Recherche appliquée

Deux à quatre injections dans les muscles des pattes arrière, pratiquées sur des rats dont les muscles sont déjà lésés par une dystrophie de Duchenne, avec un antalgique renouvelable toutes les douze heures pendant deux à trois jours. 52 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour analyses génétiques, histologiques et moléculaires. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable significatif n'est attendu" et que la méthode n'a montré ni toxicité ni effet secondaire. Le bénéfice visé, renforcer assez la force des bras et des doigts pour manipuler un fauteuil roulant, reste un objectif de long terme conditionné à la confirmation des résultats précliniques.

Objectifs

Les dystrophies musculaires constituent un groupe de maladies génétiques rares et graves pouvant affecter différents tissus, principalement le muscle squelettique. L’une des formes les plus sévères, la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), est causée par des anomalies du gène codant la dystrophine, une protéine essentielle au bon fonctionnement des fibres musculaires. En l’absence de cette protéine, les muscles s’affaiblissent progressivement, entraînant d’abord une perte de la capacité à marcher, puis des complications respiratoires et cardiaques. À ce jour, aucun traitement curatif n’est disponible, bien que plusieurs pistes thérapeutiques soient activement explorées. Certaines approches visent la réparation ciblée des mutations génétiques, afin de corriger le gène défectueux. Dans ce contexte, le système CRISPR-Cas9, souvent appelé « ciseaux moléculaires », offre une capacité puissante pour modifier l’ADN de manière précise, en supprimant ou insérant des fragments de séquence afin de corriger les mutations responsables. L’une des principales difficultés demeure la délivrance efficace et sûre de cet outil dans les cellules musculaires. Ce projet propose d’évaluer une méthode innovante d’administration du CRISPR-Cas9, reposant sur l’introduction directe et transitoire de la protéine Cas9 – ainsi que d’autres composants d’édition génétique – dans les cellules musculaires, de façon non toxique et sécurisée. L’objectif est de tester l’efficacité de cette approche chez un modèle animal présentant des symptômes et caractéristiques similaires à ceux des patients, afin de déterminer si cette méthode permet de restaurer la production de dystrophine à différents stades de la maladie. Le protocole inclura également l’évaluation de l’impact des administrations successives (deux injections) en comparaison avec une administration unique. Bien que ce type de thérapie ne constitue pas une guérison définitive, il peut être envisagé comme une option complémentaire aux traitements existants. L’objectif à long terme est de développer cette approche comme une thérapie permettant, par exemple, de renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes des fauteuils, améliorant ainsi l’autonomie quotidienne et la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à valider l’efficacité et la sécurité d’une méthode innovante d’administration des outils d’édition génique directement dans les cellules musculaires, dans un modèle de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). L’objectif principal est de démontrer que cette approche, appliquée à des muscles spécifiques, permet de restaurer la production de dystrophine et d’induire une amélioration de la force musculaire, contribuant ainsi à renforcer la fonction motrice. Un avantage majeur de cette méthode, selon les données préliminaires, est qu’elle n’active pas le système immunitaire, ce qui permet des administrations répétées pour renforcer l’effet thérapeutique sur un même muscle ou pour traiter différents muscles. De plus, la stratégie sera testée à différents stades de la maladie (précoce et avancé), afin d’évaluer son efficacité tout au long de l’évolution de la dystrophie. Cela ouvre la possibilité d’une application chez des patients d’âges variés, y compris ceux présentant une forme avancée de la maladie. En ciblant des muscles spécifiques plutôt qu’en diffusant le traitement de manière systémique, cette approche se positionne comme un traitement complémentaire, visant à améliorer l’autonomie et la qualité de vie des patients. À long terme, si les résultats précliniques se confirment, cette stratégie pourrait ouvrir la voie à des essais cliniques chez l’humain, avec l’objectif d’aider les patients à renforcer la force des bras pour manipuler les fauteuils roulants, ou celle des doigts pour saisir des objets et utiliser les commandes, facilitant ainsi les activités quotidiennes et l’indépendance. Ainsi, ce projet pourrait poser les bases d’une thérapie innovante et sûre, capable d’améliorer durablement la qualité de vie des patients et de leurs familles.

Procédures

Dans ce projet, le traitement sera administré par injection dans un muscle de chacune des pattes arrière, soit deux injections par animal, ou quatre dans le cas de doses répétées. Toutes les injections seront réalisées sur des animaux préalablement traités avec un médicament contre la douleur. Ce traitement pourra être répété toutes les 12 heures pendant deux à trois jours, uniquement si des signes de douleur sont observés. À la fin de la procédure, un prélèvement sanguin sera effectué sur des animaux complètement endormis (anesthésiés au moyen d’une injection). Ce prélèvement sera réalisé une seule fois pour chaque animal. Chaque injection sera effectuée en moins d’une minute, et le prélèvement sanguin en moins de trois minutes. Au total : - 36 animaux, chacun recevant 2 à 7 injections d’un médicament contre la douleur et 2 injections du traitement, une dans chaque patte. - 16 animaux, avec 3 à 13 injections d’un médicament contre la douleur et 4 injections avec le traitement, deux dans chaque patte.

Impact sur les animaux

Des études antérieures utilisant cette méthode ont montré l’absence d’effets toxiques ou secondaires liés à l’administration du traitement. Par conséquent, aucun effet indésirable significatif n’est attendu chez les animaux dans le cadre de ce projet. L’administration dans le muscle peut toutefois provoquer une légère gêne ou douleur, en particulier chez des animaux présentant déjà des lésions musculaires. Deux types des interventions seront réalisées : 1. L’administration d’un médicament anti-douleur, qui ne devrait pas entraîner de gêne notable. 2. L’administration du traitement dans un muscle de chaque patte arrière. Ces interventions peuvent provoquer une douleur locale transitoire. Ils seront effectués chez des animaux âgés de 4, 12 et 16 semaines, à un stade où les muscles sont peu (4 semaines) ou modérément (12 et 16 semaines) affectés, avec un impact très limité ou plus marqué respectivement, selon l’âge. Les animaux seront suivis jusqu’à un âge compris entre 3 et 6 mois, avant l’apparition des symptômes les plus graves de la maladie (vers 9 mois), afin de limiter autant que possible leur souffrance liée à l’évolution naturelle de la pathologie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les échantillons nécessaires aux analyses génétiques, histologiques et moléculaires.

Remplacement

La dystrophie musculaire de Duchenne touche plusieurs organes interconnectés (muscle, cœur, cerveau, tube digestif), mais le muscle squelettique est l’un des plus affectés. La méthode thérapeutique proposée est une approche innovante d’administration des outils d’édition génique dans les cellules musculaires, permettant de corriger de manière précise le gène défectueux responsable de cette maladie. Aucun produit n'est testé chez nos animaux sans qu’un mécanisme et un effet biologique robustes aient été préalablement établis. Avant les essais précliniques sur les animaux issus de nos lignées modèles, l’efficacité et la sécurité de cette thérapie ont été testées sur des cultures de cellules musculaires (in vitro), avec des résultats très encourageants : la méthode montre une forte efficacité pour modifier le gène défectueux, sans altérer la santé ni le fonctionnement normal des cellules. De plus, afin d’évaluer l’efficacité et la toxicité dans un organisme entier, cette stratégie a été testée in vivo sur un modèle animal de plus petite taille, confirmant que la méthode permet d’introduire efficacement les outils de réparation dans les fibres musculaires, sans toxicité, sans effets secondaires visibles et sans déclencher de réponse immunitaire chez les animaux traités. Le présent projet cherche à valider cette stratégie (en termes d’efficacité et d’innocuité) chez un organisme mammifère sévèrement atteint par la maladie, plus proche de la réalité humaine, et présentant des signes cliniques similaires à ceux observés chez les patients (perte musculaire, faiblesse et évolution progressive de la maladie), y compris dans la complexité de la réponse de l’organisme à l’administration du traitement.

Réduction

Lors des essais précliniques, le traitement de moins de 10 individus permet généralement d’obtenir des données suffisantes pour confirmer ou infirmer un effet majeur d’un candidat médicament sur l’évolution de la maladie. Des analyses statistiques ont été réalisées, permettant de réduire le nombre moyen d’animaux nécessaires pour répondre aux questions biologiques posées lors des expérimentations. Pour les objectifs de ce projet, nous avons mis en place des procédures pilotes et en cascade, permettant de n’utiliser que le nombre d’animaux strictement nécessaire selon la progression du projet. Le nombre d’animaux témoins pour les procédures pilotes a été réduit au minimum, tout en permettant que leurs données soient analysées et intégrées dans notre banque d’échantillons.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à des manipulations douces et régulières. Ils sont hébergés par groupes de deux ou plus, dans un environnement enrichi afin de prévenir l’ennui et le stress. Pour anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement, y compris les week-ends et jours fériés. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage, yeux), leur comportement (mobilité) et leur état général (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont mises en place : surveillance renforcée biquotidienne et administration de médicaments visant à atténuer ou supprimer la douleur. Dans le but de prévenir toute souffrance animale, des points limites ont été établis et feront l’objet d’un suivi rigoureux, avec application immédiate de procédures préétablies. Par ailleurs, pour réduire au maximum le stress lié aux manipulations ou aux tests, les animaux sont préhabitués et familiarisés avec l’expérimentateur 2 à 3 jours avant le début des procédures, afin d’éviter toute réaction de peur ou de stress lors des manipulations scientifiques.

Choix des espèces

Le rat est un mammifère appartenant à la même classe que l’être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle particulièrement apprécié pour la recherche biomédicale. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’homme, notamment la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Grâce aux outils génétiques récents, le rat est devenu un modèle de choix pour l’étude des troubles musculaires. Les modèles de rat reproduisent de manière très fidèle ce type de maladies humaines, tout en conservant les avantages des rongeurs : courte durée de gestation, taille raisonnable et longévité compatible avec l’évaluation à long terme des médicaments sur des individus âgés. Le rat constitue ainsi un excellent complément aux autres modèles animaux, permettant de mieux comprendre la physiopathologie et d’évaluer l’efficacité et la sécurité de nouvelles thérapies. Les animaux seront âgés de 1 et 3 mois au moment de la procédure, correspondant aux stades précoce et avancé de la maladie. Ces stades permettent d’explorer les muscles et d’évaluer l’effet de la thérapie à la fois fonctionnellement et morphologiquement, en tenant compte des différents degrés de progression pathologique.

Jusqu'à six injections par animal, des tests de suspension et d'agrippement répétés treize fois sur quatre mois, puis une chirurgie de vingt minutes sans réveil pour mesurer la contractilité du muscle : 1 008 souris porteuses d'une mutation myopathique vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyses moléculaires et histologiques des muscles injectés. Le projet vise à optimiser une thérapie génique que l'équipe dit avoir déjà validée dans le muscle, l'administration par voie sanguine ayant échoué lors des essais antérieurs. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de poursuivre dans ce modèle et que seule l'injection dans le sang permettra de vérifier l'effet à l'échelle d'un "organisme entier". La lignée fait l'objet d'une autorisation d'élevage pour phénotype dommageable, alors que le même document décrit des souris au comportement locomoteur, au poids, à la longévité et à la fertilité comparables à ceux des souris non modifiées.

Objectifs

Nous développons des approches thérapeutiques pour une maladie génétique rare du muscle, causée par des mutations dans un gène codant une protéine impliquée l’entrée et le transport de vésicules à l’intérieur de la cellule. Nous avons démontré que l'injection dans le muscle d’un virus thérapeutique exprimant une molécule ciblant la forme mutée de la protéine permet de restaurer la structure et la fonction du muscle dans un modèle murin de la maladie, lorsqu’elle est administrée à l’âge d’un mois. Cependant, le traitement est moins efficace chez les souris plus âgées qui présentent une atteinte musculaire plus prononcée. Par ailleurs, les essais d’administration systémique visant à traiter l’ensemble des muscles via la circulation sanguine se sont révélés inefficaces, même chez les souris âgées d’un mois. L’expression de la molécule thérapeutique dans la cellule par l’intermédiaire d’un vecteur viral est dépendante de son entrée dans la cellule et de son transport jusqu’au noyau. Nos travaux antérieurs ont montré que le vecteur est moins bien acheminé chez les souris malades et que ce phénomène s’empire avec la progression de la maladie. Ainsi la pathologie elle-même, semble compromettre l’efficacité de l’administration du traitement. L’objectif de ce projet est d’évaluer des stratégies thérapeutiques alternatives permettant d’acheminer efficacement la molécule de thérapie génique, notamment à travers l’utilisation de différentes combinaisons de vecteurs viraux ou non viraux.

Bénéfices attendus

Il s’agit d’une maladie neuromusculaire rare et invalidante (prévalence estimée inférieure à 1 pour 100 000 naissances), pour laquelle aucun traitement curatif n’est actuellement disponible. La faiblesse musculaire progressive entraîne une perte d’autonomie, altérant significativement la qualité de vie des patients et nécessitant une prise en charge pluridisciplinaire. La réussite de ce projet représentera une avancée cruciale dans l’évaluation préclinique de notre molécule et permettra d’envisager le développement de traitements qui, à ce jour, n’existent pas pour les patients atteints de cette maladie. Par ailleurs, ce travail enrichira notre compréhension des différentes voies d’administration (virale et non virale) de thérapies géniques dans un contexte où la transduction virale est altérée. Les stratégies optimisées et les données générées pourront être extrapolées à d’autres pathologies caractérisées par des défauts similaires de délivrance du vecteur, ouvrant ainsi de nouvelles perspectives thérapeutiques

Procédures

Toutes les souris participant à cette étude recevront une thérapie via différentes voies d’injections (entre 1 à 6 injections maximum par souris selon le protocole suivi) réparties sur plusieurs semaines. Suivant la voie, les animaux seront vigiles ou anesthésiés. L’acte technique dure 2 minutes maximum et sera répété 6 fois maximum. Afin d’évaluer la force musculaire des animaux et donc l’efficacité des thérapies testées, certains animaux suivront des tests de force non invasifs (capacité à s’agripper ou à se suspendre). Les animaux seront vigiles lors de ces tests, chaque test pourra durer 5 minutes maximum et ils seront répétés 13 fois maximum sur 4 mois. Tous les animaux auront une chirurgie en phase terminale sans réveil afin de tester la contractilité musculaire. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie et durera 20 minutes. Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

La lignée de souris présente un phénotype dommageable. Les souris hétérozygotes développent progressivement une atrophie et une faiblesse musculaire (mais sur certain muscle uniquement et après mesure spécifique de la force). Elles n’ont pas d’autre signe clinique, et présentent un comportement locomoteur, un poids, une longévité et une fertilité comparables à ceux des souris non génétiquement altérées. Les manipulations nécessaires aux différentes procédures peuvent provoquer un léger stress chez l’animal. Les différentes injections dureront quelques minutes et sont susceptibles d’occasionner une douleur au moment de l’injection et, secondairement, un saignement et/ou hématome, une inflammation locale et rarement une infection. Les administrations répétées comportent un faible risque de péritonite. L’anesthésie gazeuse utilisée peut entraîner une perturbation de la thermorégulation et, dans de rares cas, une détresse cardio respiratoire. Les tests comportementaux de 5 minutes maximum pourront engendrer de la fatigue musculaire. Enfin, une chirurgie sans réveil sera effectuée sur certains animaux, l'anesthésie pourra engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de protocole selon la réglementation en vigueur pour études moléculaires et analyses histologiques des muscles injectés.

Remplacement

L’efficacité et l’absence de toxicité de notre approche thérapeutique ont été démontrées au préalable sur des cellules de patients en culture. La validité du modèle de souris de la maladie est reconnue par les experts du domaine et par plusieurs publications dans des articles à comité de lecture ainsi que par des présentations lors de congrès internationaux. Nous avons préalablement démontré l’efficacité et l’innocuité de l’approche dans le muscle de souris du modèle en utilisant un vecteur de type virus thérapeutique. Le but de ce projet est l’optimisation de cette thérapie dans le modèle de souris en testant différent véhicule pour délivrer le médicament dans tout l’organisme. Il est indispensable pour le développement préclinique de la molécule de poursuivre l’étude dans ce modèle. Seule l’administration du traitement dans le système sanguin permettra de vérifier son efficacité et sa potentielle toxicité à l’échelle d’un organisme entier.

Réduction

Le nombre maximal théorique de souris impliquées si toutes les procédures sont réalisées est de 1008. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et nos études précédentes afin de nous permettre d’évaluer de façon correcte les paramètres observés. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. La réalisation des procédures et des étapes à l’intérieur des procédures seront réalisées de manière successive et adaptative, dans un ordre permettant de limiter le nombre d’animaux en fonction des résultats positifs ou négatifs. Les organes et tissus de souris issus de ce projet seront conservés en banque pour d’autres projets de l’équipe, évitant ainsi de nouveau prélèvements. Grâce à ces mesures de réduction, nous limitons au strict nécessaire le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant la validité statistique et scientifique de chaque protocole.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Un enrichissement de leur environnement est mis place avec au moins 2 éléments aux choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. L’entretien des animaux ainsi que les expériences seront réalisés par un personnel titulaire des autorisations et formations nécessaires. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse pour éviter toute douleur ou gêne, elles durent moins d’une minute par souris. Une analgésie sera pratiquée avant certaines injections pour éviter toute gêne. L’anesthésie gazeuse est réalisée en maintenant la thermorégulation en utilisant un tapis chauffant. Les jours suivants les injections une surveillance renforcée des souris sera exercée par l’animalier en charge de la lignée ou les personnes en charge des protocoles. Les mesures de forces sont non invasives et seront réalisés entre 1 et 13 fois maximum par souris afin de limiter un stress répété. Les mesures de forces en fin de projet seront réalisées sous anesthésie et analgésie et sans réveil. Les animaux ne développent habituellement pas de phénotype conduisant à une diminution de leur locomotion mais le cas échéant, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage pour améliorer la prise alimentaire. La lignée fait l’objet d’une autorisation d’élevage pour phénotype dommageable. Dans toutes les procédures, des modifications importantes de comportement laissant supposer une douleur excessive (retrait ou vocalisation excessive à la manipulation, prostration ou agitation anormale) seront considérées comme points limites et critères d’arrêt en cours d’expérimentation et conduira à l’euthanasie des animaux concernés.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé est le plus adapté pour développer et tester notre traitement, car la molécule étudiée cible précisément la mutation génétique présente chez ces animaux. Il s’agit du plus petit modèle de mammifère reproduisant cette myopathie, reconnu par les experts du domaine et largement utilisé dans des études publiées et présentées lors de congrès internationaux. Nous avons déjà montré que le vecteur viral thérapeutique que nous utilisons est sûr et efficace dans le muscle de ces souris. Il est donc indispensable, à ce stade du développement préclinique, de poursuivre les tests dans ce modèle afin d’optimiser l’efficacité du traitement et de vérifier l’absence d’effets indésirables sur l’ensemble de l’organisme, après une injection dans le sang. Les souris de ce modèle développent progressivement des symptômes musculaires à partir d’un mois, qui s’aggravent jusqu’à environ huit mois. Cependant, leur déplacement, leur fertilité et leur durée de vie restent normaux. Nos travaux précédents ont montré qu’entre un et deux mois, un défaut apparaît dans le transport du vecteur thérapeutique à l’intérieur des cellules, et que ce défaut s’accentue avec la progression de la maladie. Les procédures seront réalisées sur des souris adultes âgées de 1 à 6,5 mois. Les souris âgées d’un mois serviront à évaluer la capacité de nos approches à améliorer la diffusion du traitement dans tout l’organisme, tandis que celles de trois mois, présentant des signes intermédiaires de la maladie, permettront de mesurer l’efficacité du traitement pour stopper ou inverser son évolution.

Les souris sont rendues anxieuses par un isolement social chronique et par un régime hyperlipidique, que le porteur présente comme un modèle de pathologie psychiatrique. 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique d'une heure et demie pour implanter des fibres optiques dans le cerveau, parfois doublée de la pose d'une pompe sous-cutanée, puis une privation alimentaire les maintenant à 90 % de leur poids pour les tâches de conditionnement opérant. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques, une perte de poids supérieure à 20 % déclenchant une mise à mort immédiate.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées.

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (800).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (800) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Des souriceaux reçoivent sept instillations nasales d'allergènes sous sédation à l'isoflurane, geste dont le porteur admet le risque de fausse route et d'étouffement, certains subissant en plus quatorze injections intrapéritonéales. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La mesure finale des paramètres respiratoires passe par une trachéotomie sous anesthésie, sans que les animaux soient réveillés, avant prélèvement des organes. Le porteur annonce que le modèle d'asthme pédiatrique n'entraîne aucune nuisance particulière et que sa symptomatologie est "sans conséquence sur le bien-être animal", tout en déclarant les 288 souriceaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La mise en place du remodelage du muscle lisse bronchique (MLB) dans l’asthme pédiatrique sont méconnus. Pourtant, l’augmentation de la taille du MLB chez les enfants asthmatiques est associé à la sévérité de la maladie. Nos travaux, réalisés in vitro à partir de cellules MLB de patients enfants asthmatiques, nous ont permis d’identifier le rôle clé du métabolisme énergétique dans l’hyperprolifération de ces cellules. Nos travaux chez l’homme ne permettent pas d’analyser complètement les mécanismes de prolifération des cellules MLB in vivo. Afin d’étudier le rôle du MLB dans l’asthme pédiatrique, nous souhaitons utiliser un modèle murin d’asthme. Ce modèle est particulièrement pertinent, car il permet de combiner l’exposition de deux aérocontaminants impliqués dans la sévérité de la maladie chez l’Homme. Les objectifs du projet sont donc les suivants : 1) Mettre en place un modèle d’asthme pédiatrique qui permettra d’évaluer le remodelage du MLB in vivo. 2) Interférer avec le développement du MLB en traitant les animaux avec des molécules d’intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’étudier in vivo les mécanismes de mise en place du remodelage du MLB. L’équipe de recherche travaille déjà in vitro en utilisant des cellules de patients pédiatriques asthmatiques mais l’asthme est une maladie mettant en jeu différents types cellulaires (cellules épithéliales, cellules MLB et cellules inflammatoires) qui ne peuvent à ce jour pas être étudier in vitro. Le modèle murin apparaît donc comme indispensable à la compréhension des mécanismes cellulaires. Le projet permettra également de tester des molécules d’intérêts thérapeutiques, mis en évidence sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques et de tester leur efficacité in vivo sur le remodelage du MLB.

Procédures

Les animaux seront soumis à des instillations nasales (IN) sous sédation à l’isoflurane (7 IN d’une durée de moins de 2 minutes) et certains animaux à des injections intrapéritonéales (IP) (14 IP). Pour les mesures terminales de mesure des paramètres respiratoires, ces expérimentations seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés. Il n’y a pas de réveil après les mesures des paramètres respiratoires qui durent environ dix minutes.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. En revanche, nous ne nous attendons pas à observer de nuisance particulière liée à la création du modèle d’asthme pédiatrique. La collaboration scientifique menée à Gent a permis de montrer qu’il n’y a pas de mortalité suite à ce protocole ni de modification du comportement ni stress ou perte de poids, il n’y a donc pas d’incidence sur le bien-être animal. Les allergènes utilisés dans le cadre du protocole ne sont pas des molécules toxiques pour l’animal, elles permettent uniquement de développer la maladie asthmatique dont la symptomatologie est sans conséquence sur le bien-être animal.

Devenir

A la fin du protocole d’asthme, chaque animal sera utilisé pour analyser la fonction respiratoire, l’inflammation et le remodelage du MLB. Une fois mis à mort, les organes d’intérêt seront également prélevés ex vivo pour des analyses notamment d’immunofluorescence.

Remplacement

L’asthme est une maladie complexe mettant en jeu différents types cellulaires qui ne peuvent pas être étudiés in vitro. Le modèle murin d’asthme pédiatrique permettra d’élucider les mécanismes complexes conduisant au remodelage du MLB. Parallèlement à ce protocole in vivo, des études in vitro sur les cellules de patients pédiatriques asthmatiques pourront être réalisées afin de valider les observations réalisées chez les animaux.

Réduction

Chaque protocole nécessite la comparaison de plusieurs paramètres de la fonction respiratoire et ce entre différents groupes de souriceaux exposées à différents traitements. Notre but est de réduire au maximum le nombre d’animaux par expérience tout en conservant la significativité des résultats. Chaque groupe de souris doit être composé de 12 souriceaux minimums afin de mettre en évidence une différence significative entre les groupes sur les différents paramètres analysés notamment la résistance bronchique. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Les expériences seront répétées trois fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de s’assurer d’un éventuel effet bénéfique d’une molécule thérapeutique. De plus, se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, après la mise à mort, nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes.

Raffinement

Un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, la prise de poids et le comportement des animaux. Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Afin d’éviter toute souffrance, les animaux seront anesthésiés et analgésiés si nécessaire en fonction de l’évaluation de l’état des animaux par rapport aux points limites. Nous avons identifié 3 nuisances attendues potentielles : 1) Les souriceaux seront manipulés très jeunes, il y a donc un risque de rejet après manipulation des animaux par les mères. Pour éviter cela, on limitera au maximum le nombre d’expérimentateur au cours du protocole et ils veilleront à toucher la sciure de la cage avant manipulation des animaux. 2) L’administration de molécule liquide en instillation nasale chez les souriceaux pourraient conduire à une fausse route / étouffement. Pour éviter cela, l’administration des molécules sera réalisée sous sédation à l’isoflurane avec un volume d’injection réduit au maximum. Le choix d’un volume minimal associé à la bonne gestion de la profondeur de l’anesthésie gazeuse permettra de réduire considérablement un éventuel risque de fausse route. 3) Le refroidissement des animaux pendant les manipulations d’instillation nasale et injection intrapéritonéale. Pour éviter cela, l’expérimentateur placera la boite d’induction d’isoflurane sous un tapis chauffant pour maintenir les animaux à la bonne température. De plus, le procédé est très cours, moins de 2 minutes avec l’induction de l’anesthésie gazeuse comprise. Les souriceaux seront surveillés par des expérimentateurs qui ont l’habitude des protocoles murins d’asthme jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus classiquement utilisée pour l’étude de l’asthme. L’asthme est une maladie touchant différents composants, qui interagissent de façon étroite, tels que le muscle lisse bronchique, l’épithélium bronchique et les cellules inflammatoires. Il n’existe pour l’instant pas de système in vitro permettant de faire coexister ces différents types cellulaires. Par ailleurs, nos travaux chez l’homme montrent une augmentation de la prolifération des cellules musculaires lisses bronchique chez les patients enfants asthmatiques. Grâce à un modèle de souris pédiatrique asthmatique et l’utilisation de molécules thérapeutiques, nous pouvons envisager une meilleure compréhension des phénomènes qui permettent le remodelage du MLB. De plus, le stade de maturation pulmonaire des souriceaux correspond à la catégorie asthme de l’enfant pré-solaire. Au total, le modèle murin apparaît donc comme un modèle indispensable pour évaluer les mécanismes du remodelage du MLB dans l’asthme pédiatrique et pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

À dix semaines de vie, le ménisque médial du genou droit est déstabilisé par une chirurgie d'un quart d'heure pour déclencher une arthrose. À douze semaines suivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, cinq jours de suite, sur 2 004 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'arthrose qui s'installe peut faire souffrir les animaux, les conduire à la prostration, à s'isoler de leurs congénères et à cesser le toilettage social, et les injections de tamoxifène peuvent provoquer une péritonite. Toutes sont ensuite tuées pour prélever le sang, la colonne vertébrale, les pattes, la trachée, les poumons et l'aorte.

Objectifs

L’arthrose, la plus répandue des maladies rhumatismales, impacte plus de 500 millions de personnes dans le monde. A ce jour, il n’existe pas de traitements qui permettent de soigner ou ralentir la maladie, les traitements disponibles sont uniquement palliatifs. Notre projet s’intéresse particulièrement aux mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la dégradation du cartilage articulaire lors de l’arthrose. L’une des étapes clé de cette dégradation correspond à une augmentation anormale du volume (i.e. hypertrophie) des cellules du cartilage (chondrocytes). A un stade plus avancé de la maladie, une invasion pathologique du cartilage articulaire par des vaisseaux sanguins nouvellement formés se met en place, via un mécanisme nommé « angiogenèse ». Cette invasion vasculaire accélère fortement la dégradation du cartilage. Nous proposons l’hypothèse que les chondrocytes hypertrophiques, joueraient un rôle fondamental dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Nos premiers résultats indiquent qu’une protéine ligand est spécifiquement produite par les chondrocytes hypertrophiques et que l’interaction avec son récepteur, présent à la surface des cellules endothéliales vasculaire, favorise l’angiogenèse. C’est dans ce contexte, que notre projet, se propose, pour la toute première fois, de documenter le rôle de l’interaction entre cette protéine ligand et son récepteur dans l’invasion vasculaire du cartilage arthrosique. Pour ce faire, nous utiliserons une lignée de souris génétiquement modifiées, permettant à la fois d’induire une invalidation du gène codant pour le récepteur spécifiquement au niveau des cellules endothéliales vasculaires mais aussi de visualiser cette population cellulaire grâce à une protéine fluorescente. Une arthrose sera induite chirurgicalement chez ces souris et l’invasion vasculaire du cartilage articulaire sera suivie au cours du temps. Par la suite, ces expérimentations nous permettrons de définir le moment idéal pour mettre en place des stratégies thérapeutiques anti-arthrose qui ciblent spécifiquement l’interaction entre la protéine d’intérêt et son récepteur.

Bénéfices attendus

Notre projet comporte plusieurs bénéfices attendus. Dans un premier temps, notre projet va permettre d’approfondir, de manière générale, les connaissances de la communauté scientifique sur les mécanismes cellulaires/moléculaires impliqués dans l’apparition de l’arthrose et plus précisément, sur le rôle que tiennent les chondrocytes hypertrophiques dans le développement de cette maladie. Ce projet comporte également une partie dédiée à évaluer des modes d’administrations du traitement moins invasif et stressant pour les souris, ce qui permettra, in fine, une amélioration et un raffinement de ce protocole, dans un souci de respecter les 3Rs de l’expérimentation animale. Enfin, il faut prendre en compte que l’arthrose est une maladie chronique douloureuse et extrêmement répandue au sein de la population (40% des personnes de plus de 70 ans développe de l’arthrose), qui, de fait, exerce une pression importante sur le milieu médical. De manière connexe, l’arthrose de la hanche et du genou représentent des poids financiers conséquents pour les pays européens, en effet, ils sont estimés entre 408-817 milliards d’euros et 350-700 milliards d'euros/an respectivement. Ainsi, au travers de l’étude de nouvelles cibles thérapeutiques, notre projet s’inscrit dans une démarche visant à améliorer la qualité de vie des patients (amélioration de la mobilité et de l’autonomie des patients, diminution des douleurs chroniques et de comorbidités associées) et à réduire les coûts socio-économiques (limitation de dépenses liées aux arrêts de travail prolongés et aux interventions) exercées par l’arthrose sur notre société.

Procédures

A l’âge de 10 semaines de vie post-natale, les animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d’un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs de l’articulation) du genou droit. Les animaux âgés de 12 semaines recevront des injections quotidiennes du composé d’intérêt de quelques secondes sur une période de 5 jours. Un site différent sera choisi pour chaque injection afin de limiter les risques d’irritation pour l’animal.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose post-traumatique, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le cas du modèle chirurgical DMM, une douleur pourrait être causée par une dilacération du tissu cutané supplémentaire, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant les chirurgies. De plus, une infection pourrait survenir au niveau des sutures post-chirurgicales. Les injections intrapéritonéales, bien que ne durant que quelques secondes, peuvent entraîner une irritation au niveau du site d’injection. De même, les injections de tamoxifène et plus généralement la technique d’injection intrapéritonéale en elle-même peuvent entrainer des nuisances chez l’animal : stress/anxiété, perte d’appétit, inflammation du péritoine (péritonite), injection mal placée conduisant à l’accumulation du produit au niveau d’un site non ciblé (i.e. organes présents dans le péritoine) avec conséquences multiples.

Devenir

L’ensemble des animaux de ce projet seront utilisés afin de réaliser des prélèvements multi-organes post-mortem. Ces prélèvements sont indispensables pour la validation de notre modèle murin génétiquement modifié et pour mener à bien notre étude visant à déterminer l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques contre le développement de l’arthrose.

Remplacement

Des modèles in vitro/ex vivo permettent d’étudier la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et sont utilisés en amont de la présente étude pour remplacer au maximum le recours aux expérimentations animales. Ces modèles impliquent l’utilisation de cellules endothéliales d’origine humaine pour des tests de formation de tubes ou de migration cellulaires. Lors de ces tests il est possible de faire varier plusieurs paramètres et d’évaluer l’effet de communications cellulaires d’intérêt. Cependant l’utilisation de ces modèles reste limitée par le fait que les cellules endothéliales nécessitent un milieu de culture spécifique, peu compatible avec de nombreux autres types cellulaires. Or, dans le cadre de l’arthrose, l’environnement articulaire se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial trop complexes à prendre en compte dans la mise en place de modèles in vitro ou informatiques, ni même dans un modèle d’animal invertébré. D’autre part, l’arthrose est une pathologie aux causes et conséquences multiples difficilement reproductibles dans un système in vitro non intégré. C’est pourquoi, aujourd’hui, aucun autre modèle substituable aux modèles animaux ne nous permet d’évaluer les processus impliqués dans le développement de l’arthrose ni l’intérêt de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles.

Réduction

Dans le cadre du respect des 3Rs en éthique animale, le nombre d’animaux utilisés dans les procédures a été réduit au strict minimum. Pour ce projet scientifique, les nombres de 9 et 35 animaux de chaque sexe par groupe ont été calculés par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative. Pour l’analyse des résultats, le test statistique le plus adapté sera utilisé pour pouvoir comparer toutes les conditions. Il est également important de souligner que chaque souris fera l’objet de prélèvements multi-organes (prélèvement de sang, colonne vertébrale, pattes avant et arrières, trachée et poumons, artère aorte). Cette approche présente l’avantage de rassembler une collection d’échantillons suffisante sur un nombre restreint d’animaux. Enfin, notre projet comprend l’utilisation de techniques d’analyses très haut débit qui permettent de générer un grand nombre de données pertinentes scientifiques à partir d’un faible nombre d’échantillons.

Raffinement

Pour le protocole d’induction de l’arthrose, une analgésie est assurée avant et après l’opération. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’écarter tout risque d’hypothermie. Les souris seront ensuite transférées dans une cage de réveil également disposée sur tapis chauffant le temps de récupérer. Après 6h et 24h post-chirurgie, un traitement antalgique est administré aux animaux dans un souci de raffiner la prise en charge de la douleur ressentie par ces derniers. Les animaux sont observés quotidiennement pendant les 3 premiers jours post chirurgie puis 2 fois par semaine. Deux semaines post-DMM, les souris seront à nouveau observées quotidiennement le temps des injections puis 2 fois par semaine. Des grilles de points limites ont été définies pour chacune des procédures et permettront une gestion de la douleur adaptée selon le nombre et la sévérité des signes cliniques observés.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle animal dans ce projet est fondé sur plusieurs critères. La souris est tout d’abord un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Notre projet est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés qui permettent des études précises et pertinentes dans les tissus squelettiques d’intérêt pour la recherche thérapeutique sur l’arthrose. Ces lignées de souris génétiquement modifiées sont déjà développées et disponibles. Le modèle de souris d’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médian est le plus décrit dans la littérature et fait ainsi office de référence pour l’étude de cette pathologie. Le choix de l’espèce souris s’explique également par la nécessité de travailler sur des animaux arrivés à maturité squelettique. Les animaux inclus dans cette étude seront à maturité squelettique et âgés de 10 à 22 semaines. La procédure chirurgicale sera réalisée à 10 semaines de vie, il s’agit du stade de développement consensus dans la littérature pour l’induction de l’arthrose post-traumatique par déstabilisation du ménisque médial

Hébergés seuls quarante-six heures en cage à métabolisme et nourris pendant vingt et un ou cent jours d'un régime dont seule la forme du fer change, 400 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements du côlon. 240 d'entre eux reçoivent en plus une injection intrapéritonéale d'azoxyméthane, un cancérogène, pour déclencher les premiers stades d'un cancer colorectal. L'objet réel est d'évaluer si un substitut végétal de viande riche en fer, dont la mise sur le marché européen est envisagée à court terme, produit les mêmes effets sur le côlon que la charcuterie. Le porteur écrit que les régimes n'ont pas d'effet attendu sur le bien-être des rats et que la formation des phases précoces du cancer du côlon n'induit aucune douleur, tout en déclarant les 400 animaux au niveau de souffrance modéré.

Objectifs

La consommation excessive de viande rouge et de charcuteries est associée chez l’Homme à une perturbation du fonctionnement de l’intestin, et à un risque augmenté de développer un cancer du côlon. Des études scientifiques ont permis de démontrer que ces impacts sont liés au fer présent dans les viandes. Ainsi, ce fer va pendant la digestion arriver au niveau du côlon et favoriser la formation de molécules toxiques. Les recommandations nutritionnelles actuelles sont donc de limiter la consommation de produits carnés riches en fer. Dans ce contexte, plusieurs produits alternatifs à la viande sont proposés aux consommateurs. Plus précisément, certaines de ces alternatives misent sur la ressemblance parfaite avec les produits carnés en utilisant une forme de fer végétale proche de celle apportée par les viandes afin de provoquer une couleur et un goût similaires aux viandes. La mise sur le marché d’une alternative à base de ce fer d’origine végétale est envisagée à court terme en Europe. Au regard de sa proximité avec le fer des viandes, se pose donc la question de savoir si ce produit destiné à végétaliser davantage nos régimes est susceptible d’engendrer des effets néfastes sur le côlon et le cancer du côlon. En termes de santé publique, l’objectif de cette étude est d’évaluer si un apport en fer d’origine végétale risque ou non d’induire les mêmes effets délétères sur le côlon qu’un apport en fer d’origine animale. Étant donné que chez l’Homme, aucune étude interventionnelle n’est envisageable, une évaluation pré-clinique chez le rat identique à ce qui a été mis en place par le passé pour alerter les politiques publiques sur la consommation des viandes rouges et le risque de carcinogénèse colorectale est proposée.

Bénéfices attendus

À l’issue du projet, nous serons en mesure de savoir si le fer d’origine végétale peut engendrer ou non la formation dans le côlon de produits toxiques en comparaison avec d’autres formes de fer d’origine animale. Ainsi, ces études permettront de (i) évaluer le risque de pathologies associées à la consommation humaine de ces substituts, et en conséquence, selon les résultats obtenus (ii) alerter les pouvoirs publics, pour qu’ils puissent à terme proposer des messages de recommandation nutritionnelle adaptés spécifiquement à ces substituts riches en fer végétal.

Procédures

400 rats recevront un régime expérimental dont seule la nature du fer sera modifiée selon le groupe expérimental pendant 21 jours pour 160 d’entre eux, et pendant 100 jours pour les 240 autres. Ces 400 rats seront hébergés individuellement une fois pendant 46 heures en cage à métabolisme après avoir été habitués 3 heures en amont. Parmi eux, les 240 rats exposés 100 jours aux régimes expérimentaux recevront en amont une injection intrapéritonéale d’azoxyméthane d'une durée de moins d'une minute, le temps de la préhension et l'injection, pour induire les premiers stades non douloureux du cancer du côlon.

Impact sur les animaux

Les régimes n’ont pas d’effet attendu sur le bien-être ou la croissance des rats. L’hébergement en cage individuelle d’une journée peut générer un stress transitoire mais il disparait dès le retour en hébergement conventionnel. Hormis les stress attendus lors de l’injection, seule une légère douleur passagère peut se produire au site d’injection en raison du produit injecté. La formation progressive des phases précoces du cancer du côlon pendant cette étude n’induit aucune douleur.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les rats seront mis à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques et biochimiques ultérieures destinées à caractériser l’effet des régimes administrés sur la muqueuse colique, et engendrant éventuellement des perturbations de l’homéostasie des tissus environnants ou d’organes plus distants.

Remplacement

Bien que nous menions des études in vitro, aucun des modèles de cellule du côlon en culture ne permet d’évaluer l’ensemble des répercussions induites par un régime riche en produits carnés au niveau du côlon. En effet, outre la formation de composés toxiques, la consommation de fer des produits carnés va fortement modifier l’ensemble des composantes du côlon. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité du côlon et de l’impact de l’alimentation sur cet organe.

Réduction

Les études antérieures associées à ce projet ont permis d’améliorer les procédures sur le plan technique et du bien-être de l’animal, contribuant ainsi à minimiser le nombre d’animaux nécessaires pour mettre en évidence l’effet des régimes chez le rat. De plus, afin d’assurer la fiabilité des résultats, les études et analyses des échantillons issus de l’étude seront conduites en aveugle. La reproductibilité sera assurée par une répétition indépendante des études. Le traitement des données sera réalisé grâce à des tests statistiques appropriés permettant d'exploiter au maximum l'ensemble des données générées.

Raffinement

Le nombre et la durée d’hébergement individuel en cage individuelle seront limités au minimum nécessaire (46h) pour obtenir les quantités suffisantes d’urines et de fèces. Des phases d’habituation à ce type d’hébergement ont été mises en place afin de minimiser le stress. Quel que soit le type de cages, elles seront transparentes, alignées pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Lors de l’injection pour induire les premiers stades du cancer du côlon, l’acidité de la solution sera corrigée pour éviter une douleur au moment de l’injection, une habituation au geste de la piqure sera réalisée les jours précédents. Une observation des rats à l’occasion notamment de la distribution quotidienne des régimes permettra, grâce à l’utilisation de fiches individuelles de suivi, de détecter à temps toute anomalie éventuelle. Enfin, toutes les mesures susceptibles de réduire la douleur sans affecter l’objectif scientifique seront mises en application.

Choix des espèces

Depuis les années 80, l’étude de la relation entre l’alimentation et le cancer est basée sur les études chez l’Homme mais aussi des approches qui reposent sur les modèles animaux. Le modèle le plus approprié à notre étude est le rat qui a l’avantage de présenter un développement de la maladie comparable à celui chez l’Homme. De plus, ce modèle chez le rat permet d’obtenir des résultats fiables dès les stades précoces du cancer, sans qu’il soit nécessaire de poursuivre l’étude aux stades avancées de la maladie (tumeur, métastases), qui sont des stades davantage susceptibles d’engendrer des dommages et des douleurs. Les études se feront sur des rats adultes de 5 à 6 semaines à leur arrivée. À cet âge, le système digestif est suffisamment mature et fonctionnel et la composition du microbiote bien stabilisée. Afin de se placer dans les conditions pour lesquelles le modèle est maîtrisé au laboratoire, il est important de rester au même stade de développement.