Organes sensoriels

600 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des inducteurs de rosacée sont injectés de façon répétée pour provoquer une inflammation cutanée, puis les animaux reçoivent des traitements quotidiens par voie orale, cutanée ou injectée, avec imagerie, mesures de l'épaisseur des oreilles et du dos et prélèvement sanguin terminal, pour tester de nouvelles molécules contre cette maladie de peau du visage. Le porteur reconnaît que la rosacée est "sans gravité" mais insiste sur son retentissement psychologique, et décrit une inflammation locale "transitoire" ainsi qu'un possible dessèchement de la peau. Il écarte le remplacement au motif qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la peau comme tissu vivant, alors que le bénéfice reste conditionné à ce qu'une molécule "se révèle efficace".

Objectifs

La rosacée touche 2 à 3 % de la population adulte, majoritairement des personnes âgées de 30 à 60 ans et atteint deux fois plus les femmes que les hommes. La rosacée est une maladie cutanée chronique caractérisée par une atteinte des petits vaisseaux sanguins du visage. Cette maladie de la peau touche essentiellement la partie centrale du visage (front, nez, joues, menton). Elle se manifeste par des rougeurs du visage occasionnelles ou persistantes ; de la couperose (dilatation anormale et permanente de petits vaisseaux sanguins de la peau, visibles à l'œil nu) ; et éventuellement, diverses lésions cutanées comme des papules, des pustules...Bien que sans gravité, la rosacée peut avoir un fort retentissement psychologique en raison de la visibilité des lésions du visage. Il est indispensable de tester ces molécules dans un modèle murin pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la rosacée afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

La rosacée est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints de rosacée de guérir de la rosacée et de son érythème, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.

Procédures

Des traitements seront administrés quotidiennement aux animaux par voie orale, topique, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intraveineuse afin d'évaluer leur efficacité dans le cadre de la rosacée (durée d'intervention

Impact sur les animaux

L'injection répétée des inducteurs de la rosacée induit de l'inflammation locale, mais très transitoire chez l'animal, du fait de l'injection en elle-même et du produit injecté. Il est possible également que les molécules testées par voie topique puissent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées (dans le cas de traitement de 1 à 2 semaines).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des procédures car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.

Remplacement

Nous n'utiliserons le modèle animal de rosacée qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de rosacée pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (ANOVA ; seuil de significativité alpha de 5 % dont le critère principal sera l'épaisseur des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Le nombre d’animaux sera de 8 par groupe (groupe d’animaux traités avec excipient de la molécule à tester, la molécule à tester et le traitement thérapeutique de référence commercialisé). Ce nombre est le minimum pour avoir une significativité acceptable avec une variation de 15 %, une puissance de 70 %, et une différence à souligner de 20 % entre groupes témoins et tests. Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation de l'imagerie permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du meme animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63/UE). Nous veillerons à ce que chaque cage d'hébergement bénéficie d'un enrichissement adapté (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, l'utilisation de points limites adaptés et établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement sera mise en place ainsi que l'utilisation d'un arbre décisionnel et des critères d'arrêt de souffrance.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris / rat) sont les plus utilisées et il s'agit d'excellents modèles pour ce type d'études. Ainsi il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans ces espèces. Les multiples homologies de séquences entres ces espèces et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Ils sont ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faible coûts, cycle de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de préciser que les molécules actuellement utilisées en clinique ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.

50 gerbilles de Mongolie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur induit d'abord un cholestéatome, une otite chronique destructrice, par cautérisation des trompes d'Eustache sous anesthésie, puis teste un outil chirurgical robotisé couplé à un laser pour détecter et détruire la lésion. Il indique que la formation du cholestéatome peut entraîner une baisse d'audition et des infections de l'oreille et que les deux interventions durent une quinzaine de minutes chacune. Il revendique la gerbille comme seule espèce non humaine sujette au cholestéatome spontané et juge le recours à l'animal "incontournable" pour reproduire des conditions chirurgicales réalistes.

Objectifs

Le cholestéatome est une forme grave d'otite chronique caractérisée par une croissance anormale et proliférative de la peau dans la cavité épitympanique, à l’origine d’infections répétées . C’est une lésion bénigne, mais son extension locale peut être destructrice : extension à l'oreille moyenne, remplissant la cavité tympanique autour des osselets, puis autour de l’oreille interne, du nerf facial, ou des méninges. Les patients souffrant de cholestéatome ont généralement des otorrhées purulentes chroniques, des pertes auditives, des vertiges, et plus rarement une paralysie faciale. Des complications graves liées à la propagation du cholestéatome vers le crâne peuvent se produire, entraînant des abcès cérébraux, méningite ou empyème. La chirurgie est le seul traitement connu pour enlever le cholestéatome. Elle doit préserver autant que possible les fonctions normales de l'oreille moyenne et interne. En raison de la structure délicate des structures de l’oreille moyenne telles que le tympan, la chaine des osselets, le nerf facial ou celles de l’oreille interne telles que la cochlée ou le vestibule, une telle microchirurgie est réalisée sous microscope et sous anesthésie générale. L’objectif du projet est de tester un outil chirurgical intelligent visant à détecter puis éradiquer ce type de lésion histologique dans un modèle animal de cholestéatome connu. Un outil robotisé intelligent visant à améliorer la détection et le traitement du cholestéatome sur le site opératoire dans l’oreille moyenne a été préalablement développé. La détection sera améliorée à l’aide d’un système d’imagerie multimodale associant imagerie par fluorescence et tomographie par cohérence optique (ou Optical Coherence Tomography, OCT). Il sera couplé à cette détection un laser de traitement dans le but de détruire les lésions de cholestéatome. Le système a déjà été validée sur des pièces anatomiques humaines et sur des tissus biologiques humains inertes cholestéatomateux ou non (contrôle) obtenus au cours d’intervention chirurgicale. Il nécessite une évaluation sur modèle animal afin de reproduire des conditions chirurgicales réalistes (saignement) et la possibilité d’un cholestéatome résiduel en cas d’ablation incomplète de la lésion primitive.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de cette étude sont une validation d’un outil de détection et de traitement du cholestéatome. Après la mise au point et validation du prototype sur des modèles cadavériques humains, la validation sur modèle animal est l’étape suivante en vue d’une translation clinique chez l’homme. La mise au point d’un outil clinique pour cette pathologie pourrait diminuer le nombre d’intervention chirurgicale chez l’homme. En raison de la complexité de l'anatomie de l'oreille moyenne, de la taille millimétrique de ses structures et la difficulté de reconnaissance des limites du cholestéatome. Il en résulte souvent l'impossibilité de réséquer complètement le cholestéatome, ce qui entraîne une maladie résiduelle et des opérations de révision chirurgicales. L’utilisation d’un microscope opératoire ou d’endoscopes réduisent mais n'éliminent pas complètement le taux de récidive, en raison des résidus microscopiques potentiels qui ne peuvent pas être facilement distingués des tissus sains. L'incidence élevée des cholestéatomes résiduels chez l’enfant est encore plus élevée et varie de 20 à 25% par rapport à 15% environ chez les adultes. Cela nécessite une ou plusieurs interventions systématiques. Éradiquer le cholestéatome en une chirurgie réduirait les coût des interventions, de l’hospitalisation, et la médication itérative sur les otorrhées à répétition. .

Procédures

Tous les animaux subiront deux interventions sous anesthésie générale, d’une durée d’environ 15 minutes. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité́ lors de ce type de chirurgie, avec des douleurs contrôlées et des animaux se ré alimentant rapidement après la chirurgie. Les animaux auront ensuite un examen de l’oreille sous anesthésie gazeuse. L’examen durera environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

La cautérisation des trompes d’eustache a été largement décrite et utilisée dans la littérature sur de gerbilles. Les études des cinquante dernières années sur des protocoles similaires n’ont pas mis en évidence de surmortalité. Les douleurs engendrées par ce geste chirurgical sont contrôlées par les antalgiques habituels et les animaux récupèrent en quelques jours. La formation de cholestéatome peut entrainer une hypoacousie chez les Gerbilles. Parfois, le cholestéatome peut entrainer une infection de l’oreille. Dans ce cas, ces animaux suivent un traitement antibiotique adapté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés, puisque nous souhaitons faire de l’histologie et des coupes de l’oreille après l’intervention pour vérifier l’absence de cholestéatome.

Remplacement

A ce jour, aucune méthode alternative que ce soit des études au niveau cellulaire ou tissulaire ne sont connues et envisagées pour ce projet. L’oreille est un organe complexe et il n'existe pas, à ce jour, de modèle permettant de reproduire un cholestéatome. Le seul moyen permettant d’évaluer la détection et la destruction d’un cholestéatome reste l’utilisation d’un modèle animal vivant pour simuler les conditions chirurgicales réelles et notamment la présence de saignement sur le cholestéatome. Ainsi, le recours à l’animal est incontournable pour évaluer notre outil robotisé.

Réduction

Les groupes sont constitués afin de garantir une puissance statistique de 80% pour des différences de 20%. Nous utilisons classiquement des tests statistiques pour tester la significativité́ de nos résultats. Afin de réduire le nombre d’animaux, nous utilisons des mâles et des femelles indifféremment (la pathologie touche indifféremment l’homme et la femme), et nous nous concentrerons sur le nombre limité d’animaux en fonction de la capacité des dispositifs expérimentaux et de l’application des mesures sur le même animal le cas échéant. La mise au point (étape 1) permettra de valider le modèle de cholestéatome car la formation d’un cholestéatome n’est pas systématique. Dans la littérature, le taux de succès varie entre 60 et 75%. Dans cette étude, nous visons un taux de réussite de l’ordre de 60% : chaque animal ayant 2 oreilles, pour 50 animaux, nous espérons obtenir 60 oreilles (/100) avec cholestéatome à 12 semaines de suivi. La seconde étape permet d’évaluer l’outil robotique intelligent. Nous jugerons de deux critères de jugement principaux : (i) détection du cholestéatome et (ii) destruction du cholestéatome. En cas de cholestéatome bilatéral chez un même animal, les deux oreilles seront utilisées.

Raffinement

La semaine précédant l’expérimentation, les gerbilles seront manipulées plusieurs fois afin de les habituer au contact de l’expérimentateur et ainsi minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les méthodes sélectionnées pour cette étude sont les moins invasives et les moins douloureuses actuellement. Deux chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale par un chirurgien ORL expert et dureront 15 minutes environ : cautérisation des trompes d’eustache (étape 1, mise au point) et test de l’outil robotique intelligent (étape 2). Les animaux du projet seront ensuite suivis quotidiennement. La surveillance otoscopique sera courte et réalisée sous anesthésie gazeuse par un chirurgien ORL expert, elle durera 5 minutes environ. D’après la littérature, la cautérisation des trompes d’eustache n’entrainait pas de surmortalité. Les douleurs étaient contrôlées par des antalgiques habituels. Les points limites seront déterminés, selon une grille, pour évaluer une éventuelle souffrance, détresse ou inconfort. Des mesures de gestion de la douleur seront mises en place en fonction du score avec un protocole antalgique adapté. Les gerbilles seront hébergées en groupe dans un environnement enrichi pour favoriser un comportement naturel.

Choix des espèces

La gerbille est le modèle d'étude le plus approprié, car c'est la seule espèce, en dehors de l'homme, qui est sujette à des cholestéatomes spontanés. Les cholestéatomes des gerbilles présentent plusieurs caractéristiques similaires à celles des humains, tant au niveau macroscopique que microscopique. Il a déjà été démontré dans la littérature que l'oblitération expérimentale du conduit auditif externe ou de la trompe d'Eustache permettait d'induire des cholestéatomes chez ces animaux, avec des caractéristiques très similaires à celles qui se produisent spontanément. Le taux d’occurrence spontanée de cholestéatome serait équivalent à 45%, et après cautérisation de la trompe d’eustache il serait de 60–75% et après 12 semaines de suivi. Par ailleurs, la trompe d'Eustache de la gerbille est plus facile d’accès, courte (1,8 mm) et orientée très verticalement (81° contre 15° chez le rat). Le modèle de gerbille est utilisé par d’autres équipes de recherche, et nous pourrons bénéficier de leur expérience. Le projet impliquera exclusivement des animaux adultes. Les études menées jusqu’à présent dans le laboratoire ont utilisé des animaux de cet âge. Les données obtenues dans l’étude présente pourront être comparées à celles déjà obtenues avec des protocoles voisins.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des plaies cutanées par découpe à l'emporte-pièce ou par compression à l'aimant, pour étudier le rôle d'une "protéine X" dans la cicatrisation et la fonction vasculaire. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne sera administré pendant la cicatrisation "car cela pourrait modifier les résultats", une douleur modérée pouvant persister plusieurs jours. Il décrit le passage par l'animal comme "indispensable" pour observer ces mécanismes dans un "organisme entier".

Objectifs

Des candidats médicaments sont en cours de développement pour traiter certains défauts de cicatrisation tels que les plaies des grands brûlés, les opacités cornéennes ou les conséquences déletères d'un infarctus au niveau cardiaque ou d'une infection au niveau hépatique ou pulmonaire. Toutes ces pathologies peuvent s'avérer mortelles ou très invalidantes et représentent un coût sociétal très important. Pour le moment, les candidats médicaments se fixent principalement sur la Protéine Y bien caractérisée mais aussi sur une protéine très semblable, appelée Protéine X, dont les fonctions sont mal connues. Pour mieux anticiper les effets secondaires des candidats médicaments et déterminer s'il faut les améliorer pour qu'ils ne reconnaissent que la Protéine X ou la Protéine Y, il est crucial de mieux comprendre les rôles précis de la Protéine X chez les mammifères. La peau et les vaisseaux sanguins seront investigués en analysant particulièrement le rôle de la Protéine X dans la cicatrisation de la peau ainsi que dans la capacité des vaisseaux sanguins à répondre aux agents qui régulent la pression artérielle ou à laisser passer des molécules dans les tissus.

Bénéfices attendus

Les expériences ne nécessitant pas de recours aux animaux ont déjà été réalisées. Ceci a permis d'identifier des mécanismes d'action possibles pour la Protéine X. L'étape suivante consiste à vérifier ce qui se passe dans un organisme entier et à confirmer les données préliminaires déjà obtenues concernant l’effet de l’absence de la Protéine X sur l’organisation de la peau normale et cicatricielle ainsi que sur la fonction des vaisseaux sanguins. Ces éléments seront étudiés indépendamment puis conjointement dans un modèle de plaie où l’apport en oxygène et nutriments est déficient (type escarre). A plus long terme, les informations collectées lors de ces expériences serviront à mieux comprendre les fonctions de la Protéine X dans la peau et à évaluer s’il est plutôt bénéfique ou délétère que les candidats médicaments reconnaissent à la fois la Protéine X et la Protéine Y. Par exemple, s'il s'avère que la Protéine X est nécessaire à la fonction vasculaire, il faudra développer des candidats médicaments qui n'affectent que la Protéine Y. Les résultats obtenus seront ainsi très importants pour optimiser leurs propriétés.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvements sur animaux vigiles. Cependant, une injection de colorant (Bleu EVANS) est programmée sur certains animaux pour identifier des "fuites" éventuelles au niveau des vaisseaux sanguins. Une série d'animaux sera également soumise à des plaies réalisées soit à l'aide de "punchs" et ciseaux fins (6 mm de diamètre; 1 seule induction de plaies) soit par application de 2 aimants de 8 mm de diamètre pendant 3 fois 3h à 24h d'intervalle (plaies de compression). Les autres interventions auxquelles seront soumis les animaux sont non invasives et indolores.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en Protéine X sont viables, fertiles et ne semblent pas présenter de phénotype dommageable, en conditions normales, susceptible d’induire de la souffrance ou d’affecter leur comportement. La procédure visant à évaluer la fonctionnalité vasculaire utilise des techniques non invasives et indolores (laser doppler) réalisées sous anesthésie générale pour diminuer le stress des animaux. L’injection de bleu EVANS dans la veine caudale en fin de procédure peut cependant induire un stress momentané. L’induction des plaies d’excision et de compression peut aussi causer douleur et stress chez l’animal. Elles sont réalisées sous isoflurane pour diminuer ces effets et un produit analgésique sera administré avant l'induction des plaies d'excision. Une douleur modérée peut persister après l'induction de la plaie pendant quelques jours. Il n’est pas prévu d’administrer de produit anti-inflammatoire pendant l’induction des plaies ou pendant la cicatrisation car cela pourrait modifier les résultats de notre étude. L’apparition d’autres effets indésirables (perte de poids, mobilité réduite, comportement anormal etc) sera surveillée tous les 2 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures car des prélèvements seront réalisés pour étudier la peau et ses différents composants cellulaires.

Remplacement

Les modèles in vitro (protéines recombinantes) et cellulaires ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées qui nécessitent des systèmes intégrés multi-cellulaires et multi-organes. Il n’existe par exemple pas de modèle de peau reconstruite intégrant toutes les composantes cellulaires nécessaires aux études de physiologie vasculaire ou de cicatrisation. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures de fonctionnalité vasculaire, il est possible de tester deux agents vaso-dilatateurs différents sur les mêmes animaux à 7 jours d’intervalle minimum. Les mêmes animaux peuvent donc être utilisés pour ces deux mesures qui sont également couplées à chaque fois à au moins une autre mesure non invasive (réponse à la pression ou perfusion cutanée). Avant la mise à mort des animaux en fin de procédure, il est également prévu de faire une injection de bleu EVANS qui permettra de mettre en évidence une augmentation éventuelle de perméabilité vasculaire au niveau de la peau. Dans les études de cicatrisation, deux plaies sont réalisées sur le même animal pour diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Les 5 temps de mise à mort ont été soigneusement sélectionnés en fonction de la connaissance actuelle des modèles pour couvrir toutes les phases de la cicatrisation et évaluer précisément le rôle de la Protéine X dans chacune de ces phases.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). Des points limites (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal atteint par la souris, état de prostration de l’animal, plaies infectées) ont été définis qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Les animaux utilisés pour l’étude de fonctionnalité vasculaire ne subiront pas plus de deux anesthésies générales chacun. Le nombre de souris par cage sera compris entre 3 et 5, suivant la taille de la cage et en accord avec la réglementation en vigueur. Après induction des plaies ou en cas de comportement agressif d’un animal, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Ces cages possèdent des séparations transparentes pour permettre aux animaux de continuer à communiquer et diminuer le stress lié à l’isolement. Les cages seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton etc. Les plaies seront protégées par des pansements pour éviter les risques d'infection. Tous les changements de pansements (et les photographies permettant de suivre la fermeture des plaies) seront réalisés sous anesthésie gazeuse sur table chauffante.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du tissu d'intérêt (peau) très semblable au tissu humain et les étapes clés du processus de cicatrisation sont conservées (phase inflammatoire et vasculaire, phase de réparation, phase de remodelage). Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8-16 semaines pour rester cohérent avec les expériences préliminaires qui ont été réalisées.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une cécité est provoquée en sept jours par injection de méthylnitrosourée, qui détruit les photorécepteurs, puis les souris subissent deux tests comportementaux visuels dont la nature n'est pas précisée et une électrorétinographie sous anesthésie, pour comparer des animaux sauvages et des animaux dépourvus de la protéine FMRP. En s'appuyant sur la littérature, le porteur affirme que cette perte rapide de la vue n'engendre ni anxiété ni signe de souffrance. Il décrit le modèle animal comme "indispensable" et renvoie une éventuelle thérapie génique chez l'homme au conditionnel.

Objectifs

Parmi les troubles de la vision, les maladies rétiniennes sont une cause importante de morbidité oculaire et de déficiences visuelles. Des études de population ont rapporté une prévalence des troubles rétiniens, en particulier des troubles de la dégénérescence rétinienne (DR), allant de 5,35 % à 21,02 % chez les personnes âgées de 40 ans et plus. La dégénérescence maculaire liée à l'âge, la rétinopathie diabétique et la rétinopathie pigmentaire sont les manifestations pathologiques les plus courantes de la DR qui conduisent à une cécité irréversible. Ces pathologies visuelles sont dues à l'apoptose des cellules neurales de la rétine ou des tissus de soutien adjacents, principalement en raison de dommages oxydatifs cumulatifs et prolongés. Bien que les manifestations cliniques de ces maladies aient été entièrement élucidées, il est clair que les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents restent à comprendre. Très récemment, un nouveau régulateur pivot de l'apoptose et de la réponse au stress oxydatif a été mis en évidence dans le tissu cérébral : la protéine FMR (FMRP). Dans la rétine, cette protéine est également connue pour être directement associée à des déficits fonctionnels rétiniens. Notre projet vise donc à mieux étudier le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR. L'identification de nouveaux acteurs dans le processus de dégénérescence de la rétine nous permettra de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de prévention pour une meilleure prise en charge des patients. Actuellement il n’existe aucun traitement curatif de ces pathologies. Sur la base de ces résultats récents et de l'implication bien connue des mécanismes de stress oxydatif et d'apoptose dans la dégénérescence rétinienne, notre projet vise à mieux caractériser le rôle de la FMRP dans un modèle murin de dégénérescence rétinienne. La question est de mettre en évidence le rôle de FMRP, dans un modèle murin validé de DR, en comparant les résultats de souris sauvages (WT) versus des souris n'exprimant pas FMRP (KO FMR1).

Bénéfices attendus

Notre stratégie expérimentale (utilisation conjointe des souris KO FMR1 et d’un modèle validé de DR) vise à mieux comprendre le rôle de la FMRP dans les mécanismes de la DR, et donc de caractériser si FMRP est une bonne cible thérapeutique dans les DR. Des stratégies ciblées de thérapie génique pourront être envisageables chez l'homme sur la base de ces travaux.

Procédures

1/ Injection i.p (traitement unique), 2/Manipulation pour analyses comportementales (2 tests - 30 minutes) dans le but de caractériser les conséquences de la DR sur des comportements "visuels", et 3/Anesthésie pour l'étude de la fonction rétinienne (ElectroRétinoGraphie ou ERG) (anesthésie unique - 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le modèle « MNU ou MethylNitrosoUrea» de DR utilisé est extrêmement utilisé et validé dans la littérature. Ce modèle va induire une mort spécifique des cellules de la rétine (photorécepteurs), entrainant une perte rapide (7 jours) de la vision chez la souris. Cette perte de la vision est similaire à celle retrouvée chez les patients atteints de DR. Une étude récente utilisant un modèle similaire de DR induite par le MNU a montré l’absence de comportement anxieux ou de souffrance 1 à 2 semaines après injection d et, ceux malgré la perte rapide des paramètres visuels (acuité etc…). Ainsi, dans notre schéma expérimental, la perte rapide de vision n’engendre pas de comportements anxieux ou manifestation comportementale de souffrance (douleur, prostration, hyperactivité etc..).

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort en fin de la procédure, et ce par dislocation cervicale. Ainsi, à chaque temps expérimental (Jour 1, 2, 3, 5 et 7 post-traitement), un lot d’animaux sera mis à mort directement après l'étude de la fonction rétinienne et ce, encore sous anesthésie.

Remplacement

Le modèle animal est fondamental dans notre cas, puisque l’étude de la DR ne peut se faire que sur un organisme vivant entier. Plusieurs niveaux de complexité sont nécessaires, impliquant des interactions entre différents types cellulaires et organes, qui ne peuvent être développés in vitro ou in silico. Dans le cadre de ce projet s’intéressant au rôle de FMRP dans les DR, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires au niveau de la rétine (neurones et cellules gliales). Bien que les expériences in vitro sur cultures cellulaires soient utilisées (lignées cellulaires de cellules rétiniennes : cellules de Müller), aucun modèle expérimental in vitro n’est à même de remplacer l’animal entier pour étudier la réponse et la communication cellulaire entre les différents acteurs de la DR.

Réduction

Notre objectif est d’obtenir une bonne robustesse de l’analyse statistique tout en réduisant le nombre d’animaux par lot. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour ce projet in vivo, il y a 5 temps expérimentaux (Jour 1, 2, 3, 5 et 7) avec 8 souris traitées et 8 souris non traitées par génotype (WT et KO FMR1) et par temps soit 32 x 5 = 160 souris au total. A chaque temps expérimental, l’ensemble des animaux seront analysés en comportement et fonction rétinienne (ERG). Puis la moitié des animaux sera mise à mort pour l’étude histologie (prélèvement des yeux) et l’autre moitié sera mise à mort pour les analyses de biologie moléculaire (prélèvement de rétines). Chaque expérience sera répétée trois fois pour une reproductibilité des résultats soit 480 souris au maximum pour 3 ans. Ainsi, nous obtiendrons pour chaque paramètre testé (comportement et ERG) 24 points expérimentaux par temps et par génotype ce qui est un minimum nécessaire pour déterminer la significativité statistique des résultats.

Raffinement

Une surveillance et une manipulation quotidiennes des animaux seront effectuées pendant la période d’acclimatation (15 jours) et d’expérimentation. Ces manipulations permettront de limiter le stress de l’animal lors du traitement (injection unique i.p). Par ailleurs, selon les données de la littérature, les animaux traités ne présenteront pas de phénotype autre que la perte de la vision. Les animaux seront hébergés en cage à cap standard au nombre maximum de 5 souris par cage. Nous disposerons dans les cages dès le début de l'expérience, des boules de coton compactées comme enrichissement du milieu. Par ailleurs, l’état général des animaux sera évalué quotidiennement durant toute la durée de l’expérience pour détecter tous signes éventuels de souffrance (3 points limites mis en place). On ne s’attend pas à avoir d’atteinte du point limite dans notre étude. Néanmoins une grille de score quotidienne sera tenue durant le temps d’expérimentation. Les animaux seront mis à mort s’ils présentent des signes de souffrance.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, le modèle animal reste indispensable dans la compréhension des interactions cellulaires rétiniennes et leurs conséquences comportementales. Pour notre projet, l’utilisation de la souris est primordiale puis que le couple structure/fonction de sa rétine comme le processus de la DR sont proches de ceux observés chez l’homme. De même, l’existence d’un modèle murin KO FMR1 (disponible au laboratoire) va faciliter l’étude du rôle de FMRP dans la DR.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux modèles pathologiques sont induits, puis les animaux subissent des mesures de sensibilité avant une mise à mort par surdose d'isoflurane et dislocation cervicale pour prélèvement de tissus. Le résumé annonce l'étude de la rosacée oculaire, mais ses justifications glissent vers le syndrome de l'intestin irritable et une infection à C. rodentium, sans que le protocole soit détaillé. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de travailler sur des animaux" et qu'il n'existe "pas d'autre alternative".

Objectifs

La rosacée est une maladie commune de la peau, inflammatoire et chronique, avec une variété de manifestations cliniques telles que l’érythème centro-facial, les papules et les pustules, ainsi qu’une atteinte oculaire. Il s’agit d’une pathologie fluctuante, avec une alternance de poussées et de rémissions. Plusieurs facteurs exacerbant la pathologie ont été décrits, comme l’alcool, l’exposition au soleil, le sport, la nourriture épicée, le stress, les émotions et les changements de température.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet étant de mieux comprendre les mécanismes des douleurs et d'inflammation associées à la rosacée occulaire afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques, le premier bénéfice attendu serait la caractérisation de cette physiopathologie et l’identification de nouvelles cibles pharmacologiques. Dans un second temps, la validation pré-clinique des effets bénéfiques de nouvelles molécules agissant sur les nouvelles cibles identifiées nous permettraient d’envisager une étude clinique grâce à une collaboration avec des services de gastroentérologie. L’objectif à plus long terme serait donc de mettre en place cette étude clinique qui ferait intervenir des patients atteints de SII afin de tester les potentiels outils pharmacologiques développés au laboratoire. Cette étude permettrait d’ouvrir le champ des perspectives thérapeutiques visant à traiter les symptômes associés au SII et, in fine, à soulager les patients SII douloureux. Le bénéfice à long terme serait ainsi une meilleure prise en charge des douleurs chez le patient, qui reste actuellement extrêmement limitée.

Procédures

Suite à l'induction des 2 modèles (procédures 1 et 2), l'ensemble des animaux subiront les procédures 3 et 4 une seule fois et une semaine après l'induction du modèle.

Impact sur les animaux

Les animaux seront mis à mort par une overdose d’isoflurane puis dislocation cervicale. Ceci concernera les animaux en fin d'expérimentation mais aussi si un animal présente au moins 1 des points limites décrits par la suite.

Devenir

Pour l'ensemble des procédures, les animaux seront maintenus en vie. A l’issue de la procédure 4 (mesure de la sensibilité mécanique), les animaux seront mis à mort pour effectuer différents prélèvements de tissus.

Remplacement

Il apparait indispensable de travailler sur des animaux afin de pouvoir étudier l’impact de C. rodentium sur la sensibilité colique, le comportement et le microbiote intestinal. De plus, une étude comparant des données de métagénomique entre animaux infectés et animaux non infectés permettra d’établir un lien de causalité avec C. rodentium. Ce type d’étude n’est concevable que chez l’animal. D’autre part, nous voulons également évaluer les conséquences physiologiques sur la sensibilité viscérale et la perméabilité intestinale, pour lesquelles il n’existe pas d’autre alternative. L’utilisation de différents modèles cellulaires in vitro pour répondre aux objectifs de ce projet n’est donc pas envisageable.

Réduction

Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible. Les tests statistiques seront réalisés grâce au programme d'analyse statistique GraphPad Prim 9.0 et les principales analyses, notamment de suivi du poids seront effectuées grâce à des test ANOVA one-way ou two-way suivi d'un post test adéquat en fonction du résultat.

Raffinement

Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Si un animal présente une trop forte douleur, un comportement stéréotypé ou anormal, une posture anormale ou une réduction de poids de 20%, celui-ci sera euthanasié par le personnel de l’unité de stabulation animale. Ces animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type petite maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle expérimental est appuyé par la disponibilité de lignées d’animaux génétiquement modifiés et l’existence de nombreux outils d’analyse (anticorps, kit ELISA…) développés pour cette espèce. Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (4-5 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.

144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-rétiniennes de gènes, passent des tests de vision, une imagerie du fond d'œil et un électrorétinogramme sous anesthésie, avant une mise à mort et un prélèvement de la rétine. Le porteur indique que ces injections peuvent provoquer des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires, et que l'anesthésie répétée peut entraîner une hypothermie. Il affirme que ce modèle "ne peut pas être remplacé" par la culture cellulaire ou les organoïdes, les retombées pour les patients atteints de rétinite pigmentaire restant renvoyées au long terme.

Objectifs

Notre objectif est d'étudier le bénéfice thérapeutique de la combinaison de deux gènes dans la dégénérescence rétinienne. Les deux gènes ont pour fonction de protéger la rétine. Les souris qui ont perdu les deux gènes ont montré des déficits visuels marqués. Des expériences cellulaires ont également confirmé que les produits codés par les deux gènes peuvent prolonger la durée de survie des cellules rétiniennes. Dans cette étude, un modèle murin de dégénérescence rétinienne sera utilisé pour co-administrer les produits des deux gènes et l'effet thérapeutique du traitement combiné sur la vision des souris sera évalué par les tests visuels. Les résultats obtenus pourraient également s'inscrirent dans un futur assai clinique pour la thérapie génique au profit des patients.

Bénéfices attendus

La rétinite pigmentaire manque actuellement de traitements efficaces. Le projet étudiera le rôle protecteur de deux gènes dans la rétine. Une stratégie thérapeutique basée sur l'un de ces gènes est entré en essai clinique cette année. Les deux gènes prolongent la survie des cellules rétiniennes de différentes manières. Nous possédons des arguments pour penser que l’administration des deux gènes d’intérêt aurait un effet thérapeutique synergistique. A plus long terme l’objectif est de faire la preuve de concept du bénéfice pour la vision d’une thérapie combinant les deux. Les résultats obtenus seront bénéfiques pour faire avancer le traitement de la rétinite pigmentaire.

Procédures

Le projet comporte 2 étapes : La première étape consiste à injecter le traitement à des souris modèles. Chaque lot d'expériences est divisé en 5 groupes (n = 5), dont 4 groupes recevront des injections (un total de 20 souris) et 1 groupe sera un groupe témoin non injecté (un total de 5 souris). Des souris seront injectées sous anesthésie gazeuse et une pommade oculaire sera appliquée sur la cornée pour une anesthésie locale et une analgésie. La procédure d'injection durera environ 5 minutes par souris. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. La deuxième étape est l'évaluation de la fonction visuelle. 5 groupes de souris seront testés 1, 4 et 6 mois après l'injection. Au total, 4 tests seront effectués, comme suit : Test 1 : La vision sera mesurée pour chaque souris pendant environ 5 minutes chacune (sur éveillé). Test 2 : Des photos du fond d'œil des animaux seront prises pour évaluer la santé du fond d'œil. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Test 3 : Une imagerie rétinienne d'animaux sera réalisée pour obtenir des informations structurelles rétiniennes. Les animaux seront testés sous anesthésie gazeuse. Les tests 2 et 3 seront réalisés sous la même anesthésie gazeuse et dureront 15 à 20 min par souris. Test 4 : La fonction électrophysiologique de la rétine de l'animal sera testée. L'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale. Le test durera au total 30 minutes.

Impact sur les animaux

Lésion : Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés au niveau de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Douleur : Les injections intra péritonéales, sous-cutanées peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. Maladie : La majorité des gestes expérimentaux auxquels sont soumises les souris seront réalisés sous anesthésie générales par induction gazeuse ou chimique (injection intraoculaire, fond d’œil, tests de la structure rétinienne et des fonctions électrophysiologiques). L’anesthésie peut provoquer une hypothermie. Environnement non adapté : Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests visuels d’optocinétique.

Devenir

Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent. Les animaux seront euthanasiés et la rétine sera prélevée pour obtenir la quantification des photorécepteurs à cônes.

Remplacement

Le modèle de souris de la dégénérescence de la rétine peut simuler le processus pathologique de l'homme, qui ne peut pas être remplacé par la culture cellulaire et les organoïdes rétiniens. Le test d'acuité visuelle et la mesure de la fonction électrophysiologique des photorécepteurs à cônes ne peuvent pas être réalisées sur des modèles in vitro.

Réduction

Il y a 5 groupes au total, dont 4 groupes de souris injectées, et 1 groupe contrôle sans injections, comme suit : Groupe 1 : 10 souris recevront une injection de vecteur vide sans effet thérapeutique Groupe 2 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 1 Groupe 3 : 10 souris recevront une injection de médicament contenant le produit du gène 2 Groupe 4 : 10 souris recevront un médicament comprenant une combinaison de deux produits géniques Groupe 5 : 8 souris non injectées Pour réduire le nombre d'animaux, nous ne définissons pas un groupe de contrôle fictif séparé, remplaçant en profitant des deux yeux. Un contrôle fictif a été utilisé pour évaluer l'effet de l'intervention chirurgicale elle-même sur les résultats expérimentaux. Nous injecterons le traitement dans l'œil droit, et l'œil gauche sera un contrôle factice avec une seule opération chirurgicale. Le nombre de souris par groupe est estimé à partir de travaux antérieurs pour garantir la génération de résultats statistiquement significatifs, en tenant compte d'environ 15 pour cent de perte d'animaux au cours de la progression.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifie de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Les animaux seront héberges dans des cages de stabulation avec enrichissement, alimentation et abreuvement à volonté. Une anesthésie courte, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale au gaz pour les procédures courtes (injection intraoculaire, techniques d’imageries), et d’une anesthésie générale par injection intrapéritonéale pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu'à leur complet réveil. Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intrapéritonéales/sous-cutanées. Application d’une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post injection intraoculaire er a la fin des électrorétinogrammes. Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie au gaz et une anesthésie fixe (injection intrapéritonéale ) et de 7 jours entre deux anesthésies fixes. Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel, ainsi que nourriture et eau à volonté. Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. Des critères d’arrête ou points limites ont été détermines pour chaque étape de la procédure expérimentale. Les animaux provenant de l’extérieur observeront un période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Les souris modèles de dégénérescence rétinienne sont un modèle de rétinite pigmentaire (RP) autosomique récessive. Le modèle imite la RP humaine typique, et s'avère être un excellent modèle pour étudier les approches thérapeutiques de la RP. Le traitement par injection sous-rétinienne sera effectué sur PN15 (15 jours post-natal). Le début de la dégénérescence rétinienne dans ce modèle se situe autour de PN25, le traitement doit être le plus précoce. A PN15 , les yeux des souris sont ouverts et suffisamment pour les injections sous-rétiniennes. Le test de vision sur les 5 groupes sera effectué à 1, 4 et 6 mois après l'injection selon les études publiées avec un traitement similaire. Au regard des résultats que nous attendons, le point final est fixé à 6 mois, mais on se laisse la possibilité d'aller jusqu'à 10 mois si les résultats observés le nécessitent.