Recherche appliquée

2850 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Une partie developpe un lupus induit par une application sur l'oreille, l'autre porte une mutation qui declenche spontanement la maladie, avec selon le porteur rash, aphtes, arthrite, nephrite, anemie et atteintes cardiovasculaires, avant que toutes recoivent des composes par gavage puis soient tuees pour analyse des tissus. Le porteur affirme que le recours aux modeles animaux est "indispensable" et s'appuie sur des modeles utilises en routine depuis cinq ans dans l'etablissement. Les benefices avances, de nouvelles therapies pour les patients, restent renvoyes au long terme.

Objectifs

Le lupus érythémateux systémique est une maladie hétérogène, d'origine auto-immune, caractérisée par la présence d'auto-anticorps anti-nucléaires. La prévalence est estimée à environ 1 pour 1000 (variation en fonction des ethnies, rapport femmes/hommes de 10:1). Le lupus peut atteindre tous les organes et se répercute sur la qualité de la vie. Il se manifeste par les symptômes suivants : rash sur la face, aphtes, photosensibilité, arthrite, néphrite, troubles neurologiques, anémie, thrombocytopénie, atteintes cardiovasculaires, pulmonaires, digestives. Les objectifs du traitement sont de traiter les épisodes aigus qui peuvent compromettre le pronostic vital et minimiser les risques de poussées pendant les périodes de relative stabilité. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur l'hydroxy-chloroquine, les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, l'anticorps monoclonal anti-CD20. Des traitements plus performants sont nécessaires. Galapagos a mis au point plusieurs tests in vitro permettant d’induire différentes voies de signalisation impliquées dans l'inflammation dans des cellules humaines ou murines. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux du Lupus. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients Lupus.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles du Lupus chez la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Le poremier modèle sera induit par un agent en application topique sur l'oreille et le second modèle sera des souris génétiquement altérées à phénotype dommageable qui developpent spontanément la maladie. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques du lupus érythémateux systémique qui se carractérisent par un rash sur la face, des aphtes, de la photosensibilité, de l'arthrite, une néphrite, desn troubles neurologiques, une anémie, une thrombocytopénie ainsi qu'atteintes cardiovasculaires, pulmonaires et digestives.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce et les tissus seront collectées pour une étude de la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Les paramètres mesurés seront gardés ou exclus selon qu'ils suivent une distribution normale et présentent une variabilité acceptable.L'analyse statistique concerne des séries indépendantes, supérieures à 2 groupes. L'analyse de variance (ANOVA) sera suivie d'un test paramétrique ou non paramétrique en fonction de la configuration de l'étude, permettant des comparaisons multiples (e.g. Dunnett). Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%). De la buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

1848 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de tumeur sous la peau puis des traitements, avant d'etre tue pour des prelevements, le resume restant tres bref sur le deroule des procedures. Le porteur prevoit une mise a mort par dislocation des qu'un point limite est atteint et administre le butyrate dans l'eau de boisson pour limiter les manipulations. Il qualifie le recours a l'animal d'"incontournable", jugeant impossible de reproduire le systeme immunitaire et ses interactions hors d'un organisme vivant.

Objectifs

Les acides gras sont naturellement présents dans la circulation sanguine et sont utilisés comme source d’énergie par le corps humain. Lorsque ces acides gras possèdent 6 atomes de carbones ou moins, ils sont qualifiés d’acides gras à chaines courtes (AGCC). Lors d’une précédente étude, nous avons démontré que des souris recevant une boisson enrichie en butyrate (AGCC possédant 4 atomes de carbones) et traitées avec un anticorps monoclonal (médicament fabriqué en laboratoire qui est capable de se fixer spécifiquement sur une cible désignée) présentaient une réponse anti-tumorale significativement réduite par rapport aux souris également traitées mais buvant de l’eau normale. Une observation similaire a été faite dans une étude clinique chez l’homme : des concentrations plus élevées en AGCC (butyrate ou propionate, respectivement 4 et 3 carbones) ont été mises en évidence dans le sang des patients n’ayant pas répondu à un traitement par anticorps monoclonal. Ce projet a pour but de déterminer si l’efficacité d’un traitement par un type d’anticorps monoclonal (anticorps actuellement le plus fréquemment utilisée chez l’homme pour combattre le cancer) pouvait également être altérée par le butyrate. Si c’est le cas, le butyrate pourrait alors devenir une molécule prédictive de la réponse au traitement anti-cancéreux. Evaluer les effets des acides gras à chaine courte (AGCC) sur la réponse anti-tumorale et mettre en évidence les mécanismes immunosuppresseurs induits par les AGCC (butyrate et propionate) induisant une résistance aux médicaments ciblant et bloquant les checkpoints immunitaires.

Bénéfices attendus

Le butyrate (et dans une moindre mesure le propionate) sont décrits comme pouvant réduire l’activité du système immunitaire : en grandes quantités, ils vont faire pencher la balance immunitaire en faveur d’une tolérance (pouvant expliquer la tolérance vis-à-vis de la tumeur). La compréhension des mécanismes d’actions permettrait de proposer des molécules bloquant l’action des AGCC qui pourraient, à terme, être utilisées chez l’homme en combinaison des traitements actuels pour augmenter les chances de réponses.

Procédures

Greffes de tumeurs par voie sous-cutanée.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à la présence de tumeurs greffées en sous-cutané, et d'administrations de médicaments.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses.

Remplacement

Ce projet nécessite de travailler sur des souris vivantes car il est actuellement impossible de reproduire les mécanismes du système immunitaires ex-vivo du fait de sa complexité . Les modèles in-silico et in-vitro sont importants et permettent de tester les hypothèses développées dans une certaine mesure. Cependant ces modèles présentent rapidement leurs limites : ce projet s’intéresse à la modulation du système immunitaire en fonction de la concentration en AGCC. Les expérimentations font donc appel aux interactions s’établissant entre plusieurs systèmes complexes (système digestif, système immunitaire …) qui ne peuvent être reproduit in-vitro. Le caractère incontournable du recours à l’animal est de nous permettre d’étudier, dans sa globalité, la modulation du système immunitaire (et ses interactions avec les autres systèmes complexes). Pour l’heure, il reste impossible de reproduire le système immunitaire et ses interactions avec les autres systèmes ex-vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre de souris nécessaire grâce au logiciel G*Power et d’après le critère le plus pertinent : le volume tumoral. Le nombre d’animaux a été calculé à l’aide d’un test Wilcoxon-Mann-Whitney et d’après les moyennes et les écarts types obtenus après 23 jours de croissance tumorale (plus grande différence de surface entre les groupes de souris). Les variables obtenues et utilisées dans le calcul sont les suivantes : « effect size d » = 0.954, α=0.05 et « Power » =0.85.

Raffinement

Les injections seront faites sous anesthésie locale (lidocaïne) ou générale (isoflurane). Les prélèvements de sang se feront au niveau la veine submandibulaire pour réduire la douleur au long terme induite par ce genre de procédure. De plus, au moment du prélèvement, les souris seront maintenues sous anesthésie par isoflurane (1 à 1.5L/min d’air à une concentration de 1.5 à 2% d’isoflurane) et nous vérifierons que les souris sont bien endormies avant de procéder à la piqûre. Les souris seront également surveillées jusqu’à leur réveil pour contrôler le bon rétablissement après anesthésie. Les cages seront enrichies avec du sizzle nest et des tubes en carton permettant de réduire le stress induit à chaque fois qu’elles seront manipulées. De plus lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris seront placées en quarantaine pendant 1 semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les acides gras administrés aux souris seront directement présents dans l’eau de boisson. Cela réduit fortement l’angoisse et la douleur engendrées chez les souris car cela évite des administrations de produit quotidiennement par gavage ou par injection intrapéritonéale. Enfin les souris ayant reçues des cellules tumorales seront surveillées quotidiennement et la détection de points limites entrainera un sacrifice par dislocation.

Choix des espèces

Le butyrate a montré qu’il était capable d’inhiber de la réponse anti-tumorale aux immunothérapies chez la souris. Il est donc cohérent de poursuivre la caractérisation des mécanismes d’actions dans ce modèle animal. Les anticorps bloquant les checkpoints immunologiques CTLA-4 et PD-1 que nous souhaitons étudier ont été développés et optimisés chez la souris et ont fait leurs preuves. Nous utiliserons deux modèles syngéniques : BALB/c et C57Bl/6. Ces modèles sont capables de porter des tumeurs décrites comme sensibles aux immunothérapies (CT26 et MC38 et B16K1). Les souris BALB/c et C57Bl/6 possédant des fonds génétiques différents, les mécanismes impliqués dans la réponse anti-tumorale varient également. Un parallèle peut être fait avec l’homme dont la diversité génétique explique les variabilités de réponse face aux traitements. Nous intéresserons également à un modèle tumorale capable de faire de la dissémination métastatique (4T1) qui ne peut être greffé que sur le modèle BALB/c. Les souris qui seront utilisées auront au minimum 8 semaines. Elles auront d’une part atteint la maturité sexuelle et d’autres part, elles auront fini de développer leur système immunitaire. Travailler sur le système immunitaire mature des souris permettra, en partie, de faire le parallèle avec celui de l’homme.

578 souris immunodeprimees vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de cellules de glioblastome humain dans le cerveau par ouverture du crane, puis des seances hebdomadaires d'imagerie sous anesthesie et des instillations nasales de candidats-medicaments, une moitie etant en plus irradiee, avant d'etre tuee pour analyser la progression tumorale. Le porteur decrit surtout le stress lie aux anesthesies repetees et prevoit une mise a mort des qu'un point limite de degradation est atteint. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, les organoides cerebraux ne reproduisant pas selon lui la complexite du microenvironnement tumoral.

Objectifs

Avec plus de 3000 nouveaux cas par an en France, les récidives de gliomes de bas grade ainsi que les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales avec un mauvais pronostic et pour lesquelles les traitements sont lourds mais peu efficaces. Néanmoins, la chirurgie en association à la radiothérapie et la chimiothérapie permet de prolonger de quelques mois la survie. En effet, la survie des patients après diagnostic n’excède pas 2 ans y compris après un traitement. Dans des études in vitro, nous avons sélectionné de nouvelles molécules qui en association avec la radiothérapie réduisent la croissance des cellules tumorales. Nous proposons de tester ces nouvelles molécules dans un modèle préclinique. La transplantation intracérébrale de cellules issues de gliomes humains chez des souris est le modèle de choix pour tester l’efficacité d’approches pharmacologiques en combinaison avec la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique permettra d’évaluer l’efficacité in vivo de molécules pour réduire la croissance de cellules de gliomes. Ce travail pourra servir de référence pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques du cancer du cerveau le plus fréquent chez l’Humain adulte.

Procédures

L’opération de xénogreffe comporte 4 étapes : injection d’un antalgique, une anesthésie, ouverture minime de la boîte crânienne et injection de cellules issues de gliomes humains dans le cerveau de l’animal, pour une durée totale de l’opération de moins de 20 min par souris. L’imagerie par bioluminescence sera réalisée de façon hebdomadaire durant 5-9 semaines. Cette mesure nécessite une anesthésie gazeuse de l’animal pour 15-20 min et l’administration intrapéritonéale d’un composé. Deux mois après la greffe, les candidats-médicaments seront administrés par instillation nasale sous anesthésie légère à raison de 5 fois par semaine et pour 1 ou 3 semaines selon la procédure. L’administration est réalisée sous anesthésie gazeuse et dure moins de 5 min. Les jours de mesure de bioluminescence, l’administration sera réalisée au cours de la même anesthésie. La moitié des animaux sera exposée à une radiothérapie sous anesthésie gazeuse pour une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure attendue de cette expérimentation concerne le stress provoqué par les anesthésies gazeuses répétées (opération de transplantation, instillations nasales). L’opération de transplantation est un acte chirurgical qui représente des effets indésirables mais celui-ci est bien maîtrisé et les animaux se rétablissent rapidement après l’opération. L’instillation nasale d’un petit volume d’une solution saline est une méthode non-invasive permettant l’administration de petites molécules qui vont diffuser dans le cerveau. Le stress lié à cette approche réside dans les anesthésies répétées, la contention et l’obstruction momentanée d’une narine. La radiothérapie requiert une anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal mais l’exposition à l’irradiation ne génère pas de souffrance et la dose utilisée n’engendre pas d’effets néfastes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever le cerveau afin de réaliser des analyses histologiques et d’évaluer l’effets des composés pharmacologiques sur la progression tumorale.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune alternative à l’utilisation d’animaux pour l’étude du glioblastome, particulièrement en raison du microenvironnement tumoral qui joue un rôle défavorable et ne peut être reproduit dans un système in vitro. Des cultures d’organoïdes cérébraux sont en cours de développement mais ce modèle expérimental, dépourvu de certains types cellulaires impliqués dans la croissance tumorale, ne représente pas à ce jour toute la complexité du modèle in vivo.

Réduction

Dans ce projet, deux candidats-médicament seront évalués dont l’un d’entre eux est connu pour ne pas présenter d’effet indésirable in vivo. Des essais de non-toxicité pour la deuxième molécule seront réalisés au préalable et en cas d’effets cliniques néfastes, son utilisation sera interrompue ; l’étude sera limitée à la première molécule. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été défini en fonction de la littérature et notre expérience sur la variabilité des expériences de transplantation. Plusieurs types de cellules de glioblastomes représentant différentes caractéristiques des glioblastomes sont inclues dans cette étude. Les expérimentations seront réalisées indépendamment pour chacun des types de cellules de glioblastome et de façon séquentielle si bien qu’en cas d’évolution tumorale défavorable le protocole pourra être interrompu plus précocement et éviter l’utilisation de tous les groupes d’animaux.

Raffinement

Afin de protéger d’une éventuelle contamination par l’environnement, ces animaux immuno-déficients seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes dans des cages avec un système de ventilation contrôlée. Mise en place d’un protocole d’anesthésie/analgésie. Mise en place d’un suivi clinique régulier avec l’aide d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Des critères de point limite ont été établis et leur expression justifiera l’interruption de l’expérience et la mise à mort de l’animal pour lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules humaines sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour éviter tout rejet. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris présentant un thymus rudimentaire, connu pour supporter la transplantation et la croissance de cellules de gliomes humains dans leur cerveau. Par ailleurs, ce modèle de souris présente une faible radiosensibilité et permet l’étude de la radiothérapie contrairement à d’autres modèles de souris immunodéficientes. Le gliome est une tumeur cérébrale fréquente chez l’adulte qui affecte sans distinction les mâles et les femelles. Nous utiliserons donc des animaux adultes mâles et femelles.

370 souris porteuses d'une mutation de la sclerose laterale amyotrophique vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. A deux jours de vie, les souriceaux recoivent une injection d'un virus dans le cerveau apres anesthesie sur glace, subissent une echographie sous anesthesie, puis sont tues pour analyse histologique du cerveau. Le porteur indique que les injections entrainent une perte d'animaux, liee a leur jeune age et au rejet par la mere, et affirme que le modele murin reste "indispensable" faute de pouvoir modeliser la distribution d'une therapie genique sans organisme vivant. Les retombees pour les patients sont presentees comme un prerequis a d'eventuels essais chez l'homme.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec Une échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris.

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

16 macaques a longue queue femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal enchaine IRM, scanner et imagerie TEP sous anesthesie generale, plusieurs seances de neurostimulation par ultrasons en chaise de contention, puis un test de memoire ou l'animal doit choisir entre deux gobelets pour obtenir une friandise, avant d'etre tue par surdosage d'anesthesique pour analyser son cerveau. Le porteur decrit un stress a l'induction de l'anesthesie, des douleurs aux sites d'injection et une gene liee a l'intubation et a la contention. Il affirme que les modeles in silico et in vitro ne reproduisent pas la physiologie cerebrale, juge l'usage du singe "indispensable" en vue d'une transposition a l'homme, et prevoit de reutiliser des femelles deja presentes dans l'etablissement.

Objectifs

Actuellement de nombreux protocoles thérapeutiques visant les troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression, …) sont confrontés à l’apparition de pharmacorésistance chez de nombreux patients. Il semble essentiel de trouver des solutions innovantes pour parer à ces complications. Plusieurs techniques de neurostimulations sont proposées: la neurostimulation magnétique transcrânienne, utilisée en clinique, est non-invasive mais a une mauvaise discrimination spatiale, et la stimulation cérébrale profonde qui offre une meilleure résolution spatiale mais nécessite une chirurgie lourde. Nous proposons de pallier ces défauts et de garder ces points forts en utilisant la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés. La neurostimulation ultrasonore (US) se fera par application d’une sonde US sur le crâne, permettant la propagation intracrânienne d’ondes US focalisées et la stimulation précise de régions cérébrales. Nos résultats actuels ont montré que la stimulation US induit une activation neuronale, un mécanisme capital dans la thérapeutique des troubles neuropsychiatriques. Cette technique de neurostimulation offrirait une alternative ciblée et non-invasive pour les troubles neuropsychiatriques. Des études exploratoires chez les rongeurs ont démontré la faisabilité de cette technique. Cependant, leurs physiologies (épaisseur du crâne, orientation et forme du cerveau) freinent la transposition en clinique humaine. Des simulations numériques et expérimentales ont montré que les ultrasons pénètrent de façon similaire la boite crânienne chez l'homme et chez le primate. Des manipulations sur des singes cynomolgus sont en cours sans anesthésie pour la neurostimulation. Mais il y a des difficultés lors de la stimulation malgré l'habituation (tête non immobile). Dans la continuité de ce protocole, ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore aigüe et chronique sur le primate non humain (PNH) anesthésié. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation US aigüe (n=8) et la neurostimulation US chronique (n=8). Ce nombre est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Tous les individus seront euthanasiés à la fin du projet par une méthode réglementaire et les cerveaux seront prélevés pour évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation US (neuroinflammation, neurotransmission, mort cellulaire, microhémorragies, ...).

Bénéfices attendus

Actuellement, les cas de dépression chez l’homme sont traités à l’aide de divers protocoles thérapeutiques tels que la psychothérapie, les antidépresseurs et autres molécules pharmacologiques. Dans de nombreux cas, les patients développent une pharmacorésistance aux traitements médicamenteux. Cette pharmacorésistance nécessite l’orientation des patients vers d’autres techniques thérapeutiques. Parmi ces techniques, nous pouvons relever la méthode de neurostimulation magnétique transcrânienne ou la stimulation cérébrale profonde (stimulation par implantation d’électrode dans le cerveau) mais la première ne cible pas correctement la zone cérébrale impliquée dans la dépression et la deuxième est trop invasive. Pour pallier ces défauts, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité d’une nouvelle méthode non invasive et ciblée : la neurostimulation ultrasonore chez le singe. Ce projet permettra ainsi de progresser dans la possibilité de traduire cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques. La perspective directe de ce projet est une transposition de cette technique pour un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. Sont concernés tous les animaux (n=16) IRM cérébrale sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. Scanner CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. Adaptation du dispositif de neurostimulation : Sont concernés tous les animaux (n=16), jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min – 1 mois minimum Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16). Cette imagerie sera réalisée 2 fois sur 8 animaux et 3 fois sur 8 autres animaux; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique: Sont concernés tous les animaux (n=16), 8 animaux avec 2 séances de stimulation et 8 animaux avec 10 séances de stimulation; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation. Test de comportement et de mémorisation : Sont concernés uniquement les animaux ayant une neurostimulation US chronique (n=8); pour la mémorisation, l'animal est placé dans un sas et devra choisir entre deux gobelets pour trouver une récompense (friandise). Euthanasie : Sont concernés tous les animaux (n=16), surdosage d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore. Concernant l’application des ondes ultrasonores lors de la neurostimulation et d’après nos précédentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable. Les ondes ultrasonores auront une fréquence au-delà de celle de la gamme audible des primates, il n’y aura donc pas d’effets indésirable escomptés. Ceci a été validé chez les rongeurs dans nos études précédentes et dans la littérature.

Devenir

A l’issu des 2 procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques des cerveaux.

Remplacement

Les modèles in silico, in vitro, (cellulaires) et/ou mathématiques ne permettent pas de reproduire la physiologie cérébrale et son environnement (vascularisation, perfusion, débit sanguin, etc…), l’utilisation d’animaux est donc indispensable. De plus, l’objectif final est de transposer cette technique en clinique humaine, en conséquence les études chez l’animal ne peuvent pas être substituées. Des études précédentes ont été menées sur les rongeurs (souris et rats). Les résultats obtenus sont encourageants mais ils ne permettent pas une transposition directe de la neurostimulation en clinique humaine, notamment à cause des différences physio-morphologiques des rongeurs avec l’homme. Pour pallier ces différences, nous proposons d’évaluer notre méthode sur un modèle animal plus proche de l’homme pour la morphologie cérébrale et crânienne, le singe cynomolgus.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. La réduction du nombre d’animaux se fera aussi par l’utilisation d’imagerie préclinique. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière disposant de plateformes surélevées avec les congénères et en présence d’objets d’enrichissement. L'alimentation couvrira les besoins journaliers et sera complétée par des friandises. Un programme d'enrichissement sera mis en place (recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Pour limiter le stress, nous recourrons à l’habituation (renforcement positif). Elle sera effectuée par le personnel en charge de l’étude et en collaboration avec le personnel d’animalerie. Les animaux seront habitués à recevoir des récompenses (friandises) après réalisation de tâches simples (ex : toucher un objet) afin d’obtenir la coopération de l’animal et instaurer une relation de confiance. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant et sous monitoring cardio-pulmonaire. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur et l’inconfort des animaux. Ces points limites seront des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence des animaux. Les animaux seront pesés à réception puis à chaque manipulation nécessitant une sortie de cage. Des mesures préventives seront prises : médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs, notamment après le retrait des cathéters, l’animal pourra recevoir une injection d'un antidouleur au site de pose du cathéter. Nous aurons recours le plus possible à la réutilisation d’animaux inclus dans d’autres projets sous condition qu’ils n’aient subi aucun dommage cérébral, ni locomoteur.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques femelles pubères seront utilisées pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubères. Pour cette étude, des macaques femelles seront utilisées. Actuellement des macaques femelles sont utilisées au sein de l’EU et seront disponibles à la réutilisation. Cela sera en accord avec les principes de réduction et de raffinement édictés par la règle des 3R. De plus, nos équipements d’imagerie actuels ne peuvent pas supporter la forte corpulence de macaques mâles adultes (poids et largeur d’épaule sont souvent trop importants pour le stade de développement souhaité).

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'anorexie mentale, elles subissent une chirurgie d'implantation d'une pompe sous la peau, un isolement de dix-neuf jours, des lavages vaginaux quotidiens pour les femelles et deux IRM de deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur indique que la chirurgie et les prélèvements peuvent provoquer de la douleur, prise en charge par analgésiques. Il affirme qu'un animal vivant est "nécessaire" pour étudier l'effet du traitement sur le poids et la prise alimentaire, en vue d'un essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement pour la prise en charge de l’anorexie mentale (AM) sur la structure et les fonctions cérébrales chez la souris. L’AM est une maladie complexe et multifactorielle avec une auto-restriction de l’apport alimentaire et entrainant des troubles de la reproduction qui persistent même après rémission. La régulation de la fonction de reproduction repose sur la communication entre certains neurones de notre cerveau : les neurones qui sécrètent l’hormone gonadolibérine (neurones à GnRH), l’hypophyse et les gonades (ovaires et testicules). Toute perturbation des neurones à GnRH entraîne une perturbation importante de cette communication. Des études par imagerie par résonnance magnétique (IRM) ont montré une altération de la structure et du fonctionnement de certaines aires cérébrales dans l’AM. Nous avons développé un modèle de souris chez lequel nous bloquons génétiquement la sécrétion de GnRH de ces neurones. Ces souris mangent beaucoup moins que celles qui ont des neurones à GnRH fonctionnels, mais il en résulte des souris femelles plus grosses que des souris sauvages et des mâles plus maigres et plus petits que des souris contrôles. Ce modèle mime une partie des caractères physiopathologiques de l’AM. L’implantation sous la peau de petites pompes délivrant des taux physiologiques de GnRH de manière physiologique chez ces souris, permet de restaurer une prise alimentaire et un poids normal. Ces données laissent penser que les neurones GnRH pourraient être impliqués dans les maladies nutritionnelles comme l’AM ou l’obésité. Les objectifs de ce projet sont : - de caractériser notre modèle de souris sur le plan cérébral, tant anatomique que fonctionnel en se basant sur ce qui est connu sur le sujet dans l’AM. Cette caractérisation servira de référence pour l‘étude des effets du traitement ; - d’étudier l’impact du traitement à la GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau afin d’obtenir des arguments solides des effets positifs du traitement sur ces paramètres en vue d’un passage en essai clinique chez l’humain. Dans ce but, nous acquerrons en IRM à haute résolution des images anatomiques et fonctionnelles du cerveau de nos souris modèles avant et après traitement à la GnRH.

Bénéfices attendus

L’AM est une pathologie qui touche essentiellement des populations jeunes et représente la pathologie psychiatrique la plus mortelle. A ce jour, aucun traitement pharmacologique n’existe et le risque de rechute est de 41 %. La re-nutrition et la prise en charge psychologique échouent dans la grande majorité des cas. De plus, la prévalence de cette maladie ne cesse d’augmenter, notamment depuis le début de la crise sanitaire liée à la pandémie de Covid-19. Les professionnels de santé qui prennent en charge cette maladie sont démunis face au taux de rechute et à l’inefficacité à long terme de la renutrition. Les patients de leurs côtés ne disposent pas de prise en charge efficace et durable ce qui conduit au décès de 10% des patients. Une meilleure compréhension de l’effet du traitement au GnRH dans le modèle préclinique devrait permettre, à l’issue du projet, de démarrer un essai clinique de prise en charge chez l’humain. Notre but est de potentialiser l’effet de la prise en charge nutritionnelle et psychiatrique par un traitement mettant l’organisme dans de bonnes conditions métaboliques pour favoriser le retour à un état physiologique. Ce traitement porte un espoir de guérison pour ces patients sans solution thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie courte (10-15 minutes) sous anesthésie générale pour implanter la petite pompe sous la peau au niveau de leur dos. Après la chirurgie les animaux seront isolés pendant 19 jours, pour le suivi de la prise alimentaire. Les femelles auront un lavement vaginal d’une durée de moins de 30 secondes par souris et qui seront réalisés tous les matins de la période du traitement soit sur une durée de 19 jours. Pour les mâles, l’indication connue du bon fonctionnement du traitement est le retour d’un taux de présence normale de testostérone dans le sang. Avant et après le traitement, les animaux auront une petite prise de sang pour doser cette hormone dans le sang. Cela représente deux prélèvements d’une durée maximale de 30 secondes par souris. Pour les deux sexes, les souris auront deux sessions d’IRM, l’une avant, et l’autre après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, les souris sont anesthésiées.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation des pompes sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Ils seront réalisés par une personne formée et habituée à les réaliser. La prise de sang peut générer une douleur ponctuelle au moment de la piqûre. Elle sera réalisée par un expérimentateur formé. Les animaux seront suivis très scrupuleusement pluri-quotidiennement tout au long du protocole afin de repérer tout signe de douleur et d’y pallier par l’administration d’analgésiques dans les plus brefs délais. Enfin les animaux seront placés en hébergement individuel après la chirurgie afin de mesurer leur prise alimentaire.

Devenir

A l’issue des deux IRM toutes les souris du protocole seront euthanasiées afin de procéder aux analyses anatomiques et histologiques des organes après traitement

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la modulation de la structure et du fonctionnement du cerveau chez d’un modèle préclinique de souris pour un test d’efficacité du traitement juste avant le transfert chez l’humain. Cela nous limite dans la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des solutions alternatives qui ne soient pas des animaux vivants. De ce fait, nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement sur les améliorations des paramètres pertinents comme le poids ou la prise alimentaire, ce que l’on ne pas reproduire autrement. Il faut aussi pouvoir détecter d’éventuels effets néfastes, déterminer les durées idéales du traitement, analyser ses effets positifs et comprendre les mécanismes d’action du traitement pour permettre son utilisation en clinique humaine.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et des fonctions cérébrales en réponse à l’administration du traitement à la GnRH. Nous avons déterminé le nombre maximal d’animaux en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Les analyses des IRM se feront pour chaque souris juste après le passage dans l’imageur sans attendre que toutes les souris aient été examinées. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi longitudinal. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet d’étudier de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés par le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulées par le même chercheur, qui s’en occupera quotidiennement et ne changera pas au cours du protocole. Cela permet aux souris de s’habituer à la présence et à l’odeur de l’expérimentateur et de limiter le stress des animaux lorsqu’ils commenceront le protocole. Les souris devront voyager entre leur animalerie d’élevage et l’animalerie du site où le projet se réalise. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie, puis isolés. Les animaux disposeront de matériel d’enrichissement (papier pour faire un nid, morceau de bois à ronger) et maisonnettes en plastique pour les animaux en groupe. Une fois isolés les animaux n’auront plus de maisonnette à disposition, la pompe en gênant l’accès. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Par la suite, du paracétamol sera délivré dans l’eau de boisson pour pallier aux douleurs liées à l’acte chirurgical, jusqu’à cicatrisation de la plaie. Les animaux seront suivis tous les jours pour repérer et prendre en charge immédiatement tout signe de douleur. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. L’euthanasie sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie.

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été mis au point chez la souris. Nous utilisons la même espèce pour permettre d’obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de l’anorexie mentale, pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase préclinique. Les animaux utilisés sont de adultes de 4 à 8 mois parce que l’étude des effets de l’hormone GnRH nécessite d’utiliser des animaux adultes. Le vieillissement agit sur la fonction de reproduction et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous ne dépasserons pas l’âge de 8 mois. Nous avons déjà des données préliminaires chez des animaux dans cette tranche d’âge et la nécessité de pour pouvoir comparer les données impose de respecter cette limite d’âge.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie musculaire génétique, elles reçoivent des injections de molécules thérapeutiques, dont des injections rétro-orbitaires, puis sont soumises chaque mois pendant un an à des tests de locomotion et de force sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs muscles. Le porteur indique n'étudier que les premières étapes des symptômes et tuer les animaux avant la phase terminale de la maladie. Il juge le modèle animal "indispensable" car aucun modèle cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion et de la force.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la dystrophie myotonique, pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette faiblesse musculaire, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de la dystrophie myotonique, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype locomoteur et de la force musculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la dystrophie myotonique, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour une maladie humaine musculaire.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 – Les injections rétro-orbitaires de virus associés aux adénovirus adénovirales (AAV) ou d’oligonucléotides antisens (ASO), requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 12 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 12 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie musculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et de faiblesse musculaire chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs muscles squelettiques pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique, la dystrophie myotonique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera le type de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 7 types et/ou doses de traitements sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 168 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie musculaire que nous étudions touche les adultes, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 12 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.