Recherche appliquée

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux mâles reçoivent à deux jours de vie une injection de streptozotocine qui détruit une partie de leur pancréas, puis un régime gras et des prélèvements sanguins répétés, avant d'être tués pour prélever le foie, les mères et souriceaux femelles étant également tués. Le porteur teste un composé contre la stéatose hépatique dans un modèle qu'il indique avoir validé "avec le client". Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur cette maladie.

Objectifs

La stéatose est l’accumulation de graisses à l’intérieur de cellules qui, normalement, n’en contiennent pas ou peu. Le foie, qui comporte très peu de graisses lorsqu’il est sain, peut être le siège de cette concentration. On parle alors de stéatose hépatique. Ainsi, un foie qui contient trop de graisses (triglycérides) est un foie stéatosique. La stéatose hépatique est fréquemment associée à l’obésité mais certains sujets non obèses peuvent présenter cette pathologie. Au début, l’accumulation de triglycérides dans les cellules du foie est responsable d’une stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - non alcoholic fatty liver disease). Dans cette forme simple, le foie est très riche en graisses et des mesures hygiéno-diététiques permettent la guérison. Le foie retrouve alors son aspect normal. Si la surcharge en triglycérides se poursuit, le foie devient le siège d’une inflammation appelée hépatite. C’est la stéato-hépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). L’inflammation ne disparait pas, elle va au contraire s’aggraver avec le temps. Il est possible qu’elle évolue vers la fibrose hépatique. Après plusieurs années, elle peut devenir une cirrhose, avec un risque élevé de cancer hépatique. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement médicamenteux approuvé et montrant une efficacité certaine pour la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - Non Alcoholic Fatty Liver Disease) ou la stéatohépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). Le présent projet vise à tester l'efficacité d'un composé en développement visant à traité la stéatose hépatique dans un cadre préclinique. L'objectif est donc d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité avant de pousser plus en avant le développement du composé, notamment vers les stades cliniques.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la stéatose hépatique, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la stéatose hépatique.

Procédures

Les souris gestantes seront mise à mort après sevrage des souriceaux. Aucune autre intervention n'est prévue. Les souriceaux recevront une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) à deux jours postnatal (durée de la procédure : 2 minutes envron). Après sevrage, les femelles seront euthanasiées. En effet, il est bien connu que les souris femelles présentent un niveau de résistance élevé au développement de la stéatose comparativement aux souris mâles. Les mâles seront soumis à une alimentation classique (8-10 animaux) ou une alimentation enrichie en graisse (HFD 60% de l'énergie apportée par les lipides; 24-30 animaux) pendant 64 jours (D0-D63). Des prélèvements sanguins seront pratiqués via la veine caudale à D28, D35 et D49 Ces prélèvements ont rapides (durée < 5 minutes). A D63 les mâles seront euthanasiés et un prélèvement sanguin terminal et des prélèvements d'organes seront pratiqués.

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de stéatose hépatique. Le développement de la stéatose est limité dans ce modèle et ne pousse pas jusqu'à la fibrose et aux carcinomes hépatique. Le stade de stéatose (dit "NASH") ne s'accompagne pas d'effet secondaires ni d'effets néfaste. C'est d'ailleurs une des raisons qui expliquent qu'en clinique humaine la stéatose est très mal diagnostiquée avant le stade de développement de cancers du foie. Les administrations de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) et les pélèvements sanguins sont susceptibles d'induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les foies (y compris femelles reproductrices et souriceaux femelles) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur la stéatose hépatique. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la stéatose hépatique. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, et ce jusqu'au sevrage des souriceaux. Un enrichissement sera apporté sous forme d'igloo et de matériel de nidification. Après sevrage, les mâles issus des portées seront hébergés en cages collectives (4 souris/cage) et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout d'igloos et de briquettes de bois spécifiques pour rongeurs. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques et de la stéatose hépatique. C'est également ce modèle qui est classiquement utilisé pour l'obtention du modèle STAM. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux mâles seront utilisés entre leur naissance et 12 semaines d'âge. Il est nécessaire de partir de souriceaux puisque le modèle STAM demande une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) deux jours après la naissance. Ce modèle se développe ensuite grâce à la mise sous alimentation enrichie en graisse à partir du sevrage (ici à 4 semaines) et jusqu'à la fin de l'étude.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections d'alcool en fin de gestation, puis leurs souriceaux subissent des mesures cardio-respiratoires, des tests psychomoteurs et des séparations maternelles jusqu'au onzième jour de vie, avant d'être tués pour prélever leurs organes, les mères étant tuées après la mise bas. Le porteur indique que l'alcoolisation fait perdre aux femelles la coordination de la marche et que la séparation maternelle est une source de stress pour les souriceaux. Il affirme que l'étude des effets moteurs et cognitifs de l'alcoolisation foetale passe par un "organisme entier" et ne peut être évitée.

Objectifs

Dans l'altération de l’environnement fœtal, notre objectif est de caractériser l’impact d’une alcoolisation fœtale importante au dernier trimestre de la grossesse. L'alcoolisme foetale est la première cause d'handicap mental non génétique. Le placenta est perméable à l'alcool qui arrive alors au foetus dont le foie n'a pas l'efficacité pour l'éliminer. Il est ainsi exposé plus longtemps aux effets toxiques de l'alcool. Nous souhaitons évaluer et comprendre les fonctions du gène Hsf2, un gène important pour la réponse au stress dont le stress lié à l'alcool. Pour cela, nous utilisons un modèle génétique murin dépourvu de ce gène. Nous étudierons les conséquences physiologiques, motrices et cognitives dès la naissance des souriceaux issus de mères alcoolisées. Nous comparons les résultats obtenus avec les souriceaux issus de mères non alcoolisées. A ce jour, la France compte encore environ 15000 naissances avec des troubles causés par l'alcoolisation foetale. Les retombées de ce travail sont ainsi directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Résultats attendus : Les conséquences d’une alcoolisation fœtale pourraient être plus étendues avec des atteintes précoces motrices, cognitives et physiologiques. Nous préciserons les fonctions du gène Hsf2 dans ces atteintes. Les retombées de ce travail sont directement utiles en terme de prévention et d’implications thérapeutiques.

Procédures

Sur les femelles gestantes : injection intrapéritonéale (au quart cadran inférieur de l'abdomen) d'alcool ou de solvant servant à diluer l'alcool au 15ème jour de gestation (deux fois espacés de 8h) et un fois au 16ème jour de gestation - Aucun prélèvement sur animaux vigiles - Aucune procédure chirurgicale, Sur les soucriceaux : des mesures cardio-respiratoires (30 min une fois à un jour de vie, 30 min une fois à deux jours de vie, 50 min une fois à 8 jours de vie), bilan psychomoteur de 7 à 11 jours de vie à l’aide de 3 tests distincts répétés 2 fois, chaque test dure 20 secondes, enregistrement des sons émis par l’animal (une fois à 8 jours de vie, pendant 3 min)

Impact sur les animaux

L'alcoolisation de la mère ne modifie pas la prise de poids ni la température corporelle au cours de la gestation. Ce que l'on peut constater est un retard de mise bas chez les femelles alcoolisées et dans ce cas les petits ne rentreront pas dans le protocole. La modification de ces deux variables (la modification corporelle (poids et température = variable 1) et le retard de mise bas (variable 2) constitue un signe de souffrance et/ou de modification inattendue dans la procédure et nous tenons à les prendre en compte. Titubation des femelles alcoolisées : les femelles alcoolisées perdent temporairement la coordination de la marche sous l’effet de l’alcool. Ces femelles retournent en pièce d'hébergement si et seulement si elles recouvrent une marche coordonnée normale. Nuisance post-natale : séparation maternelle (durée maximale de 50 min en condition de thermoneutralité pour les mesures physiologiques, 10 min pour le test de préférence maternelle, 3 min pour la mesure des vocalisations ultrasoniques), les souriceaux sont libres de se mouvoir pour toutes les mesures/observations effectuées.

Devenir

Les souriceaux sont maintenus en vie jusqu'à 11 jours, jour de la fin des expériences. IIs seront euthanasiés et les organses sont récupérés en post-mortem pour une étude histologique. Les mères traitées sont euthanasiées après la mise bas. Comme nous nous intéressons sur l'empreinte que peut laisser l'alcoolisation, les mères ne seront pas réutilisées, elles sont euthanasiées après la mise bas selon la methode règlementaire par un personnel qualifié.

Remplacement

L'étude préclinique concerne l'expérimentation animale et permet d'obtenir les informations de toxicité notamment dans l’alcoolisme maternel. Pour étudier les effets de l'alcoolisme foetale sur le plan physiologique, moteur et cognitif, l'utilisation d'un organisme entier est pertinente et ne peut être évitée.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Nous privilégions une étude longitudinale c'est à dire que nous suivons les souriceaux sur plusieurs jours ce qui réduit le nombre d'animaux utilisés. Un groupe expérimental nécessite 30 souriceaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif découle de nos expériences. Toutefois, cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.

Raffinement

Nous utilisons des techniques de mesures non invasives et contrôlées (mesure moins d'une heure, température 32-33°C dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. Les cages avec les portées sont enrichies en papier absorbant doux pour le nid. La séparation maternelle n'excède pas l'heure. Une surveillance quotidienne visuelle est assurée tous les jours. Un suivi clinique est assuré les jours avec protocole de test prévu (poids, température, mobilité des souriceaux, aspect des poils). En somme, nous avons établi une liste de points limites intermédiaires basées sur le comportement et l'aspect des animaux qui conduit à la mise en place d'action adaptée et précoce permettant de diminuer la souffrance.

Choix des espèces

Choix de l'espèce souris : largement utilisée dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique, souris transgénique disponible pour étudier le rôle d'un gène, organisme entier pour étudier les conséquences de l'alcoolisation sur les descendances Stades de développement : Pour l'alcoolisation foetale, il s'agit de cibler les conséquences d'une consommation excessive d'alcool en fin de gestation. Pour les souriceaux, il s'agit de déceler précocément les modifications induites par l'alcoolisme foetale. Tests psycho-moteurs et cognitifs choisis avant l'ouverture des yeux

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, chaque animal reçoit une injection lombaire et cérébrale de vecteurs de thérapie génique lors d'une chirurgie d'environ deux heures, puis un prélèvement sanguin et une imagerie avant d'être tué pour analyser les tissus nerveux. Le porteur signale un stress lié à la capture, à l'anesthésie et aux contentions répétées, et présente la chirurgie cérébrale comme peu douloureuse au motif que le cerveau est dépourvu de récepteurs à la douleur. Il affirme que la souris a un pouvoir prédictif faible voire nul pour cette question et retient le macaque pour la proximité de son système nerveux avec celui de l'humain.

Objectifs

Les dysfonctions qui affectent le système nerveux, et en particulier le système nerveux central (SNC), sont une cause majeure de maladies, de handicaps et de décès. Elles sont également parmi les plus difficiles à traiter en raison de la complexité des types de cellules, des circuits neuronaux, et de la barrière hémato-encéphalique qui limite ce qui peut passer de la circulation sanguine au cerveau , y compris les produits thérapeutiques. En outre, les traitements actuels de nombreuses maladies neurodégénératives se limitent à prévenir ou à ralentir leur progression, sans les guérir définitivement. En revanche, la thérapie génique peut s'attaquer à la cause sous-jacente d'une maladie génétique et la corriger de façon permanente ou délivrer des protéines thérapeutiques qui soulagent durablement les symptômes de la maladie. Les troubles génétiques neurodégénératifs sont l'une des nombreuses maladies qui pourraient bénéficier des avantages uniques de la thérapie génique. Toutefois, les maladies génétiques sont souvent associées à une petite fraction de types de cellules dans un tissu. Par conséquent, pour être efficace, la thérapie génique doit être précise et délivrer des doses thérapeutiques de matériel génétique aux bon types cellulaires et aux bons tissus d’intérêt, tout en évitant une expression hors cible qui pourrait entraîner des effets secondaires indésirables. C’est pourquoi, ce projet vise donc à évaluer chez les primates non -humains (PNH) le bon ciblage d’outils de thérapie génique nouvellement conçus dans des types cellulaires et des tissus neuraux pertinents sur le plan thérapeutique. A termes la validation de ce ciblage comme efficace permettra le développement ultérieur d’une thérapie génique précise pour le traitement des maladies génétiques neurodégénératives.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils génétiques permettant le traitement de maladies touchant le système nerveux central. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront de base à la création de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies neurodégénératives qui à l’heure d’aujourd’hui sont incurables.

Procédures

Les interventions seront menées chez le macaque cynomolgus et toutes seront réalisées sous anesthésie générale. Les interventions seront les suivantes : (1) réalisation de l’injection lombaire et cérébrale de la solution contenant les vecteurs de thérapie génique (une seule chirurgie d’une durée d’environ 2h) ; (2) un prélèvement sanguin réalisé sous anesthésie générale ; (3) Imagerie au niveau des sites d’injection au niveau cérébral et mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, l’injection de l’anesthésique, les contentions répétées (pendant 5-7 jours post injection) pour d’éventuels soins consécutifs à la chirurgie, une légère perte de poids liée à l’opération et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections. Les chirurgies, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un léger inconfort au niveau de la zone d’incision les jours suivant l'injection et provoquer dans de très rares cas une légère réaction inflammatoire. L’absence de récepteurs à la douleur dans le cerveau fait que les interventions sur ces tissus ne sont pas considérées comme douloureuses.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus du système nerveux afin de vérifier le bon ciblage de l’outil de thérapie génique.

Remplacement

Pour pouvoir utiliser la thérapie génique efficacement, il est crucial que le vecteur viral qui délivre le gene thérapeutique cible les bonnes cellules ou groupes de cellules chez l'homme. Dans le cas contraire, les thérapies géniques pourraient avoir un effet indésirable dans des types de cellules non ciblées, ce qui pourrait entraîner le dysfonctionnement ou la mort de cellules auparavant saines. Les promoteurs (séquences d’ADN qui contrôlent l’expression des genes) doivent être testés dans des cellules dont l'expression génique est aussi proche que possible de celle des cellules correspondantes chez l'humain. Or des études antérieures dans le système nerveux ont révélé que les résultats obtenus chez le primate non-humain pouvaient prédire les résultats obtenus avec des tissus humains primaires, mais que les résultats obtenus avec des souris avaient un pouvoir prédictif faible, voire nul. Par conséquent, des tests de fonctionnalité des vecteurs de thérapie génique sera faite in vivo chez la souris avant d’évaluer la capacité de ces vecteurs à cibler les bonnes cellules chez le primate non-humain.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Six macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. L’ensemble des méthodes expérimentales a été pensé et choisi pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les études réalisées in vitro ou in vivo chez la souris ne peuvent être transposées à l'Homme en toute sécurité sans être menées, dans une étape intermédiaire, chez une espèce dont l'organisation du système nerveux central est similaire à celle de l'Homme. En effet, il a été montré précédemment que le criblage de promoteurs dans le système nerveux central de la souris avait un faible pouvoir prédictif de leur activité dans le même tissu humain. Le choix du macaque est donc justifié par le fait qu'il présente des caractéristiques anatomiques, cellulaires et génétiques du système nerveux central comparables à celles de l'Homme. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés de plus de 3 ans de manière à ce que les structures cérébrales soient développées.

200 primates non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, soit 150 macaques à longue queue, 25 macaques rhésus et 25 singes vervets. Chaque animal reçoit une administration de virus AAV par voie intraveineuse ou intrathécale, suivie de prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien, certains protocoles retirant jusqu'à 20 % du volume sanguin, avant une mise à mort pour analyser la répartition du virus dans les organes. Le porteur juge peu probables les effets secondaires des AAV rendus non réplicatifs et signale surtout un stress lié aux contentions et aux gestes. Il affirme que ces études de biodistribution sont "indispensables" et retient le primate pour sa proximité immunitaire avec l'humain, au service du développement de thérapies géniques.

Objectifs

Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Ce projet porte sur l’analyse de la biodistribution dans les organes d’un virus AAV (Adeno-Associated Virus) sur un modèle primates non humains. Ce type de virus est utilisé dans le cadre de thérapie génique, afin notamment de faire exprimer aux cellules des patients des protéines manquantes à cause de maladies génétiques. Les virus adéno-associés (AAV) sont un vecteur viable de transfert de gènes. Ils peuvent être conçus pour transporter des séquences d’ADN thérapeutiques dans le noyau de différents types de cellules (hépatiques, musculaires, ou nerveuses par exemple). Leur nature réplicative-déficiente et l'inactivation des outils moléculaires liés à l'inclusion de ces virus dans le génome humain leur donnent un profil de sécurité particulièrement intéressant pour leur utilisation clinique chez l'homme. Selon les types d'AAV, naturels ou chimériques, leur tropisme et leur profil d'infection dans divers organes va être complètement différent. Les phases de développement d'un AAV thérapeutiques passent donc par une phase de "screening" de candidats virus, dont le but est d'évaluer la biodistribution de ceux-ci dans diverses structures biologiques d'intérêts. La proximité immunitaire des singes avec l'humain fait de ces espèces un modèle intéressant et prédictif de la biodistribution attendue chez les patients.

Bénéfices attendus

Les AAV sont utilisés en thérapie génique comme "moyen de transport" pour amener du matériel génétique dans les cellules cibles. Cette étude permettra de sélectionner les « constructions » d'AAV pour traiter des maladies spécifiques, grâce à la distribution d'un transgène thérapeutique dans un tissu particulier.

Procédures

Après une période d’acclimatation de 15 jours minimum, les animaux recevront une unique administration de l’AAV par voie intraveineuse ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre et en accord avec les procédures de l’entreprise. Les volumes administrés aux animaux seront en accord avec les recommandations éthiques en vigueur selon la voie d’administration utilisée (iv bolus : 5mL/kg maximum et IT bolus : 1mL/animal maximum). Les administrations étant des bolus, elles seront de courte durée (< 5 minutes). Les administrations intraveineuses seront réalisées dans la mesure du possible sur animal vigile, les administrations intrathécales seront réalisées sous anesthésie. Suite à chaque administration, des prélèvements (principalement de sang ou LCR) seront effectués afin d’analyser les biomarqueurs liés à l’infection par l’AAV dans le sang. Les recommandations suivantes seront suivis pour la récolte de sang (7,50 % du VSC suivi d’un repos de 7 jours ; 10% du VSC suivi d’un repos de 2 semaines; 15% du VSC suivi d’un repos de 3 semaines; 20% du VSC suivi d’un repos de 4 semaines ou suivi d'une euthanasie dans les 24h). Les prélèvements de sang sont de courte durée (

Impact sur les animaux

Les AAV injectés étant des espèces non pathogènes, il est peu probable d’avoir des effets secondaires. En effet, les possibles transgènes inclus dans ces virus sont soit des séquences "rapporteuses" permettant l'identification ou la localisation du virus, ou bien des gènes codant pour des protéines humaines. En termes de contamination et multiplication, ces virus sont rendus inoffensifs et n'ont pas la possibilité de se reproduire ou de s'intégrer au génome de l'hôte. Mise à part des réactions locales au niveau des sites d'administrations et éventuellement une réaction systémique de type fièvre peuvent apparaître les jours suivants les administrations. De plus, la procédure d'injection elle-même peut potentiellement induire des effets secondaires en cas de mauvaise manipulation. Les sites d'administration et la température corporelle seront donc suivis les jours suivants les administrations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude dans le but de récolter les organes et analyser la biodistribution des AAV dans les différents tissus.

Remplacement

Les études de biodistribution in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles thérapie. En effet, celles-ci permettent de déterminer la localisation des AAV dans les tissus après administration et ainsi déterminer le lieu de distribution d'un futur transgène thérapeutique.

Réduction

Pour chaque procédure réalisée, il sera veillé à utiliser un nombre minimal et suffisant d'animaux pour que les résultats soient interprétables et transposables. Une sérologie sera réalisée sur plus d'animaux que necessaire à l'étude. Au jour de l'infection, seul le nombre d'animaux necessaire à l'étude seront injectés. Au vu du faible nombre d'animaux par groupe, aucun test statistique ne sera réalisé.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d'enrichissement dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Une attention particulière sera accordée à l’enrichissement du milieu de vie des animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. L'inclusion de paramètres hématologiques et biochimiques pour le suivi clinique, l'inclusion de prélèvement de fluides pour le suivi du viscérotropisme et du neurotropisme permettent un suivi précis du statut de l'animal. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélèvements. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable. Avant tout acte techniques, les animaux bénéficieront d'entrainements avec récompenses, ce qui permettra de réduire leur stress durant les manipulations (notamment en cas d'utilisation de la chaise à contention pour habituer l'animal à être dans cette chaise avant le jour de l'administration). Pour certains actes (LCR, administration intratécal,...), les animaux seront anesthésiés (ex: kétamine / midazolam) et recevront un analagésique (type buprénorphine) afin de palier toute douleur lié à l'acte. Les points limites décrits dans le projet permettront de décider l'euthanasie anticipé d'un animal en cas de souffrance.

Choix des espèces

Le primate non humain est un modèle de choix dans l'évaluation préclinique pour évaluer le tropisme des virus recombinants, car les AAV sont connus pour infecter largement les primates non humains et les humains (la preuve en est qu'une forte proportion des singes est séropositives pour certains types d'AAV). Nous devons utiliser des animaux qui sont évolutivement plus proches de l'homme et donc plus susceptibles de représenter fidèlement la machinerie cellulaire impliquée dans la transduction et d'autres aspects de la biologie du virus/vecteur et de l'hôte. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. De juvéniles à adultes matures selon les questionnement scientifique de l'étude.

52 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par différentes voies, dont l'injection dans la cavité abdominale, trois fois à deux jours d'intervalle, avec prélèvements sanguins sous sédation, avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur indique que l'injection abdominale de tamoxifène provoque une péritonite systématique et une inflammation douloureuse souvent négligée. Il présente ce travail comme un projet de raffinement destiné à établir des recommandations pour les nombreuses souris soumises chaque année à ce type d'administration, ces mêmes souris étant ici tuées pour le documenter.

Objectifs

Le tamoxifène est un anticancéreux majeur utilisé en particulier pour le contrôle du cancer du sein chez la femme. Chez la souris, des constructions génétiques ont été créées pour permettre l’induction d’une modification génétique suite à une administration de tamoxifène. Il s’agit là d’un outil génétique très utilisé pour générer une modification génétique à un moment précis. L’induction de cette modification génétique par le tamoxifène nécessite une dose importante, sur plusieurs jours. Le tamoxifène est une molécule soluble dans les lipides très bien absorbée par voie orale, ce qui permet de l’administrer par l’alimentation ou par gavage. Cependant, à l’échelle mondiale et notamment en France, le tamoxifène est la plupart du temps injecté, à plusieurs reprises, dans la cavité abdominale après dissolution dans une huile (huile de maïs le plus souvent). Or en bonnes pratiques vétérinaires, un excipient huileux n’est pas censé être injecté dans la cavité abdominale et notre expérience personnelle de vétérinaires en animalerie nous a amenées à observer une péritonite systématique, clinique ou subclinique, chez tous les animaux injectés avec du tamoxifène dans la cavité abdominale, même une seule fois. Il s’agit là d’une cause de douleur, souvent négligée, et d’une cause d’inflammation systémique, susceptible d’interférer avec la question scientifique posée. Nous souhaitons donc conduire une étude robuste documentant les effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène, comparés à ceux générés par d’autres voies d’administration, également décrites dans la littérature pour leur efficacité et a priori moins délétères, à savoir la voie sous-cutanée, orale et transdermique, afin de permettre d’établir des recommandations pour une utilisation du tamoxifène chez la souris qui respecte au mieux le bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Notre projet a pour but de démontrer le risque d’interférence scientifique et de réduction du bien-être des souris suite à l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et de proposer des voies d’administration alternatives, connues dans la littérature pour être également efficaces, et qui ne présenteront pas ces inconvénients. La publication de ces résultats permettra d’éditer des recommandations en matière d’administration du tamoxifène afin d’améliorer la condition des souris impliquées dans des stratégies de recombinaison induite par le tamoxifène, ce qui correspond à un grand nombre d’animaux chaque année dans un pays comme le nôtre. Il s’agit donc d’un projet de raffinement destiné aux souris.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - Administrations d'une solution soit dans la cavité abdominale, soit par voie sous-cutanée, soit par gavage, soit par application transdermique. Ces administrations seront réalisées 3 fois à 2 jours d’intervalle et chaque administration durera environ 30 secondes. - Si besoin d’une sédation ou d’une anesthésie pour ces administrations, elles seront induites par une injection sous-cutanée puis une seconde injection sous-cutanée sera réalisée pour induire le réveil (environ 30 secondes par injection). - Deux prélèvements de sang seront réalisés à 2 semaines d’intervalle à la veine mandibulaire, avec sédation et analgésie. La sédation avec analgésie sera induite par une injection sous-cutanée (environ 30 secondes pour l’injection) et sera effective en 10 min environ. Le prélèvement de sang durera alors environ 30 secondes. Une seconde injection sous-cutanée d’un antagoniste permettra le réveil de l’animal. - Avant la mise à mort en fin de procédure, les animaux recevront une sédation avec analgésie via une injection sous-cutanée (environ 30 secondes pour l’injection) qui sera effective en 10 min environ.

Impact sur les animaux

Les gestes de prélèvements et d’administration seront susceptibles de causer un stress et une douleur légers aux animaux. Les composés injectés seront susceptibles de créer une inflammation potentiellement douloureuse, d'intensité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires à de nombreuses analyses anatomopathologiques et biochimiques qui permettront d’évaluer les effets inflammatoires des différentes administrations.

Remplacement

La démonstration des effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et de l’intérêt potentiel de voies d’administration alternatives nécessite d’utiliser des organismes entiers pour caractériser les lésions des organes et l’inflammation au niveau sanguin. L’étude sera réalisée chez la souris, espèce-cible de l’utilisation du tamoxifène, qui bénéficiera donc directement de l’étude menée.

Réduction

Le nombre de groupes et sous-groupes proposé a été pensé pour répondre au plus près aux attentes des chercheurs quant à la démonstration des effets inflammatoires de l’injection dans la cavité abdominale de tamoxifène et à la proposition de voies alternatives. Au sein de chaque sous-groupe, le nombre d’animaux utilisé est aussi réduit que possible, tout en permettant d’atteindre une pertinence statistique.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Les animaux auront un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Le comportement des mâles est particulièrement surveillé et en cas de bagarre grave amenant à des plaies, le mâle agresseur est séparé de ses congénères et ses congénères sont pris en charge de manière adaptée (mise à mort compassionnelle si blessures trop graves, soins dans les autres cas). Le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft ou du coton, un bâton de bois à ronger et une maison en carton. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Tous les gestes seront réalisés avec une attention très forte au respect physique et émotionnel des animaux. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice, au besoin pharmacologique, et en cas d'absence de bénéfice, nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie par les animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce-cible de ce projet de raffinement. En effet, cette espèce pour laquelle de nombreux outils génétiques ont été développés est celle utilisée pour des modifications génétiques induites par l’administration de tamoxifène. Les animaux utilisés auront entre 2 et 4 mois, soit un âge classique pour une modification génétique induite par le tamoxifène par des équipes de recherche.