Recherche appliquée

Toutes tuées en fin de procédure pour des analyses post-mortem, 205 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, puis pour certaines des injections deux fois par semaine pendant quatre semaines, toujours sur animal vigile. Un second groupe est irradié trois minutes sous contention avant de recevoir des cellules par voie intraveineuse, puis des cellules tumorales six semaines plus tard et deux prises de sang. Le porteur reconnaît que l'irradiation peut dégrader l'état général des animaux et que des nécroses peuvent apparaître sur les tumeurs, et conclut que le recours aux souris reste "indispensable" malgré les méthodes alternatives auxquelles son laboratoire a eu recours.

Objectifs

Notre système immunitaire est capable de détecter la présence d’un élément étranger dans notre organisme et de déclencher une réponse immunitaire efficace afin d’éliminer ce pathogène. La réponse immunitaire résulte de l’action combinée des cellules de l’immunité innée comme les cellules dendritiques dont la mission est de patrouiller dans l’organisme à la recherche de cellules infectées ou tumorales, et des cellules de l’immunité adaptative comme les lymphocytes B et T qui reconnaissent de manière spécifique les pathogènes. Le contrôle de la réponse immunitaire est un mécanisme très important pour empêcher par exemple une suractivation des lymphocytes pouvant aboutir à la destruction des cellules saines de l’organisme. Pour cela, les lymphocytes sont équipés de récepteurs dits de contrôle (checkpoint). L’engagement de ces récepteurs avec leurs ligands (molécule qui se lie de manière réversible à son récepteur) régule la durée et l’intensité de l’activation lymphocytaire. Mais ce mécanisme peut être détourné par les cellules tumorales qui en exprimant les ligands des récepteurs checkpoint freinent le système immunitaire au lieu de l’activer. Les médicaments anti-checkpoints sont déjà utilisés en clinique contre plusieurs types de cancers. Cependant ces traitements dit « d’immunothérapie » ne sont pas efficaces chez tous les patients et uniquement pour certains cas de cancers. Comprendre la raison d’une telle variation est un défi important pour la communauté scientifique. Tout comme l’identification de molécules avec lesquelles les inhibiteurs de checkpoint pourraient être combinés pour augmenter leur efficacité. Parmi celles-ci, les kinases sont une cible particulièrement intéressante. Ce sont des protéines dont le rôle principal est d'ajouter un petit groupe chimique appelé phosphate à d'autres protéines, ce qui peut les activer ou les désactiver. Dans le contexte du cancer, certaines kinases peuvent être hyperactives, contribuant ainsi à la croissance incontrôlée des cellules cancéreuses. En ciblant spécifiquement ces kinases avec des médicaments inhibiteurs, les chercheurs espèrent ralentir ou arrêter la croissance des cellules cancéreuses. Plus de 30 de ces médicaments sont déjà utilisés, et d'autres sont en cours d’essai clinique. Le but de ce projet est d’explorer si notre protéine kinase d’intérêt peut améliorer les mécanismes de défense anti-tumeurs des lymphocytes en combinaison avec des traitements anti-checkpoints.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de définir si notre protéine kinase d’intérêt joue un rôle dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs solides et pourrait améliorer la réponse aux traitements d’immunothérapie. Si tel était le cas, elle pourrait être considérée comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du cancer.

Procédures

Dans un premier lot de souris, des cellules tumorales seront injectées une fois par expérience aux animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Certains animaux seront ensuite traités deux fois par semaine pendant maximum 4 semaines par injection sur animaux vigiles (durée du geste inf à 10 sec). Dans une deuxième expérience, des souris vigiles seront irradiées (3 minutes) puis 4H après, elles seront injectées avec des cellules par voie intraveineuse et sous anesthésie gazeuse rapide (durée de l’anesthésie inf à 5 minutes). Six semaines après cette manipulation les animaux seront injectés une fois par expérience avec des cellules tumorales. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles 7 jours et 14 jours après cette dernière injection (durée du geste inférieur à 20 secondes)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs. Une nécrose peut apparaitre sur la tumeur en fin d’expérience. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non douloureux et non toxiques (douleur légère de courte durée liée à la piqûre elle-même). Une légère douleur de très courte durée est attendue lors des prélèvements sanguins ou des injections par voie intraveineuse. La procédure d’irradiation n’est pas douloureuse pour les animaux néanmoins un stress de courte durée, lié à la contention est attendu. Dans de rares cas, l’irradiation peut entrainer une altération de l’état général des animaux (déshydratation, prostation……) dans les jours suivants l’irradiation.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans des lignées cellulaires in vitro, le projet a pour but maintenant d’étudier le rôle de notre molécule d’intérêt dans la réponse des lymphocytes T contre les tumeurs et nécessite donc le système immunitaire d’un organisme vivant et intégré comme la souris. En effet, le développement des tumeurs met en jeu de multiples types cellulaires et de nombreux mécanismes qui ne peuvent pas être reproduits dans des modèles in vitro. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation des souris reste indispensable pour le présent projet.

Réduction

Les croisements des lignées de souris ont été optimisés afin d’obtenir le maximum d’animaux avec un phénotype utilisable dans nos expériences. Plusieurs analyses (imagerie et cytométrie) seront réalisées sur la même tumeur pour permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de souris par groupe est de 10 avec 3 manips afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Dans l’ensemble des procédures, une grille de score est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal en souffrance est mis à mort. Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement pour l’état général, et deux fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur ayant été greffée par voie sous-cutanée, afin d’appliquer les points limites de la grille de score. Après l’irradiation, du gel nutritif et hydratant sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire, et limiter la perte de poids et la déshydratation qui peuvent apparaitre.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet.

Produire des sérums contre le virus West Nile, la fièvre catarrhale ovine et la fièvre aphteuse suppose ici d'immuniser 20 lapins, un par antigène, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit trois injections sous-cutanées espacées de trois semaines et subit quatre prises de sang à la veine de l'oreille. Le porteur écrit n'attendre aucun effet indésirable, alors qu'il décrit une douleur à l'injection et une réaction inflammatoire locale. La procédure se termine par une ponction de 50 mL dans le cœur sous anesthésie, prélèvement dont le volume impose la mise à mort de l'animal avant tout réveil.

Objectifs

Ce projet a pour but de produire des anticorps dirigés contre des virus d’intérêt en santé publique et/ou vétérinaire tels que les virus West Nile, de la fièvre catarrhale ovine, de la fièvre aphteuse. Ces virus émergents ou à risque d’émergence ont des impacts sanitaires et économiques importants. Dans le but d’assurer et de garantir une surveillance optimale de ces infections virales chez les espèces sensibles, l'amélioration des outils de diagnostic et de recherche est nécessaire. Cette activité nécessite notamment la constitution de banque de réactifs biologiques tels que des sérums issus d’animaux ayant produit des anticorps spécifiques aux virus d’intérêt, bien caractérisés. Pour permettre la production d’anticorps, des antigènes qui sont des molécules reconnues, comme par exemple des protéines virales, par l’organisme comme étant étrangères et contre lesquelles l’organisme va combattre en produisant des anticorps dirigés (immunisation), seront utilisés. Les antigènes (protéines virales ou virus ne pouvant pas se multiplier) seront donc injectés à des lapins qui produiront des anticorps dirigés contre ces antigènes. Les anticorps produits sont dits « polyclonaux » car ils sont un mélange d’anticorps dirigés contre différentes parties des antigènes. Afin de récupérer ces anticorps précieux, le sérum (phase du sang sans les globules rouges), dans lequel se trouvent les anticorps, sera collecté en fin de procédure. Ainsi, les sérums obtenus après immunisation de lapins avec des protéines (et en présence d’adjuvant) ou de virus non réplicatifs pour cette espèce serviront au développement et à la validation d’outils de diagnostic sérologiques. Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif.

Bénéfices attendus

L’obtention d’anticorps spécifiques nous permettra de développer et de valider des outis sérologiques de diagnostic et de recherche pour les virus d’intérêt en santé publique et vétérinaire.

Procédures

Trois injections par la voie sous-cutanée à 3 semaines d’intervalle seront réalisées. Les prélèvements prévus sont au total 4 prises de sang à la veine de l’oreille (2mL par prélèvement) à 3 semaines d’intervalle. Le temps de prélèvement est de quelques secondes (inférieur à 1 min). En fin de procédure, un prélèvement d’un volume de 50 mL sera réalisé en ponction intra-cardiaque sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les lapins peuvent ressentir de la douleur lors des injections de l’antigène par la voie sous-cutanéée. Une légère réaction inflammatoire locale peut être observée sans conséquence pour le bien-être de l’animal. Nous n’attendons pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

En raison du gros volume de sang prélevé en fin de procédure sous anesthésie, les lapins seront mis à mort avant le réveil.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour la production de sérum contenant des anticorps polyclonaux dirigés contre des virus d’intérêt. La production synthétique reste actuellement moins performante. Le but de cette étude est d’avoir un panel d’anticorps dirigés contre des antigènes viraux issus de nouveaux virus émergents et/ou non commercialisés à visée de diagnostic ou de recherche.

Réduction

Dans le but de réduire la nombre d’animaux, nous avons décidé d’utiliser 1 lapin par antigène. Nous avons au total 20 antigènes pour lesquels nous avons besoin de sérum polyclonal. Un lapin permet l’obtention de sérum de bonne qualité et en quantité suffisante. Cette procédure permet de générer du matériel biologique et aucune analyse statistique sera réalisée.

Raffinement

A leur arrivée, les animaux seront hébergés par paire dans des cages doubles munies d’une plateforme de repos avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (balles, branches en bois pour les dents et branches végétales). En cas d’agressivité observée, les lapins seront placés en hébergement individuel avec contat visuel et odorant (séparation des cages faites avec des plaques en plexiglas transparentes et ajourées). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Les prélèvements terminaux de sang en vue de la récupération des sérums contenant les anticorps polyclonaux seront effectués sous anesthésie, avec une surveillance permanente des animaux, puis mise à mort avant le réveil.

Choix des espèces

Les lapins sont utilisés pour leur capacité à produire des grandes quantités de sérums et donc d’anticorps dirigés contre des antigènes d’intérêt, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux requis pour cet objectif. Les animaux utilisés seront des adultes afin d'avoir un système immunitaire mature pour une production optimale d'anticorps

16 800 souris et 1 650 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir la formation d'une bulle d'air sous la peau par deux injections sous anesthésie, des administrations de composés jusqu'à deux fois par jour pendant deux semaines par voie orale, sous-cutanée, intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire, intramusculaire, intranasale ou topique, jusqu'à six administrations d'un inducteur de maladie et trois prélèvements sanguins. Le porteur annonce un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude, et 350 études sur souris et 35 sur rats en cinq ans, un compte qui laisse les 1 650 rats déclarés sans justification. Il présente ces travaux de pharmacocinétique comme un moyen de réduire le nombre d'animaux utilisés en pharmacologie.

Objectifs

Les études pharmacocinétique/pharmacodynamie offrent plusieurs avantages dans le développement des médicaments dans les maladies inflammatoires, notamment elles permettent: 1) d’aider à élucider la relation entre la cinétique d’un composé (temps, concentration) et l’effet biologique sur un biomarqueur relié à la cible ou directement sur la cible (temps, effet) 2) de comprendre le mécanisme d’action d’un composé et aider à identifier les propriétés PK pour une amélioration ultérieure et une conception optimale du composé. La modélisation de la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie peut aider à mieux relier la puissance des composés in vitro à la prédiction de l’efficacité in vivo et ainsi réduire le nombre d’études in vivo et à améliorer la translation des résultats des espèces précliniques dans le cadre clinique.

Bénéfices attendus

La connaissance de l’effet biologique sur un biomarqueur d’un produit en fonction de sa concentration chez l’animal permet d’utiliser le meilleur traitement (composé, dose, voie d’administration) et participe à réduire le nombre d’animaux utilisés en pharmacologie. A terme, les résultats précliniques de ce projet permettront également de mieux comprendre la relation pharmacocinétique/pharmacodynamie des composés afin de développer en clinique des composés prometteurs ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.

Procédures

1) Formation de bulle d’air sous la peau qui persiste maximum 8 jours, avec deux injections d’air par étude sous anesthésie. 2) Administration des composés à tester ou de leur véhicule, par voie orale ou sous-cutanée ou intraveineuse ou intrapéritonéale ou intra-articulaire ou intra-musculaire ou intra-nasale ou en topique. Au maximum 2 fois par jour pour les voies orale, sous cutané et topique pendant un maximum de 2 semaines mais, exceptionnellement un composé pourra être administré 3 fois dans la même journée mais une seule fois dans l'étude. Pour les administrations intraveineuse, intrapéritonéale, intra-articulaire ou intra-musculaire, les injections pourront être effectuées maximum 1 fois par semaines soit 2 fois maximum dans l’étude. La durée de chaque traitement prend quelques secondes 3) Administration de l’inducteur, au maximum 6 fois dans l’étude ; durée de chaque induction : quelques secondes 4) Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse ou non (dépendant de la localisation du prélèvement), au maximum 3 fois dans l’étude, durée d’une minute

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez la souris ou le rat peuvent être dus à l’injection des inducteurs ou au traitement avec les composés. Ces effets indésirables pourraient induire une perte de poids, une diminution de l’activité ou une prostration. La manipulation des animaux plusieurs fois dans l’études ainsi que l’administration des composés ou des inducteurs peuvent également générer du stress et de l’inconfort.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de l’étude car le ou les tissus cibles sont prélevés pour analyser l’effet des composés sur la cible ainsi que la concentration des composés dans les tissus

Remplacement

Il n’existe pas de modèle fiable in vitro permettant de prédire de manière exacte et approfondie le comportement pharmacocinétique d’un produit chez l’homme et aussi de le relier à un effet biologique. L’utilisation d’animaux est donc indispensable pour déterminer les paramètres pharmacocinétiques d’un composé et pour observer la conséquence sur un ou plusieurs biomarqueurs. L’ensemble des molécules ont préalablement été testées, validées et sélectionnées in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été initialement basé sur la littérature puis a été réduit suite aux résultats obtenus dans des projets précédents. Pour de nouvelles cibles, une analyse statistique rétrospective sera effectuée après 3 à 5 études selon une formule mathématique communément décrite, comme le d de Cohen, afin de vérifier que le nombre d’animaux par groupe est suffisant pour obtenir, pour chaque paramètre étudié, une puissance de 80% et alpha=0.05. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo. Pour ce projet, nous utiliserons un maximum de 48 souris ou 40 rats par étude. Sur 5 ans, nous pensons réaliser un maximum de 350 études utilisant des souris et 35 études utilisant des rats.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière. Enfin, si les points limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera euthanasié de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l’entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. Les animaux et leurs conditions d’hébergement (environnement, nourriture, eau de boisson) seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée, en adéquation avec les contraintes des différentes procédures, et pendant toute la période d’acclimatation (maisons en carton adaptées, carrés de coton et feuilles de cellulose, entre autres).

Choix des espèces

Le rat et la souris sont les espèces les plus utilisées et les plus décrites dans la littérature pour les études pharmacologiques sur les maladies inflammatoires. Les études PK/PD étant des études préludes aux études pharmacologiques d’efficacité, les espèces utilisées dans les modèles de PK/PD seront les mêmes que celles utilisées dans le modèle pharmacologique afin d’éviter toute différence due à l’espèce. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes et un système immunitaire parfaitement développés.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune portant deux greffes de tumeur sous la peau, une de chaque côté du corps. Elles passent jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie, dont une acquisition dynamique de quatre-vingt-dix minutes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient 230 souris immunodéficientes et 230 souris à système immunitaire normal, et écrit que l'imagerie non invasive a permis de réduire les effectifs. Le projet vise un produit d'imagerie mesurant une protéine du système immunitaire dans les cancers du poumon, avec l'hypothèse plus lointaine d'un marquage au lutétium 177 pour traiter, alors que les greffes tumorales et les anesthésies, elles, sont immédiates.

Objectifs

L’immunothérapie à base d’anticorps spécifiques est un traitement qui vise à stimuler les défenses immunitaires de l’organisme contre les cellules cancéreuses. Les décisions de traitement clinique sont souvent guidées par le statut d'expression d'un récepteur applé PD-L1 dont la présence sur la tumeur est évaluée par des tests d'immunohistochimie (IHC) standardisés à partir d'un seul échantillon de biopsie tumorale avant traitement. Cependant, l'IHC présente de nombreuses limites techniques et biologiques : une biopsie unique, ou plusieurs petites biopsies, représentent mal l'hétérogénéité de l'expression de PD-L1 au sein des patients (hétérogénéité au sein même de la tumeur, ou entre la tumeur primaire et ses métastases). De plus, la biopsie de la tumeur n'est pas toujours pratique lorsque le site de la lésion est inaccessible. Ces limites soulignent qu'il est nécessaire de disposer d'outils permettant de détecter les niveaux de PD-L1 dans l'organisme entier afin d'améliorer notre compréhension de la réponse des patients aux thérapies ciblant l'axe PD-1 :PD-L1 et sélectionner au mieux les patients susceptibles de répondre à cette famille de traitements. La Tomographie par Emission de Positons (TEP) permet une évaluation quantitative, en temps réel et non invasive des niveaux d'expression de la cible et de sa dynamique dans le corps entier. Nous avons pour objectif dans ce projet de développer des sondes radioactives conçues pour ce type d'imagerie.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir un produit d'imagerie basé sur un petit peptide pour mesurer la quantité de PD-L1, une protéine importante du système immunitaire dans les cancers du poumon non à petites cellules (CPNPC), en tomographie par émission de positon (TEP). Selon les résultats obtenus, nous envisagerons des expériences de radiomarquage du même peptide avec un élément radioactif nommé lutetium 177 pour tenter de traiter le cancer par radiothérapie interne.

Procédures

Les animaux subiront une fois une greffe sous cutanées des cellules cancéreuses de chaque côté, sous anesthésie et ce pendant 10 à 20 minutes par animal. Ils réaliseront également sous anesthésie, de l'imagerie non invasive. Un même animal pourra subir au total 3 imageries successives (une dynamique d'une durée de 90 min et au maximum 2 statiques d'une durée de 24 minutes), avec au moins 2 jours d'intervalle entre les imageries). En fin de protocole et suite à la dernière session d'imagerie, les animaux seront maintenus sous anesthésie, afin de réaliser un prélèvement sanguin (durée de 1 min) puis l’euthanasie sous anesthésie sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un stress lors de leur manipulation. Ils peuvent subir du stress lié à l’anesthésie lors de l'injection des cellules tumorales, lors de l'injection du radiotraceur ou lors de leur réveil. Ils peuvent également souffrir de la croissance des tumeurs greffées en sous cutané. Il existe une possibilité de perte de poids et d’altération de l’état général de santé. Les animaux vont subir une anesthésie, les nuisances possibles sont une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardio-respiratoire. Les animaux vont subir une injection intraveineuse, il y a un risque de plaie ou d'infection, de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs.

Devenir

La totalité des animaux sera euthanasiée selon une méthode règlementaire, afin de récupérer les tumeurs et effectuer ensuite les analyses adéquates

Remplacement

Pour étudier la cinétique de biodistribution de nouveaux radiotraceurs, il n'existe aujourd'hui aucun modèle non vivant qui pourrait mimer le modèle animal vivant. Nous n'avons donc pas la possibilité de remplacer le modèle vivant utilisé.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l'interet d'un radiotraceur. Les analyses statistiques seront effectuées via le test Mann Whitney qui est adapté au nombre d'échantillons faibles. Le nombre d'animaux (460 au total, 230 souris immunodéficientes et 230 souris normales, répartis dans 2 études successives, permettant de comparer nos nouveaux ligands aux données de la littérature) a été réduit, notamment par l’utilisation de l’imagerie non invasive sous anesthésie qui permet des analyses corps entier en 3D et un recueil de données longitudinales.

Raffinement

Tous les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation à l'animalerie d'au moins 7 jours. Pour minimiser les dommages aux animaux, ils bénéficieront d’un environnement enrichi (outil de nidification, maisonnettes plastiques) et du maintien de l’interaction sociale en étant groupés, et resteront sous surveillance tout au long du projet. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous avons plusieurs indicateurs physiologiques et comportementaux permettant de suivre le bien-être de l’animal dès le 1er jour de xénogreffe tumorale : pesée 2 fois par semaine (perte de poids rapide par rapport au dernier jour de mesure du poids), apparition de comportement anormal (hypertoilettage, prostration), posture en cas de douleurs, absence d’interactions avec les congénères, consommation d’aliments et d’eau, sommeil. Si plusieurs symptômes sont présents de façon légère, nous sortirons l’animal de la procédure en cours qui sera alors sous surveillance journalière, un 3ème enrichissement (baton à ronger) sera alors proposé à l'animal isolé. Si un des symptômes est important, nous euthanasierons l’animal. Cependant d’après les connaissances sur ces modèles de xénogreffe tumorale et l'utilisation de l'imagerie non invasive, il ne devrait pas y avoir de telles souffrances. Si un animal montre des signes de cyanose ou de détresse respiratoire lors de l’administration d'un des radiotraceurs, celle-ci sera immédiatement stoppée et l’animal sera placé dans sa cage sous surveillance. Pour éviter tout risque de non réveil, la quantité d'anesthésique sera maitrisée et diminuée lors des temps d'imagerie longs.

Choix des espèces

Nous travaillons avec des souris immunodéprimées car ces animaux acceptent la xénogreffe de cellules tumorales humaines et constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et la validation de la biodistribution de nouveaux radiopharmaceutiques. Nous envisageons également l'utilisation de souris immunocompétentes pour les xénogreffes de cellules tumorales murines. Stade adulte, l’étude est portée sur l’imagerie d’un organisme déjà totalement développé.

Prélevées dans d'autres projets pour ne pas en utiliser de nouvelles, 42 souris vont être soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le groupe stressé subit quinze contentions de trente minutes dans un tube de 50 ml réparties sur vingt et un jours, un rasage, un test d'anhédonie sur une semaine et un test de la boîte noire et blanche de cinq minutes en isolement. Le projet vise à valider un dosage de la corticostérone dans l'urine, les fèces et les poils, afin de mesurer ensuite le stress des souris de l'animalerie. Un stress chronique est donc infligé pour mettre au point un outil de mesure du bien-être des animaux non-humains, et les souris rejoignent ensuite le "stock" de formation interne si l'avis vétérinaire le permet, sinon elles sont tuées.

Objectifs

Le projet vise à valider une méthode de mesure de la corticostérone dans différents échantillons pouvant être prélevés de manière non invasive chez la souris. Cette méthode de mesure servira ensuite à évaluer l’effet de modifications de paramètres environnementaux ou de procédures spécifiques sur le bien-être et le stress des souris.

Bénéfices attendus

La souris est l'espèce la plus couramment utilisée dans la recherche biomédicale et sa sensibilité est désormais largement reconnue. La directive européenne demande de réduire autant que possible la douleur et la détresse ressenties par les animaux utilisés, et d'augmenter le bien-être des souris (Directive européenne 2010). La corticostérone est le principal glucocorticoïde chez les souris et sa concentration reflète le niveau de stress d'un individu. Cette hormone de stress est classiquement mesurée dans le sérum ce qui nécessite une méthode de prélèvement invasive et reflète la concentration de corticostérone à court terme. D'autres matrices peuvent être utilisées, comme les selles, l'urine et les poils. En plus des mesures environnementales et comportementales, les niveaux de corticostérone fournissent des informations sur le stress des souris de laboratoire. Mesurer le stress chez nos souris nous permet de nous conformer à l'accréditation de l'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) International qui demande de revoir le programme d'enrichissement pour garantir l’amélioration du bien-être animal.

Procédures

Chaque souris du groupe « stressé » subit 15 contentions de 30 min chacune réparties sur 21 jours. Le rasage sera d’une durée inférieure à une minute. Les prélèvements d’urines (1µL) et de fèces (0.2mg) seront réalisé une seule fois à la fin du protocole et dureront moins de 2 minutes. Les souris du groupe contrôle seront simplement manipulées pendant moins d’une minute dans les mains de l’expérimentateur. Le test d’anhédonie se déroule sur une semaine. Lors du test de la boite noire et blanche, les souris sont placées individuellement dans le dispositif durant 5 min et leurs déplacements sont automatiquement enregistrés.

Impact sur les animaux

La contention de 30min / jour dans un tube de 50ml induit un stress chronique chez les animaux du groupe stressé. Les prélèvements nécessitent une contention qui peut induire un stress ponctuel aux souris bien qu’elles soient habituées à la manipulation dans un autre projet.

Devenir

Les souris retourneront dans le stock de formation interne après la procédure si l’avis vétérinaire le permet, dans le cas contraire elles seront euthanasiées.

Remplacement

Il s’agit ici de tests comportementaux permettant d’améliorer les conditions de vie des souris de notre animalerie. Ce protocole permet d’obtenir des résultats significatifs en utilisant les individus présents dans notre établissement. Il n’est donc pas possible de remplacer l’utilisation des souris par un autre modèle pour ce projet, mais les souris seront réutilisées à partir d’autres projets, afin de pas utiliser de nouveaux animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisées pour ce projet a été réduit et permet d’obtenir des résultats significatifs sur le sexe et les souches de souris qui seront utilisées ensuite pour mesurer la corticostérone. Un total de maximum 42 souris sera utilisé pour ce projet sur 1 an. Les souris seront divisées en groupes de 5 à 10 souris en fonction des tests réalisés. Plusieurs types de prélèvement seront réalisés sur chaque individu, ces effectifs permettront donc de réaliser une analyse statistique robuste. Les souris retourneront dans le stock des souris utilisées en formation après la procédure si l’avis vétérinaire le permet.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable de 2 à 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : un morceau de bois par souris, permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, un tunnel en carton et un dôme en polycarbonate rouge seront également disposés. En cas de changement de salle d’hébergement ou de congénères, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Une échelle de scores prenant en compte l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel permettra d’objectiver la présence de souffrances et pourra amener au traitement ou à l’euthanasie des souris pour raison éthique. En cas de modification des groupes sociaux pour la réalisation de l’étude, une semaine d’acclimatation sera respectée avant de démarrer le protocole expérimental.

Choix des espèces

Notre établissement utilise uniquement des souris et majoritairement des femelles, c’est pourquoi il est nécessaire de valider la mesure de la corticostérone chez cette espèce.

Tuées pour des prélèvements d'organes ou de fluides à un volume qui ne permet pas la survie, ou réutilisées dans un autre projet après accord du vétérinaire : sur 780 souris, 450 passeront dans d'autres protocoles. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, suspendues par la queue pendant sept minutes, le temps qu'elles passent immobiles étant retenu comme mesure du comportement dépressif. Une partie reçoit vingt-quatre heures avant un agent pro-inflammatoire qui fait baisser leur activité, leur fréquence respiratoire et leur température, puis des candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant sept jours. Le porteur qualifie le stress de la suspension de transitoire puisque le test ne dure pas plus de sept minutes, et indique que les effets indésirables des produits seront anticipés avec le sponsor avant chaque étude.

Objectifs

La dépression, ou épisode dépressif caractérisé, est un trouble psychiatrique sévère touchant jusqu'à 20% de la population générale. Cette pathologie se caractérise par l'apparition de plusieurs symptômes comme la tristesse ou la perte de plaisir et de motivation. La dépression peut entraîner le décès du patient, notamment par suicide (jusqu'à 20% des patients atteints de dépression décèdent par suicide) (INSERM, 2019). Bien que la recherche a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes causant la ce trouble psychiatrique (comme l'inflammation ou des déficits en neurotransmetteurs), la majorité des traitements se limite aujourd'hui aux antidépresseurs. Malheureusement, ces traitements manquent d'efficacité et leur consommation s'accompagne de nombreux effets secondaires. Il est donc important de trouver de nouveaux traitements pour combattre la dépression. Pour ce faire, plusieurs modèles et tests comportementaux chez l'animal existent afin de mettre en lumière des effets antidépresseurs avant caractérisation chez l'homme lors des essais cliniques. C'est par exemple le cas du test de suspension par la queue chez la souris ("tail suspension test": TST). Le test de suspension par la queue chez la souris permet de mesurer un comportement dépressif. Ce test repose sur le fait que les animaux soumis au stress inéluctable et de courte durée d'être suspendus par la queue développent une posture immobile. Ce comportement peut être exacerbé par des agents chimiques pro-inflammatoires puisque l'inflammation à un rôle dans la dépression. Divers médicaments antidépresseurs inversent l'immobilité et favorisent l'apparition d'un comportement de fuite. Le but du projet est donc de tester plusieurs candidat-médicaments indiqués pour la dépression dans le test de suspension par la queue chez la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter la dépression, une pathologie humaine touchant 20% de la population globale (INSERM, 2019). Du fait de leurs cibles thérapeutiques, ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer l'efficacité de nouveaux traitements antidépresseur dans un modèle expérimental de dépression mais également, d’évaluer leurs éventuels effets secondaires avant leur passage en phases cliniques. Ainsi, ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'Homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Les animauxpourront reçevoir une administration d'un agent chimique pro-inflammatoire 24h avant le test (1 administration, env. 30sec l'administration) et reçevont des administrations de candidats-médicaments (généralement 1 administration aigue jusqu'à maximum 2 administrations par jour pendant maximum 7 jours, avec environ 2 minutes par administration) et des prélèvements (environ 3 minutes par prélèvement) et éventuellement une anesthésie en fin d’expérience pour des prélèvements. Les animaux passeront dans le test où ils seront suspendu par la queue pendant 7 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances associées au test sont l'inconfort/ douleur légère et brève et le stress induits par les administrations et la suspension de l'animal par la queue lors du test, un stress qui restera transitoire puisque le test ne durera pas plus de 7 minutes. Des effets connus et transitoires de l'agent chimique pro-inflammatoire sont également attendus à la dose max de 1mg/kg utilisée dans ce projet: baisse d'activité, de la fréquence respiratoire, et de la température. Ces effets sont transitoires et ne durent pas plus de 24h. Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Une analyse sera engagée avant toute étude avec le Sponsor afin d'anticiper les effets indésirables potentiels qui pourraient émerger en fonction de la nature du produit à tester. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organes/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal et/ou sacrifice des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux et/ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptomes de la dépression. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe (10 animaux par groupe) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. L'analyse statistique sera adaptée au modèle.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit sur la depression du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

720 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit le composé à tester, son véhicule ou la molécule de référence, jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines au maximum, avec des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires. L'expérience se termine par une chirurgie sous anesthésie sans réveil, pendant laquelle une éjaculation est provoquée par un médicament et enregistrée trente minutes durant. Le porteur limite le stress attendu au début de l'expérience et présente cette étape préclinique comme "indispensable" avant tout essai chez l'humain, pour une dysfonction sexuelle que deux médicaments traitent déjà en France.

Objectifs

L’éjaculation prématurée (ou précoce, EP) est une dysfonction sexuelle masculine caractérisée par (définition de la société internationale de médecine sexuelle): • une éjaculation qui survient toujours, ou presque toujours, avant la pénétration vaginale, ou au cours de la minute qui la suit (EP primaire), ou une diminution significative de la latence de l’éjaculation, souvent inférieur à 3 minutes (EP acquise) et • une incapacité à retarder l’éjaculation lors de toutes ou presque toutes les pénétrations vaginales, et • des conséquences personnelles négatives, telles que frustration, soucis, souffrance psychologique et l’évitement de l’intimité sexuelle. L'éjaculation prématurée, qui peut occasionner une altération significative de la qualité de vie et des difficultés relationnelles dans le couple, représente la dysfonction sexuelle masculine la plus répandue, affectant entre 5 et 30% des hommes selon les études. Aux Etats-Unis, aucun médicament n’a reçu d’autorisation pour la prise en charge des patients avec une EP. En France, à l’heure actuelle, seuls deux médicaments ont reçu une autorisation de mise sur le marché dans le traitement de l’EP. Mais leur efficacité, qui se traduit par la capacité à retarder l’éjaculation lors d’un rapport sexuel, demeure modeste et l’existence d’effets indésirables et interactions médicamenteuses potentielles laissent place à une amélioration du service médical rendu. La meilleure compréhension de la neurobiologie et neurophysiologie de l’éjaculation acquise ces 20 dernières années a permis d’identifier un certain nombre de cibles pharmacologiques pour moduler plus spécifiquement le contrôle central de l’éjaculation. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de la recherche et la sélection de nouveaux traitements médicamenteux dans la prise en charge de l’EP.

Bénéfices attendus

L’EP est la dysfonction la plus commune de la sexualité masculine. Elle peut avoir des conséquences personnelles négatives (comme la détresse, la peine, la frustration et ou l’évitement de l’intimité sexuelle), mais aussi des difficultés relationnelles dans le couple. Une fois diagnostiquée selon les critères de la société internationale de médecine sexuelle, la prise en charge des patients est multiple, associant les thérapies cognitivo-comportementales centrées sur la sexualité et les pharmacothérapies. Pour cette dernière, aucun médicament n’a l’autorisation de mise sur le marché pour le traitement de l’EP aux Etats-Unis, tandis que seuls deux médicaments l’ont obtenu en France. Ce projet permettrait donc de sélectionner les candidats médicaments qui auraient un potentiel thérapeutique dans le traitement de l’EP. Cette étape d’évaluation préclinique, dans un modèle animal validé, est indispensable pour tout futur médicament avant la réalisation des essais cliniques chez l’homme.

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et de la molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 12 semaines). Tout type d’administration, réalisé par des personnels tutorés, dure moins d’une minute sur un animal vigile, et moins de 30 min sur un animal anesthésié. Ensuite, une évaluation de la fonction éjaculatoire est réalisée chez le rat anesthésiée après le traitement, une fois, et sans réveil. L’enregistrement des réponses éjaculatories dure 30 minutes. L’ensemble de l'expérience dure environ une heure, incluant le temps de chirurgie. Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

L’administration des composés et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les animaux. L’évaluation de la réponse éjaculatoire est réalisée sur des animaux anesthésiés. Un stress peut donc survenir mais seulement au début de l’expérience avant la médication.

Devenir

Tous les animaux du projet vont avoir une évaluation de leur fonction éjaculatoire à la fin de l'étude, qui est une procédure sans réveil. Tous les animaux vont donc être euthanasiés à la fin de l'expérience.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur la réponse éjaculatoire. En effet, l’éjaculation résulte de l’apparition concomitante d’une première phase d’émission, suivi de la phase d’expulsion chez l’homme.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a été réalisée afin de réduire au minimum le nombre de rats par groupe. Le résultat du calcul est n=11 et est corrigé, en prenant en compte les pertes dues aux difficultés techniques inhérentes au modèle expérimental, à n=12. Les tests statistiques utilisés pour une petite population sont le t-test non apparié pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les rats sont hébergés par 2 animaux par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant un éventuel ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie. L’évaluation fonctionnelle de la réponse éjaculatoire, comprenant la chirurgie, se fait sous analgésie et anesthésie générale et est sans réveil. De plus, une analgésie locorégionale par l’application de lidocaïne est réalisée au cours de la chirurgie. Ensuite, un suivi de la pression artérielle permet de suivre l’état général des rats lors de l’évaluation.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et le rat est l’espèce animale la plus largement utilisée dans le domaine de la médecine sexuelle. L’organisation anatomique des organes participant à l’éjaculation, ainsi que leurs innervations, chez le rat sont comparables à ceux de l’homme. De plus l’organisation des réseaux neuronaux du système nerveux central impliqués dans l’éjaculation chez le rat partage des similitudes avec ce qui est connu chez l’homme. Des rats mâles adultes de plus de 12 semaines sont employés, âge auquel les organes sexuels sont à maturité et des spermatozoïdes sont présents dans l’épididyme.