Recherche appliquée

Tous gardés en vie à l'issue et réutilisés, 34 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une boiterie leur est provoquée par huit points d'injection de kaolin sous la peau de la face plantaire d'un membre postérieur, sous une heure d'anesthésie générale, et dure environ cinq jours pendant lesquels ils sont hébergés seuls. Ils reçoivent jusqu'à trois administrations du produit testé espacées de trois semaines, des prélèvements sanguins à la jugulaire, et marchent en laisse sur une plateforme de mesure de force pour évaluer l'appui du membre rendu douloureux. Deux animaux ont été ajoutés au projet pour valider l'induction de la boiterie elle-même, et le porteur affirme qu'"aucune méthode alternative" ne permet d'évaluer un anti-inflammatoire vétérinaire sur ce modèle.

Objectifs

MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX. L'objectif de ce projet est d'évaluer puis de comparer l'efficacité d'un élément d'essai administré à deux doses différentes. L'objectif est de pouvoir démontrer les propriétés anti-inflammatoire et analgésique du produit testé sur un modèle inflammatoire chez le chat. Ce produit test sera mis en comparaison avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (le véhicule du produit test à administrer ou du sérum physiologique). Modification au projet: Ajout de deux animaux pour valider l'injection de kaolin et valider l'inflammation. Ce modèle permet de créer une boiterie en induisant réponse inflammatoire au niveau du membre induit. Grâce au modèle boiterie, les propriétées anti-inflammatoire et analgésique des produits testés pourront être évalués.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations sous-cutanées quelques soit le groupe, pour le produit test, le contrôle négatif et le contrôle positif. Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 3 administrations par produit espacées de 3 semaines de récupération entre les administrations pourront être réalisées. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés avant chaque administration du produit test, contrôle négatif ou positif puis toutes les 3 semaines jusqu'à la fin de l'étude. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenus en laisse et harnais et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation. MODIFICATION: INDUCTION D'UNE BOITERIE SUR DEUX ANIMAUX SUPPLEMENTAIRES POUR LA MISE AU POINT TECHNIQUE.La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré avec la solution de kaolin, à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Des réactions inflammatoires (gonflement, rougeurs par exemple) peuvent également être observées au niveau des sites d'injections des éléments tests.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

32 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 4 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis deux groupes auront l' élément test à deux doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée au donneur d'ordre. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Ces études ont mis en avant qu'il était necessaire d'avoir des groupes de 6 à 8 animaux. Des groupes de 6 à 8 animaux ont été également indiqué dans des textes de références (J. vet. Pharmacol. Therap., 2005, 28, 275-285, J Vet Pharmacol Ther. 2009 Feb; 32(1):18-30 par exemple) . Pas de test statistique réalisé en amont. Pas d'approche statistique prévue pour ce projet. MODIFICATION : AJOUT D'UNE PROCEDURE DE VALIDATION DE METHODE DU CHALLENGE KAOLIN SUR DEUX NOUVEAUX ANIMAUX SOIT UN TOTAL DE 34 ANIMAUX INCLUS DANS CE PROJET. DEUX ANIMAUX DE PLUS RAJOUTES POUR VALIDER LA METHODE EST LE NOMBRE MINIMAL POUR EFFECTUER CE PROJET.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux continueront une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle tout au long de la présence de la boiterie. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active du modèle boiterie. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet. Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

Infectées par gavage avec un parasite intestinal, 980 souris immunodéficientes passent jusqu'à douze jours hébergées sur grille en cage métabolique pour que leurs fèces soient récoltées. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes sont tuées à l'issue, l'agent en cause étant transmissible à l'humain. Le porteur décrit un ramollissement des fèces pendant plusieurs jours, une prostration possible et une légère perte de poids à partir du douzième jour après l'infection. La finalité est l'entretien d'un stock : Cryptosporidium parvum ne se congèle pas et perd son infectiosité au bout de quatre mois environ, ce qui impose plusieurs passages par animal chaque année, 900 souris étant prévues pour la seule multiplication des souches.

Objectifs

Cryptosporidium parvum est un parasite unicellulaire qui se multiplie dans l’intestin avant d’être excrété dans le milieu extérieur avec les selles. Il est responsable de la cryptosporidiose, une maladie conduisant à des diarrhées sévères chez les individus jeunes ou immunodéprimés, que ce soit chez les ruminants ou chez l’humain. Les moyens de contrôle vis-à-vis de la cryptosporidiose sont limités et de nouvelles cibles thérapeutiques doivent donc être identifiées. La possibilité de modifier génétiquement le parasite est un outil précieux pour nos recherches portant sur la réponse immunitaire de l’hôte face à l’infection et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi d’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. De plus, nos projets de recherche requièrent des quantités importantes de parasites. Comme il n’existe pas de système in vitro permettant de générer ou de multiplier efficacement une souche transgénique, nous utilisons pour cela un modèle murin sensible à la cryptosporidiose. Par ailleurs, le parasite ne peut être congelé, il peut être conservé à 4 °C, mais au-delà de plusieurs mois (environ 4 mois) une diminution progressive de sa capacité à infecter les cellules est observée. Nos études exigent des parasites fraichement multipliés, aussi plusieurs multiplications par an sont nécessaires pour conserver chaque souche générée. Ce projet a pour but de générer puis de maintenir des souches transgéniques de Cryptosporidium parvum in vivo, puisque celles-ci ne peuvent être congelées ou stockées au réfrigérateur plus de 4 mois (perte de leur infectiosité).

Bénéfices attendus

De nouvelles cibles thérapeutiques doivent être identifiées pour lutter plus efficacement contre la cryptosporidiose, que ce soit en santé humaine ou animale. Le développement et l’utilisation de souches parasitaires transgéniques permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, ces souches permettent de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) et/ou plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro et in vivo). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour conserver et maintenir l’infectiosité de chaque nouvelle souche transgénique générée, et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.

Procédures

Les souris adultes vigiles seront toutes soumises à une ou deux administration(s) orale(s) par gavage, sous contention. Ce geste dure quelques dizaines de secondes. Les animaux reçoivent deux administrations de ce type dans la transfection (au maximum 80 souris sur 5 ans) et une seule dans la multiplication (au maximum 900 souris sur 5 ans).

Impact sur les animaux

Les animaux vigiles seront soumis sous contention à une (inoculation de parasites) ou deux (inoculation de sodium bicarbonate puis parasites) administration(s) orale(s) selon la procédure considérée. Le gavage réalisé sur animal vigile génère un stress du fait de la contention et une gêne par l’introduction de la sonde par voie buccale. Il n’y a pas de souffrance liée au gavage oral. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée si le gavage est effectué en douceur par du personnel expérimenté, ce qui est toujours le cas. Il est attendu que les animaux soient atteints par la maladie. Chez les rongeurs, on n’observe pas de diarrhée mais un ramollissement des fèces durant plusieurs jours et éventuellement une prostration des animaux et une légère perte de poids à partir d’une douzaine de jours après infection par le parasite. L’hébergement des animaux sur grille en cage métabolique durant une partie du protocole (12 jours maximum) est nécessaire pour la récolte des parasites qui constitue l’objectif du projet. Les déplacements ou postures statiques sur la grille peuvent engendrer de l’inconfort pour les animaux.

Devenir

Les animaux entrent dans un protocole expérimental en zone confinée et sont tous infectés avec un agent pathogène zoonotique de classe II (risque pour l'humain et pour l’environnement). Ils sont donc mis à mort en fin d’expérimentation selon les normes réglementaires et de sécurité biologique.

Remplacement

Pour l’obtention de nouveaux parasites infectieux, la complétion du cycle parasitaire incluant une phase de reproduction sexuée est requise (durée de 3-4 jours). Les cultures cellulaires conventionnelles, utilisées par le laboratoire, permettent de reproduire le début du cycle mais pas la fécondation ni la production de nouveaux parasites infectieux. La complétion du cycle parasitaire a été récemment obtenue par quelques laboratoires dans le monde, mais uniquement à l’aide d’approches impliquant un système de bio-ingénierie ou basées sur des structures cellulaires tridimensionnelles dérivées de cellules souches. Surtout, ces quelques approches in vitro non conventionnelles permettent l’obtention d’oocystes en très faible quantité. Ce faible rendement est très éloigné des quantités dont le laboratoire a besoin pour ses recherches, et qui ne peuvent être obtenues à l’heure actuelle qu’à partir d’un modèle in vivo.

Réduction

Les effectifs d’animaux utilisés pour ce projet ont été définis d’après la littérature et notre expérience sur les 8 dernières années. Ils permettent d’assurer l’obtention du nombre de parasites requis pour nos études, tout en utilisant le moins d’animaux possible.

Raffinement

Avant la phase de récolte des matières fécales, les animaux sont hébergés au maximum par 4 dans des cages sur litière et un enrichissement comprenant des feuilles de papier cellulose, bâtonnets de bois et abri en polycarbonate est ajouté. Durant la phase de récolte des matières fécales, les souris sont toujours hébergées au maximum par 4 sur grille dans des cages de récolte et durant 12 jours maximum. Ces cages de récolte sont enrichies de bâtonnet de bois, d’un abri en polycarbonate et d’une plateforme de repos ajoutée au centre de la cage, afin que les animaux puissent monter dessus pour se reposer et ne pas être continuellement sur cette grille. Les animaux reçoivent une récompense alimentaire (ex : graines de tournesol, popcorn…) après l’administration orale des parasites. Pour limiter l’impact de l’infection sur le poids des animaux et éviter une éventuelle déshydratation, un complément alimentaire riche en calories (DietGel® Boost, Clear H20) sera ajouté sur une plateforme dans chaque cage de récolte dès le début de l’excrétion parasitaire et cette supplémentation sera maintenue jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis seront définis dans une grille de suivi clinique (perte de poids, apparence, comportement de l’animal) et tout animal atteignant l’un de ces points limites sera pris en charge sans délai.

Choix des espèces

Les espèces pouvant être infectées par Cryptosporidium parvum sont nombreuses. En élevage, les ruminants sont les plus touchés par la cryptosporidiose. Les souris adultes immunodéficientes utilisées pour la totalité de ce projet représentent un bon modèle d’étude de cette maladie car il reproduit bien la sensibilité des patients immunodéprimés. Ce modèle permet également une multiplication du parasite sur animaux exempt d'agents pathogènes spécifiques et opportunistes, ce qui évite les contaminations par d’autres espèces ou souches de Cryptosporidium, ou par d’autres parasites ou agents pathogènes. Cette lignée murine est plus sensible aux infections (notamment par des parasites).

Opérées de la cochlée entre leur sixième et leur neuvième jour de vie pour y recevoir un vecteur viral, 504 gerbilles de Mongolie attendent au moins huit semaines avant une seconde intervention dont elles ne se réveillent pas. Pendant celle-ci, leurs potentiels évoqués auditifs sont enregistrés de quatre à douze heures sous anesthésie entretenue par réinjections. Le niveau de souffrance déclaré est modéré pour la totalité de l'effectif, et le porteur ne mentionne comme nuisances que la douleur suivant l'injection intracochléaire et le stress lié aux piqûres. Toutes sont tuées pour que leur oreille interne et leur cerveau soient examinés au microscope, l'objet étant de préparer un implant cochléaire fonctionnant à la lumière plutôt qu'à l'électricité.

Objectifs

En 2050, près de 2,5 milliards de personnes dans le monde auront des problèmes d’audition. Pour 700 millions d’entre elles, ces problèmes seront très graves. Aujourd’hui, la meilleure solution pour les personnes qui n’entendent presque plus, c’est l’implant cochléaire électrique. C’est un petit appareil placé dans l’oreille interne. Il capte les sons et les transforme en courants électriques pour faire travailler directement les nerfs de l’oreille. Mais il y a un souci : l’électricité stimule trop large. Elle excite beaucoup de nerfs en même temps, ce qui fait perdre la précision des sons. Par exemple, dans un restaurant bruyant ou dans une classe, c’est difficile de comprendre une conversation. Pour améliorer ça, nous travaillons sur une nouvelle idée : utiliser la lumière au lieu de l’électricité. Comment ? On rend les nerfs sensibles à la lumière grâce à des petites protéines spéciales. Ensuite, on envoie de la lumière avec des mini-lampes dans l’oreille. Cette lumière active les nerfs, mais de manière beaucoup plus précise, un peu comme un rayon laser au lieu d’un éclair. Grâce à ça, on espère que les personnes entendront beaucoup mieux et comprendront les voix même dans le bruit. Notre projet a deux buts : Trouver la meilleure manière de rendre les nerfs sensibles à la lumière. Savoir exactement quels nerfs réagissent à cette lumière.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, un million de personnes qui ne pouvaient plus entendre utilisent déjà des implants cochléaires électriques. Grâce à ces appareils, la plupart arrivent à comprendre la parole quand il n’y a pas de bruit, par exemple dans une pièce calme. Mais dès qu’il y a du bruit autour – dans la rue, un restaurant, une salle de classe ou un bureau – ça devient très difficile. Parfois, ils n’arrivent presque plus à comprendre ce qu’on leur dit. Et il y a un autre problème : ils ne peuvent pas vraiment profiter de la musique, car les sons sont trop simplifiés. Pour améliorer ça, nous développons un implant cochléaire qui utilise la lumière. Cette nouvelle technologie devrait permettre d’entendre plus clairement, même quand il y a du bruit, et peut-être aussi de mieux profiter des sons comme la musique. Pour y arriver, il faut deux étapes importantes : Trouver la meilleure façon de rendre les nerfs de l’oreille sensibles à la lumière. Comprendre comment ces nerfs réagissent à la lumière pour pouvoir les contrôler de manière très précise. Ces recherches sont essentielles pour amener un jour cette nouvelle technologie aux patients et leur rendre une audition la plus naturelle possible.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales. La première procédure consiste à injecter un vecteur viral dans les cochlées des animaux entre le sixième et le neuvième jour de vie. Cette procédure permettra de photosensibiliser les neurones cochléaires. Cette procédure nécessitera environ 30 minutes par animal, en incluant l'induction de l'anesthésie et le réveil. La seconde procédure chirurgicale sera réalisée au moins 8 semaines après l’injection du vecteur viral, lors d’une procédure durant laquelle les animaux ne se réveilleront pas. Durant cette procédure, les potentiels évoqués auditifs seront enregistrés sur une durée de 4 à 12 heures. L'état de profonde anesthésie sera maintenu par reinjection régulière d'anesthésiant durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les différentes nuisances ont été identifiées: - suite à l’injection intracochléaire à 6-9 jours de vie, douleur post-opératoire; - injection d’antalgiques et anesthétiques : stress

Devenir

À la fin de chaque étape, les animaux devront être euthanasiés (endormis définitivement sans douleur). C’est nécessaire car nous devons analyser leur oreille interne (cochlée) et leur cerveau pour vérifier si la thérapie génique a bien fonctionné. Pour cela, il faut prélever ces organes afin de les examiner au microscope.

Remplacement

Les travaux prévus nécessitent une organisation cellulaire extrêmement complexe, formant un réseau qui ne peut pas encore être reproduit en culture cellulaire ou dans les modèles in silico les plus sophistiqués. Une telle organisation cellulaire complexe ne peut être trouvée que chez d'autres mammifères, tels que les rongeurs. En outre, l'objectif du présent travail est de prédire les performances d'un implant cochléaire optique pour l'homme. Nous devons donc utiliser un modèle animal dont le système auditif est anatomiquement et physiologiquement aussi proche que possible de celui de l'homme. Nous avons donc choisi la gerbille de Mongolie. Les données générées seront partagées avec les scientifiques qui développent des modèles informatiques des voies auditives, ce qui permettra, nous l'espérons, d'utiliser des modèles in silico plutôt que des modèles animaux dans le cadre d'études futures.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé dans ce projet a été calculé avec soin grâce à un outil statistique. L’objectif est d’utiliser le moins d’animaux possible, tout en s’assurant que les résultats soient fiables. Pour cela, nous avons choisi des critères précis pour garantir que les expériences soient assez puissantes pour montrer un effet réel. Dans ce projet, les deux sexes (mâles et femelles) seront inclus sans faire de distinction.

Raffinement

Le bien-être des animaux est notre priorité pendant toute la durée du projet. Si un animal se retrouve seul, nous ferons en sorte qu’il ne reste pas isolé en le mettant avec d’autres animaux. Au début, un séparateur percé sera utilisé pour qu’ils puissent s’habituer les uns aux autres sans risque. Nous savons que manipuler les animaux peut être stressant pour eux. C’est pourquoi nous allons les habituer doucement à venir d’eux-mêmes sur la main des chercheurs, plutôt que d’être attrapés. Après l’injection (faite très tôt après la naissance), les animaux seront surveillés tous les jours et recevront des médicaments contre la douleur pendant deux jours. Ces médicaments seront donnés après une courte anesthésie (moins de 5 minutes) pour éviter tout stress. Si nous voyons qu’un petit n’est pas bien (par exemple, s’il n’est plus soigné par sa mère), il recevra des soins supplémentaires après avis d’un vétérinaire. Si malgré tout son état ne s’améliore pas, il sera endormi sans douleur. De même, si un animal montre des signes de souffrance plus tard, nous utiliserons une grille d’évaluation spéciale et, après avis du vétérinaire, il recevra des soins ou sera euthanasié.

Choix des espèces

Notre objectif est de savoir si l’implant cochléaire optique pourrait bien fonctionner chez l’être humain. Pour cela, nous devons faire des tests sur un animal qui a une oreille très semblable à celle de l’homme. Nous avons choisi la gerbille de Mongolie, un petit rongeur. Elle entend presque comme nous et sa grande oreille facilite l’accès à la cochlée pour y mettre un implant ou injecter le vecteur viral. Le vecteur viral (qui sert à rendre les nerfs sensibles à la lumière) sera injecté quand les petits ont entre 6 et 9 jours. Pourquoi ? Parce que le traitement marche beaucoup mieux à cet âge. Parce qu’à cet âge, l’os autour de l’oreille n’est pas encore formé, ce qui permet de faire l’injection sans opération lourde. Après 10 jours, cet os se durcit et il faudrait une chirurgie beaucoup plus invasive. Enfin, les mesures (tests) seront faites au moins 8 semaines plus tard, quand les animaux seront adultes et que leur système nerveux sera complètement développé.

Seuls des mâles adultes de deux à quatre ans, écartés de l'effort reproducteur annuel de la colonie, sont retenus dans ce projet sur un primate à saisonnalité marquée. 22 prosimiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit deux biopsies testiculaires d'un millimètre carré sous anesthésie générale, à trois mois d'intervalle, chaque prélèvement étant suivi d'une ponction de sang à la patte arrière. Les 22 animaux retournent ensuite dans la population de l'établissement, avec un suivi de cicatrisation renforcé et des cachettes supplémentaires pour limiter les agressions entre congénères que le porteur qualifie de naturelles.

Objectifs

La compétition spermatique in-utero est à l’origine de l’évolution du système reproducteur des mâles chez de nombreuses espèces, dont les primates. Les variations saisonnières du statut sexuel des femelles peuvent intensifier la compétition entre mâles reproducteurs. Ceci peut engendrer des variations physiologiques du système reproducteur des mâles au cours de la saison de reproduction, telles qu’une augmentation du taux de testostérone, une augmentation du volume testiculaire, ou encore la réactivation de la spermatogenèse. Plus largement, l'objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes génétiques sous-jacents à la variation phénotypique de la reproduction saisonnière chez les primates en identifiant les gènes qui sont impliqués dans la spermatogénèse et la maturation spermatique, en particulier ceux impliqués dans des fonctions particulières telles que la réponse au stress oxydatif ou à l’immunité.

Bénéfices attendus

Cette étude va permettre d'augmenter la compréhension de l’impact des variations moléculaires associées à la reproduction saisonnière chez les primates, dans une approche comparative. L’espèce concernée faisant partie de la branche primitive des primates, les résultats de ce projet contribueront à clarifier les processus évolutifs qui ont contribué la régulation du système reproducteur chez l'humain. L'objectif sera ici de mettre en évidence les mécanismes moléculaires responsables de l’arrêt momentané puis de la reprise de la spermatogenèse selon la saison chez un primate saisonnier. Ceci permettra ainsi de progresser dans la compréhension de l’ensemble des nombreux contributeurs à la régulation de la fertilité chez les mâles, tels que ceux observés au niveau du système immunitaire ou encore pour lutter contre le stress oxydatif. Par ailleurs les résultats attendus ont également un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'humain, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Procédures

Chaque animal du projet aura 2 prélèvements successifs, réalisés sous anesthésie générale et à 3 mois d'intervalle. Les prélèvements consisteront en une biopsie testiculaire de 1mm² réalisée avec un dispositif stérile dédié, suivie d'un prélèvement sanguin réalisé à la patte arrière de l'animal, dans la limite de 200µL maximum de sang par animal et par prélèvement.

Impact sur les animaux

Les gestes associés à cette procédure sont maîtrisés par les expérimentateurs et réalisés sous contrôle vétérinaire. Seuls les individus mâles adultes ne présentant aucune contre-indication vétérinaire et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel participeront à ce projet. De plus, un contrôle quotidien renforcé sera réalisé les jours suivant l’échantillonnage afin de s’assurer de la bonne cicatrisation des zones de biopsie et de l’absence d’interactions antagonistes au sein des groupes. Un enrichissement adapté et renforcé sera mis en place dans les hébergements concernés. Les produits vétérinaires utilisés dans cette procédure sont régulièrement utilisés au sein du laboratoire et les effets secondaires potentiels sont bien identifiés. Enfin, une étude pilote sur 2 animaux sera menée en amont afin de s'assurer du maintien du bien-être animal sur le long-terme et de valider la mise en place de la procédure expérimentale d'échantillonage sur la majorité des animaux (N=20) concernés par ce projet.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet qui sera appliquée 2 fois sur une durée de 3 mois, les 22 animaux du projet retourneront dans la population.

Remplacement

Il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux par des méthodes alternatives compte-tenu de la nature des processus explorés. L'animal utilisé dans ce projet est un modèle particulièrement adapté à l’étude de l’influence de la saisonnalité sur la spermatogenèse chez les primates, car il est soumis à une compétition spermatique extrême lors de la saison de reproduction qui est très courte. Les mâles participent à une compétition intense pour l’accès à l’accouplement, sachant que les femelles vont s’accoupler avec plusieurs mâles lors de la période de reproduction. A cause de cette très forte compétition spermatique, les mâles ont un des plus haut ratio taille des testicules/ taille du corps chez les primates ; leurs testicules vont augmenter de 4 à 5 fois leur volume initial en préparation de la saison de reproduction. Ce processus démarre 2 à 3 mois avant l’entrée des femelles en oestrus et la spermatogenèse est totalement arrêtée au cours de la saison de repos.

Réduction

Nous collecterons 44 biopsies testiculaires et 44 échantillons sanguins sur 22 mâles adultes au total (phase pilote + expérimentale). Chaque mâle sera donc échantillonné à deux reprises: au cours de la réactivation de l’activité sexuelle (quelques semaines avant l'accouplement) puis lorsque l’axe reproducteur est complètement actif (pendant la période d'accouplement). Ces deux périodes de l’année correspondent à des états physiologiques, et en particulier de l’axe reproducteur, très contrastés et très bien documentés, qui supplanteront la potentielle variabilité inter-individuelle. Comme nous souhaitons réaliser du séquençage ARN sur ces échantillons, ce nombre d'individus total est conditionné par le fait qu'une analyse de puissance de l'expression génique différentielle attendue a été effectuée.

Raffinement

Une étude pilote va être menée sur 2 individus en amont du projet afin de valider la procédure et de s'assurer du maintien du bien-être animal après la procédure. Tous les produits vétérinaires utilisés dans la procédure sont connus et leurs effets sont maîtrisés par les expérimentateurs. Dès l'apparition éventuelle d'inconfort, ou de souffrance (absence d’alimentation, prostration, agressivité anormale, réaction à la palpation), l'animal sera sorti du projet et un suivi vétérinaire sera enclenché. D'un point de vue zootechnique, un enrichissement adapté sera développé au sein des zones d'hébergements concernées afin de limiter les intéractions antagonistes qui existent de manière naturelle entre les animaux, notamment lors de la periode de reproduction. Ainsi des cachettes supplémentaires seront ajoutées, les zones de fourragements seront multipliées et le taux d'occupation des hébéregement pourra être diminué si nécessauire.

Choix des espèces

Outre sa proximité phylogénétique avec l’humain, l'espèce utilisée dans ce projet est un modèle particulièrement adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans le contrôle de la reproduction, qui est saisonnière même en captivité, ce qui est rendu possible par un contrôle du régime photopériodique. Seuls des animaux mâles adultes, matures sexuellement (entre 2 et 4 ans) et n'étant pas programmés pour contribuer à l'effort reproducteur annuel seront échantillonnés. Les résultats attendus ont un intérêt biomédical, avec une transposition des résultats obtenus aux perturbations possibles des voies moléculaires impliquées dans l'altération du processus de spermatogenèse chez l'Homme, qu'elles soient liées à des blessures ou des maladies et qui peuvent mener à l’infertilité.

Apporter aux autorités sanitaires les preuves d'innocuité exigées avant la mise sur le marché de dispositifs médicaux censés reconstituer le collagène de la peau : 300 rats sains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur peau. Le dos rasé, chaque animal reçoit le même jour jusqu'à six injections d'hydrogels différents en sous-cutané ou en intradermique, sous anesthésie et après administration d'un analgésique opiacé. Le porteur présente cette accumulation de six produits sur un même individu comme une mesure de réduction qui divise par six le nombre d'animaux utilisés. Il énumère les limites des modèles de peau humaine, explants qui ne survivent que sept à huit jours et échantillons d'abdominoplastie au derme épaissi, pour conclure que l'évaluation chez l'animal reste "nécessaire".

Objectifs

Les traitements contre le diabète, l’obésité (anti-GLP1) ou l’infection par le virus du SIDA (VIH) ont pour effets secondaires une atrophie des tissus adipeux sous-cutanés (lipoatrophie) et un vieillissement cutané (perte de collagène) accéléré. L’infection par d’autres virus chroniques ainsi que certains troubles métaboliques peuvent aussi être à l’origine de ces effets. La perte de collagène est une cause sous-jacente majeure du vieillissement cutané observé chez ces patients. Il est donc nécessaire de développer des thérapies susceptibles de stimuler la régénération cutanée (production de collagène, régénération du tissu adipeux dermique) et de combler les zones atrophiées afin de limiter l’impact structurel. Ces effets secondaires présentent également un impact psychologique délétère qui dégrade fortement la qualité de vie de ces patients. Ce programme de recherche s’intéresse à caractériser chez le rat la régénération tissulaire et la stimulation de la fabrication naturelle de collagène grâce à de nouvelles formulations ou composés (efficacité), et vérifier l’absence de réactions inflammatoires délétères autour du site d’injection (innocuité). Ces études consistent à injecter, en une seule fois, par voie sous cutanée ou intradermique, plusieurs composés sous forme d’hydrogel à potentiel régénérateur de collagène, sur des sites différents d’un même animal, dans le but d’évaluer la réponse induite par la stimulation sur la peau. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse, des prélèvements post mortem de peau, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre la régénération tissulaire dans le temps et de comparer la stimulation induite par différents composés ou formulations (augmentation du collagène, élastine et autres protéines de la matrice extracellulaire). Des prélèvements sanguins longitudinaux seront également possibles pour suivre certains biomarqueurs de l’activité tissulaire. La production de collagène supplémentaire est étudiable chez l’animal sain, et ces études seront donc réalisées sur animaux sains, en amont d’éventuelles études sur animaux présentant des anomalies cutanées comparables à celles observées chez les patients. Cela permettra donc de cribler au mieux plusieurs composés avec le minimum d’impact sur le bien-être animal, avant d’envisager des études plus impactantes pour le bien-être animal.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles formulations et composés pour une utilisation dont l’innocuité et l’efficacité doivent être testées avant des essais cliniques. Les expériences menées chez le rat, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettront l’introduction en clinique de nouvelles stratégies pour la régénération tissulaire cutanée dans le cadre des lipoatrophies. Un bénéfice supplémentaire sera de sélectionner un nombre réduit de composés candidats qui seront testés sur des modèles pathologiques plus complexes.

Procédures

Les animaux (rats) seront exposés à des composés multiples. Les zones à injecter seront rasées (manipulation de 5 minutes) ce qui pourrait créer une légère rougeur transitoire. Les animaux recevront le même jour et une seule fois dans toute la procédure, plusieurs injections successives en sous-cutané ou intradermique de produits non dispersibles sur des sites différents localisés sur le dos de l’animal (maximum 6 sites = 6 injections pour le rat) en respectant le volume d’administration maximum recommandé par la SBEA sur une journée (ex : rat en sous cutané). Pour les traitements multiples et pour les intradermiques une administration préalable d’un analgésique opiacé en sous cutané sera réalisée (30 min avant) et l’administration des composés sera ensuite réalisée sous anesthésie à l’isoflurane. Les traitements seront administrés sous anesthésie d’un total d’enviton 30 minutes. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 1 fois par semaine (manipulation de 5 minutes). Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone (par ex. irritation, pétéchie, œdème, érythème…), effets cependant extrêmement peu probables, et l’état général des animaux sera vérifié. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible (manipulation de 5 minutes sans anesthésie ou anesthésie d’un total de 30 minutes). En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront être effectués après mise à mort.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, aucun effet sur l’évolution du poids des animaux n’est attendu. Les animaux seront rasés au niveau des sites d’injection. Une rougeur pourra être présente juste après le rasage. Les animaux recevront plusieurs traitements en une seul occurrence sur des sites différents . Des douleurs transitoires aux différents sites d’injection peuvent être observés, nécessitant administration d’un analgésique. Nous n’attendons pas d’effets nuisibles au site d’injection, cependant nous surveillerons l’apparition éventuelle de signes d’irritation de la peau, de lésions cutanées, pétéchies, d’érythèmes, nécroses cutanées, d’œdèmes ou toute autre altération macroscopique de la peau. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés principalement pour des mesures de poids qui pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible. Le jour de la formation des groupes, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress modéré de 1-2 jours. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible.

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre la récupération de différents échantillons biologiques d’intérêt (notamment peau).

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de régénération tissulaire et sont utilisés pour pré-sélectionner les composés les plus intéressants. Ces études sont réalisées en amont dans nos laboratoires. Cependant, aucune ne reproduit la complexité observée in vivo, et les meilleurs composés sélectionnés in vitro doivent être évalués in vivo. En effet, il est possible de travailler dans un premier temps avec des modèles 3D de peau, des cultures de cellules de tissu adipeux et des échantillons de peau humaine mais ceux-ci présentent plusieurs limites : - Toxicité des gels sur cellules isolées du fait de l’absence de matrice extra-cellulaire - Modèles incomplets ne récapitulant pas tous les effets (par exemple inflammation) - Origine de la peau : les échantillons proviennent de chirurgies de type abdominoplasties et présentent donc en général un derme hypertrophié et non hypotrophié (patients en surpoids) - Durée de vie des explants : les échantillons de peau ne peuvent survivre qu’environ 7-8 jours, ne permettant pas une évaluation sur le long terme De plus, s’agissant de dispositifs médicaux, des preuves d’innocuité et d’efficacité doivent être apportées aux autorités sanitaires avant essais cliniques et mise sur le marché. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal de la régénération tissulaire par biostimulation de composés chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé avant un passage en phase clinique chez l’Homme.

Réduction

Dans les études de ce projet, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux (en général de 6 à 8 animaux) selon le poids en début d’étude (randomisation). Grace à l’injection de plusieurs composés sur un même animal (maximum 6, sous forme de matrices hydrogel restant au niveau de l’emplacement d’injection sous-cutanée), le nombre d’animaux utilisé en est d’autant réduit. En pratique, le nombre d’animaux utilisés est divisé par 6 si on ne se limite pas à un produit par animal. Le nombre d’animaux nécessaire par groupe a été estimé sur la base de tests statistiques.

Raffinement

Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes (comportement, masque facial de douleur). Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les traitements simultanés sur plusieurs sites en sous-cutané ou intradermique sur un même animal sont réalisés sous anesthésie générale précédé d’une analgésie (30 minutes minimum avant). Pour l’administration intradermique, la zone sera préalablement stérilisée. La possibilité de réaliser les intradermiques par « microneedling » sera évaluée, afin de répartir le volume au niveau des sites d’injection ID . De l’enrichissement est utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie (nids, jouets en bois, niche). Des graines de tournesol pourront être utilisées comme enrichissement positif après la manipulation des animaux. Lorsqu’ils sont nécessaires, les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et aux recommandations de la SBEA. Toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après mise à mort de l’animal. En cas d’apparition de signes cliniques indésirables, les animaux seront observés quotidiennement et des mesures seront mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal.

Choix des espèces

Les études à l’aide des rongeurs, notamment les rats, sont utilisées pour l’exploration de la régénérescence tissulaire ou l’évaluation de l’efficacité de tout nouveau composé stimulateur de la régénérescence, qu’il soit d’origine chimique, issu de la biotechnologie ou naturel. La connaissance de la peau des rongeurs et de son organisation extracellulaire, conduit à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme et permet d’explorer de nouvelles pistes pour la médecine. Les animaux seront immunocompétents pour répondre à l’objectif du projet et se rapprocher le plus possible du phénomène de régénérescence tissulaire humaine. De plus, le rat en raison de sa taille, est l’espèce la plus adaptée à ce projet pour la co-implantation de plusieurs matrices simultanées (réduction). Les rats sont par ailleurs de loin l’espèce la plus utilisée dans la littérature pour ce type d’évaluation, permettant de comparer les données obtenues avec la littérature. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum lors de leur première manipulation). Des animaux adultes seront utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adultes et afin qu’ils présentent une peau et un système immunitaire matures.