine lipidique qui est indispensable à la bactérie pour coloniser ses hôtes vertébrés ou invertébrés. Elle présente divers effets biologiques dont les principaux sont l’immunomodulation et l’analgésie. Dans ce contexte, nos projets s’articulent autour de trois axes : - Etudes de la régulation de la synthèse de la mycolactone dans des modèles in vitro puis in vivo - Identification des stratégies déployées par le bacille pour coloniser ses hôtes à l’échelle cellulaire et d’organismes entiers. - Etudes des effets analgésiques de la mycolactone. Ainsi, il nous est donc indispensable d’utiliser des souches produisant la mycolactone. Le génome de M. ulcerans possède plus de 260 séquences d’insertions, qui en raison de leur mobilité rendent les souches incapables de produire la mycolactone après 2-3 passages (repiquages) sur des milieux de culture artificiels, et donc les souches « perdent » leur virulence. A ce jour, malgré nos efforts (recherche de milieux sélectifs…), l’unique moyen de conserver la capacité des bactéries à produire la mycolactone est de réaliser des passages successifs chez l’animal (souris). Depuis trente ans nos souches sont entretenues par ce moyen. Sans recours à l’animal, nous ne pourrions plus développer nos projets de recherche, tout particulièrement ceux utilisant des approches in vitro (limitant l’utilisation d’animaux) ou requérant de la mycolactone purifiée. Ainsi notre présente demande n’est pas d’un projet de recherche sensu stricto mais d’un protocole requérant l’utilisation d’animaux pour obtenir des souches bactériennes « virulentes » qui seront utilisées pour nos différents projets de recherche tout particulièrement pour développer des approches in vitro permettant de limiter l’utilisation d’animaux.
Bénéfices attendus
Le bénéfice de ce protocole n’est pas direct puisqu’il ne s’agit pas d’un projet de recherche. Mais il est indispensable à l’ensemble de nos projets de recherche visant à (i) étudier l’effet analgésique de la mycolactone (nouvel analgésique) (ii) comprendre la physiopathologie de l’infection à M. ulcerans incluant les systèmes de régulation de la synthèse de la mycolactone.
Procédures
Pour ce protocole, la nuisance prévue est l’inoculation en sous cutanée de 50 µL d’une suspension contenant M. ulcerans. Pour limiter cette nuisance l’injection se fera sous anesthésie gazeuse. La colonisation des tissus cutanés (uniquement autour du site d’injection) induit une inflammation non douloureuse puisque M. ulcerans produit une toxine aux propriétés analgésiques puissantes (rendant les lésions indolores). Aucun prélèvement ne sera réalisé sur animal vigile. Les prélèvements des tissus cutanés seront effectués 45 jours post inoculation sur des animaux morts. Les animaux subiront une unique injection sous cutanée, (seringue 1mL, aiguille 26G) lors de l’inoculation bactérienne sous anesthésie générale (isoflurane). La durée de l’injection en sous-cutanée dans la queue dura moins de 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont liés à l’injection. L’injection peut produire une douleur légère. Pour atténuer cette douleur, l’injection en sous cutanée se sera sous anesthésie gazeuse. Le risque majeur est lors de l’inoculation de M. ulcerans, où une surinfection peut survenir dans les jours qui suivent. Selon notre expérience (sur 30 ans) les cas de surinfection sont rares ( 2°C à la normale, l’animal sera euthanasié. Si la température est normale mais que le comportement de l’animal ne redevient pas à la normale dans les 48h, l’animal sera mis à mort. Il est à noter que la mycolactone produite lors de l’infection présente un effet analgésique rendant les lésions indolores. Ainsi, nous n’avons jamais observé de gêne chez les animaux infectés par M. ulcerans (perte de poids, changement de comportement).
Devenir
Le but de ce protocole est de prélever le tissu cutané de la queue infectée par M. ulcerans. Dans ce contexte tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Le bien-être animal a été une des priorités dans la conception de cette étude mais nous ne pouvons à ce stade nous passer d'utiliser des animaux. L’utilisation de ces animaux permet de fournir du matériel à l’ensemble des projets de l’équipe permettant ainsi de réaliser de nombreuses expériences/criblage in vitro limitant ainsi l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu pour ce protocole est suffisant pour satisfaire l’ensemble des projets de recherche qui en dépendent. Il s’agit là d’un entretien de souche. Ce protocole ne requière pas d’utilisation d’analyses statistiques.
Raffinement
Afin de raffiner les conditions de vie des souris, un suivi adapté des animaux a été instauré afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'elles pourraient éprouver. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. Un suivi régulier sera effectué sur l'ensemble des animaux et des indicateurs comportementaux et physiques sont prédéfinis et constituent les points limites. Pour éviter toute souffrance ou stress lors de l’inoculation dans la queue, un anesthésique volatil (isoflurane) sera utilisé et le geste réalisé par une unique personne qui pratique régulièrement cette procédure (le porteur de projet). Il est important de souligner que la colonisation du tissu cutané par M. ulcerans est indolore. En effet, le bacille produit une toxine qui présente des propriétés analgésiques rendant le site infectieux hypo-esthésique. Les animaux subiront une surveillance accrue les 15 premiers jours post inoculation pour surveiller le risque de surinfection lié à l’inoculation (rarement observé ;
Choix des espèces
L’espèce souris est un très bon modèle pour étudier l’infection à M. ulcerans puisque cette espèce est « très sensible à l’infection ». Nos études antérieures ont montré que l’injection de moins de 10 bacilles était suffisante pour permettre une colonisation. De plus, le développement de l’infection est très homogène. Les souris utilisées peuvent être indifféremment des Balb/c ou des Swiss. Nous utiliserons donc souris des Balb/c ou des Swiss en fonction des disponibilités dans les élevages. Les animaux utilisés pour ce protocole devront être âgés de 8 semaines (maturation immunitaire) minimum.
Etude de la fonction vasculaire dépendante des prostaglandines chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Certaines sont dépourvues d'un récepteur vasculaire, subissent une dépilation du dos sous anesthésie puis une mesure du flux sanguin cutané sous une seconde anesthésie de trente à quarante-cinq minutes, avant d'être tuées pour prélever peau et vaisseaux. Les retombées annoncées, des pistes de traitement des troubles microcirculatoires humains, restent lointaines. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire de travailler sur un organisme entier" et qu'"il n'existe à l'heure actuelle aucune autre méthode".
Objectifs
La microcirculation joue un rôle clé dans la survie des tissus en leur fournissant de l'oxygène et des nutriments. Le flux sanguin est régulé par plusieurs substances qui sont libérées par le vaisseau lui-même tel que le monoxyde d’azote, un puissant vasodilatateur. Cependant, un nombre important de données expérimentales suggèrent maintenant un rôle pour d'autres substances vasculaires par l’intermédiaire d’un récepteur. L’évaluation de cette voie vasculaire est peu étudiée mais peut s’évaluer en mesurant la capacité des vaisseaux de la peau (au niveau du dos) à se dilater en réponse à l’application locale d’un faible courant. L’objectif de ce projet est d’étudier cette réponse vasculaire de la peau chez des souris qui sont dépourvues du récepteur vasculaire.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données de réactivité vasculaire de la peau obtenues sur animaux sains et animaux dépourvus pour le récepteur à la prostacycline. Ces résultats permettront de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts microcirculatoires chez l’homme et la femme.
Procédures
Une dépilation de la peau sur la partie basse du dos sera réalisée sous anesthésie générale induite par un gaz (2 à 3 min) 2 à 3 jours avant la mesure du flux sanguin de la peau. L’étude de la réponse du flux sanguin nécessite une nouvelle anesthésie générale induite par injection pour une durée de 30 à 45 min.
Impact sur les animaux
Une détresse respiratoire peut apparaître suite aux anesthésies. Une irritation cutanée peut apparaitre après dépilation. Une perte d’interaction avec changement de comportement peut apparaître suite à l’isolement d’une souris agressive ou blessée.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus cutané et vasculaires.
Remplacement
Ce projet a pour but de déterminer le rôle du récepteur de la prostacycline dans la fonction vasculaire cutanée. La prostacycline peut être produite par plusieurs cellules présentes dans la peau. Il est nécessaire de travailler sur un organisme entier car il est impossible de reproduire toutes les interactions dans un modèle de peau in-vitro. Des études chez l’homme existent mais aucune drogue n’est suffisamment efficace pour étudier l’effet du récepteur de la prostacycline sur la fonction vasculaire cutanée. Il n’existe à l’heure actuelle aucune autre méthode que celle décrite ici.
Réduction
Le nombre d’animaux total de souris prévues pour ce projet est de 90 afin d’étudier 15 souris par groupe, des 2 sexes. Le nombre d’animaux prévu est maximal. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons prévu d’utiliser des tests statistiques adaptés aux petits groupes pour évaluer les différences intra- ou inter-individuelles pour toutes les mesures. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les souris auront une période d’acclimatation de 1 semaine après leur arrivée avec suivi du poids 1 fois par semaine. Les cages sont enrichies pour améliorer le confort des animaux. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance.
Choix des espèces
La souris, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, reste largement utilisée pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède en effet une physiologie cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier la fonction vasculaire par les mêmes approches techniques tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaire et moléculaire. Afin de garder une cohérence avec tous nos projets antérieurs et pour renforcer la compréhension des mécanismes, nous utiliserons les animaux de ce projet à 12-14 semaines d’âge ce qui correspond à la maturité du système vasculaire et très éloigné du phénotype dommageable qui peut apparaitre à 12 mois.
Etude préliminaire de la caractérisation des connectivités rétino-tectales et rétino-corticales chez les Platyrhiniens
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Singes écureuils : 3
4 primates, un ouistiti et trois singes écureuils, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun reçoit deux injections dans les yeux sous anesthésie, avec un risque déclaré d'inflammation, d'ulcération de la cornée ou de baisse de vision, puis est tué sept jours plus tard pour prélever ses yeux et son cerveau. Cette étude préliminaire vise à cartographier les connexions visuelles pour comprendre l'évolution de la vision binoculaire. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe et que le primate non humain est le modèle le plus proche de l'humain, précisant que trois de ces individus ont déjà servi dans un autre projet.
Objectifs
La perception visuelle de la profondeur est possible par le chevauchement de ce qui est perçu par l’œil gauche et l’œil droit. Cette visualisation de la profondeur est rendue possible par la position frontale des yeux au niveau de la tête. Les neurones ganglionnaires situés dans la rétine et recevant les informations visuelles se projettent des deux côtés (hémisphères droit et gauche) du cerveau vers les noyaux visuels dont la zone du thalamus (corps genouillé latéral) qui joue un rôle de relais et est connecté au cortex visuel primaire (zone située à l’arrière du cerveau dans le lobe occipital). Ces projections entre la rétine et le thalamus se retrouvent chez la plupart des vertébrés. Cependant, la proportion des projections qui sont connectées au même côté du cerveau est très minoritaire chez les rongeurs (2-3%) tandis qu’elles représentent une part importante chez les primates (40%). Certaines études portant sur la latéralité des projections visuelles chez le primate présentent des résultats contradictoires sur la présence des projections visuelles bilatérales notamment chez le singe écureuil et leur présence semble éphémère chez le ouistiti. Les différences observées montrent les difficultés de mettre en évidence la présence ou non de ces projections chez le singe écureuil et le ouistiti commun. Ces deux espèces montrent des caractéristiques cérébrales intermédiaires, entre le macaque et le rongeur, ce qui en fait des modèles très importants pour étudier l’évolution de l’apparition de la vision binoculaire par l’intermédiaire de l’existence des projections visuelles bilatérales. Ce projet est une étude préliminaire afin de caractériser les connections permettant la stabilisation de l’image et la coordination des mouvements de la tête et des yeux ainsi que les connections impliquées dans la perception visuelle consciente chez les primates originaires d’Amérique (par exemple : singe écureuil et ouistiti commun) en comparaison avec ceux originaires d’Afrique et d’Asie (par exemple : macaque).
Bénéfices attendus
Savoir comment les neurones ganglionnaires se projettent de la rétine aux centres visuels cérébraux, dont le thalamus, nous permettrait de mieux comprendre l’organisation de la vision binoculaire des primates et de mieux comprendre son évolution chez les vertébrés.
Procédures
Pour chaque individu, deux injections intraoculaires (1 pour chaque œil) seront réalisées sous anesthésie. La durée de l’intervention est estimée à 2h par individu. Les animaux seront ensuite euthanasiés, 7 jours après les injections. La durée de l’intervention est estimée à 30 minutes par individu.
Impact sur les animaux
L’ensemble des injections sera réalisé sous anesthésie. Lors de l’anesthésie, les animaux pourraient présenter une instabilité de leurs constantes physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire…). Une douleur peut être induite lors de l’injection oculaire. Même si rarement, plusieurs complications post-injection peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (inflammation de la cornée, infection, ulcération de la cornée, dégradation transitoire de la vision).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés 7 jours après l’injection dans les deux yeux afin de récupérer leurs yeux, le chiasma optique (zone dans le cerveau où les nerfs optiques provenant de l’œil gauche et de l’œil droit se croisent) et le cerveau pour des analyses post mortem.
Remplacement
Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur l’organisation de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Cette complexité rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation des processus et nécessite des systèmes intégrés. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Ainsi, le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus prédictif et le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.
Réduction
Pour cette étude pilote, nous utiliserons seulement deux lots d'animaux : 1 saïmiri et un marmouset pour la 1e technique d'injection et 2 saïmiris pour la 2e technique d'injection. Certains de ces individus utilisés sont des animaux non naïfs qui ont participé à un autre projet scientifique classé comme modéré portant sur la menstruation humaine (APAFIS#31395-202103251034478 v7).
Raffinement
Les animaux seront manipulés seulement à deux moments, lors de l’injection oculaire puis lors de l’euthanasie pour le prélèvement des organes. En dehors de ce deux procédures les animaux évolueront dans leurs groupes sociaux respectifs. Toutes les animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par le responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal. Les deux manipulations se feront sous anesthésie générale . Une fois anesthésiés, les animaux seront placés sur une surface chauffante pour maintenir leur température corporelle et différents paramètres seront surveillées (fréquence cardiaque, fréquence respiratoire...). Les mesures mises en place (anesthésie, analgésie (méthode pour diminuer ou supprimer la douleur), asepsie (méthode préventive pour limiter les contaminations). Ce genre de procédure n'est habituellement pas douloureux après l'opération et ne nécessite pas de traitement anti-douleur de manière systématique. L'animal est gardé sous surveillance pendant 24h en zone d'isolement avec un autre congénère avant réintroduction dans son groupe et évalué quotidiennement par le personnel et le vétérinaire. En cas de signes de douleurs (immobilité, troubles de l'appétit...), un traitement anti-douleur pourra être donné. La période en zone d'isolement pourra être prolongé (24h supplémentaire) si la récupération de l'animal n'est pas validée par l'équipe vétérinaire. Au bout de 48h, après rétablissement complet validé par l'équipe vétérinaire, l'animal pourra être réintroduit dans son groupe sous surveillance accrue (vétérinaire et équipe responsable du bien-être).
Choix des espèces
Ce projet a pour objectifs de comprendre l’organisation des connexions entre l'oeil et les zones cérébrales impliquées dans la vision chez le singe écureuil et chez le ouistiti commun afin d’améliorer nos connaissances sur le développement de la vision binoculaire chez les vertébrés. Les processus impliqués dans le développement de la vision binoculaire sont complexes et mettent en jeu de multiples interactions cellulaires entre deux zones éloignées du cerveau. Le niveau de complexité anatomique de ces structures ainsi que la volonté d’obtenir un modèle suffisamment proche de l’Homme font du primate non-humain un modèle particulièrement approprié pour notre étude. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Des études ont permis de montrer la présence de connexions entre l'oeil et les zones cérébrales visuelles, des deux côtés du cerveau chez le macaque et l’Homme mais leur absence chez les rongeurs. Le choix de modèles pour cette étude s’est porté sur le singe écureuil et le ouistiti commun car ces espèces sont des primates partageant des caractéristiques visuelles et cérébrales communes avec d’autres primates provenant d'Afrique et d'Asie (par exemple : macaques) mais aussi des différences évolutives dues à leur appartenance aux primates originaires d'Amérique.