Recherche appliquée

Établir le dossier préclinique d'une molécule anticancéreuse avant de premiers essais chez l'humain passe ici par six modèles de cancer colorectal humain greffés sous la peau de souris privées de système immunitaire. 540 souris de cinq à six semaines vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au 56e jour ou plus tôt si un point limite est atteint. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous anesthésie gazeuse, puis trois injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, sur animal vigile. Le porteur indique que l'efficacité du produit a déjà été validée sur lignées cellulaires "par toutes les techniques pertinentes", et que le passage chez la souris devient "nécessaire" pour l'évaluer sur un "organisme entier".

Objectifs

Le cancer colorectal est l’un des cancers le plus fréquent dans le monde avec, en 2020, 1,93 millions de nouveaux cas et 916 000 de décès. En France, il constitue le troisième cancer le plus fréquent chez l’homme et le deuxième cancer le plus fréquent chez la femme. La mise en place du programme de dépistage organisé en France permet la prise en charge des patients à un stade précoce et améliore ainsi le pronostic de ces patients. Malgré cela la majorité des patients sont diagnostiqués alors que la maladie est à un stade avancé, diminuant fortement l’espérance de vie des patients, et cela en dépit des avancées thérapeutiques. Récemment, de nouveaux traitements ont permis une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Dans ce sens, une molécule a été mise en évidence pour son efficacité à stimuler le système immunitaire. Le présent projet vise à établir évaluer l’efficacité cette nouvelle molécule dans ces différents modèles de cancer colorectal humain chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la démonstration de l’efficacité anti-tumorale d’une nouvelle molécule dans le traitement des cancers colorectaux. Ces résultats sont nécessaires afin de procéder à l’évaluation ultérieure de ce produit dans le cadre d’études cliniques précoces chez l’Homme.

Procédures

Pour chaque souris : - 1 injection sous-cutanée de cellules tumorales sous vapeur d’isoflurane (3,5 %) (durée < 1 minute) - 3 injections intraveineuses (animal vigile) du composé testé ou intrapéritonéales du contrôle positif + contention (durée < 5 minutes)

Impact sur les animaux

- Douleur de courte durée lors de l’injection des cellules tumorales en sous cutanée (quelques secondes maximum) - Injection dans la veine caudale : douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable) - Douleur de courte durée lors de l’injection intrapéritonéale (quelques secondes maximum) - Stress lié à la contention et aux mesures des volumes tumoraux cutanés (quelques minutes maximum) - Perte de poids < 10% et transitoire (moins de 24h) suite à l’injection de notre produit sous forme liposomale - Gêne à la locomotion, nuisances possibles si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 56 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre produit a été validé sur les lignées cellulaires par toutes les techniques pertinentes pour l’étude de notre produit. Le passage chez la souris, est désormais nécessaire pour évaluer l’effet du produit sur un organisme entier.

Réduction

La procédure sera réalisée sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. La partie mise au point sera réalisée de façon séquentielle afin d’arrêter cette mise au point dès que la prise tumorale sera suffisante.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Les souris seront observées trois fois par semaine en surveillant leur état général, leur comportement (activité, isolement…), des critères physiques (poils hérissés, dos voussé (signe de douleur chez la souris) …), ou le moindre signe de douleur. Lors des manipulations, les souris seront anesthésiées sous vapeur d'Isoflurane. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mise en place des mesures nécessaires afin que le bien-être de l’animal soit respecté. Si souffrance animale, de la buprénorphine sera injectée aux souris. Chaque cage présentera des enrichissements (cotons de nidation, tunnel).

Choix des espèces

Les souris sont particulièrement adaptées pour l’étude des cancers. La souris immunodéprimée (déprouvue de système immunitaire) est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Chacun des 15 360 poulets reçoit, à son arrivée, une dose exacte de bactérie pathogène administrée par une sonde de gavage. Tous relèvent d'un niveau de souffrance modéré, avec pour effets attendus un retard de croissance, une boiterie notée au Gait Score et des fèces plus liquides. L'objet déclaré est de caler un modèle d'infection reproductible chez le poulet de chair à croissance rapide, afin d'y tester des additifs alimentaires censés remplacer les antibiotiques et améliorer les "performances zootechniques". 1 250 oiseaux sont tués pour des biopsies du foie, de la rate et de la moelle osseuse, et les 14 110 autres partent, à 32 jours, dans le circuit alimentaire humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’élaborer un modèle répétable d’inoculation d’une souche pathogène d’E. cecorum, afin d’en préciser et d’en mesurer les effets sur les poulets de chair. Le modèle d’inoculation doit permettre de tester des solutions alternatives à l’utilisation d’antibiotique, en favorisant l’intégrité intestinale dans le but de prévenir la translocation d’E. cecorum.

Bénéfices attendus

L’efficacité des additifs alimentaires apportés dans la ration des poulets de chair vis-à-vis des impacts des pathologies liées à E. cecorum sera évaluée par rapport au lot témoin. On attendons un effet positif sur : - Les performances zootechniques des animaux (poids moyen, gain moyen quotidien, consommation, journalière et l’indice de consommation) - La qualité de l’intégrité intestinale - La qualité du système locomoteur

Procédures

Durée prévue du protocole : 32 jours Mesures prévues : 0/ Les animaux seront infectés par voie orale, à la mise en place. Chaque animal sera inoculé par voie orale de façon individuelle par sonde de gavage, ainsi la quantité réelle administrée correspondra à la dose exacte de bactérie (et sera donc contrôlé et répétable). Soit 1 intervention de 3h en parallèle de la mise en place. 1/ Pesée (4 interventions de 2h) des animaux par case (64 animaux) le jour de leur arrivée, à 10 jours d’âge et 21 jours d’âge, et la veille de leur départ, afin d’établir pour chaque case le poids moyen des poulets, leur croissance et l’indice de consommation. Les éventuels morts seront ramassés chaque jour et pesés individuellement. Ils seront pris en compte dans le calcul des indices. 2/ Des écouvillons cloacaux à 0 et 5 jours d’âge (2 interventions de 2h) pour mesure la qualité d’infection. 3/ Des prélèvements de fèces à 10, 21 et 32 jours d’âge (3 interventions de 1h) : la boite est placée dans chaque case la veille de la récolte. Les fientes prélevées permettront de mesures des facteurs de l’intégrité intestinale. 4/ L’infection d’E. cecorum sera évaluée grâce à des biopsies au niveau du foie, de la rate, et de la moelle osseuse seront réalisées sur un total de 48 oiseaux, à 10 et 21 jours d’âge (2 interventions de 1h). Au total, il y aura 5 interventions à des âges différents, représentant 17h d'intervention : J0 : Pesée + Mise en place + Ecouvillons cloaquaux = 4h ; J5 : Ecouvillons cloaquaux = 2h ; J10 Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J21 : Pesée + Prélèvement fèces + Biopsies = 3h + 1h ; J32 : Pesée + Prélèvement fèces = 3h.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront montrer les effets indésirables suivants : un retard de croissance, une moindre mobilité des animaux (notation de boiterie via le Gait Score) et un aspect des fèces plus liquide.

Devenir

Procédure 1 : Nombre d'animaux qui seront autopsiés au total sur le projet : 1250 (à différents âges pour des biopsies). Nombre d'animaux gardés en vie (replacés afin d’être valorisés dans le circuit alimentaire humain, étant conforme au paquet hygiène ) : 14110.

Remplacement

Avant de tester un additif sur poulet, des simulations informatiques seront testées afin de mettre en place seulement celles intéressantes nutritivement. De plus, avant de mettre en place des études sur poulets nous travaillons avec des modèles in vitro (analyses en laboratoire) permettant de vérifier l’efficacité de nouvelles plantes, additifs ou matières premières. Seuls ceux efficaces après ces premiers tests seront testés in vivo, afin d’observer leur appétence et leur effet sur les performances et l’immunité des animaux. De plus, compte tenu de notre expérience d’essai (plus de 20 ans de données dans nos fermes de recherche zootechniques), nous avons accès à une très grande quantité de données. Toutes ces data nous permettent de réaliser des tests statistiques avant chaque essai, pour valider que nous aurons une probabilité importante d’obtenir des résultats significatifs avec le plus faible nombre d’animaux possible.

Réduction

Nous utilisons au total 15 360 poulets sur ce projet. L'utilisation d'animaux homogènes sur les plans biologiques et sanitaire, nous permet de réduire la variabilité d'un individu à l'autre et donc d’obtenir un nombre minimum d’individus par lot. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les poulets seront élevées dans le respect de la réglementation : logées sur aire avec copeaux et auront constamment accès à une eau propre ainsi qu’à l’aliment. Ils vivront en groupe et ne seront pas isolées. La surveillance des animaux se déroulera de manière très rapprochée puisque des prélèvements sont prévus toutes les semaines et une surveillance quotidienne sera faite par l’animalier.

Choix des espèces

Les infections à Enterococcus cecorum provoquent spécifiquement chez le poulet (Gallus gallus) des problèmes locomoteurs associés à une altération du bien être animal, et une baisse des performances zootechniques. Les poulets utilisés auront de 1 à 32 jours d’âge, soit la durée classique d’élevage d’une poulet de chair standard.

Tués au terme d'une dernière intervention menée sous anesthésie sans réveil, pour que leurs organes soient prélevés, 720 souris et 720 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles sont ovariectomisées à quatre semaines pour reproduire une ménopause, reçoivent des hormones jusqu'à six mois, subissent de deux à quatre chirurgies et passent des séjours de vingt-quatre heures en cage métabolique individuelle, jusqu'à deux fois par semaine. S'y ajoutent jusqu'à vingt-quatre prélèvements de sang, à la queue ou à la veine saphène, sur animal vigile. Le porteur teste des molécules dont ses clients ne lui communiquent ni la nature ni les effets secondaires possibles, prévoit trente études sur cinq ans, et indique qu'aucun test statistique n'a servi à fixer la taille des groupes, arrêtée à huit animaux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets fonctionnels et morphologiques de candidats médicament sur l’appareil urinaire dans un modèle mimant la ménopause. Nous pensons réaliser 3 études par an et par espèce, soit sur 5 ans 30 études.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les symptômes de la ménopause.

Procédures

Les animaux vont recevoir des traitements pharmacologiques ou hormonaux (fréquence dépendante de chaque protocole expérimental pouvant aller de quelques jours à 6 mois selon les procédures) donc vont être manipulés régulièrement. Chaque administration classique durera 30 sec – 1 min en moyenne. Ils pourront également subir plusieurs chirurgies allant de 10 à 30 minutes environ. Au maximum, les animaux auront 4 chirurgies et 2 au minimum. Les animaux iront dans des cages à métabolisme pour la collecte d’urine où ils seront en cage individuelle pendant 24H. Selon le protocole expérimental, plusieurs sessions de cages à métabolisme pourront être réalisées mais pas plus de deux par semaine sur une période de 6 mois maximum. Des prélèvements sanguins sur animal vigile pourront être réalisés à la queue ou à la veine saphène (1 prélèvement maximum par semaine sur un suivi total de 6 mois d’expérimentation). Sur animal anesthésié, des prélèvements terminaux pourront être réalisés. La fréquence des prélèvements est dépendante de chaque protocole expérimental et peut aller de 1 à 24 (1 prélèvement par semaine pendant 6 mois). Ces gestes étant réalisés par du personnel qualifié seront rapides (5 min max).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Cependant, nos clients ont déjà des données sur l’innocuité des doses utilisées et les doses testées n’engendrent pas d’effets toxiques. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). Les animaux auront des chirurgies pour mimer la ménopause ou pour les traitements hormonaux, par conséquent, les animaux pourront avoir les mêmes symptômes cliniques que chez l’homme (humeur et comportement changeants notamment avec les hormones). De plus, toute chirurgie peut provoquer des douleurs, des saignements, un certain mal-être.

Devenir

Tous les animaux de l’expérience seront mis à mort car la dernière intervention de cette procédure se réalise sous anesthésie sans réveil et des organes seront collectés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des symptômes de la ménopause. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer les symptômes dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments ou nouvelles hormonothérapies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle) pour certains paramètres. Pour mesurer certains paramètres, nous utilisons des méthodes non invasives telles que des cages métaboliques. Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. La méthode nous permettant d’analyser la fonction vésicale et principalement la fuite urinaire se réalise sur des animaux anesthésiés (anesthésie sans réveil), ne provoquant pas de douleur aux animaux. Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus et notre expérience sur ce modèle) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, igloo, aspen brick, carré de coton) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de symptômes tels que prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure avant d’atteindre des points limites… En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée afin d’éviter toute hypothermie. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ses congénères. Des antalgiques seront administrés lors des chirurgies afin de limiter la douleur des animaux. Si un animal présentait des symptômes pouvant aller jusqu’à l’atteinte d’un point limite, il serait hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière, isolé et soigné si besoin selon les symptômes. Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h ou si un point limite était atteint, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Les protocoles utilisés seront conformes aux recommandations des comités d'éthique et viseront à assurer le bien-être des animaux, en se référant aux "cinq libertés fondamentales" établies par l'Organisation mondiale de la santé animale. Cela implique : 1. que les animaux ont accès à une alimentation et à de l'eau en quantité et en qualité suffisantes 2. que nous prenons des mesures pour minimiser la douleur, les blessures et les maladies chez les animaux. 3. que nous veillons à ce que les conditions de logement et d'environnement des animaux soient adaptées 4. que nous permettons aux animaux d'exprimer leurs comportements naturels et essentiels à leur bien-être 5. que nous prenons des mesures pour minimiser la peur et la détresse chez les animaux lors des contentions.

Choix des espèces

Ces procédures seront effectuées chez des animaux « normaux » et chez des animaux transgéniques avec inactivation du récepteur aux œstrogènes, de l’un de ses sous-types, ou de l’une de ses voies d’action (nucléaire ou membranaire). Le modèle d’ovariectomie et d’effet sur l’appareil urinaire est bien décrit dans la littérature chez le rongeur. Les femelles seront ovariectomisées à 4 semaines afin d’éviter toute imprégnation hormonale. Le traitement hormonal sera administré 1-2 semaines après l’ovariectomie et ce pendant 6 mois maximum. Les expérimentations de mesure de point de fuite et les administrations de candidats médicaments seront de ce fait réalisées sur des animaux matures afin de miner la condition humaine.

Dépourvues de lymphocytes T et B fonctionnels, avec des cellules Natural Killer affaiblies pour qu'elles ne rejettent pas la greffe, 100 souris femelles de sept à huit semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des lymphocytes T humains porteurs d'un gène de mort, puis le médicament censé déclencher ce gène, en deux injections au plus sous anesthésie et analgésie, avec trois pesées en dix jours et un prélèvement de sang pour douze d'entre elles. Cette étude pilote vise à montrer qu'on peut détruire à volonté des cellules thérapeutiques devenues dangereuses chez un patient, la preuve ayant déjà été obtenue in vitro puis chez la souris avec un gène rapporteur fluorescent. Toutes sont tuées pour que leurs tissus et organes soient prélevés.

Objectifs

Les lymphocytes T (LT) font partie d’une catégorie de globules blancs qui jouent un rôle très important pour les défenses de l’organisme. Ces cellules sont responsables de la réponse immunitaire cellulaire visant à détruire les agents pathogènes, aussi bien les bactéries que les cellules cancéreuses. L’idée d’utiliser ces LT pour le traitement de maladies est en plein développement. Le principe de ces thérapies consiste à prélever les LT des patients pour les modifier génétiquement et les lui réinjecter dans le but de reconnaître puis d'éliminer les cellules cancéreuses. Leur efficacité est contrebalancée par de fréquents effets secondaires indésirables tels que la production massive de cytokines suivie par des neurotoxicités. Dans ce projet nous souhaitons démontrer la possibilité de pouvoir éliminer de façon contrôlée les cellules T génétiquement modifiées si des effets adverses apparaissaient. Pour contrôler ces cellules en clinique chez l’homme, elles peuvent être équipées de gènes « dit suicide » qui sont activables par des médicaments cliniquement approuvées. L’activation du gène suicide par le médicament va déclencher la mort du LT. Nous avons validé le concept in vitro en substituant le gène suicide par un gène rapporteur fluorescent et montré que notre médicament permettait d’activer ce gène rapporteur en activant un signal fluorescent dans la cellule. Puis, in vivo, chez la souris nous avons confirmé que ce médicament est capable d'induire l'expression de ce gène rapporteur. L’objectif de ce projet est de déterminer l'efficacité de notre médicament à induire la mort de LT humains équipés, cette fois-ci, d'un gène suicide après une greffe chez la souris .

Bénéfices attendus

Le bénéfice de cette étude pilote préclinique est la validation de systèmes de sécurité, inductibles et contrôlés, permettant d'éliminer des cellules T greffées chez un patient en cas d’effets secondaires graves pour le traitement de pathologies. Cette sécurité vise à perfectionner considérablement les protocoles actuels de cellules T et favorisera leurs utilisations en première intention améliorant ainsi la prise en charge des cancers et le traitement de certaines pathologies auto-immunes.

Procédures

Les souris seront soumises à 3 pesées d'une durée de moins de 30 secondes (réalisées sur animal vigile) à J0, J5 et J10. Deux injections maximum sur animal anesthésié et analgésié, d'une durée de moins de 30 secondes, seront réalisées. Un prélèvement de sang sur animal anesthésié sera réalisé sur 12 animaux.

Impact sur les animaux

Un stress, de courte durée de moins de 30 secondes, pourra être généré au moment des contentions des souris et lors des pesées hebdomadaires. Du stress sera également généré lors des anesthésies d'une durée de 5 à 10 minutes maximum. Les injections pour l'inoculation des lymphocytes et du médicament ainsi que le prélèvement de sang pourront également générer une douleur d'intensité légère de courte durée (10 à 15 secondes).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus et d'organes pour des analyses tissulaires.

Remplacement

Des tests in vitro réalisés ont montré que le médicament utilisé est capable d'activer le signal de mort dans des lymphocytes T humains modifiés. Nous souhaitons maintenant valider le concept in vivo aussi l'utilisation du modèle souris est indispensable.

Réduction

Il s'agit d'une étude pilote répartie en deux étapes comportant un effectif de 100 animaux au total. Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, les groupes comporteront 10 animaux maximum tout en permettant une analyse à l'aide d’outils statistiques appropriés sur les prélèvements analysés.

Raffinement

Les souris seront acclimatées au moins 7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. La procédure expérimentale a été conçue de manière à minimiser les dommages causés aux animaux. Les pesées seront réalisées sur animal vigile par contre tous les autres gestes techniques seront réalisés sur animal anesthésié/analgésié afin de diminuer le stress et l'inconfort de l'animal. Durant les 10 jours de la procédure, les souris sont suivies quotidiennement, le registre de soins est complété en se rapportant à la grille de suivi de soins adaptée.

Choix des espèces

Afin de pouvoir greffer des lymphocytes T humains, une immunodéficience est nécessaire. Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéprimée caractérisée par une absence des cellules T fonctionnelles et des lymphocytes B, une diminution des activités des cellules présentatrices d’antigènes, des cellules myéloïdes et des cellules Natural Killer. Ces caractéristiques évitent le rejet des lymphocytes T humains. Les animaux utilisés seront âgés de 7 à 8 semaines dont le poids varie entre 15-20 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors de la greffe de cellules humaines.

1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des analyses après leur mort, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux chimiothérapies ou un immunostimulant dans l'abdomen, puis subissent de trois à neuf prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil, sans anesthésie. Le porteur décrit des effets de la chimiothérapie qui peuvent durer plusieurs mois, diminution du poids, altérations du comportement et du pelage, et cherche à comprendre comment ces traitements dérèglent la moelle osseuse avant l'apparition d'une leucémie secondaire. Il écrit aussi que "les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux".

Objectifs

La chimiothérapie permet de guérir un grand nombre de cancers. Actuellement une grande partie de ces traitements ne sont toujours pas « ciblés » sur la tumeur. Ils empêchent la multiplication des cellules du cancer ce qui est l’objectif désiré, mais empêchent aussi la multiplication de certaines cellules saines notamment dans la moelle osseuse. La moelle osseuse est le lieu de fabrication des cellules du sang à partir des cellules souches. La chimiothérapie fait baisser transitoirement les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes (désignés sous le terme de lignées sanguines). Malheureusement, dans un certain nombre de cas rares, les traitements anti-cancéreux sont eux-mêmes à l’origine du développement de maladies cancéreuses de la moelle osseuse comme les leucémies aigues et les myélodysplasies dites secondaires des années après la guérison du premier cancer. Ce projet vise à comprendre comment la chimiothérapie affecte les cellules de la moelle et la production des lignées sanguines avant l’apparition d’une maladie leucémique secondaire. Pour mener à bien notre projet, nous allons étudier la production des trois lignées sanguines issues de la moelle osseuse, suivre les dérèglements induits au cours du temps par la chimiothérapie et la comparer à un autre facteur perturbant la production des lignées sanguines temporairement et qui n’induit pas de maladies leucémiques secondaires. Nous souhaitons étudier la quantité des cellules souches de la moelle, avant et après traitement par chimiothérapie et par l’agent perturbateur. Les cellules souches sont une population rare, capable de fabriquer toutes les autres lignées, mais aussi de se maintenir tout au long de la vie. Notre hypothèse est que la chimiothérapie diminue le nombre de cellules souches et que cette diminution favorise à son tour le développement précoce de la leucémie en favorisant des cellules qui prolifèrent plus. Notre projet a pour objectif d’étudier, chez la souris, les phases précoces du développement leucémique favorisé par la chimiothérapie. Une meilleure compréhension de ces phases précoces permettra de surveiller les patients porteurs de cancers traités par chimiothérapie et ainsi de prévenir la survenue d’un second cancer, souvent fatal, chez des patients souvent guéris d’une première maladie grave. De plus, la capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié.

Bénéfices attendus

La capacité de la moelle osseuse à se réparer après chimiothérapie est un domaine encore peu étudié. Nous pensons que notre projet à son terme apportera des avancées significatives dans ce domaine et participera ainsi à l’amélioration du traitement du cancer et notamment des leucémies . Il permettra de mieux connaître ce qui induit l’apparition de leucémie secondaire et comment le prévenir.

Procédures

Dans ce projet, les souris vigiles recevront 2 traitements par voie intra-péritonéale. Le 1er traitement sera administré à raison d’une injection par jour pendant 3 jours (durée du geste inférieure à 10 sec) puis 4 mois après ce 1er traitement les souris recevront un 2ème traitement. En fonction de la molécule, ce 2nd traitement sera administré à raison d’une injection par semaine pendant 6 semaines ou d’une injection à jour 1 et jour 3 ou d’une injection unique (durée de chaque injection inférieure à 10 sec) . Entre 3 et 9 prélèvements de sang par voie rétro-orbitaire, sans anesthésie, seront aussi effectués. Un prélèvement sanguin après le premier traitement et entre 2-6 prélèvements une fois par mois maximum après le deuxième traitement. Chaque prélèvement sanguin se fera en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous administrerons aux souris deux chimiothérapies et un immuno-stimulateur par voie intra-péritonéale. La douleur sera une nuisance directe associée à cet acte. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage qui peuvent durer sur plusieurs mois. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique est généralement observée pendant 3 jours après traitement.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques (cellules sanguines) matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, l’hématopoïèse se développent durant des mois ou des années et il n’est pas encore possible de les reproduire in-vitro. C’est chez elle que des premiers résultats précliniques ont été obtenus pour modéliser les leucémies secondaires. Il n’existe donc pas de méthode alternative à l’expérimentation animale. En revanche, notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur de nombreuses observations cliniques chez des patients ayant reçu de la chimiothérapie pour le traitement de leur cancer.

Réduction

Le choix des traitements et leurs doses dans ce projet provient des résultats positifs de notre précédente étude. Nous effectuerons des suivis longitudinaux des souris, minimisant leur utilisation. L’évaluation du nombre d’animaux nécessaire est aussi le fruit d’analyses statistiques basés sur le résultat de précédentes expériences effectuées dans notre laboratoire ou dans la littérature. Ainsi nous avons identifié que 8 animaux étaient suffisants pour avoir assez de pouvoir statistiques.

Raffinement

Des protocoles d’intervention en cas de début de souffrance seront mis en place (réchauffement, enrichissement de l’alimentation et du milieu), ainsi que des critères stricts d’arrêt de l’expérimentation en suivant une grille de score. En accord avec les recommandations internationales dans le domaine de l’hématologie, les animaux sont suivis trois fois par semaine afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations sont arrêtées avant la souffrance des animaux. Les effets possibles de la chimiothérapie comprennent une diminution du poids, des altérations du comportement et du pelage. Pour l’utilisation de l’immunomodulateur, une inflammation systémique avec apparition de fièvre est généralement observée mais que nous n’avons jamais observée dans les doses que nous utilisons. La surveillance à l’aide de la grille de score permettra de réduire au minimum la souffrance animale : dès qu’un signe de souffrance débutante sera détecté, l’expérimentation sera interrompue. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d'atteinte d'un point-limite, nous arrêterons les traitements administrés, et si les symptômes persistent, l'animal sera mis à mort dans les 24h heures .

Choix des espèces

Pour étudier la production des cellules hématopoïétiques matures perturbée par la chimiothérapie, un animal ayant un système hématopoïétique proche du nôtre est nécessaire : la souris reste le modèle de référence. De plus, il n’est pas encore possible de reproduire in vitro l’hématopoïèse car elle se développent durant des mois ou des années et dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in-vitro. L’hématopoièse dépend du microenvironnement qui ne peut pas encore être reproduit expérimentalement in vitro. De plus, l’induction de code-barres ou du rapporteur de cycle cellulaire se fait in vivo, grâce à deux lignées de souris spécifique excluant la possibilité de modèle in vitro. A noter cependant que notre schéma expérimental et nos hypothèses reposent sur l’étude de nombreuses cohortes cliniques de patients traités pour le cancer et ayant développé ensuite un cancer secondaire. Les animaux seront adultes. Nous souhaitons étudier l’effet de la chimiothérapie sur les cellules souches hématopoïétiques à l’âge adulte car c’est l’âge de survenue des cancers secondaires.

150 lapins vont recevoir dans le derme, vigiles ou anesthésiés, des produits de comblement destinés au marché de la chirurgie esthétique et reconstructrice, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent ensuite des scanners sous anesthésie générale, jusqu'à trois le premier jour, un par jour les quinze jours suivants, un par semaine pendant deux mois, puis un par mois jusqu'à la fin de l'étude. Le porteur situe ce travail sur un marché "en constante évolution" et parle d'un "enjeu de santé publique", en citant la restauration du visage après un accident et la perte de graisse faciale liée au VIH. 140 lapins sont tués pour l'analyse histologique du site d'injection, les 10 autres pouvant être adoptés ou replacés si aucun prélèvement n'est requis.

Objectifs

Le marché mondial de la chirurgie reconstructrice est en constante évolution avec des demandes pour des procédures de moins en moins invasives. Les dermal fillers (remplisseurs cutanés) sont généralement utilisés pour des traitements peu invasifs, tels que la restauration du volume du visage dans des cas de dégradations physiques sévères (lésions postaccidentelles, restauration et correction des signes de perte de graisse faciale (lipoatrophie) chez les personnes atteintes du VIH, ... ). Certains produits de comblement se résorbent naturellement avec le temps nécessitant pour les patients de répéter les injections, il est donc nécessaire d'améliorer la persistance de ces produits. La recherche de nouveaux produits, performants et sains pour le patient, est donc un enjeux de santé publique. Ce projet a pour objectif de tester et d’évaluer des dispositifs médicaux injectables de comblement sur le modèle lapin. Il comporte plusieurs protocoles visant à évaluer leur comportement (persistance et potentielles réactions locales de type inflammatoire) après injections dans le derme. Lors de ce projet, l'imagerie médicale sera utilisée afin de suivre l'évolution (volume, hauteur, étalement, densité et forme) des produits injectés au cours du temps. Un effet inflammatoire des produits pourra également être mis en évidence par analyse histologique.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera aux développements de nouveaux produits dermatologiques de comblements et éventuellement à leur mise sur le marché dans le but de proposer des produits plus performants et persistants.

Procédures

Les animaux pourront être vigiles ou anesthésiés lors de l’injection des produits expérimentaux intradermique en respectant les volumes d’injections recommandés. Ces injections seront réalisées en maximum 10 minutes (anesthésie comprise) Des examens scanners seront réalisées sous anesthésie générale. Un examen scanner dure jusqu’à 20 minutes (anesthésie comprise). La fréquence des examens scanners sera de maximum 3 acquisitions par jour le premier jour, puis maximum 1 acquisition par jour pendant les 15 jours suivants, puis maximum 1 acquisition par semaine pendant les 2 premiers mois puis maximum 1 acquisition par mois jusqu’à la fin de l’étude.

Impact sur les animaux

Les manipulations bien que réalisées avec le plus grand soin par du personnel formé seront susceptibles d’induire un stress chez le lapin. De plus, l’injection de produits par voie intradermique peut induire une douleur potentielle causée par une potentielle inflammation (rongeur et/ou gonflement) au site d’injection.

Devenir

Si des prélèvements du site d’injection ou d’organe doivent être réalisés afin de réaliser des analyses histologiques, les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole. Si aucun prélèvement n’est nécessaire à la fin de l’étude , dans la mesure du possible, un replacement ou une adoption des animaux sera envisagé.

Remplacement

Afin de répondre aux objectifs de ce projet ainsi qu’à des exigences réglementaires, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire car il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode alternative permettant de modéliser le comportement de produits injectés dans un organisme entier vivant de manière fiable. Ce comportement dépend de très nombreux facteurs tels que la zone d’injection, les tissus environnant et l’activité de l’animal, etc.

Réduction

Le suivi du comportement des produits injectés réalisé par imagerie médicale permet de suivre les mêmes animaux au cours du temps et donc de diminuer le nombre d’animaux par projet. Afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et pouvoir utiliser des tests statistiques permettant d’étudier la performance du produit au cours du temps, des groupes de minimum 6 sites d’injection par éléments d’essai seront constitués (plusieurs sites d’injection pourront être réalisés sur un même animal réduisant le nombre d’animaux à utiliser).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 7 jours minimum sera respectée pour les lapins. Les lapins seront hébergés en parc de manière collective durant toute la durée de l’étude (sauf exception en cas de bagarre ou blessure où ils seront hébergés en individuel, en parc ou cage) avec des enrichissements appropriés. Pour que l’hébergement collectif des mâles soit une réussite, une demande auprès du fournisseur pourra être faite pour que les animaux de l’étude soient hébergés de manière collective jusqu’à réception dans nos locaux. Au cours de l’étude, les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tout signe clinique anormal et ainsi prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires : mesure de soutien ou la mise à mort des animaux ayant un état clinique jugé moribond. Le poids des animaux sera contrôlé régulièrement tout au long de l’étude. Une pesée ainsi qu’un suivi clinique approfondi sera réalisé dans les 24h à 72h après l’injection des produits afin de détecter les signes suivants : Signes cliniques généraux : comportement général de l’animal pour déceler une éventuelle baisse d’activité, une prostration une apathie, une non réponse à la stimulation ou des oreilles basses avec un rythme respiratoire accéléré voire la présence d’écoulement nasaux et/ou oculaires. Signe cliniques en lien avec l’administration du produit : inflammation, lésion ou nécrose du site d’injection. Toute anomalie clinique sera rapportée au vétérinaire responsable du suivi et des examens cliniques approfondis pourront être réalisés. Les signes cliniques observés seront pris en charge si les actions n’interfèrent pas avec les produits administrés et l’objectif de l’étude. S’il n’est pas possible de le soigner sans interférer avec les objectifs de l’étude alors il sera euthanasié. Des fluides pourront être injecté. Du gel oculaire sera également appliqué à chaque examen d’imagerie pour éviter le dessèchement cornéen pendant les anesthésies.Des analgésiques pourront être administrés par voie sous-cutanée pour diminuer toute douleur éventuelle ; la fréquence sera décidée par un vétérinaire. Des antibiotiques pourront également être administrés sur avis du vétérinaire (la voie et la posologie seront précisées par le vétérinaire). La fréquence des administrations sera adaptée en fonction des besoins et des conseils apportés par le vétérinaire.

Choix des espèces

Le lapin permet de tester des volumes importants et ainsi mimer les volumes d’injections les plus importants réalisés chez l’humain. Les lapins pourront être utilisés à partir de 10 semaines. Le stade de développement jeune adulte est celui habituellement utilisé (pas de contrainte spécifique lié à l’âge pour cette procédure).

Des injections cinq jours sur sept pendant quarante-cinq jours, plus trois gavages par semaine pour une partie des animaux : 620 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses après leur mort. Des cellules cancéreuses humaines, de pancréas, de poumon, de côlon, de vessie ou de la sphère ORL, leur sont greffées sous la peau du flanc, où les tumeurs se développent jusqu'à devenir palpables. L'immunodéficience est recherchée pour éviter le rejet de ces cellules et pour que le système immunitaire des souris ne vienne pas moduler l'effet du peptide testé. Le porteur détaille une grille de douleur qui va du rétrécissement de l'aire orbitale aux vibrisses orientées vers l'arrière, et prévoit la mise à mort par dislocation cervicale des animaux dont l'état ne s'améliore pas en vingt-quatre heures.

Objectifs

Nous travaillons sur est une protéine (ci-après nommée K1) qui joue un rôle central dans le contrôle de divers fonctions cellulaires (adhésion, migration, croissance et différenciation). La surexpression de K1 dans différents types de cancers est un facteur de mauvais pronostic qui prédit une diminution de la survie des patients. En particulier, K1 est impliquée dans les cancers du pancréas, du côlon, du poumon, de la vessie et de la sphère ORL, cancers présentant souvent des options thérapeutiques limitées. Nous avons récemment montré que la déplétion de K1 réduit spécifiquement la viabilité des cellules cancéreuses dépendantes de voies oncogéniques particulières. Nos résultats montrent, par ailleurs, qu’un mutant de K1, qui ne peut plus se lier à ces partenaires moléculaires inhibe totalement les propriétés prolifératives et invasives des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que le ciblage de K1 à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques sélectifs pourrait être une approche thérapeutique pertinente pour le traitement des cancers dépendants de voies de signalisation particulières. Nous avons donc conçu un peptide-médicament qui interfère avec la capacité de liaison de K1 à d’autres protéines. L’utilisation de notre inhibiteur pharmacologique sur un grand nombre de lignées immortalisées de cancers du pancréas, du poumon, du colon, de la vessie et de la sphère ORL a montré une réduction importante de la prolifération tumorale in vitro. L’objectif de ce projet est de déterminer si notre inhibiteur pharmacologique peut inhiber la croissance de tumeurs dépendantes de voies de signalisation particulières in vivo et de mettre en évidence de potentiels effets synergiques de notre inhibiteur pharmacologique en combinaisons avec des agents thérapeutiques classiquement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

L'objectif principal de l'étude proposée est de déterminer les groupes de patients atteints de cancer susceptibles de répondre favorablement à notre peptide inhibiteur et qui pourront donc bénéficier de notre inhibiteur pharmacologique en monothérapie ou en combinaison avec d’autres molécules déjà utilisées en clinique. De plus, notre inhibiteur pourrait permettre de surmonter la résistance à certains traitements, utilisés actuellement en clinique, et ainsi améliorer la prise en charge de patients dont les options thérapeutiques sont limitées.

Procédures

Afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de notre inhibiteur pharmacologique, les souris seront greffées avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée (J1 de l’expérience) sur le flanc de l’animal afin de minimiser la gêne liée à la croissance tumorale. Les souris vigiles recevront une seule injection Les souris seront ensuite suivies quotidiennement afin de contrôler l’apparition de tumeurs et l’état général des animaux. De plus, une mesure du poids sera effectuée 2 fois par semaine. Dès lors que les tumeurs deviendront palpables les souris vigiles recevront une injection d’un produit non irritant, 5 jours sur 7, sur une durée de 45 jours maximum. Certains animaux recevront également un second traitement anticancéreux par voie orale à raison de 3 gavages par semaine.

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée développeront des tumeurs. Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection elle-même (gène de courte durée) ou à l’administration des traitements par voie orale (stress lié au gavage)

Devenir

Tous les animaux du protocole seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Nous avons d’ores et déjà accumulé de nombreuses données in vitro sur les différentes lignées correspondant au projet proposé, et avons constaté l’effet anti-tumoral spécifique de notre inhibiteur pharmacologique sur les lignées dépendantes d’une voie de signalisation particulière. Cependant, les modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo. Ces dernières ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales, elles sont également colonisées par des cellules de l’hôte (macrophages, cellules du système immunitaire, fibroblastes) et des vaisseaux sanguins qui viennent vasculariser les tumeurs et permettent leur croissance. De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. C’est pour ces raisons que nous avons besoin d’utiliser ce modèle murin.

Réduction

La taille des groupes d’animaux nécessaires à la réalisation de l’étude a été calculée à l’aide d’une analyse de puissance qui nous a permis de déterminer l’effectif minimal garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs. De plus, ce projet sera réalisé par étape. La première partie du projet, permettra de déterminer le nombre de souris nécessaires pour la deuxième partie du projet. Cette analyse ne sera lancée que dans un deuxième temps, sur les modèles les plus pertinents obtenus en première partie de projet.

Raffinement

Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de 2 semaines est observée suite à leur réception. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress. Un examen clinique approfondi (avec pesées des animaux) sera réalisé deux fois par semaine pour évaluer les anomalies comportementales naturelles, qui incluent (1) l’apparition de morsures ou de lésions indiquant des comportements agressifs de souris entre elles, (2) une hyperactivité locomotrice et la modification de la structure du nid, (3) un isolement de l’animal (4) une prostration de l’animal dans un coin de la cage, mais également aux anomalies comportementales provoquées en touchant l’animal (l’animal bouge lentement ou refuse de bouger, prostration transitoire, hyperactivité, agressivité). Les signes de douleur comprennent également (1) l’apparition de plaies par grattage, (2) une expression faciale modifiée (rétrécissement de l'aire orbitale, gonflements du museau et joues, oreilles écartées vers l'arrière, vibrisses orientées vers l'arrière), (3) un écoulement naso-oculaire, et (4) une perte de poids supérieure à 10 % sur une semaine. En cas de petites plaies causées par les souris, une solution aqueuse de chlorhexidine sera appliquée afin de les désinfecter, suivie de l’application d’une crème cicatrisante afin d’aider à la régénération des tissus endommagés. Suivant le type de dommage et afin de garantir le bien-être animal, les souris pourront être (1) isolées dans une nouvelle cage en vue de leur apporter les soins adaptés, (2) observées plusieurs fois par jour, (3) recevoir des antalgiques en cas de signe de douleur, et (4) mises à mort si aucune amélioration n’est observée au bout des premières 24h. L’observation de signes de douleur ou de mal être entraînera automatiquement la sortie de l’animal du protocole. L’identification d’un point limite entraînera la mise à mort de l’animal par dislocation cervicale.

Choix des espèces

Nous avons obtenu de nombreuses données in vitro à partir de lignées tumorales. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas récapituler la complexité des tumeurs in vivo qui ne sont pas simplement constituées de cellules tumorales mais également de cellules de l’hôte (macrophages, cellules immunitaire, fibroblastes, vaisseaux). De plus, il est également impossible de mimer in vitro la dissémination métastatique à partir d’une tumeur primaire vers d’autres organes à distance. Le recours à un organisme-modèle est indispensable. Les souris sont des mammifères couramment utilisés en recherche cancérologique. Les souris immunodéficientes, permettent de réaliser des greffes de cellules humaines dans le modèle murin sans rejet par son système immunitaire. De plus, l’activité biologique de notre inhibiteur pharmacologique pourra être évalué sans que le système immunitaire des souris puisse moduler son effet. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.