Recherche appliquée

Tuées à la fin des expérimentations pour que leurs tissus soient prélevés, 96 rates Lewis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont suspendues par un harnais qui décharge leurs pattes arrière pour reproduire un alitement, ce qui peut provoquer sur les premières quarante-huit heures une perte de poids et des bouchons d'urine. S'y ajoutent trois prélèvements de sang à la veine de la queue et, trois fois au cours du protocole, un test de vitesse maximale aérobie sur tapis roulant d'une vingtaine de minutes, un test d'endurance de trente à soixante minutes et un test de force d'agrippement. Le porteur écrit que ces procédures "n'entraînent pas de douleurs spécifiques" et qualifie le recours aux rates d'"étape obligatoire" mais aussi d'"extrêmement enrichissante du point de vue scientifique", pour évaluer un extrait de romarin contre la fonte musculaire.

Objectifs

Le romarin est connu depuis quelques décennies pour avoir des effets antioxydants et anti-inflammatoires pouvant être bénéfiques pour l’être humain dans certaines circonstances. Le projet vise à tester les effets d’une substance naturelle extraite du romarin et de ces dérivés afin de prévenir la perte de masse musculaire et d’endurance lors d’une immobilisation prolongée ou bien résultante d’une maladie musculaire. Ce projet présente plusieurs objectifs. Dans un premier temps, il s’agira de tester l’efficacité des composés contre la perte de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le modèle de suspension par harnais chez le rat. Il s’agira aussi de compléter la connaissance des mécanismes de fonctionnement du composé principal. Dans un second temps, l’objectif de ce programme est de développer des substances dérivées mais avec des propriétés sur la masse musculaire et sur l’endurance plus importantes. Ces substances seront développées et d’abord testées sur des cultures de cellules musculaires humaines. La ou les molécules les plus efficaces seront ensuite testées pour lutter contre la diminution de masse musculaire et la perte d’endurance lors d’une immobilisation en utilisant le même modèle de suspension). L’ensemble de ce projet vise donc à la fois des aspects fondamentaux mais aussi appliqués avec le développement d’une nouvelle stratégie de prévention de la perte de masse musculaire et d’endurance. Les effets du modèle de suspension par harnais qui sera utilisé se rapprochent énormément de ceux retrouvés lors d’un alitement clinique chez l’humain et par conséquent la réussite de ce projet pourrait avoir un impact important chez les patients alités et par extension dans les diverses situations entrainant une diminution de l’activité physique (plâtrage, sédentarité) ou dans diverses maladies musculaires impliquant les cibles du composé et de ses dérivés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et l’inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est un réel problème en matière de santé publique. Ces expérimentations portent donc sur un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine.

Procédures

Tous les animaux subiront 3 prélèvements de sang sur animal vigile en respectant les recommandations en termes de volume, de fréquence et de site de prélèvement. Les animaux réaliseront ensuite des tests non invasifs. Pour les qualités d'endurance, 2 tests seront réalisés sur tapis roulant à savoir le test de VMA (vitesse maximale aérobie) qui dure une vingtaine de minutes et le test de temps limite qui dure entre 30 et 60 minutes en général. L’étude de la composition corporelle dure 2 min. Le test de force d’agrippement dure une quinzaine de minutes (3 séries de 5 essais de 2-3 secondes entrecoupées de 5 minutes de récupération). L'ensemble des tests seront réalisés 3 fois au cours de la procédure à raison d'une fois par semaine sur 3 semaine distinctes (avant le début du traitement, après le traitement et après la suspension). L'ordre des tests au cours des 3 périodes de test sera la suivant. Le test de composition corporelle sera réalisé 3 fois au cours de la procédure. Il sera réalisé une fois le premier jour de chacune des 3 semaines de test. Le test d’agrippement est réalisé au jour 2. Le test de vitesse maximale aérobie est réalisé à 3 jours et le test d’endurance est réalisé à 5 jours pour permettre un repos complet de l’animal.

Impact sur les animaux

La principale nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera le stress lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension des pattes arrières qui peut entrainer sur les premières 48h une perte de poids ainsi que des bouchons d’urine. Les animaux seront aussi stressés lors des tests fonctionnels sur tapis roulant (3 tests de 20-30 minutes espacés de 2-3 semaines) et ou pendant l’évaluation de la force d’agrippement (3 tests de 5 répétitions d’agrippement durant 2-3 secondes chacune espacés de 2-3 semaines) ainsi que lors des 3 prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue. De plus, lors des 3 prélèvements sanguins, les animaux pourrait ressentir une légère douleur au moment de l'introduction de l'aiguille dans la veine caudale.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps. De plus, ces expérimentations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de par les résultats pré-cliniques très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés aux moyens de trois axes de réductions. Le premier axe consiste à regrouper les procédures de 2 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 2 le nombre de rats qui aurait été classiquement employé. Le deuxième axe consiste à utiliser les mêmes animaux pour obtenir des données fonctionnelles et des données cellulaires et moléculaires permettant là encore de réduire le nombre de rats par 2 sans affecter la qualité des résultats. Enfin, le troisième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement avec un logiciel.

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour les tests physiques réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir. Les différents composés sont intégrés dans la nourriture pour éviter toute injection ou gavage. Les procédures de suspensions par harnais sont validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toutes complications. De plus, les rats seront hébergés par deux dans une même cage pour éviter l’isolement social. Pour éviter le refroidissement, la température de la pièce d'élevage sera de 24-25° et les animaux auront à disposition de la ouate pour réaliser leur nid. Chaque phase de l’étude possède également des points limites et critères d’arrêts strictes en cas d’évènements potentiellement néfaste du point de vue des animaux en ce qui concerne la douleur, le mal-être etc. Les suivis quotidiens des animaux, des poids corporels et la consommation de nourriture sera un paramètre intégré à nos protocoles. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt, les animaux sont anesthésiés avant d’être mis à mort pour éviter toute douleur.

Choix des espèces

Le rat Lewis est privilégié pour de plusieurs raisons. Les espèces murines rat et souris sont des espèces se rapprochant de l'humain en ce qui concerne le système musculaire. Cette espèce est de même plus petite et moins lourde que les rats Wistar nous permettant d’utiliser le modèle de suspension par harnais en toute sécurité. Enfin, ces expérimentations se feront sur des rats femelles, afin de combler le manque de résultats sur ce sexe. Les animaux seront utilisés entre 11 et 22 semaines d’âge. L’expérimentation commencera à 12 semaines car à partir de cet âge la croissance musculaire des rats Lewis devient très lente.

Jusqu'à seize prélèvements de sang par semaine, et douze en vingt-quatre heures pour un même individu : 150 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous gardés vivants et réutilisés d'un protocole à l'autre pendant cinq ans. Ils reçoivent des substances par voie intraveineuse, orale, intramusculaire, sous-cutanée ou cutanée, subissent des ponctions de vessie à l'aiguille et des cathétérismes urétraux, le tout sous contention manuelle. L'objet déclaré est de suivre le devenir de principes actifs dans l'organisme pour de futurs médicaments vétérinaires, le chat étant l'espèce visée par ces produits. L'avenant qui porte l'effectif à 150 est justifié par "une demande accrue d'études", et le porteur indique qu'il n'y a "pas d'approche statistique prévue".

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées et sa voie d'administration est étudié chez l'animal: son absorption, sa distribution par la circulation sanguine, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espece cible). AVENANT: Suite à une demande accrue d'études, le nombre d'animaux doit être augmenté

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des l'éléments tests. Et de montrer que cela n'a pas eu d'impact au niveau clinique en suivant certains paramètres hématologiques, biochimiques impact sur la pharmacodynamie. Ce projet est necessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations (intraveineuse, orale, intramusculaire, souscutannée ou topique) . Pour cela les animaux auront une contention manuelle légère. la durée d'un administration est inférieure à la minute. Il y aura des prélèvements sanguins. Dans ce cas le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum par semaine (environ 1 mL prélevé) et une période de récupération sera respectée ( à minima 1 semaine). Les volumes de sang prélevé seront généralement de 1 mL environ. Aprés un total d'environ 12 prélèvements sanguins sur 24h une période de récupération d'au minimum 7 jours sera respectée. Dans tous les cas, le volume des prélèvements sera réduit au minimum pour chaque protocole, sans jamais dépasser 15% du volume sanguin de l’animal, et une période de récupération adaptée sera respectée : 1 semaine suite à un prélèvement de 7.5% du volume sanguin, 2 semaines pour 10%, 4 semaines pour 15%. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. La période de récupération pourra être allongée si nécessaire.Les animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Soit cela se fera par miction spontanée (aucun geste n'est fait à l'animal), soit prélèvement urinaire par cathétérisation urétral ou par cystocentèse ( contention manuelle légère). Durée de l'ordre de la minute. Deux cystocentèses au maximum sur 24h, espacées d'au moins 6h. Une seule cathétérisation maximum pour les chats males sur une semaine.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Toute contention peut engendrer un stress, un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entrainer un stress pour la contention , un inconfort mais également de la douleur (cas d'un prélèvement d'urine par cystocentèse par exemple).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. Ces techniques de remplacement ne peuvent pas être appliquées dans ce projet.

Réduction

150 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 5 ans. Cela représente en moyenne 30 animaux par an. On calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus. Il n'y a pas d'approche statistique prévue.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe entre 2 et 4 animaux par groupe. De l'enrichissement (exemple: griffoir, coussin) sera présent dans chaque box autant que possible. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...) Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires Jeune adulte. Stade avec un système immunitaire, métabolique mature

Greffées de cellules d'adénocarcinome colorectal humain sous anesthésie, 80 souris mâles portent une tumeur pendant deux à trois semaines, traitées tous les trois jours et passées deux à trois fois en microtomographie à rayons X. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyse des tumeurs. Le porteur écrit qu'aucune nuisance ni douleur n'est prévisible puisque les animaux sont anesthésiés pendant les manipulations puis tués en fin de protocole, tout en listant la perte de poids, le stress et la perte de mobilité parmi les effets à surveiller. Le projet transpose au cancer colorectal des peptides déjà testés sur un modèle de mélanome, jugé moins utile parce que ce cancer est plus rare et de meilleur pronostic.

Objectifs

Avec plus de 43000 personnes touchées par an en France, le cancer colorectal se situe au troisième rang des cancers les plus fréquents chez l’homme et au deuxième rang chez la femme. Il constitue la deuxième cause de décès par cancer et représente près de 12 % de l’ensemble des décès par cancer, en particulier chez les 65 ans et plus. Le choix du traitement du cancer colorectal dépend du stade, de sa localisation et de l'état général du patient. Bien que la  chirurgie  soit utilisée en première ligne, la chimiothérapie peut être prescrite à tous les stades de la maladie, et plus récemment, des thérapies ciblées sont utilisées en association avec la chimiothérapie . Malheureusement tous les patients ne répondent pas à ces thérapies et des phénomènes de résistance se développent très souvent. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à limiter la progression du cancer colorectal demeure donc un défi majeur.

Bénéfices attendus

Historiquement, nos premiers résultats sur les effets anti-cancéreux de nos peptides ont été obtenus sur un modèle de mélanome, en association avec un laboratoire de dermatologie. Toutefois, en France, le mélanome cutané se situe au 9ème rang des cancers tous sexes confondus et ne représente que 2 à 3 % de l’ensemble des cancers. C’est également un cancer de bon pronostic avec une survie à 5 ans supérieure à 80% dans le cas du mélanome de stade I, représentant lui-même 84% des cancers diagnostiqués. A l’heure actuelle, les traitements sont souvent efficaces depuis les progrès de l’immunothérapie. Le cancer colorectal est, quant à lui, le troisième cancer le plus fréquent, tous sexes confondus, en France où il représente la deuxième cause de décès par cancer. Les traitements peuvent être très lourds avec de nombreux effets secondaires. Il apparaît donc important de cibler de nouvelles approches thérapeutiques, c’est pourquoi nous souhaitons vérifier que l’activité anti-tumorale de notre molécule et de ses analogues, observée in vivo dans un modèle de mélanome murin, est transposable au cancer colorectal. En effet, les résultats préliminaires obtenus dans un modèle in vitro de tumeur 3D sont très prometteurs.

Procédures

Pour nos expériences, les animaux seront sous anesthésie générale (quelques minutes) pour l'injection des cellules de cancer colorectal. 7 jours après, les animaux seront traités tous les 3 jours (quelques secondes par animal) pendant 2 à 3 semaines. Le suivi longitudinal (imagerie 3D par microtomographie rayons X) des animaux se fera sous anesthésie (10 à 15 minutes) à raison de 2 à 3 fois au cours des 2 dernières semaines du projet.

Impact sur les animaux

Pas de nuisances ou critère prévisible de douleur dans la mesure ou les animaux seront sous anesthésie générale durant les manipulations puis euthanasiés en fin de protocole. Douleur potentielle modérée et passagère (piqure) à l'injection des molécules. Une surveillance quotidienne du développement des tumeurs permettra de s'assurer du bien-être des animaux (absence de gêne à la locomotion ou de signes visibles de souffrance). Les effets indésirables surveillés pourraient être : perte de poids, stress, perte mobilité.

Devenir

Pour chaque procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations, afin de prélever et d'analyser les tumeurs.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisées in silico, in vitro et ex vivo. Les peptides testés ont fait l’objet d’une étude in silico afin de sélectionner les meilleurs candidats potentiels. Ces candidats ont ensuite été validés par des études in vitro (migration et invasion cellulaire, modèles 3D multicellulaires) et ex vivo (anneaux aortiques) et nous testerons dans ce projet les peptides ayant donnés les meilleures réponses. Ce projet vise donc à valider in vivo les effets observés. Aucune méthode de substitution n’existe actuellement pour mesurer les effets sur la croissance tumorale.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les peptides candidats ont été sélectionnés sur des modèles de sphéroïdes 3D. Ainsi seuls les peptides à fort potentiel seront testés. Ainsi l’étude considérée dans sa globalité est susceptible de concerner un nombre maximal de 80 souris mâles, réparties en 4 groupes et 2 procédures : 1 groupe contrôle, 3 groupes de test. Afin d’obtenir des résultats significativement robustes, un nombre maximal de 10 souris par groupe sera utilisé. L’analyse statistique se fera avec le test U de Mann-Whitney bidirectionnel.

Raffinement

Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (tubes de jeu, niche, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 7 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du Bien-être animal et les animaux seront anesthésiés lors des procédures pouvant apporter un stress (jusqu'à l'euthanasie), de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle choisi est la souris. Il s’agit du modèle de référence pour l’étude de la croissance tumorale.

Irradiées 90 secondes sans anesthésie, 1 860 souris dépourvues de système immunitaire reçoivent le lendemain des cellules de leucémie humaine, par la veine de la queue ou directement dans la moelle osseuse de la patte. Chacune peut ensuite subir jusqu'à dix ponctions de moelle osseuse et douze prélèvements de sang à la joue, plus un gavage ou une injection quotidiens par cycles de 28 jours répétés jusqu'à trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur qualifie ces procédures de "rapides, non invasives et maîtrisées", tout en décrivant la prolifération leucémique comme une source de souffrance annoncée par une perte de poids et des diarrhées. Toutes sont tuées, au plus tard douze mois après la greffe, pour prélever la rate et la moelle osseuse et conserver les cellules leucémiques en vue d'"utilisations mutualisées".

Objectifs

Les leucémies aiguës (LA) sont des cancers agressifs du sang affectant les différents types de cellules de notre système immunitaire. Notre objectif est de générer des modèles d’étude de ces leucémies humaines en injectant les cellules leucémiques humaines provenant des prélèvements faits sur les patients dans des souris dépourvus de système immunitaire (absence de rejet de greffe). L’établissement de ces modèles nous permettra d’élucider les mécanismes biologiques de ces leucémies et de tester l’efficacité thérapeutique de molécules déjà utilisées en médecine humaine dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients atteints de leucémies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la transformation des cellules normales en cellules leucémiques mais aussi des mécanismes responsables des résistances aux traitements par la chimiothérapie et des rechutes. L’amélioration de ces connaissances devrait nous permettre d’identifier des molécules déjà utilisées en médecine humaine pour d’autres pathologies qui pourraient présenter un avantage thérapeutique aussi pour le traitement des leucémies. A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer les thérapeutiques futures en proposant des traitements ciblés plus efficaces et moins toxiques dans le but d’améliorer le devenir des patients.

Procédures

Pour mettre en place le modèle d’étude, des souris dépourvues de système immunitaire et non anesthésiées seront d’abord soumises à une irradiation de 90 secondes afin de réduire le nombre de cellules sanguines murines et faciliter la greffe, survie et prolifération des cellules leucémiques humaines injectées. Le lendemain les cellules leucémiques humaines seront injectées en une fois soit par voie intraveineuse dans la veine de la queue de la souris non anesthésiée (durée 30 secondes) soit directement dans la moelle osseuse au niveau de la patte des souris anesthésiées et analgésiées. (durée 3 min maximum). Afin de suivre le développement du cancer, des prélèvements de moelle osseuse dans la patte des souris anesthésiées et analgésiées (3 minutes maximum) seront réalisés une fois par mois et au maximum 10 fois ; en alternant la patte prélevée. En complément, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue des souris (30 secondes maximum) sans anesthésie seront réalisés 2 fois par mois et au maximum 12 fois. La dose, la fréquence et la voie d’administration des molécules thérapeutiques testées peuvent être variables. Les molécules thérapeutiques seront administrées quotidiennement aux souris sans anesthésie soit oralement (avec une sonde de gavage ; durée 1 min) soit par voie intraveineuse (dans la veine de la queue ; durée 30 sec) soit par voie intrapéritonéale (dans la cavité abdominale ; durée 30 sec). Des cycles de traitement d’une durée de 28 jours seront réalisés et pourront être répétés au maximum 3 fois De l’imagerie non invasive sur souris anesthésiées (ayant reçu une injection intrapéritonéale d’une molécule permettant la visualisation des cellules leucémiques) pourra dans certains cas remplacer les prélèvements de sang ou de moelle osseuse pour le suivi de la réponse aux molécules thérapeutiques testées (durée de l’imagerie= 15 min).

Impact sur les animaux

Les procédures réalisées sont rapides, non invasives et maîtrisées par l’ensemble du personnel. Cependant, l’irradiation des souris peut causer du stress et des diarrhées. L’implantation des cellules leucémiques peut causer une douleur légère et brève au niveau du site d’injection. Les prélèvements de sang et moelle osseuse peuvent causer une douleur légère et brève au niveau du site de prélèvement. L’implantation et le prélèvement dans la moelle osseuse peut potentiellement entrainer une perte de mobilité sur une très courte durée. L’administration de molécules thérapeutiques peut causer un stress ainsi qu’une douleur légère et brève au site d’injection. L’administration répétée de molécule thérapeutique par gavage peut potentiellement causer une irritation. La prolifération des cellules leucémiques peut causer une souffrance pour l’animal qui pourra se manifester par une modification du comportement ou de l’apparence physique en cas de manque de toilettage ; le plus souvent une perte de poids et des diarrhées précéderont ces évènements.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales (et au plus tard 12 mois après l’implantation des cellules leucémiques humaines ou l’arrêt du traitement en cas d’absence de greffe) afin de collecter les différents organes tels que la rate et la moelle osseuse. Cela permettra de réaliser des analyses complémentaires sur les cellules leucémiques mais également de les conserver afin de permettre des utilisations mutualisées.

Remplacement

Les lignées de cellules leucémiques existantes ne permettent pas de représenter la diversité des leucémies observées chez les patients ni de modéliser les étapes de transformation de cellules normales en cellules cancéreuses ni les mécanismes biologiques responsables des résistances aux traitements et des rechutes. De plus à ce jour il n’existe que quelques modèles de culture en milieu artificiel (in vitro) qui permettent seulement de maintenir temporairement des cellules leucémiques humaines mais leur pertinence reste partielle car cela ne récapitule pas la complexité de l’environnement physiologique ou pathologique des cellules humaines. Au contraire, l’utilisation d’un modèle animal entier vivant assure la présence d’un environnement complexe récapitulant les conditions retrouvées chez les patients. Ainsi l’utilisation d’un modèle utilisant un animal entier vivant est donc nécessaire et indispensable pour étudier la biologie des leucémies et tester des molécules thérapeutiques dans le but d’améliorer les traitements proposés aux patients.

Réduction

Afin d’obtenir des différences statistiques significatives tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons réalisé une estimation du nombre d’animaux nécessaires et suffisants définie à l’aide d’une analyse statistique. Pour certains modèles, de l’imagerie in vivo non invasive sera réalisée permettant de faire un suivi en direct de l’évolution de la maladie et de l’efficacité des traitements. De plus cela permettra d’anticiper les signes cliniques visibles.

Raffinement

Une surveillance quotidienne visuelle sera réalisée par l’animalier ou les expérimentateurs. Nous serons également attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Les animaux dépourvus de système immunitaire seront hébergés dans des conditions permettant d’éviter tout risque d’infections. Une surveillance clinique hebdomadaire du comportement, de l’apparence physique, du poids sera effectuée par les expérimentateurs dès l’implantation des cellules leucémiques humaines et jusqu’à la fin de la procédure (ou au plus tard 12 mois après l’implantation en cas d’échec de greffe). Une surveillance biologique mensuelle par prélèvement de moelle osseuse et bimensuelle par prélèvement de sang sera également effectuée afin de détecter et quantifier la prolifération des cellules leucémiques humaines implantées. Le suivi des animaux se fera en à l’aide d’une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs avec un système de scores. Toute souris présentant des signes de souffrance ou atteignant les points limites pendant la durée de l’expérience sera euthanasiée sans attendre et analysée. Néanmoins certains signes cliniques observés pourront entraîner des actions comme le renforcement du suivi clinique pendant 1 semaine, une réhydratation. De plus, le recours à de l’imagerie in vivo non invasive permettra de suivre en direct l’évolution de la maladie et d’anticiper les signes cliniques visibles.

Choix des espèces

L’utilisation de souris adultes dépourvues de système immunitaire est largement décrite dans la littérature scientifique depuis de nombreuses années comme étant le meilleur modèle pour la greffe de cellules leucémiques humaines. Ce modèle permet également d’étudier la biologie des leucémies humaines, et de servir de modèles précliniques permettant de tester de nouvelles molécules thérapeutiques dans un environnement tumoral complexe se rapprochant de ce qui se passe chez les patients. De plus, nous avons une bonne connaissance des signes de douleur et de souffrance des souris et donc de leur prise en charge Nous utiliserons des souris adultes, âgées de 7 à 12 semaines, afin de garantir une prise de greffe maximale des cellules leucémiques humaines.

360 souris descendantes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 36 d'entre elles étant conservées pour maintenir la lignée et les autres tuées, une partie dès le sevrage. Les mères gestantes sont gavées chaque jour de resvératrol ou d'un placebo, du huitième jour de gestation au sevrage, et leurs petits passent un test de suspension, un champ ouvert, un test d'acuité visuelle, une reconnaissance d'odeurs et un labyrinthe aquatique, l'ensemble étant qualifié de non douloureux. Ces souris portent une déficience génétique de la méthionine synthase limitée au cœur ou au cerveau, pour reproduire la maladie CblG, qui touche moins d'un enfant sur un million. Le porteur reconnaît que des études in vitro sur biopsies de peau de patients ont déjà montré l'effet des activateurs de SIRT1, et affirme qu'il est "indispensable" de tester les organes atteints chez l'animal.

Objectifs

La maladie CblG (Cobalamine G) est une maladie rare, moins d’un enfant sur 1.000.000 de naissances est atteint. La maladie se manifeste en général dès la naissance, mais des formes tardives (adolescence ou âge adulte) ont été décrites. Dans la plupart des cas, les patients présentent un retard du développement, des manifestations neurologiques (crises convulsives, encéphalopathie, hypotonie, troubles psychiatriques), anémie, mais les patients peuvent présenter des anomalies dans d’autres organes comme le cœur (malformation) ou le foie. La maladie peut être diagnostiquée dès la naissance grâce à la détection dans le sang d’une concentration élevée de la molécule nommée l’homocystéine et une diminution de la molécule nommée méthionine. Actuellement, le traitement est basé sur des injections quotidiennes de vitamine B12 associées à une supplémentation en méthionine afin de réduire la concentration d’Homocystéine et augmenter celle de la méthionine. Bien que ces traitements permettent l’amélioration des symptômes cliniques, ils sont inefficaces en qui concerne les troubles neurologiques. Un nouveau traitement impliquant la sirtuine Sirt1 pourrait être une nouvelle piste. Sirt1 est une protéine qui participe au bon fonctionnement de l'organisme (notamment le métabolisme central) dans plusieurs organes dont le cœur et le cerveau, elle exerce des effets protecteurs contre le stress cellulaire et l'inflammation. L’objectif de ce projet est de démontrer, sur le cœur ou le cerveau, l’efficacité du traitement avec un activateur de Sirt1 (resvératrol) chez un modèle de souris reproduisant cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’utilisation de Resvératrol comme activateur de Sirt1 est efficace dans la prévention et le traitement des manifestations neurologiques et cardiaques de la maladie CblG. De plus, ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans chaque organe atteint, coeur ou cerveau, grâce à l’utilisation de 2 types de souris génétiquement modifiées, ayant une protéine MTR déficiente (cause de la maladie) spécifiquement au niveau du coeur ou du cerveau.

Procédures

Les souris femelles gestantes seront traitées quotidiennement par gavage avec le Resvératrol ou le placebo dès le 8ème jour de gestation jusqu’au sevrage : un tiers des souriceaux subira un examen d’imagerie non invasif à l'âge de 20 jours, un autre tiers à 6 mois tandis que le dernier tiers sera soumis à des tests comportementaux non douloureux (3x16 animaux). Pour évaluer la fonction cardiaque nous testerons la force, l'agilité et le niveau d’exploration libre des souris par un test de suspension et un test du champ ouvert. Et pour l’étude du cerveau, nous réaliserons un test d’acuité visuelle, de tests de reconnaissance d'odeur et un labyrinthe aquatique pour tester les capacités de mémorisation.

Impact sur les animaux

Bien qu’elle ne soit pas douloureuse, la procédure de gavage est désagréable pour les souris. Elle peut entrainer un léger stress physique lié à la contention de l'animal. Ce stress va inéluctablement diminuer suite à l'habituation des souris, sur les manipulations répétées par le manipulateur. L'inconfort à l'introduction de la sonde se verra lui aussi diminuer de jour en jour au fil du protocole. Ce geste technique sera effectué par un zootechnicien expérimenté qui prend toutes les mesures nécessaires pour limiter la souffrance animale en pratiquant un geste rapide et sûr. De plus, la prise de poids étant effectuée 3 fois par semaine, les pertes de poids éventuelles, mais peu probables, seront un indicateur de signe de mal-être chez les animaux. La procédure de TEP sera intégralement réalisée par une équipe technique qualifiée dans un environ dédiée à ce type d’analyse, et les animaux seront plongés sous anesthésie durant toute la procédure. Malgré cela, cette étape pourrait déclencher un stress post-anesthésie.

Devenir

Maintien : Les souris surnuméraires présentant la modification génétique d'intérêt pour le maintien de la lignée seront conservées dès le sevrage. Mise à mort : A la fin de l’ensemble des procédures, toutes souris soumises à l'imagerie médicale ou aux tests comportementaux seront mises à mort à l’âge de 21 jours (48 souris), 8 semaines (48 souris) ou 6 mois (48 souris). De même, les souris génétiquement modifiées surnuméraires présentant d'intérêt pour la recherche seront également mises à mort à l'âge de 6 mois pour dissection et analyses biochimiques et histopathologiques. Les souris surnuméraires ne présentant pas la modification génétique pour le maintien de la lignée seront mises à mort dès le sevrage ou pourront servir à des formations internes (dissections et microdissections).

Remplacement

tôt dans la vie, laissant penser qu’un traitement précoce chez le nouveau-né ou même pendant la grossesse pourrait diminuer les manifestations cliniques chez le nouveau-né. Des études in-vitro ont déjà été menées sur des biopsies de la peau des patients, démontrant l’efficacité des activateurs de la protéine SIRT1 pour palier à la déficience de la protéine MTR. Cependant, ces études sont faites sur des sur biopsie de la peau de patients atteints par la maladie. Cependant les cellules de la peau ne reflètent pas la spécificité des organes atteints. C’est pourquoi, afin de valider l’efficacité du traitement par resvératrol, il est indispensable tester les effets sur les organes atteints par la maladie, nous souhaitons utiliser des animaux avec une déficience de la protéine MTR dans le cerveau et cœur (mère et progéniture). Pendant cette étude, des expérimentations non invasives seront réalisées chez la progéniture (imagerie cardiaque) pour mieux comprendre les conséquences de la carence en vitamine B12 dans chaque organe étudié, et une épreuve d’effort pour comprendre pourquoi les souris meurent à un âge précoce si la défaut est au niveau du cœur, et des tests comportementaux d'observation et non douloureux seront menés en parallèle pour savoir si un traitement réduit les manifestations neurologiques. L’ensemble des résultats sera étudié par informatique pour créer un modèle de « souris personnalisée » capable de prédire ce qui se passe dans l’organisme de la souris en cas de dérégulation ou de traitement, permettant ainsi de remplacer toute autre utilisation de souris dans certaines expérimentations, ou de limiter le nombre d’expérimentations grâce à ce modèle.

Réduction

Pour évaluer l’efficacité du Resvératrol sur la protéine Sirt-1 chez les patients CblG qui ont des troubles sévères dans différents organes essentiels tels que le cerveau ou le cœur, nous souhaitons utiliser 2 lignées de souris transgéniques qui expriment la maladie dans ces 2 organes cibles, et les étudier à 3 périodes différentes de la vie (sevrage à 21 jours, maturité sexuelle à 8 semaines et début du vieillissement à 6 mois). Afin d’assurer une étude statistique fiable nous inclurons 16 animaux par groupe d’étude, pour chaque tranche d’âge. Ces souris transgéniques seront traitées quotidiennement avec le médicament (ou placebo) par gavage durant la gestation jusqu’à la veille de la mise à mort, puis durant la lactation à partir de 2 jours post-naissance et jusqu’à l’âge de 21 jours. Ce projet nécessitera 72 femelles dont la moitié sera accouplée à 12 mâles portant la mutation au cerveau, et l’autre moitié à 12 mâles porteurs de la mutation au cœur Ce nombre d’accouplements est suffisant pour produire tous les animaux descendants nécessaires à la poursuite du projet. 360 animaux descendants seront nécessaires car l’étude est divisée en 3 groupes d’animaux traités avec le médicament ou son placebo et analysés à plusieurs stades du développement : - Groupe malade au niveau du cœur : 96 souris dont 48 sont traitées avec le médicament et 48 avec le placebo, et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois. - Groupe malade au niveau du cerveau : 96 souris, distribuées de la même manière que les souris malades au niveau du coeur. - Groupe témoin non malade : 96 souris traitées avec le placebo et maintenues 21 jours, 8 semaines ou 6 mois, et dont la moitié sera utilisée comme groupe témoin “Cœur” et l’autre moitié comme groupe témoin “cerveau” Étant donné le type de données (variables continues), les effectifs (N>5), le nombre de groupes comparés (n>2) et l'indépendance des échantillons, nous aurons le nombre indispensable de souris qui nous permettra faire des statistiques et arriver à avoir de conclusions de notre travail. Par ailleurs, toutes les données issues de nos expérimentations seront modélisées en tenant en compte du phénotype, des résultats des études fonctionnelles et du traitement. Cette modélisation nous permettra d’aborder l’ensemble de résultats obtenus et de réduire au maximum le nombre de souris étudiées.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans une animalerie conventionnelle agréée respectant les paramètres pour les conditions de vie des souris (hygrométrie, température…). Les souris seront hébergées en groupe dans la même cage (4/cage), auront un accès illimité à l’eau et à la nourriture, et bénéficieront d’objets pour l’enrichissement (bouts de bois, carton, mouchoir…). Toutes les procédures seront réalisées par des personnels entraînés et qualifiés pour ce type d’étude. Une procédure d’estimation et suppression de la douleur est mise en place : différents éléments visuels chez l’animal sont évalués afin d’établir un score qui permet d’anticiper et d’éviter d’atteindre les points limites déterminés au préalable, et qui tient compte des signes éventuels de mal-être (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids, yeux et abdomen creux). En fin de protocole, les animaux seront mis à mort et des organes prélevés pour permettre des analyses biochimiques, enzymologiques et anatomopathologiques.

Choix des espèces

La souris génétiquement modifiée est le seul modèle disponible de mutation tissu-spécifique permettant l'étude de cette maladie génétique, et il mime parfaitement la pathologie car nous observons chez la souris les mêmes symptômes que ceux rencontrés chez l'homme. Il n'existe pas de modèle animal autre que la souris génétiquement modifiée permettant l'étude de cette maladie. Les animaux impliqués dans ce projet seront étudiés à plusieurs périodes de la vie telles que le sevrage (21 jours), la maturité sexuelle (8 semaines) et le début du vieillissement (6 mois) car ce sont des périodes charnières dans le déclenchement de la maladie CblG chez l’homme. Le traitement par Resvératrol sera effectué quotidiennement par gavage de la mère gestante (40 mg/kg/j) à partir de 9 jours après le début de la gestation (E9) jusqu’au sevrage. Différentes procédures expérimentales seront mises en œuvre (tests comportementaux, tests d’effort, imagerie à J20 ou 6 mois). A l’issue de chaque période clé du protocole, une partie des animaux sera mise à mort pour procéder aux analyses biochimiques et histopathologiques.

2 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, une partie parce qu'ils ont reçu des substances dont les effets à long terme sont inconnus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées qui forment une poche d'air sous la peau de leur dos, poche ensuite regonflée, et chaque animal peut recevoir jusqu'à 224 administrations et subir jusqu'à 72 prélèvements sanguins sur cinquante-six jours. Le modèle sert à tester des anti-inflammatoires et la biocompatibilité de biomatériaux, de nanoparticules ou d'implants, y compris des molécules déjà commercialisées, pour des industriels. Le porteur écrit qu'il lui est "malheureusement impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico, les réponses globales de l'organisme étant selon lui difficiles à simuler.

Objectifs

L’inflammation est un processus complexe en réponse à diverses agressions du corps. Cette réaction qui vise à éliminer l'agent agresseur, à réparer les tissus endommagés et à favoriser la guérison, se caractérise par des symptômes tels que le gonflement, la douleur et la rougeur au niveau des zones touchées. La crise inflammatoire est un mécanisme de défense vital qui aide à éliminer l'agresseur et à limiter les dommages. Cependant lorsque l'inflammation devient excessive ou persiste pendant de longues périodes, elle peut conduire à une inflammation chronique pathologique. Il est alors essentiel de disposer de traitements anti-inflammatoires pour éviter les complications à long terme. Actuellement il existe plusieurs médicaments anti-inflammatoires qui sont couramment utilisés pour contrôler l'inflammation et atténuer les symptômes de la crise inflammatoire. Cependant, ils présentent des effets secondaires parfois importants, ce qui limitent leur utilisation, et dans certains cas, l’inflammation résiste à ces traitements. Pour ces deux raisons le développement de nouvelles molécules reste un défi important. L’inflammation peut aussi avoir pour origine l’utilisation de biomatériaux, de nanoparticules ou d’implant dans le traitement de pathologies. Dans ce cadre il est important de tester la biocompatibilité des produits utilisés afin de sélectionner ceux qui seront le mieux tolérés par le corps.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements anti-inflammatoires et au développement de produits biocompatibles lorsque l’utilisation de biomatériaux est nécessaire. De plus comme nous testons également des molécules déjà sur le marché ou en phase clinique dans ce modèle, nous participons à une meilleure connaissance de sa prédictivité.

Procédures

Les animaux de ce projet seront tous amenés à subir la formation d’une poche air. Les animaux auront un maximum de 224 administrations et un maximum de 72 prélèvements sanguins sur la période de maximum 56j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en termes de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire. Les administrations durent moins de 30 secondes. En cas injection intraveineuse, durée est d’environ 5 min. Concernant les prélèvements de sang, ils durent de 1 à 5 minutes selon la méthode utilisée. Chacune des étapes de la formation de la poche prend moins de 3 min avec le temps de l’anesthésie et le temps l’injection. Le prélèvement du liquide de la poche prend moins de 5 min en tenant compte du temps d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les administrations répétées ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent induire des désagréments au niveau des sites d’administration et de prélèvement comme une douleur passagère ou une irritation, une inflammation, une induration mais aussi un phénomène de mâchonnement et de fausse route pour la voie per os. Un stress lié aux différentes manipulations peut également apparaitre. Si le prélèvement terminal de sang nécessite une mise à jeun cela peut induire un stress chez l’animal. Les procédures mises en œuvre peuvent induire des douleurs chez l’animal notamment lors de la création de la poche, lors de l’inflammation induite ou si le produit testé induit une inflammation.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de l'expérience, une partie des animaux seront utilisées pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances aux effets inconnus à long terme.

Remplacement

Bien qu'il soit possible de disséquer les mécanismes anti- et pro-inflammatoires in vitro, les réponses globales à court et moyen terme sont difficiles à simuler et à prédire par des expériences in vitro. Ainsi vue notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer nos modèles in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Néanmoins, les molécules et produits testés dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. C’est pourquoi, très souvent, plusieurs types de prélèvements seront associés. De plus, quand c’est possible et pertinent, nous testons plusieurs molécules ou produits en parallèle afin de ne pas multiplier les groupes contrôles. Comme aucune inflammation n’est attendue en l’absence d’injection de molécule immunostimulante dans la poche, le groupe sans injection de molécules immunostimulantes ne sera, en général, pas mis en œuvre. Au regard de notre expertise, de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle et d'une éventuelle différence inter-individuelle à l’exposition aux traitements, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Des analyses statistiques finales seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du Le bien-être des animaux est primordial durant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment l’inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux. De plus, l’environnement des animaux est enrichi. Pour les souris, il comporte du matériel de nidification, un dôme pour se cacher et un tunnel suspendu. Pour les rats, il comporte un tunnel en carton pour leur permettre de se cacher et des boules de bois pouvant servir de jeu et de matériel à ronger. La douleur induite par les étapes de création de la poche et de regonflage est prise en charge par un traitement anti-douleur. Les prélèvements de sang en cours d’expérience se font sous anesthésie et tous les autres prélèvements (ponction de la poche, prélèvement sanguin terminal) se font en phase terminale, sous anesthésie sans réveil. De plus nous avons établi des points limites afin de soustraire l’animal à une douleur qui n’est pas en relation avec les signes attendus du projet. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre SBEA (Structure du Bien Être Animal) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris ou des rats non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. C’est le cas pour la souris et le rat dans les études utilisant le modèle de la poche d’air. De plus ce modèle répond favorablement aux médicaments déjà sur le marché ce qui prouve leur prédictivité et permet aux industriels d’étudier l’apport de leurs nouvelles recherches par rapport aux traitements déjà existants. De plus, ces espèces disposent d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Les besoins d’anti-inflammatoire et de matériaux biocompatibles peuvent apparaitre à tout âge, cependant comme beaucoup de ces phénomènes impliquent également le système immunitaire, l’utilisation de jeunes adultes au système immunitaire mature nous parait pertinent. De plus chez la souris il nous faut également des animaux pas trop petits pour des questions techniques de place dans le dos pour former une poche exploitable. Nous utiliserons donc des souris d’environ 12 semaines et rats d’environ 10 semaines au début de l’expérience.