Recherche appliquée

Rasées sur le dos, puis enduites chaque jour pendant cinq jours d'une crème qui provoque rougeurs, épaississement de la peau et desquamation, 100 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de la peau et des organes. Vingt d'entre elles sont gavées trois jours de suite, quarante reçoivent des injections quotidiennes d'un anticorps ciblant la molécule CD146 ou d'un placebo. Le projet cherche à savoir si cette molécule intervient dans le psoriasis et si la bloquer soulage la maladie, ainsi que l'athérosclérose qui l'accompagne souvent. Le porteur cite des études cliniques déjà menées sur des patients psoriasiques, les juge descriptives, et affirme qu'il n'existe "aucune alternative à l'animal" pour étudier cette maladie.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la physiopathologie du psoriasis et à évaluer cette molécule comme cible thérapeutique dans le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Bénéfices attendus

Plusieurs études cliniques portant sur des patients psoriasiques ont été menées antérieurement pour évaluer les niveaux d’expression de la molécule d'adhésion cellulaire CD146/MCAM sur des biopsies de peau, quantifier les concentrations de sa forme soluble dans le sang ou pour étudier les différentes sous-populations leucocytaires exprimant ce marqueur cellulaire dans le sang. Cependant, ces études restent descriptives et ne permettent pas d’évaluer le rôle du CD146 global, du CD146 endothélial ou du CD146 exprimé par certaines cellules du système immunitaire sécrétrices de la cytokine proinflammatoire interleukine 17 dans la pathogenèse du psoriasis. Contrairement à notre projet qui compare des souris mutées ou non pour CD146, ces études ne permettent pas d’étudier les voies de signalisation régulées par CD146. De plus, ces études cliniques n’ont pas évalué l’effet de thérapies ciblant CD146. Ainsi, ce projet permettra d'identifier des mécanismes moléculaires régulés par CD146 dans la pathogenèse du psoriasis. Il permettra aussi d'évaluer dans un modèle murin le bénéfice thérapeutique d'anticorps monoclonaux ciblant CD146 pour traiter le psoriasis et une comorbidité associée au psoriasis, l'athérosclérose.

Procédures

Tous les animaux du projet seront rasés une fois sur le dos (2 minutes par souris). Ils recevront un traitement sous la forme d'une application quotidienne de crème sur le dos pendant 5 jours (30 secondes par application). 20 souris seront gavées avec une solution diluée dans de l'huile de maïs une fois par jour pendant 3 jours (30 secondes par gavage). 40 souris recevront des injections quotidiennes d'un traitement ciblant CD146 ou un placebo pendant 5 jours (30 secondes par injection). Un prélèvement sanguin sera effectué sur toutes les souris (30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

20 souris seront gavées une fois par jour pendant 3 jours avec une solution à base d'huile de maïs. Bien que le gavage ne soit pas douloureux, cela pourrait tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de sa répétition et de la contention. Les souris seront rasées sur le dos, ce qui pourrait générer un stress. L'application d'un traitement à base de crème sur la peau des souris pour induire le psoriasis devrait entraîner une inflammation associée à à l'apparition de rougeurs, un épaississement de la peau et une desquamation en plaques. Ce traitement peut entraîner une déshydratation et une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions l'implication de la molécule d'adhésion cellulaire CD146, également appelée MCAM (Melanoma Cell Adhesion Molecule) dans la pathogenèse du psoriasis. Cette pathologie autoimmune implique différents types cellulaires (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales, cellules du système immunitaire), avec de nombreuses interactions biochimiques et cellulaires. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle in vitro, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier cette maladie.

Réduction

Afin de réduire le nombre de souris nécessaires pour générer les effectifs de chaque groupe utilisé dans les procédures expérimentales, nous utiliserons des souris issues d'accouplements homozygotes et nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles, le psoriasis touchant chez l'humain autant les hommes que les femmes. En l'absence de toute étude antérieure sur le rôle de la molécule d'adhésion cellulaire CD146 dans le psoriasis chez la souris, nous évaluerons son implication dans cette pathologie en comparant des groupes de 10 souris entre eux, effectif minimal déterminé par une approche statistique pour mettre en évidence de potentielles différences significatives.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux issus des établissements d'élevage. Les souris seront observées avant d’initier le protocole et les animaux présentant des symptômes type infection seront écartés des protocoles. Le protocole sera arrêté si l’animal présente des difficultés à respirer (visualisées par une augmentation des rythmes cardiaque et respiratoire répercutée au niveau des flancs de l’animal), si l’animal est prostré ou en retrait, si ses poils sont hérissés. Les animaux seront pesés une fois par jour et observés deux fois par jour pour prévenir tout risque de déshydratation liée à leur traitement. Les animaux seront hébergés en groupe avec un enrichissement. Les animaux disposeront de nestlets, nids à base de fibres courtes de coton, utilisés comme enrichissement de l ’environnement et matériaux de nidification, ainsi que de tunnels afin de réduire l'ennui et de diminuer le stress en stimulant l'activité et en procurant un sentiment de sécurité à l'animal.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, sa manipulabilité génétique permet d'analyser l'effet de mutations du gène cible sur la pathogenèse du psoriasis. La souris permet également d'évaluer l'effet d'un traitement thérapeutique ciblant une protéine d'adhésion cellulaire potentiellement impliquée dans le psoriasis et une comorbidité associée, l'athérosclérose. Les souris utilisées seront âgées entre 8 et 16 semaines. Un âge compris entre 8 et 16 semaines est couramment utilisé dans la littérature pour ce modèle induit de psoriasis car l'épaississement de l'épiderme, l'érythème et la desquamation sont clairement visibles à cet âge là. De plus, cette tranche d'âge a permis de mettre en évidence dans plusieurs études les effets thérapeutiques chez la souris de différents traitements utilisés pour soigner le psoriasis chez l'homme.

Chaque souris subit une ouverture chirurgicale du crâne sous anesthésie pour recevoir dans le cerveau une dose unique de candidat médicament, avec jusqu'à six prélèvements sanguins en 24 heures. 4160 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, par groupes de trois animaux par dose et par molécule. Le porteur présente ce dispositif comme un moyen de réduire le nombre total d'animaux, en éliminant tôt les molécules les moins prometteuses. Toutes celles qui ont reçu un composé sont tuées après trois à huit semaines pour le prélèvement du sang, du liquide céphalorachidien et des organes, tandis que 400 souris déjà opérées mais non injectées seront réutilisées dans d'autres projets.

Objectifs

Le développement de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau commence par des études de sécurité sur des animaux, notamment les souris. Ces études servent à vérifier si les médicaments n’induisent pas de toxicité avant de pouvoir les tester chez l’Homme. Les maladies du cerveau sont souvent très graves et peuvent être causées par un dérèglement dans la production de certaines protéines ou par l'accumulation de protéines anormales. Pour traiter ces maladies, des thérapies innovantes sont en cours de développement pour éliminer ces protéines. Avant de tester ces médicaments chez l'Homme, il est crucial de déterminer à la fois la dose qui pourrait être toxique et la dose efficace. La barrière hémato-encéphalique est une structure qui protège le cerveau en contrôlant les substances qui peuvent y entrer. Cette barrière rend difficile l'accès des médicaments au cerveau lorsqu'ils sont administrés par voie sanguine. Pour contourner ce problème, les médicaments sont injectés directement au niveau des lombaires entre les méninges chez l'Homme. Chez la souris, cette méthode n'est pas possible en raison de sa petite taille, et les médicaments sont administrés directement dans le cerveau. Les médicaments les plus prometteurs sont d’abord sélectionnés après des études in vitro en laboratoire, et sont ensuite testés in vivo sur des souris pour évaluer leur sécurité et leur efficacité. Ce projet consiste à évaluer la tolérabilité (c’est-à-dire une toxicité éventuelle aiguë et à court/moyen terme) et à mettre en place des évaluations neurocomportementales/fonctionnelles qui pourraient prédire l’apparition d’une toxicité retardée après l’administration unique des candidats médicaments directement dans le cerveau des souris. Ces études permettent de sélectionner les médicaments les plus prometteurs afin de réduire les risques avant de passer aux essais d’efficacité. En résumé, ce projet a pour but d'évaluer de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau tout en respectant les normes éthiques et en minimisant l'utilisation d'animaux. Les études préliminaires chez les souris aident à identifier les doses sûres et à évaluer les risques potentiels, permettant ainsi de sélectionner les meilleurs candidats pour les études ultérieures chez l'Homme. Les données recueillies permettent de décider si le développement du médicament doit continuer ou s'arrêter.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer le développement de nouveaux médicaments pour traiter les maladies du cerveau en évaluant très tôt leur toxicité potentielle (immédiate ou retardée) et en ajustant les doses et les plans des études de toxicité et d'efficacité qui suivront. Dans un premier temps, des études in vivo de trois semaines permettent de recueillir suffisamment d'informations pour sélectionner les médicaments les plus prometteurs, qui seront ensuite testés pour leur efficacité dans des modèles de maladies neurologiques. Après les études précoces de toxicité et d’efficacité, les meilleurs médicaments seront soumis à une étude de toxicité de huit semaines pour affiner leur profil de sécurité, comme les doses et les effets sur les tissus. Ces étapes supplémentaires de sélection visent à éviter des études ultérieures plus longues et avec plus d'animaux, réduisant ainsi le nombre total d'animaux utilisés pour un projet thérapeutique donné. Grâce aux études de présélection in vitro et aux études in vivo de toxicité et de pharmacologie qui en découlent, nous pouvons sélectionner le meilleur candidat et éliminer très précocement les moins prometteurs pour assurer la sureté et l’efficacité des médicaments de demain au service du bien-être du patient. En effet, ces études accélèrent la mise à disposition de nouvelles thérapies pour traiter les maladies du cerveau. Plus d'un tiers de la population mondiale souffre de troubles neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, l'épilepsie, la sclérose en plaques et les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Ces maladies sont la principale cause de maladie et d'invalidité dans le monde. La qualité de vie des patients atteints de ces maladies est gravement affectée et le taux de mortalité est élevé, même chez les enfants. Les options de traitement actuelles sont très limitées et souvent insuffisantes pour répondre aux besoins des patients. Ce projet vise donc à améliorer les traitements, et améliorer la vie des patients atteints par ces maladies neurologiques.

Procédures

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 3 semaines à 8 semaines, les animaux seront soumis à différentes interventions : • Administration unique du composé testé dans le cerveau nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et une couverture analgésique (durée de la chirurgie 30 min environ) • Administrations d’analgésique (moins de 10 sec) (maximum 2 fois par jour) • Prélèvements de sang de très faibles volumes sur animal vigile (la contention est d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30s ; maximum 6 prélèvements sur 24h) • Tests neurocomportementaux non invasifs (observations, max 15 min/semaine) et fonctionnels (évaluation de la motricité, max 10 min/semaine) réalisés pour chaque animal 1 fois avant traitement puis de façon hebdomadaire jusqu’à la fin de la procédure (3 à 8 semaines après traitement). Tests évaluant les performances neuro-locomotrices des souris et permettant de mieux, et plus rapidement, déceler la toxicité retardée à la suite de l’administration de candidats médicaments. • Administration d’anesthésique en fin d’expérimentation avant euthanasie. (moins de 10 sec)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet et pour une durée de procédure pouvant aller de 3 semaines à 8 semaines, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : Conséquences directes des actes expérimentaux : • La phase de chirurgie (30 min) nécessaire à l’administration du composé d’intérêt dans le cerveau ainsi que la période post-opératoire peuvent générer du stress et une douleur modérée • Les administrations d’analgésiques et anesthésiques, maximum 2 fois par jour pendant 2 jours peuvent générer des douleurs légères et de courte durée • Maximum 6 prélèvements de faible volume de sang répartis sur 24h (1 seule fois par animal pour toute la durée de l’étude), effectués sur animal vigile avec une contention d’une durée maximale de 2min et chaque prélèvement dure moins de 30 sec (Degré de sévérité léger de courte durée) • Administration de l’anesthésique en fin d’expérimentation préalable à l’euthanasie (degré de sévérité léger) Conséquence indirecte des actes expérimentaux : Le composé testé peut en lui-même induire des effets cliniques et peut provoquer une nuisance modérée pour l’animal (impacts sur l’activité, état général, variation du poids corporel par exemple).

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet sera euthanasié à l’issue de chaque procédure (au bout de 3 à 4 semaines ou 8 semaines post injection selon la procédure mise en œuvre). Des collectes de sang/ liquide céphalo-rachidien pour analyses et d’organes pour lecture anatomopathologique seront effectuées. Tous les animaux pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire) et qui n’ont pas reçu de candidat médicament ou son/véhicule pourront être réutilisés dans un autre projet. Ces situations peuvent se produire, dans le cas où une dose d’un candidat médicament ou son véhicule montre des signes de toxicité immédiate consécutive à l’administration, les administrations prévues pour le reste des souris du groupe ne sont alors pas réalisées. Ces animaux ayant déjà reçu au préalable l’analgésie avant la chirurgie pourront dans ce cas être réutilisés dans d’autres DAP.

Remplacement

Ce projet étudie la sécurité des candidats médicaments pour les maladies neurologiques. Actuellement, il est nécessaire d'utiliser des animaux pour ces études car il n'existe pas d'autres méthodes validées scientifiquement et réglementairement. Cependant, avant de tester sur les animaux, des méthodes en laboratoire (in vitro) et sur ordinateur (in silico) sont utilisées pour choisir les médicaments les plus prometteurs. Cela permet de réduire le nombre d’études sur les animaux. Seuls les candidats médicaments qui semblent les plus efficaces et sûrs sont ensuite testés sur les animaux pour vérifier leur sécurité. Les maladies neurologiques sont complexes, et ces études sont essentielles pour évaluer l'efficacité et la toxicité des médicaments. En retour, les résultats des données collectées dans les études in vivo chez l’animal améliorent les méthodes de prédiction in vitro avec pour objectif final de remplacer intégralement le modèle animal.

Réduction

Les médicaments à visée neurologique les plus prometteurs sont présélectionnés grâce à des études in vitro en laboratoire avant de les tester sur des animaux dans les études incluses dans ce projet. Le nombre d'animaux utilisés est ajusté en fonction des paramètres étudiés. En général, seuls 3 animaux/dose/médicament sont utilisés, ce nombre « standard » pour ce type d’études assure un effectif par groupe faible mais suffisant pour permettre d’interpréter les résultats. Pour évaluer la toxicité des candidats médicaments, ces derniers sont administrés directement dans le cerveau des animaux. Les administrations se font de façon séquentielle : dans le cas où une toxicité aigüe surviendrait chez un premier animal d’un groupe, les administrations suivantes prévues pour les autres animaux ne seront pas réalisées. Des études préliminaires ont montré qu’une approche par observations comportementales des animaux, comme prévu dans ce projet, peut prédire la toxicité tardive des médicaments. Sa mise en œuvre vise à affiner et rendre plus efficace la sélection des candidats médicaments et ainsi réduire le nombre d’études et d'animaux nécessaires aux processus de recherche de candidats médicaments. Lors des évaluations comportementales, chaque animal est suivi dans le temps et est son propre contrôle, ce qui évite d’inclure systématiquement des groupes témoins dans les études et réduire ainsi le nombre d'animaux nécessaires. Divers examens cliniques et prélèvements peuvent être effectués pour limiter encore plus le nombre d'animaux utilisés. Les résultats obtenus sécurisent les études de pharmacologie en évitant l’utilisation de doses toxiques possible aux doses testées. Les prélèvements de petits volumes de sang permettent de suivre la cinétique sur un même animal tout en respectant son bien-être, réduisant également le nombre d'animaux nécessaires pour chaque étude. Enfin, les données recueillies lors des études sur les animaux aident également à améliorer les méthodes de prédiction de toxicité in vitro. Ces méthodes prédictives de toxicité in vitro permettent ainsi de limiter l’utilisation des animaux dans les études ultérieures et pourraient à terme les réduire de moitié voire les remplacer.

Raffinement

Dans ce projet, les médicaments sont administrés dans le cerveau de manière séquentielle au sein d’un même groupe d’animaux. Si un premier animal montre des signes cliniques peu après le traitement, le traitement est arrêté. Si des signes de toxicité apparaissent, une décision rapide est prise par le vétérinaire, le responsable scientifique, l'équipe de bien-être animal ou les équipes en charge des animaux. Cette décision peut inclure des soins, l'arrêt du traitement, ou, en dernier recours, l'euthanasie de l’animal. Un suivi précis des animaux est réalisé via différentes grilles de score complémentaires (incluant des évaluations comportementales) permettant ainsi de détecter au plus tôt les signes de toxicité et de réduire ainsi la souffrance des animaux. Tous les animaux sont hébergés dans des conditions strictes de confinement avec à disposition un enrichissement spécifique (tunnel, éléments de nidification) et manipulés par du personnel formé au bien-être animal. De faibles quantités de sang peuvent être rapidement prélevées chez les souris de manière peu invasive et peu stressante, ce qui limite l'impact sur les animaux et respecte leur bien-être. Cette méthode évite d’utiliser les procédures classiques qui nécessitent de placer l'animal dans une enceinte thermorégulée pour dilater les vaisseaux. L'administration du candidat médicament nécessite une incision de la peau et est réalisée sous anesthésie générale avec une couverture analgésique afin de limiter tout risque de douleur au réveil de l'animal.

Choix des espèces

Ce projet sera réalisé sur l’espèce souris car de nombreux modèles mimant des pathologies humaines sont disponibles chez la souris et seront utilisés dans les études ultérieures de détermination de l’efficacité du candidat médicament. Cette espèce présente une forte homologie génétique et physiologique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle permettant d’obtenir la meilleure prédiction possible chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes, issues de la littérature, par souche, âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets. Chez la souris, les candidats médicaments sont délivrés directement au niveau du système nerveux central par voie intracérébroventriculaire, pour palier le problème du mauvais passage de la barrière hémato-encéphalique. En outre, cette voie d’administration nécessite une chirurgie moins invasive que la voie intrathécale utilisée chez d’autres espèces comme le rat. Pour se placer dans les mêmes conditions que les études d’efficacité puis les études requises ultérieurement, les souris utilisées seront des jeunes adultes et adultes, correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet. Ces études vont permettre de présélectionner des candidats médicaments pour les études ultérieures effectuées chez le rat par voie intrathécale, même voie utilisée chez l’Homme pour la délivrance de thérapeutiques.

Jusqu'à deux administrations par jour, sept semaines de suite, par gavage, sous la peau ou dans l'abdomen, et jusqu'à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie : 994 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles développent dès deux semaines une obstruction du flux biliaire et une fibrose du foie, et servent à cribler des candidats-médicaments contre la cholangite sclérosante primitive. Le porteur qualifie de mineurs les symptômes attendus, léthargie et jaunisse transitoire, tout en indiquant que la mise à mort à douze semaines au plus tard leur évitera des symptômes sévères liés à leur modification génétique. Toutes sont tuées pour le prélèvement d'organes et de sang.

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive (PSC) fait partie des maladie auto-immunes du foie et est caractérisée par une dégénérescence des canaux biliaires internes et externes au foie, entrainant une accumulation de bile. Cette accumulation provoque du stress oxydant, de l’inflammation, de la fibrose (surproduction de fibres de collagène réduisant la fonctionnalité d’un organe) et mène ultimement à la cirrhose du foie et à une insuffisance hépatique (perte de fonctionnalité de l’organe). La PSC ne présente pas de symptômes au stade précoce, mais les personnes atteintes présentent progressivement un état de fatigue, des démangeaisons, de la jaunisse, des douleurs articulaires ou abdominales et des diarrhées. L’estimation de la survie moyenne à partir du diagnostic de la maladie est de 15 à 20 ans ; celui-ci est le plus souvent posé chez des hommes entre 30 et 40 ans, mais 15 à 20 % des diagnostics sont pédiatriques. A ce jour, aucun traitement n’a été approuvé, et il est urgent de développer de nouvelles solutions permettant de traiter et d’améliorer la qualité de vie des patients touchés par cette pathologie. Cela implique la nécessité de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques afin de découvrir ou repositionner des molécules et comprendre les mécanismes qui jouent un rôle dans la survenue et l’évolution de la maladie. C’est dans ce contexte que s’inscrit ce projet : composé d’une étape de caractérisation du modèle d’étude de la maladie (souris génétiquement modifiées), puis d'une phase de screening de molécules thérapeutiques, il permettra l’évaluation de plusieurs candidats-médicaments avant une éventuelle évaluation clinique chez l'humain. Ce projet a donc pour objectif l’évaluation de l'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques pour la PSC, dans le modèle génétique considéré aujourd'hui comme celui reproduisant au mieux les caractéristiques de la maladie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la PSC. Si le screening de molécules dans le modèle révèle des candidats médicaments prometteurs, ce projet débouchera sur l’étude de leur mécanisme d’action dans le contexte de la pathologie et permettra l’évaluation des meilleures molécules avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, cette étude supportera la recherche de nouveaux médicaments potentiels dont les effets seraient supérieurs aux traitements purement symptomatiques actuellement délivrés pour la PSC, et qui ralentiront ou stopperont l'évolution de la maladie.

Procédures

Afin d'évaluer de potentielles molécules thérapeutiques dans le modèle, puis de déterminer la dose, la fréquence et la voie d'administration permettant un effet optimal du composé, les animaux pourront recevoir un traitement administré une à sept fois par semaine, jusqu’à 2 fois par jour (en fonction de la molécule étudiée et de la voie d’administration), pendant 7 semaines maximum. Le mode d’administration du composé dépendra de la nature de la molécule, de son mécanisme d’action et de la cible thérapeutique. En effet, notre approche étant exploratoire, nous devons envisager plusieurs voies d’administration afin d’optimiser l’efficacité du traitement. Nous n’attendons pas de nuisance liée à la nature des traitements (doses non toxiques selon les études de toxicologie préliminaires ou la littérature). L’administration des traitements par gavage entrainera un stress dû à la manipulation et une irritation liée à la sonde ; l’administration par voie intra-péritonéale ou sous-cutanée entrainera un stress dû à la manipulation et une douleur liée à la piqûre. Des prélèvements de sang en cours de procédure pourront être réalisés sous anesthésie gazeuse à raison d'un prélèvement toutes les deux semaines au maximum (soit 4 prélèvements par animal au maximum sur toute la durée de la procédure), d’un volume conforme aux recommandations éthiques. Le sang sera récupéré et l’animal sera remis dans sa cage pour son réveil.

Impact sur les animaux

Bien que les marqueurs sanguins et l'imagerie du foie révèlent l'apparition d'une altération du flux biliaire et d'une fibrose du foie dès 2 semaines, les animaux ne montrent pas de symptômes avant 8 à 12 semaines. Les symptômes documentés survenant dans cette période et leur impact sur le bien-être animal sont mineurs : petites altérations du comportement (léthargie/activité réduite), jaunisse transitoire. Cependant, l'état des animaux sera suivi 2 fois par semaine en observant la survenue de ces symptômes, en vérifiant la prise de nourriture, et en mesurant le poids des animaux. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques selon les études de toxicologie préliminaires ou la littérature) en dehors de celle induite par la piqûre. De plus, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront alors récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés afin de pratiquer différentes analyses qui nous permettront d'évaluer l'efficacité des candidats-médicaments dans ce modèle de PSC. De plus, l'euthanasie des animaux à 12 semaines maximum empêchera les animaux de subir des symptômes sévères liées à la modification génétique.

Remplacement

Des expériences sur cellules pourront être réalisées en amont selon le mode d'action documenté ou envisagé des molécules testées. Cependant, l’étude de l’efficacité de molécules pouvant agir sur l’inflammation et/ou sur la fibrose est bien plus pertinente dans ce modèle dont l’ensemble des caractères anatomiques, physiologiques et immunitaires reproduit la majorité des aspects de la PSC humaine. Cette souche de souris est le modèle génétique de référence pour l'étude préclinique de la PSC, et modélise tout à la fois une altération du flux biliaire, une infiltration de cellules immunitaires en périphérie des canaux biliaires, une fibrose autour des canaux biliaires dite en "peau d'oignon" caractéristique de la PSC, ainsi qu'un déséquilibre des acides biliaires et de la flore intestinale. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d’autres méthodes alternatives n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information. Pour évaluer et déterminer l’effet d’un traitement sur tous les facteurs précités, il est essentiel d’examiner l’animal vivant entier.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous nous sommes appuyés sur les données de la littérature pour déterminer un nombre d’animaux nécessaire afin de garantir une puissance statistique adéquate pour l’analyse des résultats et d’inclure un nombre suffisant de contrôles internes permettant de conclure de manière robuste sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 8 groupes de 7 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.

Raffinement

Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude préliminaire sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études de screening ultérieures. L'implantation des puces d’identification et les prélèvements sanguins sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane, un anesthésique volatile reconnu pour son induction et son réveil rapide, minimisant ainsi le stress et l’impact sur l’animal. L’implantation de la puce est une procédure rapide (quelques secondes) et bien que légèrement invasive, elle ne provoque qu’un inconfort transitoire. Les prélèvements sanguins sont effectués de manière à limiter le traumatisme local pour minimiser la douleur et l’inflammation post-procédure. Toutefois, les animaux seront surveillés attentivement après chaque intervention. Si des signes de douleur ou d’inconfort prolongés étaient observés (léthargie, prostration, diminution de l’alimentation), un analgésique sera administré. Les animaux seront également suivis et pesés 2 fois par semaine afin d’anticiper tout signe de souffrance. Si les points limites sont atteints et que des signes de souffrance sont avérés chez l’animal, il sera sorti du protocole et euthanasié. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour éviter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon leur poids et/ou selon un marqueur sanguin déterminé au cours de l'étude préliminaire. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux, la satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettant également d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

Ce modèle de souris génétiquement modifiées exprime un ensemble de caractères anatomiques, physiologiques et immunitaires très proche de la cholangite sclérosante primitive. Il s'agit du modèle génétique de référence dans la littérature ou les entreprises de recherche préclinique afin de tester l’efficacité de nouveaux traitements pour cette maladie. Dans le cadre de ce projet, nous nous intéresserons à la phase précoce (semaines 4 à 12 de la vie des animaux) de la maladie pendant laquelle se développent l'altération du flux biliaire, l'inflammation en périphérie des canaux biliaires et la fibrose du foie qui seront les principaux paramètres que nous chercherons à diminuer par l'administration de candidats-médicaments. Lors de cette phase, la pathologie est en cours de développement, ses caractéristiques sont encore modérées mais suffisamment développées pour permettre l'évaluation d'un candidat-médicament. Ne pas poursuivre l'étude sur les animaux au-delà de 12 semaines nous permettra d'obtenir des résultats suffisants pour démontrer l'efficacité de nos molécules tout en réduisant l'impact que la modification génétique pourrait avoir sur le bien-être des animaux.

Tester un additif alimentaire destiné à l'aquaculture industrielle conduit à soumettre 225 truites arc-en-ciel à dix jours de stress d'entassement, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le volume d'eau du bassin est réduit une heure par jour, les poissons sont sortis de l'eau dix fois en trois mois pour être pesés, et chacun subit une prise de sang. Le porteur indique que cette période provoque perte de poids, refus de s'alimenter et pertes partielles d'écailles au niveau des nageoires pectorale et caudale. Toutes les truites sont tuées à l'issue pour prélèvements, dans une étude dont le porteur annonce qu'elle améliorera le "bien-être" des poissons d'élevage et le rendement des rations.

Objectifs

L’industrie aquacole, confrontée à une demande croissante, fait face à des défis majeurs tels que les épidémies et la résistance aux antibiotiques, qui menacent sa pérennité. Les antibiotiques sont utilisés depuis longtemps en aquaculture, pour leur grande efficacité dans le traitement et la prévention des maladies. Cependant, les préoccupations croissantes concernant la résistance aux antibiotiques ont conduit les chercheurs à se tourner vers des additifs alimentaires naturels et des produits immunostimulants sûrs et efficaces, susceptibles de soutenir des pratiques aquacoles durables. Parmi ces additifs, les probiotiques (micro-organisme vivants (bactéries ou levures)) et les postbiotiques (composés non vivants produits par les probiotiques) suscitent un intérêt considérable en raison de résultats encourageant sur la croissance, la résistance aux maladies, la réduction des réponses au stress, le renforcement des réponses immunitaires et le bien-être général des animaux aquatiques. Par ailleurs, contrairement aux probiotiques, les postbiotiques sont stables pendant le traitement des aliments, y compris l’extrusion à haute température, ce qui les rend particulièrement adaptés aux aliments aquacoles commerciaux. Dérivés de micro-organismes probiotiques, les postbiotiques comprennent des cellules probiotiques inactivées, des composants cellulaires bactériens et des métabolites microbiens, offrant des bénéfices potentiels pour la santé des animaux aquatiques. Cependant, si les postbiotiques sont très prometteurs, il reste encore à comprendre pleinement leurs mécanismes d'action et à déterminer les niveaux de supplémentation optimaux. L’objectif de ce projet est de tester chez la truite arc en ciel un postbiotique dont les effets sur la modulation de la réponse immunitaire et la santé intestinale ont déjà été démontrés chez d’autres espèces animales comme le porcelet.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront, à court terme, de mieux comprendre le mécanisme par lequel les effets de la supplémentation alimentaire permettent d'améliorer la capacité des truites arc-en-ciel à faire face à des conditions de stress. En évaluant différents niveaux d'inclusion, cette étude permettra d'identifier le dosage optimal pour améliorer la résilience, la fonction immunitaire et la santé intestinale des poissons. La diffusion de ces résultats et leur interprétation dans le contexte de l'aquaculture commerciale permettront aux producteurs de poissons d'adopter des stratégies non pharmaceutiques plus efficaces pour améliorer le bien-être des poissons. À terme, cela contribuera à des pratiques piscicoles plus durables, plus efficaces et plus accessibles, tout en réduisant le recours aux antibiotiques et en favorisant la protection de l'environnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à la procédure (stress d’entassement) pour une durée de 10 jours. Au cours du stress, le volume d'eau dans le bassin sera diminué une heure par jour pendant 10 jours. Les animaux seront sortis hors de l’eau pour les pesées et le prélèvement (10 fois en trois mois ; moins de 30 secondes). Un prélèvement de sang sera réalisé une fois par animal avec un temps de prélèvement qui ne dépassera pas une minute.

Impact sur les animaux

Durant la période de stress : Perte de poids, diminution de l’indice corporel, refus de s’alimenter, dégradation de l’état corporel (pertes partielles des écailles au niveau de la nageoire pectorale et caudale en fin de période de stress). Douleur transitoire à l'endroit du prélèvement de sang réalisé une fois par animal.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure expérimentale seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements biologiques. Ces prélèvements permettront de mieux appréhender l'effet de l’inclusion d’un postbiotique sur la résistance des poissons au stress d'élevage et d'optimiser de ce fait les rations alimentaires pour leur bien-être.

Remplacement

La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Il n'existe aucun modèle in vitro ou in silico capable de reproduire tous les facteurs cellulaires et acellulaires impliqués dans la stimulation du système immunitaire pour faire face au stress d'élevage subi par les poissons.

Réduction

Des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre d'animaux adéquat pour ce projet. Les calculs ont été faits sur la base de résultats obtenus dans d'autres études sur la réponse au stress d’élevage lors de l’utilisation du complément alimentaire chez d’autres espèces aquatiques. Le nombre d'animaux à utiliser permettra d'apporter de bonnes conditions d'élevage en favorisant une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d'obtenir des données scientifiquement robustes. Des analyses post-mortem seront réalisées sur les tissus de chaque animal afin de générer le maximum d'informations possibles par animal.

Raffinement

Avant toute manipulation, les truites arc-en-ciel seront anesthésiées. Le stress dû à la capture, à la sortie des bassins et aux prises de sang sera réduit par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement, comme décrit dans la procédure qui définit le volume limite de sang et les périodes de récupération nécessaires. Pour protéger le bien-être des animaux, ils seront suivis au moyen de grilles d'évaluation du bien-être animal, et des points limites adaptés seront appliqués immédiatement si un animal semble éprouver des effets indésirables imprévus. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte à ce que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et répondent à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, comme modèle animal des salmonidés. La truite est un bon modèle pour les salmonidés car elle est taxonomiquement proche du saumon et les résultats sont transposables au saumon. La truite est également un animal plus résistant aux conditions d'élevage et aux maladies, avec un taux de croissance plus élevé. Au début de l'étude, les truites pèseront 250 ± 10 grammes après 9 semaines d'élevage. Puis, à 280 g, elles seront soumises à un stress chronique pendant 10 jours. Enfin, une période de récupération de 8 jours sera envisagée pour atteindre une taille finale de 350 g.

2 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une réaction allergique leur est provoquée, avec une inflammation locale ou généralisée, un inconfort respiratoire transitoire et une baisse de la température corporelle mesurée trente minutes après chaque administration d'antigène, puis elles reçoivent des substances une à deux fois par semaine pendant cinq à huit semaines et subissent deux à trois prélèvements sanguins. La mise à mort sert à prélever poumons, intestin, peau et ganglions, le porteur indiquant que ces analyses ne peuvent pas être faites sur des animaux vivants. L'objet reste l'optimisation d'une molécule immunomodulatrice, dont il compare plusieurs versions pour la rendre "plus facile à produire", tout en affirmant qu'aucune alternative au modèle murin n'est disponible et que la souris demeure "incontournable".

Objectifs

Ce projet a pour but de mieux comprendre et d’optimiser une approche innovante pour traiter les allergies. Il repose sur trois grands axes : 1.Observer comment une molécule testée agit sur certaines cellules du système immunitaire, en particulier celles qui fabriquent les anticorps. 2.Vérifier si cette approche pourrait prévenir ou soulager les différents allergies, en l’essayant dans différents modèles d’allergie chez la souris. 3.Améliorer cette stratégie en comparant plusieurs versions de la molécule, pour la rendre plus efficace, mieux tolérée, plus stable dans le temps et plus facile à produire.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’explorer une approche immunomodulatrice innovante dans un contexte allergique, et de caractériser de manière approfondie les mécanismes immunitaires sous-jacents, afin de mieux comprendre leur implication dans l’efficacité thérapeutique. Ces pathologies, en forte augmentation dans les pays industrialisés, touchent aujourd’hui jusqu’à 30 à 40 pourcents de la population mondiale et représentent un fardeau important en termes de santé publique et de coût socio-économique (arrêts de travail, baisse de qualité de vie, consommation de soins). En étudiant les effets immunologiques de cette approche, notamment sur la production d’anticorps et la régulation de la réponse immunitaire, ce projet a pour objectif d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus efficaces, mieux tolérées et adaptées aux besoins des patients allergiques. Les retombées attendues concernent principalement la santé humaine, avec un potentiel impact à long terme sur la prévention et la prise en charge des maladies allergiques. Ce projet contribue également à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation immunitaire, ce qui pourrait bénéficier à d’autres pathologies inflammatoires ou auto-immunes.

Procédures

Les animaux seront soumis à différentes interventions non chirurgicales, réparties sur plusieurs semaines selon le modèle expérimental. Celles-ci incluent des administrations de substances (1 à 2 fois par semaine, quelques minutes, sur une période totale de 5 à 8 semaines, sur animaux vigiles ou sous anesthésie courte), la mesure des paramètres respiratoires (1 fois pendant le projet, environ 20 minutes, sur animaux vigiles avec contention douce) et des prélèvements sanguins (2 à 3 fois par animal sur l’ensemble du protocole, environ 5 minutes, sur animaux vigiles).

Impact sur les animaux

L’induction d’une réaction allergique chez les souris peut provoquer une réponse inflammatoire locale ou généralisée, pouvant entraîner une gêne physique passagère, ainsi qu’un état temporaire de mal-être. Selon le modèle allergique utilisé, cette réaction peut également s’accompagner d’un inconfort respiratoire transitoire. Par ailleurs, cette phase d’induction est susceptible de provoquer une baisse modérée de la température corporelle (stress thermique), nécessitant une surveillance spécifique. Les nuisances attendues incluent le stress lié à la contention temporaire nécessaire pour les injections et administrations, ainsi qu’à la réalisation de mesures de paramètres respiratoires. Ces manipulations peuvent entraîner un inconfort transitoire, sans conséquences durables pour les animaux. Les prélèvements sanguins répétés, indispensables pour le suivi de la réponse immunitaire, peuvent occasionner une douleur brève ainsi qu’un risque localisé d’irritation ou d’hématome. La contention temporaire nécessaire à ces procédures est également susceptible de générer un stress ponctuel, en raison de la restriction de mouvement qu’elle implique.

Devenir

À l’issue des différentes procédures expérimentales, les animaux seront euthanasiés afin de permettre la récupération des tissus nécessaires aux analyses scientifiques. Cette étape est indispensable pour atteindre les objectifs du projet, qui nécessitent l’étude fine des organes impliqués dans les réponses allergiques (poumons, intestin, peau, ganglions, etc.). Les prélèvements post-mortem permettent de réaliser des analyses de type histologique, immunologique, transcriptomique ou moléculaire, qui ne peuvent pas être effectuées sur des animaux vivants sans entraîner une souffrance importante ou des biais expérimentaux. L’euthanasie est donc justifiée scientifiquement et a été retenue comme la seule solution éthique permettant d’obtenir des résultats fiables tout en respectant le bien-être animal.

Remplacement

La souris est un modèle valide en immunologie et particulièrement dans les études visant à mieux décrire les mécanismes modulant la réponse immunitaire. Aucune alternative à l'utilisation d'un modèle murin n'est disponible pour cette recherche. Avant d’avoir recours à l’expérimentation animale, des approches alternatives ont été utilisées en amont du projet, notamment des cultures cellulaires et des tests de stimulation in vitro pour étudier certaines voies de signalisation. Ces modèles ont permis de mieux cibler les conditions expérimentales, de réduire le nombre d’animaux nécessaires et d’optimiser les doses utilisées. Toutefois, ces approches ne permettent pas d’évaluer l’efficacité globale d’une immunothérapie ou l’impact d’une modulation immunitaire dans le cadre d’une pathologie systémique comme l’allergie. La souris a donc été retenue comme modèle, en raison de sa pertinence en immunologie et de la disponibilité de lignées transgéniques bien caractérisées, qui permettent une exploration fine des mécanismes impliqués. Ainsi, malgré les efforts de remplacement mis en œuvre, l’utilisation d’un modèle murin reste à ce jour incontournable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Dans le cadre de ce projet, un total de 2064 souris est prévu sur une durée de 5 ans. Ce nombre représente le minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en respectant le principe de réduction inscrit dans la règle des 3R. Le nombre d’animaux par groupe expérimentale a été défini à partir de calculs de puissance statistique, en se basant sur les données issues de nos travaux antérieurs, afin de garantir une puissance suffisante pour détecter des différences biologiquement significatives. Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, plusieurs mesures de réduction ont été mises en œuvre : Optimisation des protocoles expérimentaux à partir de données issues de cultures cellulaires et d’études préliminaires in vitro. Planification raisonnée des groupes expérimentaux, en tenant compte à la fois de l’objectif scientifique et des contraintes de stabulation. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux impliqués, sans compromettre la validité scientifique des résultats attendus.

Raffinement

Des mesures spécifiques sont appliquées à chaque étape du protocole pour réduire douleur, stress et souffrance. Une surveillance clinique quotidienne est effectuée, incluant l’observation du comportement dans l’environnement habituel afin de détecter précocement tout signe de mal-être. Lors de la phase d’induction allergique, une chute de température corporelle pouvant survenir (stress thermique), une mesure systématique est réalisée 30 minutes après l’administration de l’antigène. Un suivi clinique quotidien est effectué. Des critères d’arrêt stricts sont définis. Les prélèvements sanguins répétés sont réalisés à l’aide de techniques peu invasives, et la contention est brève et maîtrisée afin de minimiser la gêne. Les animaux sont hébergés en groupe dans des portoirs ventilés, à température et hygrométrie contrôlées, avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture, et un cycle lumineux de 12 heures par jour. L'environnement est enrichi. L’ensemble de ces mesures vise à réduire au strict minimum les contraintes imposées aux animaux, en garantissant leur bien-être tout en assurant la fiabilité et la qualité des données expérimentales. Les procédures peuvent générer un inconfort passager lié à la contention ou aux manipulations, sans effets durables. Toutes les interventions seront réalisées par du personnel expérimenté, dans des conditions visant à limiter le stress et à préserver le bien-être des animaux.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris dans ce projet se justifie par son statut de modèle validé en immunologie, particulièrement adapté aux études portant sur les mécanismes de régulation du système immunitaire et le développement de nouvelles stratégies d’immunothérapie. La souris offre une excellente reproductibilité des résultats, grâce à sa standardisation génétique, à la disponibilité d’outils immunologiques spécifiques, et à l’existence de nombreux modèles expérimentaux bien caractérisés. Les animaux seront utilisés à un stade adulte jeune, entre 6 et 8 semaines d’âge. Ce choix correspond à un stade de développement où le système immunitaire est pleinement mature, ce qui est essentiel pour étudier les réponses immunitaires induites dans le cadre du projet.