Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 000 souris immunodéficientes vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, chacune recevant dans la veine de la queue une injection de cellules sanguines humaines destinée à lui faire développer un système immunitaire humain. Celles de la phase de validation subissent des prélèvements de sang jusqu'à une fois par semaine et sont tuées quand les points limites sont atteints, entre quatre et douze semaines après l'injection. L'effet secondaire attendu est la maladie du greffon contre l'hôte, que le porteur décrit comme une réponse inflammatoire sévère avec altération de la peau, des organes et des poils, perte de poids et douleur. Les souris de la phase de production, elles, ne restent que deux à trois jours avant d'être expédiées à des partenaires académiques et industriels, le nombre produit correspondant au nombre commandé.
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules du sang humain consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptées en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). En effet, ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée, mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. L’un des avantages de ce modèle est le développement rapide du système immunitaire chez son hôte et la multiplication des cellules d’intérêt capable de déclencher une réponse inflammatoire. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Pour la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue et, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour la production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Au cours des procédures, les souris vont être déplacées pour être envoyées en zone de production, ou lors du transport chez le partenaire. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Les souris recevront une injection dans la veine de la queue, ce qui pourra engendrer un bref stress et/ou douleur. Plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et au maximum une fois par semaine, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire lié à l’injection de cellules humaine du sang à la souris est l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant de graves lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire sévère (altération de la peau, des organes, des poils, perte de poids et douleur).
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort lorsque les points limites auront été atteints. Les animaux de la production seront expédiés.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes relatives au processus. Nous avons établi qu’un groupe d’un minimum de 60 souris sera planifié pour chaque modèle animal immunodéficient et scindé en deux groupes qui seront eux-mêmes divisés en 2 ou plusieurs sous-groupes pour tester les différentes quantités de cellules à injecter. Soit un nombre de 15 animaux par sous-groupe. Le nombre de souris à tester a été calculé en prenant en compte : • que le test devra être répété. • qu’il est possible que la greffe ne soit pas concluantes chez certains animaux. Deux paramètres nous permettrons de déterminer la quantité de cellules du sang humain à injecter la plus adaptée : • Le taux d'humanisation • Le temps d’apparition des points limites. Plus le temps d’apparition des points limites sera tardif et plus cela laissera du temps aux partenaires de faire ses études. Grâce aux résultats obtenus nous pourrons faire des analyses statistiques. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact d’un donneur sur l’humanisation. Grâce à la validation du protocole et à son optimisation pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine par modèle, nous réduirons d’autant le nombre d’animaux à implanter pour obtenir le nombre de souris souhaitées. Pour la production, ce protocole sera exclusivement réalisé après réception d’une commande du partenaire afin de limiter le nombre d’animaux humanisés. Le nombre de souris produits correspondra donc au nombre de souris commandées.
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois par semaine post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7.5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois par semaine. L’apparition de la maladie du greffon chez les souris humanisées est également un point important. Les animaux seront donc observés quotidiennement et évalués sur leur aspect physique, leur comportement et leur poids selon une grille d’observation spécifique. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Pour un état observé dit « normal », les souris seront pesées 1 fois par semaine. Si l’état général de la souris se dégrade un examen clinique de la souris sera appliqué avec la mise en place d’une pesée plus régulière en fonction du développement de la maladie du greffon contre l’hôte. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, des l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. La souris est simple à élever, relativement peu coûteuse à reproduire, à entretenir en grand nombre et à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. La souris est un modèle de choix pour les études précliniques en raison de sa petite taille, sa courte gestation, de sa durée de vie et de la nécessité en réactifs expérimentaux en plus faibles quantités. Les génomes des souris sont bien caractérisés et très comparables au génome humain. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de souris génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la validation ou la production, les souris entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge jusqu’à l’atteinte des points limites pour la phase de validation, ce qui peut représenter plusieurs semaines après l’injection des cellules (entre 4 et 12 semaines post humanisation en fonction de la quantité de cellules injectées). Les souris de la phase de production entreront dans le protocole d’humanisation à 5 semaines d’âge. Elles seront ensuite envoyées aux partenaires deux à trois jours après l’injection des cellules humaines. S’agissant d’un modèle pour des études à court terme avec un développement rapide de la maladie du greffon, nous choisissons d’envoyer rapidement les animaux afin qu’ils puissent commencer leurs protocoles expérimentaux le plus tôt possible.
Evaluation de la physiopathologie de la drépanocytose au niveau centrale et périphérique dans le modèle murin Townes
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Porteuses de la drépanocytose, les souris du modèle Townes sont utilisées ici pour étudier les défauts de production des globules rouges et les obstructions de vaisseaux qui accompagnent la maladie. 524 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, une partie dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, les autres dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection puis une série de cinq ou vingt prélèvements sanguins sous anesthésie espacés d'une semaine, ou subissent une chirurgie du muscle crémaster. Le porteur range parmi les atteintes attendues la piqûre de l'aiguille et l'angoisse liée aux pesées, sans dire ce que produit la drépanocytose elle-même chez ces souris, et indique qu'elles seront tuées pour caractériser leur moelle osseuse et leurs vaisseaux.
Objectifs
L’objectif de notre étude porte sur la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la survenue de la drépanocytose. Ce projet s’articule autour de trois objectifs principaux : 1. Evaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés à des défauts d’hématopoièse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des différentes cellules sanguines, et d’érythropoïèse, l'ensemble des mécanismes qui assurent la production des globules rouges; 2. Disséquer les mécanismes cellulaires associés à la survenue des crises vaso-occlusives,des obstructions locaux de la circulation sanguine; 3.Evaluer le mécanisme d’action et l’efficacité de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques associés à la drépanocytose et d’identifier les mécanismes d’action et l’efficacité de candidats médicaments afin d’offrir dans un futur proche un nouvel arsenal thérapeutique dans la prise en charge de cette maladie.
Procédures
En fonctions des groupes expérimentaux d'appartenance, les animaux subiront: 1. une injection et une série de 5 ou 20 prélèvements sanguins sous anesthésie (3min) tous espacés de 1 semaines; 2. une chirurgie sur le cremaster sous anesthésiée.
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins, les injections et l'anesthésie constitueront une nuisance pour les animaux. La piqure d'aiguille pour l’injection ainsi que les prélèvements sanguins entraînent une douleur légère de courte durée. L'ensemble des manipulations, ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.
Devenir
Les souris impliquées dans ce projet feront l’objet d’une caractérisation de leur système hématopoïétique et vasculaire qui nécessitera leur mise à mort.
Remplacement
Les nombreux partenaires (cellulaires et moléculaires) des processus dynamiques d’hématopoïèse, d’érythropoïèse et de thrombose nécessitent une approche expérimentale in vivo car il n’existe pas à ce jour de système suffisamment fiable pour mimer cette complexité biologique.
Réduction
En nous appuyant sur un test d'effectif, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir d’étudier la physiopathologie de la drépanocytose dans la moelle osseuse et dans les vaisseaux sanguins. Le calcul d’effectif sera réalisé sur la base d’une expérience pilote qui implique elle-même un nombre minimum d'individus déterminé sur la base de données de la littérature. La comparaison des différentes conditions expérimentales se fera par des tests statistiques adaptés à ces petits effectifs.
Raffinement
Le suivi des traitements se fera par des mesures utilisant un procédé peu invasif à partir de prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés et afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de coton et de dômes en carton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proches de l’homme pour sa physiologie. Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour adresser les questions relatives à l’hématopoïèse, à l’érythropoiese et à la thrombose. En effet les caractéristiques moléculaires des cellules hématopoïétiques murines sont très semblables aux cellules hématopoïétiques humaines. Chez l’Homme la drépanocytose est une maladie qui se déclare dès la naissance et qui nécessite une prise en charge thérapeutique précoce. Nous utiliserons des individus sevrés avec un suivi de 4 à 24 semaines post-naissance (de jeunes à adultes).
Nouvelle combinaison thérapeutique dans le traitement de la stéatohépatite non alcoolique chez la souris C57BL/6J
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Deux injections par semaine pendant dix semaines, chacune précédée d'une incision de deux millimètres au bout de la queue pour prélever une goutte de sang : 90 souris sur les 133 utilisées suivent ce protocole, après un régime enrichi en lipides et en sucre. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour prélever leur foie et leurs autres organes. L'objectif est de tester la combinaison d'un peptide médicament et de molécules issues de cellules souches contre la stéatohépatite non alcoolique. Sur les atteintes attendues, le porteur décrit ce que produit la maladie chez le chat et chez l'être humain, note que ces symptômes n'ont pas été décrits chez les rongeurs, et ne dit pas ce que les souris elles-mêmes vont ressentir.
Objectifs
La maladie du foie gras encore appelée NAFLD est une pathologie hépatique couramment retrouvé chez l'Homme, sans qu'il y ait eu d'abus d'alcool. La forme la plus grave correspond à l'accumulation de graisses associée à un dépot excessif de substances cicatritielles dans le foie, que nous résumerons sous le terme de NASH. La NASH, corrélée à l’obésité et au diabète, représente un problème majeur mondial de santé. Environ 20 % des personnes atteintes de foie gras évoluent vers la NASH, qui dans les cas les plus graves, évolue vers une cirrhose voire, vers un cancer hépatique. Acctuellement, la transplantation hépatique est le seul traitement efficace. Notre objectif principal est de combiner deux traitements pharmacologiques : un peptide médicament et de molécules bioactives (MB) issues de cellules souches. Nous prévoyons que ces deux traitements exerceront un effet complémentaire pour limiter la progression de la NASH, réparer le tissu hépatique et le rendre de nouveau fonctionnel. Ensemble, cette combinaison vise à traiter les causes profondes de la maladie en amont de la cicatrisation exacerbée, offrant ainsi une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour prévenir la progression de la NASH. Les modèles de souris reproduisent les conditions cliniques pour une compréhension intégrative de la maladie et des complications associées dans les autres organes. Ceci rend difficile de simplifier l'étude par des systèmes cellulaires. Notre modèle murin nourri avec un régime enrichi en lipides/ sucre, se rapproche de la pathologie humaine et de son évolution et sera moins de nuissances que les modèles déjà décrits dans la littérature où une perte de plus de 20% du poids corporel est décrite associée à un effet hépato-toxique. Le peptide médicament utilisé,est aujourd'hui testé chez le patient pour une autre pathologie. L'absence d'effets secondaires, observée dans ce dernier cadre tant chez l'homme que chez la souris, en fait une molécule sure pour notre étude sur la NASH. L'injection MB a été décrites dans la littérature comme ayant des effets secondaires limités chez l'homme et l'animal.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ce projet sont importants. D’un point de vue scientifique, les données obtenues permettront de contribuer aux connaissances générales sur les mécanismes pathologiques et notamment inflammatoires dans la NASH et leur potentiel résolution. D’un point de vu clinique, cette étude permettrait d’apporter des données majeurs et solides pour l’utilisation de cette thérapie combinée chez les patients atteints de NASH et pourrait s’avérer être une alternative efficace aux futurs traitements en cours de développement.
Procédures
Sur les 133 souris ulisées, 111 souris seront soumis à un régime enrichi en lipides/sucre. Parmi ces dernières, 90 seront soumis au traitement anti-NASH avec le peptide médicament ou avec du liquide physiologique et/ou avec les MB., sur une durée de 10 semaines à raison de 2 injections hebdomadaires (100 µL maximum). Avant chaque injection, un prélèvement sanguin ( 1min max) de 10 µL au niveau de la queue (incision 2 mm) sera réalisé pour controler le niveau du sucre dans le sang.
Impact sur les animaux
Chez le chat, la NAFLD est associé à un jaunissement et une perte de poids sévère et à des vomissements. Ces symptomes n'ont pas été décrits à notre connaissance dans la littérature chez les rongeurs. Selon les données cliniques, la NASH ne présente pas de symptômes chez l'homme. Dans quelques rares cas, un état d’inconfort dans l’abdomen au niveau du foie, de la fatigue, une sensation générale de malaise et un vague inconfort sont décrite. Une diminution progressive de la fonction hépatique pourrait potentiellement être à l’origine de l’apparition d’un jaunissement, d’un œdème. Un état d'incofonrt de la locomotion expliquée par la prise régulière du poids de la souris pourrait etre observée. Une douleur légère de courte durée de la piqure de l'aiguille sera ressenti lors de l'evaluation de la glycémie hebdomadaire.
Devenir
A la fin de chqcune des 2 procédure les animaux seront anesthésiés avant d'être euthanasiés afin de prélever leur tissus et leurs organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses moléculaires.
Remplacement
L'utilisation de modèles murins est indispensable en raison de la complexité de cette maladie qui implique plusieurs organes comme la rate, le foie, le tissu adipeux, etc. Notre stratégie thérapeutique repose sur la modulation 1- du système immunitaire pour atténuer la progression de la NASH, 2- d’une réduction de l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui rend indispensable l'étude de ces interactions complexes. A ce jour, il n'existe aucun modèle in vitro fiable et adapté pour une telle étude intégrative. Cependant, nous avons réalisé des tests in vitro sur une lignée cellulaires cultivées en milieu enrichi en graisses, où nous montrons un effet protecteur du peptide médicament, et un effet réparateur des MB. Ces essais nous rendent confiants sur l'efficacité combinée du peptide et des MB sur notre modèle murin mimant la NASH. Les modèles murins permettent de reproduire de manière fidèle les conditions in vivo, offrant ainsi une compréhension plus complète de la maladie et de l'effet de la modulation immunitaire sur son évolution ce qui rend difficile de simplifier l'étude en utilisant des systèmes in vitro ou ex vivo, comme les modèles 3D par exemple. Les modèles murins permettent de prendre en compte cette complexité et d'analyser comment différents organes et tissus interagissent pour déterminer et faire progresser la maladie. Il n'existe actuellement aucune alternative non animale satisfaisante pour répondre à nos questions. Ainsi, les modèles murins restent la meilleure option pour générer des données pertinentes qui pourraient ultérieurement avoir un impact translationnel chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux dans le projet est estimé en considérant la nécessité de réduire l’utilisation d’animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement, statistiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude. La taille de chaque groupe d’animaux est de n= 7 souris (procedure 1) et de n = 15 souris (procedure 2). Elle a été calculée, en tenant en compte du risque de décès prématurés et en utilisant un logiciel statistique adapté. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, les procédures seront interrompues pour la totalité des animaux. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Pour la procedure 2; l'expérimentation sera réalisée en 3 fois afin que scientifiquement nous ayons 3 expériences indépendantes (soit 5 animaux/groupe/ période expérimentale). Cette façon de procéder nous permettra de travailler avec des petits effectifs faisant 1- qu'en cas des points limites atteints, d'arreter la procedure, de la revoir (i.e. temps d'injection, quantité injectée du peptide, age des souris...) après discussion avec le comité d'éthique... voire de stopper définitivement la procedure; 2- qu'en cas d'obtention de résultats statistiquement significatifs apres le 1er et/ou le 2e essais, les essais suivants (2 et 3, respectivement) pourront alors ne pas avoir lieu. Les variables quantitatives seront analysées par des tests statistiques. Dans le but de renforcer les données statistiques, l’étude sera randomisée (tirage au sort de l’ordre groupes pour les injections et clause d’ignorance) et contrôlée. Enfin toujours dans le but de réduire le nombre d'animaux, les tissus issus de nos différents groupes seront prélevés pour être utilisés dans d'autres projets en cours ou futurs.
Raffinement
La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de production d'urine excessive des souris NASH (valable surtout en fin de procédure pour les souris NASH non traitées). Au cours des phases de stabulation, plusieurs animaux du même sexe seront hébergés dans la même cage. En revanche, lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte, 30 minutes maximum) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées lors de certaines méthodologies (injections) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention (prise de sang). Cela devrait réduire le stress au minimum. Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de gain de la masse corporelle) ou d'un taux élevé de sucres dans le sang (> 6g/l ) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de l'euthanasie de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases des injections, des anesthésiques généraux seront administrés. Une grille de score définie nous permettra d'évaluer l’état dans lequel se trouvent les individus. Afin de limiter les perturbations locomotrices, l'age de 2 mois post-natals des souris pour le début du traitement et la durée de 10 semaines (pour le traitement) ont été choisis afin que le phénotype dommageable ne soit pas atteint. Ainsi cette nuisance devrait être limitée dans la durée de la procédure (10 semaines). Au moment de l'euthanasie, de part l'expérience que nous avons de ce modèle nous estimons que les souris non traitées ne devraient pas atteindre le phénotype dommageable (e.i poids >40 g). Si c'est le cas avant la date d'euthanasie, initialement déterminée, alors nous interromprons l'ensemble du protocole pour la totalité des souris. Ces dernières seront alors euthanasiées pour l'analyse tissulaire.
Choix des espèces
Les souris ont un génome très proche de celui de l’Homme, et leur système physiologique récapitule assez bien les observations faites chez l’Homme. Aujourd’hui, la souris représente le meilleur modèle pour tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques et le meilleur compromis entre les besoins expérimentaux et le respect du critère de choix de l’espèce. Deux souches seront nécessaire à l'étude, les souris obèses qui subiront les traitements et des souris controles non diabétiques, non obéses, non traitées qui représenteront le témoin négatif et la référence de poids normal. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 mois à l’initiation des procédures.
Validation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers agressifs tels que les cancers du sein
- Recherche appliquée
- Cancers
1 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune portant une greffe de cancer du sein humain pendant treize semaines, avec seize séances d'imagerie sous anesthésie et treize prises de sang à la joue sur animal éveillé. La tumeur est mesurée deux fois par semaine, les traitements sont injectés dans la veine de la queue ou directement dans la tumeur sans anesthésie, et le porteur attend douleurs, difficultés à se déplacer, lésions aux points d'injection et métastases pouvant provoquer gêne respiratoire et atteinte du foie. Toutes sont tuées à treize semaines, ou plus tôt si un point limite terminal est atteint, pour prélever la tumeur et les organes. Le bénéfice annoncé, un transfert vers la clinique "dans un futur proche" pour des cancers du sein métastatiques sans solution, reste au conditionnel, quand l'atteinte est immédiate et déclarée sévère pour les 1 880 animaux.
Objectifs
Il n’existe aucun traitement efficace pour traiter les patients atteints de cancer du sein avec métastases. Les objectifs du projet sont donc de développer de nouveaux médicaments capables de cibler la tumeur primaire ainsi que les métastases dans les cancers du sein. En particulier les objectifs de ce projet sont de proposer de nouvelles thérapies innovantes seules ou en combinaison avec des drogues de chimiothérapie pour proposer un traitement efficace de ces cancers du sein pour lesquels il y a un réel manque de solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le cancer est l'une des principales causes de mortalité dans le monde. Le nombre de nouveaux cas devrait augmenter au cours des prochaines décennies. C’est ainsi que l’apparition de métastases dans les cancers du sein très aggressifs est la principale cause de décès et ces cancers très agressifs sont ceux qui bénéficient le moins des thérapies ciblées. Malgré le développement de nouvelles stratégies, des traitements efficaces sont encore en devenir pour les cancers dits métastatiques. Des approches thérapeutiques innovantes, guidées par des découvertes fondamentales, sont nécessaires d'urgence pour répondre à cette problématique. Notre projet permettra de tester et valider de nouveaux médicaments efficaces contre le cancer du sein métastatique pour permettre dans un futur proche un transfert vers la pratique médicale en clinique aux bénéfices des patients atteints de cancer du sein métastatique en réel manque de solutions thérapeutiques.
Procédures
Les souris, sous anesthésie, recevront une injection unique sous la peau au niveau de la glande mammaires des cellules de cancer du sein humain (durée 30s). Un suivi de la taille de la tumeur sera réalisé 2fois par semaine (2 minutes). Cinq semaines après l’injection des cellules tumorales, les souris seront analysées en imagerie après une injection d’un produit de contraste au niveau de l’abdomen (sous anesthésie, durée 10 min) 2 fois par semaine pendant 8 semaines. En fonction des groupes d’animaux, deux traitements seront administrés avec des dosages, modes d’administration (dans la veine de la queue, sans anesthésie; durée 30 secondes ou au niveau de la tumeur, sans anesthésie; durée 30 secondes) et durées différents. Une prise de sang au niveau de la joue sur animal éveillé sera réalisée 1 fois par semaine pendant 13 semaines (durée 30s, sans anesthésie).
Impact sur les animaux
L'injection des cellules tumorales peut entrainer une douleur de courte durée au site d'injection. Lors du développement d’une tumeur au niveau de la glande mammaire, il peut en découler une douleur et lorsque la tumeur grossira une éventuelle difficulté de locomotion. Les souris peuvent aussi présenter du stress lié à la mesure répétée de la taille de la tumeur (2 fois par semaine), l'injection répétée des traitements et les anesthésies répétées pour les séances d'imagerie. Les injections répétées des traitements peuvent également générer une douleur et des lésions au niveau du site d'injection. L’apparition de métastases pourrait engendrer de la douleur, une difficulté respiratoire, éventuellement une atteinte hépatique. Le prélèvement sanguin peut être source de stress et pourrait entrainer une hémorragie.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés soit à la fin de la procédure (13 semaines après le début) soit de manière anticipée si atteinte d’un point limite terminal. Post-mortem, des prélèvements de la tumeur primaire et des différents organes des souris seront effectués pour analyser la présence et contenu des cellules tumorales.
Remplacement
Le modèle murin de cancer du sein que nous utiliserons reproduit la physiopathologie de la progression du cancer du sein que l’on retrouve chez la femme avec tout d’abord une croissance de la tumeur, puis l’apparition de métastases. Ce modèle animal entier vivant permet aussi de reproduire la biodistribution des traitements que l'on retrouve dans le corps humain. Les interactions des cellules cancéreuses avec l’hôte (ici la souris) ne peuvent pas être reproduites en culture cellulaire. Nous avons réalisé au préalable le maximum d’expériences in vitro avec des cellules humaines dans des tubes à essai. Néanmoins, l’utilisation d’animaux est indispensable car malheureusement la capacité de former des métastases ne peut pas être évaluée in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum après estimation des effectifs basée sur les données antérieures du laboratoire et une simulation statistique afin de garantir l’obtention de résultats statistiquement recevables.
Raffinement
Nous serons attentifs au bien-être des animaux en veillant à ce que les animaux soient maintenus autant que possible en groupe dans un environnement agréable et stimulant grâce à leur mise disposition des carrés de coton et des tunnels en carton. Tout au long du déroulement de l’expérience, une surveillance quotidienne (visuelle) sera effectué ainsi qu’une observation systématique de l’état clinique (3 fois par semaine) des souris utilisées sera assurée. L’état des animaux sera scrupuleusement évalué grâce à une grille de critères d’observation prédéfinis qui dirigerons la mise en place d’actions spécifiques en cas de souffrance. L’injection de cellules tumorale sera fera sous anesthésie générale par injection d’anesthésiques. L’imagerie de l’apparition des métastases sera faite sous anesthésie gazeuse. En cas de signes d'affaiblissement de la souris, nous ajouterons de la nourriture humidifiée dans la cage. Si la tumeur présente une zone de nécrose, un traitement local avec un anti-douleur sera mis en place juste avant l'injection des traitements anti-cancéreux. En cas de lésions liées aux injections répétées, la zone sera désinfectée et la cicatrisation surveillée. Si l'état de la souris ne s'améliore pas en 24h, l'euthanasie sera réalisée.
Choix des espèces
Nous utilions dans ce projet des souris, car le modèle de cancer du sein est bien décrit dans la littérature scientifique et les nouvelles thérapies peuvent y être testés avec la possibilité d'utiliser des voies d'administration similaire à celles réalisées chez les patientes. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 8 semaines, âge à partir duquel les souris sont sexuellement matures et considérées comme jeunes adultes. Cela correspond à la période au stade de développement chez la femme de ce type de cancer.
Caractérisation d’une protéine par imagerie par résonance magnétique (IRM) dans un modèle murin de sepsis.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois séances d'imagerie d'environ une heure chacune, anesthésie comprise, et quatre prises de sang dans la veine de la queue avec un risque de saignement, d'infection ou de nécrose des tissus : 63 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever organes et sang. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Une injection unique de lipopolysaccharide dans l'abdomen déclenche une inflammation généralisée qui reproduit un sepsis, avec perte de poids, baisse de mobilité et réduction des interactions sociales, pour tester si une protéine protège la barrière entre le sang et le cerveau. Le porteur retient le rat parce que c'est l'espèce déjà utilisée sur ce modèle et parce que sa taille donne de meilleures images que la souris, et situe un éventuel premier essai chez l'être humain dans les cinq prochaines années.
Objectifs
Le sepsis est une réaction inflammatoire exagérée qui force le corps à s’attaquer à ses propres tissus et organes. Il peut se produire en réponse de n’importe quelle infection, que ce soit par la présence d’une bactérie, d’un virus ou d’un parasite dans le corps. La forme la plus grave est le choc septique qui est une cause fréquente de décès. Cette inflammation entraîne des problèmes dans tout le corps, jusqu’à la baisse de la pression sanguine qui peut causer des défaillances d'organes. Si cette défaillance atteint le cerveau et les vaisseaux sanguins qui l’alimentent il peut y avoir des conséquences graves pour les patients, en accélérant l'apparition de problèmes de mémoire à long terme. Si l’inflammation reste excessive et continue dans le temps, elle va endommager la barrière qui sépare le sang et le cerveau entraînant un gonflement du cerveau et l'activation de certaines cellules immunitaires qui vont accentuer l'inflammation au niveau du cerveau. De plus, il peut y avoir des problèmes avec la circulation sanguine et provoquer des saignements dans le cerveau. Pour traiter le choc septique, on utilise des antibiotiques et on traite l'infection initiale. On s'assure aussi que la pression sanguine reste normale pour que les organes fonctionnent de manière normale. Actuellement, il n'y a pas de traitement spécifique pour traiter les problèmes qui touchent les vaisseaux altérés par cette maladie, ni l'inflammation du cerveau. Notre équipe de recherche étudie une protéine qui pourrait aider à conserver la fonction des vaisseaux pendant l'inflammation et empêcher les problèmes qu’elle provoque. Pour cela, nous utilisons un modèle chez le rat chez qui nous allons injecter une substance appelée Lipopolysaccharide (LPS) pour provoquer l'inflammation au niveau du cerveau. Nous allons faire des images IRM du cerveau de ces animaux pour voir si la protéine d’intérêt peut empêcher les problèmes liés à l'inflammation dans le cerveau, en mesurant la diminution du gonflement du cerveau et de la circulation sanguine cérébrale.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à examiner comment la protéine agit dans la réponse de la barrière entre le sang et le cerveau en cas d'inflammation dans tout le corps. Avant de pouvoir envisager de tester cette protéine chez l'homme, il est important de vérifier son efficacité dans le traitement de l'infection grave chez le rat. Les résultats attendus aideront à mieux comprendre comment traiter ce genre d'inflammation chez les humains et à réduire le risque de développer des troubles de la mémoire graves. Il est possible qu'une première phase d'essais chez l'homme puisse être envisagée dans les cinq prochaines années.
Procédures
L’ensemble des gestes réalisés sur les animaux, le seront par des personnes formés à la manipulation expérimentale du petit animal. Dans cette étude, nous avons besoin d'endormir les animaux pour les examens d'imagerie. Les animaux seront imagés 3 fois au cours de ce projet. Un protocole d’imagerie dure environ 1h de l’anesthésie au placement de l’animal dans sa cage de réveil. Pour induire l’anesthésie générale, nous injecterons au niveau abdominal un produit dont on ajustera la concentration en fonction du poids de l’animal. Après 5 minutes et confirmation de l'anesthésie générale, un prélèvement de sang sera effectué au niveau de la veine de la queue, ce geste expérimental prend 2 à 3 minutes. Nous allons mesurer dans ce prélèvement les différentes protéines impactées par la protéine d’intérêt pour voir si elle a bien effet. Ce prélèvement sera réalisé 3 fois au cours de ce projet. Un 4ème prélèvement sera effectué, lors de la dernière étape du projet, toujours sous anesthésie générale. La mise en place du modèle expérimental est réalisée par une injection unique de Lipopolysaccharide au niveau abdominal.
Impact sur les animaux
Nous utiliserons des injections dans la cavité abdominale pour administrer la protéine d’intérêt, le produit pour déclencher la maladie inflammatoire ainsi que pour le mélange pour l’anesthésie. Lors de ces injections l’animal est tenu dans les mains de l’opérateur avec les gestes préconisés pour limiter le stress et la douleur de l’animal lors de l’injection. L'injection du produit d'anesthésie peut être répétée avec une concentration plus faible pendant l'examen d'imagerie dans le cas où l'animal commence à se réveiller. Le LPS est une substance qui provoque une réaction inflammatoire généralisée semblable à celle observée dans le sepsis et peut entraîner à court terme une perte de poids, une réduction de la mobilité et des interactions sociales chez les animaux. Le fait de répéter les prélèvements sanguins au niveau de la queue peut entrainer soit des saignements, soit une infection qui peut aller jusqu’à la nécrose c’est-à-dire à la mort des tissus.
Devenir
L'ensemble des animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés pour effectuer des prélèvements d'organes et de sang. Ces prélèvements seront utilisés pour une analyse tissulaire au niveau microscopique afin d'évaluer le rôle protecteur de la protéine. Plus particulièrement pour les prélèvements de cerveau, nous allons les comparer aux données obtenues par imagerie.
Remplacement
L'inflammation du cerveau est un phénomène complexe résultant de l'interaction de différents types cellulaires et la barrière qui sépare le sang du cerveau. Cette interaction est encore partiellement connue. L'approche avec des modèles théoriques ou de remplacement ne permet pas de rendre compte de façon fiable de ces différentes interactions. Le modèle animal utilisé sera celui le plus validé à l'heure actuelle pour l'étude de l'inflammation du cerveau.
Réduction
Le nombre d'animaux pour ce projet été déterminé à l’aide d’outils mathématiques spécialisés pour permettre une analyse cohérente et juste des données obtenues. De plus, comme nous allons utiliser les animaux dans les différentes conditions expérimentales, les données obtenues chez les animaux en bonne santé seront comparées à celles récoltés sur ces mêmes animaux mais après le déclenchement de l’inflammation par le LPS. Ceci va nous permettre d’obtenir des résultats dans les différentes conditions expérimentales avec moins d’animaux en plus de la réutilisation des animaux utilisés pour l'étude pilote. L’étude pilote va permettre d'ajuster le nombre d'animaux en fonction de la variabilité qui peut exister entre les animaux. En effet, s’il existe des différences ou non dans les mesures réalisées dans le groupe d’animaux sains, nous saurons s’il est nécessaire d’ajuster le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats cohérents et fiables. De plus, les données d'imagerie seront analysées au fur et à mesure, si les résultats sont satisfaisants avec moins d'animaux que prévu, les protocoles d'imagerie seront arrêtés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sur la totalité du projet.
Raffinement
Une période minimale d'acclimation de 7 jours à la réception des animaux du fournisseur sera respectée. Le milieu des cages sera enrichi et le nombre d'individus par cage sera adapté à leur taille mais aucun animal ne sera laissé seul en cage. La profondeur de l’anesthésie est vérifiée par l’absence de mouvement par pression sur la patte. Une évaluation en temps réel de l'anesthésie sera réalisée pendant les protocoles d’imagerie. Si la fonction respiratoire se dégrade et se maintient dégradée, le protocole d'imagerie sera interrompu pour permettre une surveillance accrue de l'animal dans une cage de réveil dédiée placée sous une lampe chauffante. Pour garantir un maintien de la température corporelle pendant le protocole d'imagerie, l’animal est réchauffé pendant tout le protocole d’imagerie. Pour les animaux qui ne sont pas euthanasiés à l'issue du protocole d'imagerie, la phase de réveil sera réalisée sous lampe chauffante puis remplacement dans leur cage d'origine. Les animaux seront observés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et les points limites seront étudiés par les responsables de projet 2 fois par semaine pour s’assurer du bien-être des animaux et qu’ils soient traités avec le plus grand respect et le moins de douleurs possible. Si la mise en place d’un traitement anti-douleur ne permet de pas d’améliorer le bien-être animal, le protocole d’euthanasié sera réalisé.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats pour cette étude car c'est l'espèce utilisée dans les études sur ce modèle pathologique. Le rat est une espèce couramment utilisée pour les travaux d'expertise par imagerie chez le petit animal et les outils utilisés sont dédiés à cette espèce. De plus, c’est une espèce de plus grande taille par rapport à la souris ce qui permet d’avoir une qualité d’image supérieure avec plus de détails et précision pour les expérimentations d’imagerie préclinique. Nous utiliserons des animaux âgés de 10 à 12 semaines pesant entre 400 et 600g. Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions pathologiques retrouvées chez l'Homme.
Évaluation thérapeutique du blocage des récepteurs de chimiokines sur la douleur cornéenne chronique dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
La cornée abrasée sous anesthésie puis exposée à des molécules inflammatoires, ou les glandes lacrymales retirées en quinze minutes de chirurgie : 1 600 souris mâles subissent l'un de ces deux modèles de douleur oculaire. Toutes sont tuées pour prélèvements et analyses post-mortem, 1 000 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 600 un niveau léger. Le porteur attend les mêmes sensations que chez les patients humains, picotements, démangeaisons, brûlures, impression de corps étranger et sensibilité accrue à la lumière, et fait passer aux souris des tests de sensibilité cornéenne sur animal éveillé, une à quatre fois selon le modèle. L'effectif de 1 600 est présenté comme le fruit d'un calcul de puissance, sans que le nombre de groupes ni la répartition entre les deux modèles ne soient donnés, et rien n'indique combien de souris subissent l'ablation des glandes lacrymales.
Objectifs
La douleur oculaire est un symptôme d'alerte en réaction à une inflammation ou un traumatisme, affectant particulièrement la cornée, la sclérotique et la conjonctive. La douleur oculaire est remarquable par la variabilité de l'intensité qu'elle peut générer, allant d'une simple gêne oculaire à une douleur intense, voire insupportable. les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. Diverses maladies inflammatoires ou infectieuses, des troubles neurologiques et des interventions chirurgicales oculaires peuvent être la cause sous-jacente de douleur cornéenne chronique. Dans les cas pathologiques graves, les lésions des nerfs cornéens peuvent entraîner une sensibilité accrue à la lumière et/ou des douleurs, une altération des fonctions physiques et sociales, une privation de sommeil, une anxiété et une dépression. Le poids des maladies de la surface oculaire, associant des symptômes douloureux intenses, des comorbidités émotionnelles et des altérations psychosociales, nous a conduit à en étudier les mécanismes sous-jacents. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués est un des enjeux cruciaux pour le développement de nouvelles stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire chronique.
Bénéfices attendus
Les douleurs chroniques de la surface oculaire entraînent, au-delà de la souffrance exprimée par les patients, une réelle altération de leur qualité de vie puisqu'on estime que près de 60 pour cent des patients sont gênés dans leurs activités quotidiennes. La prise en charge de la douleur chronique oculaire est actuellement un enjeu majeur alors que les traitements restent peu efficaces. Le bénéfice de ce projet est d’aboutir à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués, principalement inflammatoires et neurogènes, qui sont des enjeux cruciaux pour le développement de stratégies de prise en charge et thérapeutiques efficaces pour soulager la douleur oculaire.
Procédures
Deux modèles seront mis en œuvre dans le cadre de ce projet. Le modèle de douleur inflammatoire est induit par l’abrasion de la cornée effectuée sous anesthésie et analgésie (1 fois -10 minutes) associé à l’instillation de molécule inflammatoires le jour de l’abrasion lors de la même anesthésie (quelques secondes) et une seconde fois 3 jours après sur animal vigile par simple contention (quelques secondes). Le modèle de sécheresse oculaire est induit par exérèse des glandes lacrymales. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie et dure au maximum 15 minutes. Ces modèles reproduisant le contexte de la maladie étudiée sont réalisés sous anesthésie et analgésie dans le respect des normes et recommandations concernant le bien-être animal et l’éthique en vigueur Dans toutes les procédures, les animaux seront soumis à des tests de sensibilité cornéenne, d’imagerie de la cornée, avant, durant et après la mise en place des modèles mimant ces douleurs. Ces tests ne durent qu’entre 1 à 5 minutes. Ils seront réalisés 2 fois chez les souris modèles de douleur inflammatoire, 4 fois chez les souris modèles de sécheresse oculaire. - Test de sensibilité cornéenne : animal vigile (pas d’anesthésie), durée du test : 1 minutes/session - Imagerie de la cornée par biomicroscopie : animal anesthésié, 1 injection d’anesthésique et le test dure 3 minutes. - Imagerie de la cornée par imagerie confocale in vivo : animal anesthésié, durée du test : 5 minutes. Les examens ophtalmologiques se feront à l’aide de techniques non invasives (lampe à fente, biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’Homme par un ophtalmologiste sous anesthésie locale et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Le test de la sensibilité cornéenne se fera chez l’animal vigile contrairement aux études d’imagerie de la cornée qui nécessitent une immobilisation complète de l’animal et qui seront alors pratiqués sous anesthésie générale. Toutes les procédures comprennent une euthanasie qui sera réalisé selon une méthode réglementaire effectuée sous anesthésie générale et analgésie en vue des différents prélèvements pour analyses.
Impact sur les animaux
Des contentions de courtes durées et les injections sur animal vigile nécessaires aux anesthésies pourront être sources de stress ou d’inconfort pour l’animal. Les nuisances attendues dans les modèles de sécheresse oculaire sont celles observées chez l’Homme à savoir des picotements, des démangeaisons, des sensations de brulure, de corps étrangers dans l’œil, une sensibilité accrue à la lumière. L'anesthésie durant la chirurgie peut entrainer une détresse respiratoire ou cardiaque, une hypothermie. Les tests pratiqués peuvent engendrer une gêne transitoire de courte durée comme on peut le constater chez l’Homme
Devenir
Des prélèvements et analyses post-mortem sont nécessaires ce qui implique l’euthanasie des animaux à la fin de chaque procédure.
Remplacement
À l’heure actuelle, ce projet nécessite l’utilisation d’animaux car aucune alternative in vitro ne peut mimer la pathologie de sécheresse et douleur oculaire qui lui est liée. La complexité et l’interaction du circuit mis en jeu (cornée, ganglions trigéminés et cerveau) et activité du système immunitaire inné ne peuvent également être étudiés et remplacés par un modèle vitro. Bien que les questions soulevées par ce projet visent à mieux comprendre les mécanismes physiologiques mis en jeu dans cette pathologie chez l’Homme, il est d’abord nécessaire d’élucider ces points clés à travers l’utilisation d’un modèle rongeur. De plus, une veille bibliographique réalisée confirme qu’à l’heure actuelle, aucun model in silico n’existe pour répondre à ces questions.
Réduction
Nous utiliserons au maximum 1600 animaux dans ce projet. Afin de respecter la règle de réduction, notre étude portera sur plusieurs structures (cornée, ganglion trigéminal, cerveaux,) de chaque animal. Nous utiliserons un nombre limité de souris et de groupes tout en gardant la significativité des résultats via une analyse statistique adaptée. Ces effectifs ont été établis grâce à une calcul de puissance statistique.
Raffinement
Afin de réduire le stress et l’anxiété, les animaux seront reçus une semaine avant le début des expérimentations. L’hébergement des animaux est effectué en confinement adapté à la stabulation de lignés de souris. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compacté, tube en carton) et maintien des animaux en groupe de 5 congénères afin d’éviter le stress de l’isolement. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. La température de la zone d’hébergement est maintenue à température règlementaire et suit un cycle d’éclairage non inversé 12h jour/12h nuit. Les animaux seront observés et manipulés quotidiennement afin de minimiser le stress et la douleur qui seront évalués à l’aide de points limites validés par le comité local du bien-être animal en concertation avec les responsables de l’animalerie. Toute observation anormale sera notée dans un tableau des points limites et nous suivrons l’échelle décisionnelle que nous avons définie. L’application de cette échelle permettra de modifier la procédure en cours avec l’administration d’un traitement antalgique, et/ou de décaler dans le temps les actes prévus par la suite ou enfin d'euthanasier l’animal en dernier recours. Pour éviter toute souffrance les procédures de chirurgie se feront sous anesthésie générale associée à un protocole analgésique en pré-, per- et post-opératoire. Aucun acte ne sera entrepris avant que l’animal ne soit stabilisé pour ces différentes constantes. Les tests d’imageries qui peuvent induire un stress et nécessitent que l’animal soit immobile seront réalisés sous anesthésie générale légère.
Choix des espèces
Le développement de modèles précliniques chez la souris est hautement reconnu et utilisé en routine pour la recherche portant sur la douleur oculaire. La souris de laboratoire est l'animal de choix car (1) elle possède les structures oculaires et cérébrales adéquates, (2) nous avons accès à tous les outils génétiques requis. Ce projet nécessite l’utilisation de souris mâles adultes sauvages C57BL/6J, de souris mâles adultes issus des lignées transgéniques. Ces animaux arriveront à l’animalerie à l’âge de 7 semaines (poids environs 20-25g) afin de respecter une semaine d’acclimatation et seront utilisés à l’âge de 8 semaines (âge de la maturité sexuel). Cela permettra de travailler sur des souris adultes tout en évitant des biais liés au changement physiologique de l’animal vieillissant. En effet l’ensemble des procédures de ce projet durant entre 3 à 11 semaines maximum. Les souris auront donc au maximum 19 semaines en sortie de procédure.
Rôle des vésicules extracellulaires dans le développement du diabète
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Deux injections intraveineuses à sept jours d'intervalle, huit mesures de pression artérielle de dix minutes, six gouttes de sang prélevées, un capteur de télémétrie implanté sous la peau en vingt minutes, une fibrillation atriale déclenchée, une analyse de composition corporelle, deux prélèvements de tissus sur animal vivant. 288 souris Swiss vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, 72 d'entre elles vivant seules en cage depuis l'implantation du capteur jusqu'à la fin de l'étude, soit vingt et un jours. Le porteur leur injecte des vésicules extracellulaires prélevées chez des patients diabétiques, pour voir si elles provoquent chez l'animal la résistance à l'insuline qu'elles provoquent en culture cellulaire. Toutes sont tuées pour prélever des tissus.
Objectifs
Les patients souffrant d’obésité sont confrontés à un risque plus accru de développer des maladies cardiovasculaires et le diabète de type 2. Ce risque est d’autant plus élevé que la majorité de ces patients développent une résistance à l’insuline, une hormone qui permet l’absorption et le stockage du glucose dans les organes tels que le foie, le tissu adipeux et le muscle squelettique. Outre le développement du diabète de type 2, la résistance à l’insuline est, à long terme, responsable de plusieurs complications métaboliques telles qu’une dyslipidémie, une athérosclérose ou une hypertension artérielle. La résistance à l’insuline étant un état pathologique silencieux, il devient nécessaire de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses. Dans ce contexte, nous nous intéressons aux vésicules extracellulaires (VEs) libérées par les cellules de l’organisme. Ces VEs, impliquées dans la communication entre les cellules, sont considérées comme de nouveaux biomarqueurs de différentes maladies. Des travaux préalablement réalisés in vitro au sein de notre laboratoire ont démontré que les VEs circulantes de patients diabétiques induisent une résistance à l’insuline dans les cellules du foie et du tissu adipeux par des mécanismes bien distincts, ainsi qu’une accumulation de graisse. Ces effets ne sont pas observés avec les VEs circulantes de sujets sans diabète. La question posée ici est de vérifier si les VEs de patients diabétiques induisent également la résistance à l’insuline in vivo. L’objectif de ce projet est d’évaluer l‘implication des VEs de patients non diabétiques ou diabétiques, dans le développement in vivo du diabète chez la souris et les mécanismes mis en jeu.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les VEs participent aux altérations métaboliques associées au diabète. A long terme, ces résultats permettront de développer de nouveaux outils de diagnostic de l’apparition de la résistance à l’insuline chez les patients obèses et d’aborder de nouvelles stratégies thérapeutiques et préventives du diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires associées.
Procédures
SEPT INTERVENTIONS : (i) Injections intraveineuses : 2 injections (une injection tous les 7 jours dans toutes les procédures), durée de chaque injection < 5 min. (ii) Mesure pression artérielle : 8 mesures (8 jours), durée : 10 min/mesure (iii) Prélèvement de sang : 6 prélèvements d’une goutte de sang par souris à la fin du régime, durée de chaque prélèvement < 1 min. (iv) Implantation sous-cutanée : 1 implantation/animal, durée 20 min (v) Induction d’une fibrillation atriale : une fois, durée 20 min/animal. (vi) Analyse composition corporelle : une fois, durée 20 min/animal. (vii) Prélèvement tissulaire sur animal vivant : deux fois, durée 10 min/animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris seront les suivants : 1) Stress associé aux manipulations (échographie, IRM, prise de la pression artérielle sur animal éveillé, prise de poids, prise de la température avec une caméra thermographique, et injection de vésicules extracellulaires). Concerne tous les animaux ; 2) Stress et douleur (prise en charge avec une analgésie) associés à la chirurgie après l’implantation du capteur pour la télémétrie (concerne 72 animaux) ; 3) Douleur (prise en charge avec une analgésie) associés au prélèvement des tissus concerne 72 souris ; 4) Stress associé à l’isolement des souris après l’implantation du capteur pour la télémétrie et jusqu’à la fin de la procédure (concerne 72 animaux).
Devenir
Tous les animaux utilisés seront euthanasiés pour prélever des tissues qui permettront compléter les objectives initiales de l’étude.
Remplacement
Il n’existe aucun moyen de remplacer de telles études qui englobent l’ensemble de l’organisme dans sa réponse physiopathologique, et seule l’expérimentation animale permet un suivi complet des altérations métaboliques et cardiovasculaires associées au diabète, comme la résistance à l'insuline.
Réduction
Nous avons réduit le nombre de souris à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé pour chaque expérience en fonction des données de la littérature, de notre expérience avec ces modèles maitrisés au laboratoire depuis plusieurs années et à l’aide d'un logiciel statistique. Également, afin de réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons un même animal pour plusieurs mesures.
Raffinement
Pour favoriser la sociabilisation des animaux, nous mettrons au maximum 4 animaux par cage. Les animaux concernés par l’analyse des paramètres cardiaques par télémétrie seront placés dans des cages individuelles à partir de l’implantation du capteur télémétrique et seront maintenues dans ces conditions nécessaires pour permettre l’analyse individuelle dans les plateformes d’enregistrement jusqu’à la fin de l'étude, c’est-à-dire 21 jours. Pendant cette période, l’isolement des animaux sera compensé par de l’enrichissement. Ainsi, dans la cage, les animaux auront à disposition des cabanes pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. La mise en place de pointes limites adaptées aux différentes manipulations décrites dans chaque procédure permettra d’assurer que les animaux soient dans les meilleures conditions pendant la durée de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour cette étude est la souris Swiss. Comme en témoignent les résultats publiés par notre laboratoire, ces souris sont un bon modèle pour l’étude des maladies métaboliques et cardiovasculaires. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, pour lequel les animaux sont considérés comme jeunes adultes. A partir des 8 semaines d’âge, les rongeurs montrent une fonction métabolique du glucose optimale pour évaluer une possible altération avec le traitement de l’étude. En effet, le déclin de la fonction métabolique est décrit à partir de 10 semaines d’âge chez la souris.
Optimisation de traitements prometteurs pour la stéatose hépatique non alcoolique – Efficacité d’une approche thérapeutique par combinaison du traitement avec un anticorps.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une fausse route lors du gavage, et la souris est observée quelques heures puis tuée si elle ne récupère pas : c'est l'un des points limites de ce projet. 260 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur foie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries en permanence au régime riche en graisse pour développer une fibrose du foie, elles reçoivent un anticorps injecté deux fois par semaine pendant huit semaines et un médicament administré chaque jour par la bouche ou par piqûre, avec des prises de sang avant, pendant et à la fin. Le porteur attend des ulcérations aux points d'injection et une irritation de l'œsophage qui gêne l'alimentation, quand le bénéfice annoncé se limite à savoir si son anticorps ajoute quelque chose à deux médicaments dont l'un est déjà sur le point d'être approuvé.
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’une combinaison associant des traitements prometteurs et prochainement approuvés pour la fibrose dans la stéatose hépatique non alcoolique (NASH) et un anticorps pour une meilleure prise en charge de la NASH. Cette dernière, également connue sous le nom de maladie du foie gras, est la conséquence d’une alimentation trop riche en sucre et en graisse. Ce type d’alimentation va entrainer le stockage et l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui va conduire à une inflammation locale au sein de l’organe. Cette inflammation chronique va entraîner avec le temps le développement d’une fibrose dans 20% des cas. Au stade précoce, la NASH est souvent asymptomatique et est généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, pouvant évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie dans les cas les plus graves. Un premier médicament sera prochainement approuvé (résultat positive dans un essai clinique de phase III) pour le traitement de la fibrose dans la NASH. Cependant, il permet de retarder l’échéance en réduisant la fibrose dans seulement 24% des patients. Un second médicament très prometteur, le Sémaglutide montre une diminution de la fibrose hépatique mais seulement partielle. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser ces traitements. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cela suggère qu’une combinaison entre notre anticorps et ces traitements prometteurs pourrait améliorer l’efficacité du traitement des fibroses hépatiques. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de la combinaison entre des traitements prometteurs et prochainement approuvé et notre anticorps sur la progression de la fibrose hépatique dans la NASH.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à étudier l’efficacité d’une combinaison thérapeutique associant, des traitements prometteurs et prochainement approuvé pour le traitement de la fibrose hépatique dans la NASH et un anticorps. Les résultats de ce projet permettront d’évaluer l’efficacité de cette combinaison afin d’envisager l’utilisation de cet anticorps en combinaison avec l’un de ces traitements prochainement approuvés. Cela permettra une meilleure optimisation thérapeutique chez les patients atteints de NASH et de fibrose hépatique et contribuera à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.
Procédures
Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation. Les animaux recevront un traitement par un anticorps 2 fois par semaine pendant 8 semaines par injection. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral ou par injection (en fonction du médicament administré) par un médicament, quotidiennement pendant 8 semaines. Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Un prélèvement de sang sera réalisé avant et pendant le traitement afin d’évaluer l’évolution de la fibrose hépatique. Avant d’effectuer ces prélèvements de sang, les souris recevront un anesthésiant local puis ces dernières auront une anesthésie générale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ. Les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute. Lors de la 15ème semaine de régime riche en graisse, des prélèvements seront réalisés sur 5 souris. Ces prélèvements seront faits à 0, 6h, 24h, 72h et 7 jours après l’injection de l’anticorps. Cela permettra de mesurer la concentration de l’anticorps dans le plasma et de déterminer sa demi-vie plasmatique. Ces prélèvements seront réalisés sur animaux sous anesthésie locale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ.
Impact sur les animaux
Les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Le traitement oral peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir et donc une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections et au traitement oral. Il sera également prévu une habituation au traitement oral à l’aide d’une sonde trempée dans une solution de glucose. Des points limites spécifique au projet ont également été établis faisant référence aux injections : apparition d’une induration au niveau des sites d’injection du traitement et au traitement oral : fausse route, animal observé dans les heures qui suivent et sacrifié si état satisfaisant non recouvré.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).
Validation d’un protocole de thérapie génique et essai pré-clinique dans un modèle murin pour une neuropathie fatale chez l’Homme
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Une injection intraveineuse sous anesthésie générale, jusqu'à cinq prises de sang à la veine mandibulaire réparties sur douze mois, et cinq séries de cinq tests moteurs et sensitifs : les souris de ce projet portent la mutation d'une neuropathie mortelle et sans traitement chez l'être humain. 1 200 animaux vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour la plupart et modéré pour 180 d'entre eux. Le porteur affirme que le phénotype de la lignée ne diffère pas du modèle sauvage pendant les douze mois d'expérimentation, tout en indiquant ailleurs que les défauts moteurs et sensoriels apparaissent dès trois mois aux tests comportementaux, ces mêmes tests servant à mesurer l'efficacité de la thérapie génique. Les anciens reproducteurs et les animaux au génotype non voulu sont tués, ceux du protocole sont tués pour prélever leurs organes, et une partie de la production part vers les autres projets de l'équipe en utilisation continue.
Objectifs
Ce projet concerne l'élevage d’une lignée de souris modèles d’une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle il n’existe aujourd’hui aucun traitement, et le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour cette pathologie. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme. Précédemment, nos collaborateurs ont développé un modèle souris qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. L’objectif de cette étude est d’élever les animaux nécessaires pour pouvoir évaluer les bénéfices de ce protocole de thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ses bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.
Bénéfices attendus
La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique rare (50 familles identifiées dans le monde). De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidence des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives
Procédures
Les animaux auront un prélèvement d’un petit fragment de queue pour connaitre leur patrimoine génétique (1min par animal, une seule fois). Une partie des souris recevront une injection intraveineuse (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Une partie des souris auront 5 prélèvements sanguins maximum répartis sur 12 mois (durée : 5mn) au niveau de la veine sous mandibulaire sous anesthésie générale. Ces mêmes animaux réaliseront 5 fois une série de tests comportementaux moteurs et sensitifs (5 tests comportementaux répartis sur 5 jours, durée : entre 30s et 15mn par test) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique. Les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
L’injection intraveineuse, et les prises de sang par la veine sous mandibulaire pourront induire un stress faible chez les animaux et un léger inconfort au site d’injection ou de prélèvement respectivement. Un risque d’hypothermie et d’arrêt respiratoire lors des anesthésies reste possible mais très rare. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modéré. Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact ici sachant que les souris sont maintenues jusqu’à 12 mois au maximum. Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement de queue pour connaitre leur patrimoine génétique.
Devenir
les anciens reproducteurs et les animaux porteurs de genotypes non souhaités seront euthanasiés. Les animaux utilisés pour évaluer les bénéfices de la thérapie devront être euthanasiés pour le prélèvement d’organes post mortem pour l’analyse. Une partie des animaux produit sera en utilisation continue dans nos autres projets de recherche.
Remplacement
Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire etcellulaire de cette approche. Cette approche thérapeutique nécessite d’être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyser nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet. Les accouplements seront contrôlés afin de générer que les animaux nécessaires pour le projet. Un total de 1200 animaux est prévu pour le projet.
Raffinement
Nos animaux seront hébergés dans une animalerie agréée avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Ils bénéficieront d’un enrichissement règlementaire. Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’injection intraveineuse de notre thérapie génique est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voire 1 jour entier est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis et seront respectés pour soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Avec 98 pourcents d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude de caractérisation du modèle utilisé dans ce projet a montré qu’il reproduit pour la première fois les désordres moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients atteints de neuropathies à axones géants, justifiant son utilisation pour valider notre approche de thérapie génique. Les souris seront prélevées pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) pour l’injection. En effet, les premiers symptômes se développant chez l’Homme à 2 ans, il est nécessaire de débuter la stratégie le plus tôt possible afin d’être le plus en amont possible afin de limiter au mieux les symptômes (1 mois) et de la poursuivre jusqu’au stade adulte (12 mois) pour valider notre protocole et évaluer ses bénéfices au niveau comportemental et histologique. Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels (visibles uniquement au moment de tests comportementaux à partir de 3 mois). Un phénotype dommageable est développé par les souris à partir de 15 mois ce qui n’aura pas d’impact dans notre projet sachant que nos animaux seront maintenus jusqu’à 12 mois au maximum.
Evaluation de la biodisponibilité des métabolites de la vitamine D par cinétique plasmatique et leurs effets sur l’homéostasie du calcium et du phosphore chez la truite arc-en ciel.
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Tuées à la fin de la procédure parce qu'au-delà de mille grammes elles ne peuvent plus être utilisées, 48 truites arc-en-ciel subissent des procédures d'un niveau de souffrance léger. Un transpondeur leur est enfoncé dans le muscle, une gélule leur est introduite dans l'œsophage à la pipette, puis leur sang est prélevé de façon répétée à la queue pendant sept jours, chaque sortie hors de l'eau durant moins de trente secondes. Le porteur attend des régurgitations, des lésions de l'œsophage et des branchies, des saignements et des ecchymoses au bout de la queue, ainsi qu'une circulation réduite dans la nageoire caudale. L'objet réel est de comparer des formes de vitamine D3 déjà vendues pour l'alimentation des salmonidés d'élevage, la truite étant retenue parce qu'elle grossit vite et supporte mieux la manipulation que le saumon atlantique.
Objectifs
Chez les vertébrés terrestres et les poissons, deux réactions chimiques sont nécessaires pour convertir le cholécalciférol alimentaire (vitamine D3) en sa forme active. Il est désormais reconnu, y compris chez les poissons, que la forme active de la vitamine D3 est non seulement essentielle à la santé des os, mais qu'elle régule également une myriade de processus physiologiques, notamment la fonction immunitaire, le métabolisme des nutriments, la croissance et la différenciation cellulaire. Les salmonidés déficients en vitamine D3 présentent une croissance réduite, des dommages au bout des nageoires, une peau plus fine, des modifications de l'épithélium branchial, des lésions hépatiques et un faible taux de calcium dans le sang. Un apport alimentaire en vitamine D3 est donc essentiel pour les poissons. Malgré son importance pour la santé et le bien-être, les niveaux de vitamine D3 dans les aliments pour poissons ont diminué d'année en année en raison de la formulation de régimes alimentaires davantage à base de plantes pouvant contenir des facteurs antinutritionnels impactant l'absorption et l'utilisation de la vitamine D3 par les poissons. Des études ont montré que la supplémentation alimentaire en métabolite intermédiaire de la vitamine D3, était plus efficace que l'addition de vitamine D3 chez le poisson pour produire le principal métabolite circulant chez les salmonidés, essentielle à l’homéostasie du calcium et du phosphore et à la prévention de taux élevé de calcium dans le sang due à un taux élevé de vitamine. Toutefois, peu de données sont disponible sur l’ajout de la forme hormonalement active de la vitamine D3, dans les aliments pour poissons dont la demi-vie pourrait être trop courte pour qu'il constitue un additif alimentaire bénéfique pour les poissons. Un essai in vivo est nécessaire chez le poisson pour évaluer les effets homéostatiques des apports alimentaires en métabolites de la vitamine D3. Les données de ce projet permettront d’identifier le métabolite le plus sûr, le plus efficace et le plus bénéfique pour l’apport de vitamine D3 dans les régimes alimentaires pour les poissons.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de comparer l'efficacité et l'innocuité des différents métabolites de la vitamine D3 disponible actuellement sur le marché afin de définir correctement la stratégie de supplémentation en vitamine D3 chez les salmonidés. Ils permettront aussi d’établir si les métabolites sont biodisponibles de la même manière et leur effet sur l’homéostasie plasmatique du calcium et du phosphore.
Procédures
Les animaux seront soumis à la procédure pour une durée de 7 jours. La piqure d’aiguille pour l’injection du transpondeur et de l’analgésique entraine une douleur légère de courte durée. Les prélèvements sanguins répétés entrainent une douleur légère de courte durée. Les sorties des animaux hors de l’eau entrainent un stress physique de courte durée (
Impact sur les animaux
Régurgitation après gavage, dommages au niveau de l'œsophage et des branchies, dommages au niveau de la queue (saignement mineur au site de prélèvement sanguin, ecchymose à l'extrémité, circulation périphérique restreinte dans la nageoire caudale.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure, les animaux de plus de 1000 g ne peuvent plus être utilisés.
Remplacement
La procédure expérimentale est nécessaire et ne peut pas être remplacée par une autre stratégie n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Elle porte sur le métabolisme et les actions endocriniennes des métabolites alimentaires de la vitamine D3 chez l'animal. En raison des actions endocriniennes des métabolites de la vitamine D3 et de l’absence de modèles in vitro permettant de mesurer leur absorption et leur métabolisme, des études in vivo restent indispensables.
Réduction
Sur la base de résultats obtenus dans des études antérieures sur la concentration plasmatique en vitamine D3 chez la truite arc en ciel, des calculs statistiques détaillés ont été réalisés afin de déterminer le nombre minimum d'animaux à utiliser, l’animal étant considéré comme l’unité expérimentale. Le nombre d'animaux a utilisé permettra d'obtenir une densité adéquate pour favoriser une hiérarchie sociale essentielle au bien-être des animaux et d’avoir suffisamment d’échantillons biologiques pour répondre aux objectifs de ce projet. Le nombre d'animaux et la conception expérimentale de ce projet ont été établis en suivant une approche statistique validée par un biostatisticien.
Raffinement
Avant toute manipulation (pesée ou prélèvement) au cours d’une étude, les truites arc en ciel sont sédatées puis anesthésiées . La capture et le stress dus à la sortie des bassins (moins de 30s avant d’être anesthésiés) pour la pesée par groupe des animaux et pour le marquage au-dessus de la ligne media et les prises de sang (approche ventrale) sont réduits par une manipulation délicate des animaux par les applicateurs, un séchage modéré des poissons, le port de gants, l’utilisation d’un mousse humide pour poser l’animal sur le support de contention et d’un point de pression sur le site de prélèvement comme décrit dans une procédure interne qui définit le volume limite de prélèvement sanguin et les périodes de récupération nécessaires. L’introduction intra-musculaire du transpondeur , se fera entre le début de la nageoire dorsale et la tête, en direction a la tête de l'individu et pas en position péritonéale qui génère plus de souffrance. Utilisation d'un analgésique en plus de l'anesthésique afin de réduire la douleur après l’introduction du transpondeur. Ceci permettra une meilleure récupération et une réduction des effets secondaires comme les frottements de l'animal contre les murs. La dose utilisée est celle recommandée par notre vétérinaire référent pour les poissons. Pour l'administration de la gélule, une pipette graduée de laboratoire en plastique sera introduite superficiellement dans l'œsophage. Les conditions d’hébergement des animaux sont définies de telle sorte que la densité des animaux par bassin, les paramètres environnementaux (température…) ou encore la qualité d’eau procurent le maximum de confort aux animaux, et restent supérieurs ou égaux à la législation en vigueur. Aucun animal ne reste isolé sans contact visuel ou tactile avec ses congénères, ceci afin de réduire au minimum l’angoisse et le stress des animaux.Un minimum de deux observations quotidiennes des animaux est réalisé afin de détecter prématurément des signes cliniques de dommages corporels et pour vérifier que les poissons s’alimentent correctement. Dès l’observation d’un signe clinique, les animaux sont suivis au moyen d’une grille de score de point limites.
Choix des espèces
L’'espèce utilisée est la truite arc-en-ciel, elle est représentative de la famille des salmonidés. La truite est également une espèce intéressante en soi car elle est largement élevée en Europe. En raison de ses taux de croissance plus rapides et de sa sensibilité réduite au stress de manipulation, la truite arc-en-ciel est un animal de laboratoire plus approprié que le saumon d’'Atlantique . L'utilisation et le métabolisme de la vitamine D3 ne sont pas différents entre la truite et le saumon d’'Atlantique. Utilisation de truites adultes pesant 1000 grammes au démarrage de la procédure. Cette taille est nécessaire pour pouvoir effectuer des prélèvements sanguins répétées et rapprochés avec une période de récupération minimale et suffisante de 1 jour, sauf pour les deux premiers prélèvements qui seront faits le même jour.
Etude de l’effet de dérivés d’hormones sexuelles sur l’inflammation
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
148 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection dans la veine de la queue et une sonde de température implantée sous la peau, 48 subissent une prise de sang sous anesthésie et 133 une prise de sang terminale. Le traitement doit déclencher une inflammation générale et de la fièvre, pour tester si des dérivés d'hormones sexuelles provoquent les crises de la fièvre méditerranéenne familiale, dont les mécanismes restent inconnus. Le porteur écrit que l'analyse in vivo est "indispensable" et que la réponse aux hormones sexuelles n'est modélisable ni en culture cellulaire ni en organoïde, d'où son intérêt pour un "organisme entier".
Objectifs
La pyrine est un composant de l’immunité. Des mutations sur la protéine pyrine causent des maladies inflammatoires, dont la fièvre méditerranéenne familiale. La fièvre Méditerranéenne familiale se caractérise par des épisodes qui se répètent dans le temps de douleur abdominale intense liée à des phénomènes d’inflammation. A ce jour, les mécanismes responsables de ces flambées inflammatoires chez les patients demeurent inconnus. Certaines hormones sexuelles seraient capables de déclencher les crises inflammatoires. Le but de ce projet est de tester cette hypothèse dans un modèle murin où l'inflammation sera suivie dans le temps.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur l’activation et la régulation de l'immunité) et cliniques (thérapies pour lutter contre les flambées inflammatoires des patients).
Procédures
Tous les animaux du projet subiront une injection intraveineuse, qui durera 30 secondes dans la veine de la queue et une injection sous-cutanée, qui durera 30 secondes d'une sonde de température. 48 animaux subiront une prise de sang sous anesthésie, l'intervention durera 2minutes environ. 133 animaux subiront une prise de sang terminale sous anesthésie sans réveil, l'intervention durera 5minutes environ.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures (injections intraveineuses ponctuelles ; prélèvements de sang sous anesthésie ; mesure de poids, pose de sonde de température) sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. Les traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires (baisse de température, anesthésie) et une inflammation systémique qui se traduit par de la fièvre.
Devenir
Procédure 1 : réutilisation des animaux lors de la procédure 2. Procédure 2 : Euthanasie des animaux pour réaliser une deuxième prise de sang (terminale) chez les même animaux (réduction du nombre d’animaux utilisés) Procédure 3 : euthanasie des animaux (prise de sang terminale)
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests déjà réalisés in vitro) et pour s’assurer d’une potentielle pertinence clinique. La réponse physiologique aux hormones sexuelles n’est pas modélisable in vitro, ni dans de systèmes plus évolués tels que les cultures tridimensionnelles ou organoïdes. D’où l’intérêt de travailler sur un organisme entier, sur lequel il est possible d’étudier la réponse inflammatoire globale de l'organisme.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus, l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec des « essais pilotes » déterminants. Une réutilisation des animaux est prévue suite à la première procédure pour réduire le nombre d'animaux du projet. Le nombre d'animaux est calculé au minimum en fonction des résultats attendus et des tests statistiques qui seront appliqués.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Habituation des souris à la contention (i.e. la manipulation de souris) (une fois par jour, une semaine avant le début de l’expérience) pour minimiser l'angoisse des souris lors de l'expérience . 2) Anesthésie gazeuse pour chaque acte potentiellement douloureux pour la souris 3) Utilisation d'implants avec une transmission du signal pour prendre la température à distance sans introduction anale répétée 4) Minimisation de la fréquence de manipulation 5) Les animaux dont la température diminue seront placés dans des cages sur portoirs chauffants. Les doses de traitement et la fréquence d’administration des molécules résultent de plusieurs retours d’expériences bibliographiques.
Choix des espèces
Il est nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo), avec un fonctionnement immunitaire et hormonal reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain (vertébré Mammifère). La souris en est un modèle idéal du fait des outils disponibles pour suivre l'inflammation et de la possibilité de manipulation génétique qui permet de mieux comprendre les mécanismes. Les expériences débuteront à l’âge de 6-8 semaines ce qui correspond à des souris avec un système immunitaire mature. L’âge des animaux sera de 8-10 semaines maximum en fin de procédure expérimentale.
Rôle de l’inhibition de TREM-1 sur la prévention et le traitement du carcinome hépatocellulaire sur cirrhose métabolique EU2/2
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Génétiquement privées du récepteur TREM-1, des souris mâles reçoivent un antibiotique injecté deux jours après leur naissance puis un régime riche en graisse qui les fait passer du foie gras à la cirrhose puis au cancer du foie. 104 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit selon son groupe de 4 à 40 injections dans le ventre sur animal éveillé, trois anesthésies gazeuses et deux aller-retours entre l'animalerie et un service d'imagerie situé à cinq cents mètres. La mise à mort intervient entre la vingtième et la vingt-deuxième semaine de vie, une fois le cancer installé, et le porteur qualifie d'indolore cette évolution provoquée par l'alimentation.
Objectifs
Le cancer du foie est le 6° cancer le plus fréquent et la 3° cause de décès par cancer dans le monde. Il survient sur un foie avec une inflammation et en situation de cirrhose. Le traitement de référence est une immunothérapie mais elle ne fonctionne que chez un patient sur 3. Aussi, nous souhaitons voir si un traitement de l’inflammation, déjà efficace dans d’autres pathologies inflammatoires, combiné à l’immunothérapie, permettra de retarder ou éviter l’évolution vers le cancer dans un modèle de souris mâles développant tous les stades d’évolution depuis la cirrhose jusqu’au cancer du foie. Des imageries par scanner seront réalisées pour évaluer l’effet préventif, ou curatif, ou complémentaire de l’immunothérapie. Ce projet sera réalisé au sein de deux établissements utilisateurs, un établissement pour l'hébergement et un établissement spécialisé dans les imageries.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de comprendre et étudier les mécanismes bénéfiques d’un médicament régulant l’inflammation sur le cancer du foie avancé développé sur un foie gras et inflammé, et d’évaluer sa complémentarité avec l’efficacité antitumorale de l’immunothérapie.
Procédures
Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU1 : - La maladie du foie gras sera provoquée chez les souris en leur injectant un antibiotique, appelé streptozotocine, juste après leur naissance, et cela prendra seulement 5 secondes par souris. Ensuite, après avoir été sevrées, elles recevront une alimentation riche en graisse. - Le traitement par le médicament régulant l’inflammation du foie se fera par injections dans le ventre 4 jours par semaine en suivant un plan spécifique pour chaque groupe de souris. Chaque injection prendra environ 3 secondes par animal. - Le traitement par immunothérapie se fera par des injections dans le ventre 1 jour par semaine avec des injections à partir de la semaine 18 pour les groupes d’étude concernés. Les interventions suivantes seront réalisées au sein de l'établissement utilisateur EU2 : - Une imagerie du foie sera réalisée en utilisant un scanner, pendant que les souris seront sous anesthésie générale. Cette procédure sera effectuée par du personnel qualifié et avec le matériel approprié pour les souris, incluant une plaque chauffante et un suivi des signes vitaux. Cela prendra entre 2 minutes par souris. L'agent de contraste pour l’imagerie sera administré qu’une seule fois pour toute la durée de l’étude.
Impact sur les animaux
- Injection à J+2 de vie + séparation du souriceau de la mère de quelques minutes classée légère. - Au sevrage, régime riche en graisse provoquant l’évolution de la maladie jusqu’au carcinome hépatocellulaire à partir de la semaine 16 classé légère. - 4, 16, 20, 40 injections intra-péritonéales sur souris vigiles selon les groupes d’étude classée modérée. - 3 anesthésies gazeuses par individus de 5 minutes chacune (1 pour réaliser une injection de produit de contraste en veine caudale + 2 pour réaliser les imageries) classée légère- 2 aller-retours entre l’animalerie centrale et animalerie d’imagerie, distante de 500 mètres classée légère.
Devenir
Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude et les procédures.
Remplacement
A nos jours, il n’existe aucune approche in vitro pour étudier l’apparition et l’évolution de la stéato-hépatite métabolique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire. Une étude chez l’animal est indispensable pour mettre en évidence l’effet de l’inhibition d'un récepteur de l'immunité associé ou non à l’immunothérapie sur l’ensemble des paramètres contribuant au développement de cancer du foie.
Réduction
Nos résultats préliminaires de la mise en place de ce modèle nous ont permis de calculer et de fixer le nombre de 104 souris mâles de façon optimale, en nous appuyant sur une méthode statistique adéquate. L'utilisation de l'imagerie permet donc de limiter le nombre d’animaux utilisés, car non invasive.
Raffinement
Dès leur réception, les souris parents auront une période d’acclimatation d’une semaine pour s’adapter à leur nouvel environnement avant de réaliser les accouplements. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, enrichissement) à leur bien-être. Une observation quotidienne du bien-être animal avec une grille d’évaluation de l’état des animaux et une pesée tous les 3 jours seront réalisés pour tous les animaux tout au long du projet. Les injections chez les souriceaux mâles puis au long de l’étude seront réalisées par un zootechnicien expert sur animal vigile. Le régime riche en graisse administré à partir de la 4ème semaine de vie (dès le sevrage), conduit à l’évolution de la maladie jusqu’au cancer du foie de manière indolore. Après la phase de sevrage, les souris seront hébergées en petit groupe cage avec des divers types d’enrichissements, tels que : des cylindres de coton et/ou des nids de papier, afin de permettre aux souris de construire des nids confortables, ainsi que des Mini Dômes comme refuge. Des petits bouts de bois non toxiques seront fournies afin de permettre aux souris d'assouvir leur besoin de ronger. Des tunnels ou des abris afin de permettre aux souris de se cacher et d'explorer leur environnement. Les stades d’évolution de la maladie seront évalués de manière non invasive par scanners, sous anesthésie générale sans douleur, avec une seule injection du produit de contraste pour toute la durée du suivi sur plusieurs semaines. Durant l’examen, les animaux seront surveillés par un monitoring respiratoire. Si l’animal présente une détresse respiratoire, il sera immédiatement retiré de l’appareil, soigné et surveillé jusqu’au réveil.
Choix des espèces
Les principaux modèles des maladies chroniques du foie ont été validés internationalement sur des souris ou des rats. Nous avons une bonne connaissance des modèles murins et de plus, le choix de l’espèce « souris » se justifie par l’existence du modèle invalidé génétiquement pour le récepteur d’intérêt permettant d’étudier le(s) rôle(s) spécifique(s) de l’inflammation dans la maladie du foie gras non alcoolique et du cancer du foie. Les souriceaux débuteront le protocole à J+2 de vie et seront issus de souris gestantes et le termineront à la semaine 20 ou 22 selon les groupes d’étude.