Recherche appliquée

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour pendant quatre semaines une statine à une dose connue pour provoquer des troubles musculaires proches de ceux observés chez l'humain, associée à un composé en développement, avec prélèvements sanguins, tests de force de préhension et mesures d'activité locomotrice. Le porteur indique que la statine réduit la force de préhension et altère la locomotion, et que les manipulations et prélèvements sont sources de stress. Il affirme qu'aucune méthode de substitution ne permet ce type d'étude, les retombées pour les patients, prolonger le traitement par statines, étant renvoyées à d'éventuels essais cliniques.

Objectifs

Les statines sont l’un des médicaments de première intention pour le traitement des troubles du cholestérol chez l’homme. En plus d’induire une diminution des taux plasmatiques de lipides, de cholestérol et de LDL, de nombreuses études ont rapporté que les statines protègent considérablement des maladies cardiovasculaires. Néanmoins, malgré l’efficacité inégalée des statines, ces dernières induisent des effets secondaires graves et environ 50% des patients ne peuvent continuer leur traitement après 6 mois et seuls 20% des patients continuent leur traitement plus de 5 ans. Parmi ces effets secondaires, les symptômes musculaires associés aux statines sont les effets indésirables les plus fréquents. De nombreuses données de la littérature suggèrent que les troubles musculaires liés aux statines sont dues à une altération du fonctionnement des mitochondriale. D’intenses recherches sont ainsi actuellement menées afin de développer des composés capables d’inhiber les effets secondaires des statines dans le cadre de co-traitements. Le présent projet s’inscrit dans ce contexte. Il vise à étudier la capacité d’un composé en développement (composé X) à inhiber les effets secondaires musculaires d’un traitement chronique avec une statine de référence. Le projet sera mené sur des souris ApoE-/- (souris déficientes pour le gène codant l’Apolipoprotéine E). La délétion présente chez ces souris induit la formation de plaque d’athérome, tout particulièrement lorsque ces souris sont soumises à un régime alimentaire enrichi en lipides et en cholestérol. Pendant 4 semaines, les souris seront traitées avec une statine à des doses connues pour induire des troubles musculaire similaires aux effets secondaires observés chez l’homme, ainsi qu’à l’aide du composé X. Pendant le co-traitement, la prise alimentaire, la prise de poids corporel, l’activité locomotrice et la force de préhension seront mesurés. Les résultats seront comparés à des souris traitées à l’atorvastatine seule.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les effets secondaires d'un traitement chronique par les statines, ce dernier sera employé ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ainsi, ce type de médicament pourrait permettre aux patients atteints de troubles des lipides de prolonger la durée de leur prise en charge thérapeutique par les statines du fait de l'inhibition de ses effets secondaires musculaires, et ainsi grandement améliorer leur qualité de vie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) une administration orale quotidienne d'une statine et du composé test, ou de placébo pendant 4 semaines- 4) une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - 2) des prélèvements sanguinq à la veine de la queue à D-2 et D15 - 3) des mesures de prise alimentaire et de poids corporel une fois par semaine sur toute la durée de l'étude - 4) trois analyses de leur composition corporelle à D-3 et D14 et D28 (

Impact sur les animaux

Tout d'abord, le phénotype des souris ApoE n'est pas dommageable, mais le traitement avec la statine est connu pour induire des effets secondaires musculaires qui se traduisent par une réduction de la force de préhension et d'une altération légère de la locomotion. Ceci est une source de nuisance pour les animaux. Les traitements journaliers par voie orale pendant 4 semaines sont une source de nuisance pour les animaux. Le grip test est un test très rapide et indolore pour l'animal. Néanmoins, la manipulation des animaux nécessaire pour réaliser le grip test pourrait être source de test. Les 2 prélèvements sanguins réalisés à D-2 et D15 pourront également être source de nuisance. Enfin, les mesures de composition corporelle et de l'activité locomotrice, bien que non invasives, peut engendrer un stress chez les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète des effets du composé test.

Remplacement

Le présent projet vise à contrer les effets secondaires au niveau musculaire d'un traitement chronique avec une statine chez la souris atteiinte de troubles des lipides. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant ce type d'étude.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt compte tenu des patramètre mesurés dans la présente étude mais également de l'hétérogénéité connue du modèle utilisée. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté e de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés (principalement Grip test, activité locomotrice et masse musculaire) avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes de 3 par cage (les deux sexes étant maintenus dans des cages séparés). Par ailleurs, nous avons remarqué que la litière en cellulose permet non seulement une bonne absorbance mais également un enrichissement (nidification). Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. En cas de signe de souffrance de l'animal, un analgésique (buprénorphine) sera administré. Si aucune amélioration n'est constaté passé un certain délai, l'animal sera euthanasié. Enfin, afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés avant dislocation cervicale.

Choix des espèces

Nous avons opté pour un modèle de souris déficientes en apolipoprotéine E (Souris ApoE-/-) nourri avec une alimentation enrichie en lipide et en cholestérol (HFHC). Ce dernier est trés bien caractérisé dans la littérature et s'avère classiquement utilisé dans les études précliniques visant à développer des traitements de l'atherosclérose. Ce modèle est un modèle très prédictif dans ce cadre. Il représente également un modèle de choix car il exprime, lors d'un traitement chronique aux statines, des effets secondaires musculaires très similaires à ceux observés chez l'homme. Les animaux seront utilisés au stade adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.

1 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique injectant du peptide amyloïde dans le cerveau, puis des traitements quotidiens par gavage et injections, et des tests de mémoire dont la piscine de Morris, avant d'être tuées pour analyse des tissus. Le porteur indique que la chirurgie peut causer une souffrance post-opératoire et que les traitements et le test de la piscine de Morris peuvent générer un stress. Il affirme que la complexité de la maladie d'Alzheimer ne peut être atteinte qu'avec un modèle animal et retient la souris de douze mois comme le modèle le plus proche de l'humain, d'éventuels essais cliniques restant conditionnels.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée par des troubles de la mémoire et du comportement, ainsi que par une désorientation dans le temps et dans l'espace et touche aujourd’hui 50 millions de personnes dans le monde, dont plus de 1 000 000 en France. L'objectif de ce projet est d'évaluer le potentiel neuroprotecteur de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie de Alzheimer. Les effets des composés seront étudiés par l’analyse des capacités mnésiques des animaux et par analyse histologique. Un composé prometteur devra améliorer la mémoire à court et/ou à long terme des souris, diminuer la perte des neurones dans une région clé pour la formation de la mémoire. En cas de résultats positifs, le développement préclinique des composés pourra se poursuivre.

Bénéfices attendus

Le projet s'intégre dans la phase préclinique du développement de candidats médicaments pour cette maladie incurable. En cas de résultats positifs, le ou les candidats médicaments pourront à terme entrer dans des études cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à de la chirurgie stéréotaxique, sous anesthésie générale. Les souris récupèrent bien de la chirurgie. Les procédures incluent des traitements chroniques (quotidiens) par gavage ainsi qu’en intra-peritonéal et en sous-cutanée. La mémoire à court et long terme sera étudiée avec des tests comportementaux. Ces tests seront rapides (maximum 15 minutes par jour), sur une durée maximale de 7 jours, non consécutifs.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une chirurgie stéréotaxique pouvant causer de la souffrance post-opératoire. Le traitement quotidien des souris peut induire un stress, particulièrement lors des premières administrations. Les tests comportementaux peuvent également induire une nuisance chez les souris, notamment avec le test de la piscine de Morris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter des tissus pour des analyses complémentaires (ex. histologie).

Remplacement

Notre but est d'évaluer les effets neuroprotecteurs de candidats médicaments dans un modèle murin de la maladie d'Alzheimer. Les processus physiopathologiques de la maladie d’Alzheimer impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires (neurones et cellules gliales) dans différentes structures cérébrales. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal. La souris est le modèle intégré le plus proche de l’humain pour ce projet.

Réduction

Le nombre de souris (n par expérience) sera optimisé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. À cette fin, des études antérieures disponibles dans la littérature scientifique suggèrent un nombre minimal de 12 souris par groupe, afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs en termes de (i) détérioration des fonctions cognitives se traduisant par une perte de mémoire spatiale, et (ii) % de neurones morts (neurodégénérescence); deux caractéristiques essentielles et déterminantes dans la pathophysiologie de la maladie d'Alzheimer. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe pour détecter d’éventuel effets significatifs de candidats médicaments dans modèle animal de la maladie d’Alzheimer.

Raffinement

La stratégie de raffinement sera basée sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (tube en carton, feuille de papier), (ii) des approches d'analgésies pré, pendant et après l'opération, (iii) et le contrôle strict des besoins physiologiques des animaux (température corporelle) pendant et après l'opération (pour assurer un rétablissement rapide). Les animaux seront hébergés par deux au minimum (5 au maximum), en cages ventilées, avec accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrances. Le projet a défini des points limites. Si un de ces points limites est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrances sont détectés, le responsable de l’étude sera informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révèlerait être inefficace, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris possède un système cérébral complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. D'après la littérature et l'expérience du personnel du laboratoire, ce modèle d’étude est reproductible et pertinent pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. La souris est donc un modèle approprié permettant la mise en place de protocoles expérimentaux courts, efficaces, simples et reproductibles. Nous avons le matériel chirurgical et les équipements dédiées aux études impliquant des souris. Comme dans la plupart des cas les symptômes de la maladie d'Alzheimer apparaissent à un âge avancé, nous utiliserons des souris âgées de 12 mois. Ainsi, nous pourrons reproduire plus fidèlement et plus précisément la physiopathologie humaine de la maladie d'Alzheimer dans notre modèle de souris.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux d'un jour sont anesthésiés pour recevoir de l'ADN par électroporation dans les neurones du bulbe olfactif, puis tués entre deux et vingt-huit jours plus tard par perfusion intracardiaque après surdose d'anesthésique. Le porteur affirme pratiquer cette électroporation en routine depuis une douzaine d'années sans jamais avoir observé d'effet nuisible conséquent, et juge très limité le stress de l'injection intrapéritonéale. Il indique que la culture in vitro ne convient pas et retient la souris comme seul mammifère permettant les tests génétiques recherchés, pour éclairer le rôle de mutations du gène Ago2 identifiées chez des patients.

Objectifs

Certaines mutations du gène Ago2 chez des patients humains provoquent dans l’embryon des anomalies de formation des neurones (neurogenèse) conduisant ultérieurement à l’apparition de déficits cognitifs. Le présent projet cherche à comprendre les mécanismes qui conduisent les mutations du gène Ago2 à provoquer ces anomalies. Pour mener cette étude, nous utiliserons un modèle de neurogenèse (formation de nouveaux neurones) particulier chez la souris : la formation de nouveaux neurones dans le bulbe olfactif. Ce modèle de neurogenèse, qui perdure tout au long de la vie de l’animal, autorise la modification de l’expression des gènes au cours du processus. Ainsi, en utilisant ce modèle nous pourrons étudier les conséquences de l’expression induite des formes mutantes du gène Ago2 au cours de la neurogenèse sur les propriétés des jeunes neurones qui en sont issus.

Bénéfices attendus

La meilleure compréhension des mécanismes conduisant aux anomalies de formation des neurones liés aux mutations du gène Ago2 est susceptible d’aboutir au développement de nouveaux traitements permettant d’atténuer les effets de ces mutations. Ce projet permettra aussi de mieux comprendre la fonction du gène Ago2 dans les neurones en développement.

Procédures

Pour l'étape d'électroporation, les 300 animaux de ce projet seront traités avec le même protocole: les souriceaux âgés de 1 jour seront anesthésiés et de l'ADN sera introduit par électroporation dans les jeunes neurones du bulbe olfactif en développement. L’ensemble de ces actes ne dure que 30 secondes. Les souriceaux seront réveillés progressivement en les ramenant à une température de 37°C et replacés auprès de leur mère. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l'électroporation par perfusion intracardiaque après injection d'une surdose d'anesthésique. De plus, les animaux du lot 1 recevront une injection intrapéritonéale d'une solution non dommageable 2 heures avant perfusion.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 28 jours après électroporation. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’années et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur l'état de santé et le bien être des animaux. Concernant l’injection par voie intrapéritonéale, l’acte entraine probablement un stress des animaux mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits par l'introduction de l’aiguille sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser au niveau histologique le devenir des jeunes neurones modifiées génétiquement.

Remplacement

Les jeunes neurones peuvent être cultivés in vitro. Cependant nous savons que in vivo leur prolifération et leur développement en neurones matures sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux que nous ne savons pas reproduire in vitro. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. D'autre part nous ne sommes pas capables de cultiver suffisamment longtemps les progéniteurs neuronaux et les jeunes neurones qui en découlent pour leur faire atteindre un niveau de maturité suffisant pour qu'ils puissent entrer en communication avec d'autres neurones. Or il est fortement suggéré que les anomalies chez les patients causées par des mutations du gène Ago2 soient dues, au moins en partie, à un défaut de connectivité entre neurones. Pour ces raisons, le modèle de la culture in vitro n'est pas approprié à ce projet.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des jeunes neurones directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et la variabilité entre échantillons réduite au minimum. Les résultats seront analysés par des tests statistiques dédiés aux petits échantillons (tests non paramétriques) que nous maitrisons grace aux formations en biostatistique que nous avons suivies. Les animaux des 2 sexes seront utilisés pour ces expériences.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. Six personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin des animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation postexpérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

Le projet vise à reproduire et à étudier le mécanisme d'apparition de défauts de développement et/ou de fonctionnement des neurones exprimant une forme mutante d’Ago2. Nous privilégions donc un modèle de mammifère pour ce projet. Chez les mammifères, seule l’espèce souris permet de réaliser des tests génétiques sophistiqués tels que ceux décrits dans ce projet. Les animaux seront électroporés à 1 jour après leur naissance (stade P1) car c'est à ce stade que l'efficacité d'électroporation est optimale. Les animaux ayant subi l'électroporation seront euthanasiés pour analyse aux stades P3 (jour 3 après la naissance, les jeunes neurones électroporés sont en pleine phase de prolifération), P15 (jour 15 après la naissance, à ce stade la majorité des neurones électroporé ont atteint le bulbe olfactif mais restent immatures) ou P29 (29 jours après la naissance, les neurones électroporés sont complètement matures).

2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intraveineuses de candidats médicaments et des prélèvements sanguins répétés à la veine submandibulaire, réalisés sous simple contention sans anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour analyse des organes. Le porteur reconnaît que la toxicité inconnue des molécules testées peut provoquer des douleurs non prévues et que les manipulations génèrent inconfort et angoisse. Il indique avoir limité la phase in vivo grâce à des modèles cellulaires et des organoïdes, tout en la jugeant nécessaire pour évaluer toxicité et efficacité des cinq candidats anticancéreux.

Objectifs

Le développement de traitements anti-cancéreux demeure un sujet d’actualité. Ce développement comporte différentes phases qui vont de l’identification de la cible thérapeutique jusqu’aux dernières phases d’essais cliniques. Entre la phase de l’identification de la cible thérapeutique impliquée dans l’agressivité de cette maladie et l’entrée en phases d’essais cliniques, il est nécessaire de sélectionner le candidat médicament le plus efficace et le moins toxique (phase de recherche et de développement préclinique). Cette phase préclinique a pour but de bien caractériser le mécanisme d’action du candidat médicament, de valider son efficacité et sa bonne innocuité. Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place afin de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire pour la réalisation des études de toxicité (identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), des études pharmacocinétiques (caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant) et des études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Durant ces différentes études expérimentales, des administrations, des suivis tumoraux et des prélèvements divers sont réalisés sur les animaux. L'objectif principal est de valider le mécanisme d'action de 5 nouveaux candidats médicament (à raison de un candidat/an), de s'assurer de leur bonne innocuité, de bien caractériser leurs paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques afin d’avoir une efficacité antitumorale optimale. Cette caractérisation préclinique est primordiale afin d’identifier les meilleurs schémas de traitement et de préparer au mieux les futurs essais cliniques avec ces nouveaux candidats médicament anti-cancer. Les études se porteront sur les cancers suivants : les cancers du pancréas, du sein, des ovaires et du poumon.

Bénéfices attendus

Ces études représentent une phase essentielle dans l’estimation du bénéfice/risque des nouveaux candidats médicaments développés pour le traitement du cancer.

Procédures

Dans le présent projet, les études sont réalisées sur des souris immuno-déficientes et immunocompétentes. Pour la majeure partie de ces gestes techniques, l’animal vigile est maintenu sous contention. Différents protocoles expérimentaux sont réalisés. Des greffes de cellules tumorales par injection en sous cutanée sur souris vigile (1 injection de 5 secondes). Des administrations en intraveineuses (1 fois par semaine) des candidats médicaments sur souris non anesthésiées (5 à 10 secondes par injection), en utilisant différents schémas de traitement pendant la durée de l’expérimentation. A la suite de l’administration, des prélèvements sanguins (2 prélèvements par souris, 10 secondes par acte) sont effectués à la veine submandibulaire sur souris non anesthésiées à différents temps (9 temps). Le sang est recueilli dans un tube de prélèvement adapté et est par la suite analysé selon les besoins de l’étude. Les organes ainsi que les tumeurs seront récupérés pour les analyses ex-vivo. Une contention manuelle est réalisée pour l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée, le puçage des souris en sous-cutanée (10 secondes par manipulation) pour effectuer l’identification et le suivi tumoral, de l’injection des cellules tumorales jusqu’au prélèvement sanguin à la veine submandibulaire. Une contention mécanique est réalisée pour les injections intraveineuses des candidats médicaments (boites à contention).

Impact sur les animaux

Un des protocoles peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait de la toxicité des candidats médicaments n'est pas connue. Un autre protocole peut induire un inconfort et une angoisse liés à la manipulation de la souris et aux prises de sang effectuées. Les deux derniers peuvent induire un inconfort, une angoisse liée à la manipulation des souris, des douleurs liées à l'administration des cellules tumorales et aux injections en intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyses des organes principaux.

Remplacement

Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place pour permettre de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire qui sont les études de toxicité (pour identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), les études pharmacocinétiques (pour caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant), et les études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet, l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur. L’essai de nouveaux traitements sur des patients nécessite une évaluation préalable de l’efficacité et de la tolérance sur des animaux conformément à la directive 2001/20/CE.

Réduction

Les études visant à déterminer la DMT (dose maximale tolérée) sont menées sur 6 souris par groupe. Ce nombre est lié à la variabilité intrinsèque des signes cliniques observées chez des souris d’une même cage. Ces études ainsi que les études de pharmacocinétiques et d'efficacité antitumorale sont menées avec des analyses statistiques afin de s'assurer de la significativité statistique des résultats obtenus en fonction du nombre de souris par groupe et du nombre de groupes. Par conséquent, pour les études d'efficacité, le nombre d’animaux sera fixé de 15 animaux par groupe. Ce nombre est issu d’un compromis entre la variabilité du succès de l’induction tumorale et du volume tumoral nécessaire pour la détection d’un effet.

Raffinement

Une phase d’observation et un suivi quotidien des animaux est réalisé pour évaluer leur état général. Ce suivi régulier de l’état clinique des souris est nécessaire pour tous les protocoles. L’utilisation d’une grille unique de scoring est mise en place et est décrite dans tous les protocoles. Pour les souris porteuses de tumeurs, la taille de la tumeur sera mesurée 3 fois/semaine afin de surveiller l’aspect et la croissance tumorale. Toutes les observations liées à l’aspect et au volume tumoral sont décrites dans la grille de scoring. Les critères concernant l'apparence, la mobilité et le comportement des animaux sont détaillés. Le changement de poids de l'animal est analysé. Les animaux bénéficient de raffinement tel que : maisonnette, carrés de coton, bâtonnets à ronger. La détermination des points limites et l’utilisation d’une grille de score permettent de réduire, supprimer ou soulager au maximum l'inconfort, la douleur et l'angoisse subis par les animaux. Dès l’atteinte d’un point limite, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l’isolflurane.

Choix des espèces

Dans le présent projet, nous utiliserons comme petit modèle de rongeur la souris, car les études règlementaires de toxicité et de pharmacocinétique requièrent un modèle rongeur et un modèle non rongeur. Pour les études d’efficacité antitumorale (procédure 3), la souris est un modèle de choix car la majorité des modèles tumoraux sont développés sur des souches de souris. De plus, la souris est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes de 6 semaines. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule. Ces souris (jeunes adultes de 6 semaines) peuvent finir leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux le transport de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie.

64 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie générale l'implantation intracérébrale d'une sonde de microdialyse pendant environ une heure, suivie d'une acquisition IRM d'une heure. Le porteur indique que la pose de la canule et de la sonde présente un risque de saignement et d'hémorragie, avec douleur post-opératoire et stress liés à la présence de la canule sur le crâne, et précise que la procédure ne permet pas de garder les animaux en vie. Il présente cette approche de chélation des métaux comme une piste thérapeutique contre des maladies neurodégénératives, les bénéfices annoncés restant à valider.

Objectifs

Les objectifs du projet de recherche portent sur le développement, la validation et l’application de nouvelles méthodes pour limiter la présence de métaux indésirables dans le cerveau. Le projet repose sur l’utilisation de molécules capables de capturer (chélater) puis d’extraire un certain nombre de métaux (Al, Fe, Cu, Zn, Mn, Pb,…). L’objectif thérapeutique de cette nouvelle approche de chélation des métaux est d’aider à rétablir l’équilibre en métaux qui se trouve perturbé dans des pathologies neurodénégératives (maladie de Parkinson ou d’Alzeihmer) ou dans des maladies génétiques (accumulation de cuivre dans le cas de la maladie de Wilson). L’efficacité des métodes de chélation sera évaluée par l’analyse de la concentration des métaux à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de la réalisation de ce projet sont la validation de nouvelles stratégies thérapeutiques pour lutter contre les déséquilibres (excès de métaux) présents dans des maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzeihmer, huntington), génétique (maladie de Wilson) et lors d’intoxications aiguës ou chroniques liées à des expositions accidentelles à des métaux.

Procédures

Les animaux (64), seront soumis à l’implantation intracérébrale d’une sonde de microdialyse utilisée pour la chélation de cations métalliques durant 1 heure environ. La procédure d’implantation et de dialyse sera réalisée, une seule fois, sous anesthésie générale et sera suivie d’une acquisition IRM sous anesthésie générale également durant 1 heure environ.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables et nuisances attendus et possibles pour les animaux sont les suivants. La pose de la canule présente un risque de saignement avec des effets indésirables de douleur post-opératoire et de stress lié à la présence de la canule sur le crâne de l’animal. L’introduction de la sonde de micro-dialyse présente un risque d’hémorragie. Durant la réalisation des gestes, existent également des risques de déshydratation et de sécheresse oculaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure. La procédure subie par les animaux ne permettant pas de les maintenir en vie.

Remplacement

En ce qui concerne l’exigence de remplacement, la validation amont des protocoles de recherche sera réalisée dans la mesure du possible in vitro sur des solutions contenant des métaux à des concentrations similaires à celles rencontrées in vivo. L’ensemble de ces validations en amont permet de réduire le nombre d’animaux qui seront utilisés dans le projet et de s’assurer autant que possible de la pertinence de l’approche avant sa validation in vivo.

Réduction

En ce qui concerne l’exigence de réduction, la spectroscopie et l’imagerie par résonance magnétique (SRM et IRM) sont des techniques qui permettent de suivre longitudinalement l’évolution d’une pathologie ou les bénéfices d’une thérapie. L’imagerie in vivo est clairement reconnue comme une approche permettant de reduire le nombre d’animaux. De plus chaque animal peut être son propre témoin. Ceci permet de réduire fortement le nombre d’animaux nécessaire pour distinguer de façon statistiquement significative deux populations.

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement comprend l’installation dans les cages de cachettes, coton, frisures pour nidification en lanières de peuplier ou papier craft afin d’introduire de la nouveauté et briquette à ronger. L’hébergement se fait en groupe (3 rats par cage) durant la période d’acclimatation. L’ensemble des gestes est réalisé sous anesthésie générale par isoflurane avec administration d’antalgique (analgésie multimodale) pré et post-chirurgie pendant 48h. Ceci permet de réduire la douleur ou l’angoisse des animaux et de répondre à l’exigence de raffinement requise pour les protocoles expérimentaux sur animaux. Un tapis chauffant, permettant de maintenir la température des animaux pendant les opérations de chirurgie et les sessions d’imagerie, est utilisé ainsi que l’administration de gel ophtalmique Ocrygel afin de compenser la sécheresse occulaire. Le suivi de la fréquence respiratoire est réalisé lors des sessions d’imagerie ainsi qu’une rehydratation des animaux pendant les gestes chirurgicaux. De la nourriture sous forme de gel (geldiet energy) sera déposée dans la cage après le réveil des animaux. Une fiche de suivi post-opératoire sera utilisée. Les animaux seront suivis quotidiennement. Les gestes sont évalués de classe modérée ou légère. Les expérimentateurs et les soigneurs disposent des formations nécessaires pour répondre à la mise en place des conditions de raffinement.

Choix des espèces

Les rats sont les modèles animaux largement utilisés sur les plateformes d’imagerie IRM dites pré-cliniques. L’instrumentation (microdialyse, antenne RF) et les protocoles IRM pré-cliniques sont bien adaptés à cette espèce animale. Le rat type Wistar sera utilisé dans ce projet. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (entre 3 et 6 mois) afin de faciliter le geste de chirurgie (pose de canule, implantation de la sonde microdialyse).

20 primates non-humains, dix macaques à longue queue et dix macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort à l'issue. Chaque animal subit neuf examens d'imagerie sous anesthésie générale pouvant durer jusqu'à cinq heures, avec pose d'une voie artérielle et prélèvements sanguins, pour suivre la distribution de radiotraceurs et de candidats médicaments. Le porteur reconnaît que ces anesthésies répétées et longues peuvent être fatigantes et prévoit la réutilisation des animaux sur décision du vétérinaire. Il retient le primate non-humain pour la proximité de sa physiologie avec celle de l'humain, afin d'extrapoler les résultats.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des composés radiomarqués que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes à demi-vie courte utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant à chacun des isotopes utilisés. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés ciblent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Il peut s’agir également de candidats médicaments neuroprotecteurs. Trois séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqués dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations indispensables sur l’exposition tissulaire aux doses de radiotraceurs et sur les spécificités de la distribution tissulaire et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis trois séances d’imagerie dynamique (TEP) par radiotraceur. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM, par contre il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvements sanguins (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Cette voie artérielle sera retirée à la fin de l’examen. Pour 1 des 3 imageries TEP, les animaux recevront une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intraveineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) qui précède l’injection de l’anesthésique par voie intra-musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). La réalisation d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins, peut être fatigante pour l’animal. La mise à jeun la veille au soir pour le lendemain matin et le contrôle hydrique 2 heures avant l’induction de l’anesthésie, peuvent constituer des stress modérés.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte-tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et permettre ainsi d’extrapoler les résultats à l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’anatomie et la physiologie se rapprochent au maximum de celles de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in-vivo chez des primates non-humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de ceux de l’Homme que ceux des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des trois conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable, global ou régional. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humains. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 20 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 9 examens afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura la mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements de l’environnement. Les primates non-humains seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs. Toutes les procédures expérimentales se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de la procédure, un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air, suppléée par une perfusion de liquide à 37°C. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité accrue aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir cette susceptibilité.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de radiotraceurs sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier les effets de ces transporteurs sur la pharmacocinétique des médicaments et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le projet sera conduit sur des individus adultes, car nous avons besoin que l’ensemble des tissus d’intérêts soit pleinement développés (mature).

108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de peau sur le dos sous anesthésie, avec un bandage qui gêne l'auto-toilettage et expose à une infection uro-génitale, avant la mise à mort pour analyser les tissus. Le porteur cherche à imiter dans le greffon un mécanisme de la bactérie Listeria pour échapper au rejet immunitaire, comme alternative aux immunosuppresseurs. Il conclut à la nécessité de la souris, aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la complexité du rejet de greffe.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de démontrer qu’une alternative aux traitements immunosuppresseurs des patients ayant reçu une greffe d’organe est possible.. Ces traitements à vie présentent des effets secondaires néfastes tels que la sensibilité accrue aux infections et le risque de développement tumoral. Nous proposons d’étudier une stratégie de traitement alternative, consistant à mimer dans le greffon un mécanisme utilisé par la bactérie Listeria monocytogenes pour échapper au système immunitaire. L’induction de cette capacité, de manière localisée au niveau du greffon dans un modèle murin de greffe de peau, devrait permettre de le maintenir à long-terme et d’éviter l’utilisation d’immunosuppresseurs.

Bénéfices attendus

Environ 6.000 patients en France et 130.000 dans le monde reçoivent chaque année une greffe d’organe. De nombreuses autres personnes vivent avec une greffe. Les traitements immunosuppresseurs actuels, indispensables à ces patients, entrainent des effets secondaires importants. Notre projet est une preuve de concept en vue de proposer par la suite une alternative thérapeutique dans laquelle le système immunitaire n’est pas altéré, afin d’améliorer la qualité de vie des personnes greffées.

Procédures

Les souris seront soumises à une greffe de peau au niveau du dos (environ 40 minutes de l’induction de l’anesthésie au placement dans la cage de réveil). Cela implique 2 injections pré-opératoires en sous-cutané de traitements analgésiques (Buprénorphine et Metacam, Lidocaine), une anesthésie par injection intrapéritonéale (Ketamine et Xylazine) et d’éventuelles injections sous-cutanée d’analgésique (Buprenorphine) en cas de persistance des signes de souffrances 3 jours après l’opération. Chaque injection dure 10 secondes environ.

Impact sur les animaux

Les différentes expériences réalisées conduisent à un degré de sévérité modéré. La réalisation de la greffe de peau induit de la douleur chez les animaux. C’est également le cas des injections sous-cutanée ou intra-péritonéales des traitements. La présence du bandage peut aussi être une source de gêne pour l’animal et l’expose à un risque d’infection uro-génitale en empéchant l’auto-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les tissus pour des analyses cytométriques et histologiques.

Remplacement

Ce projet a pour but l’étude des mécanismes immunitaires impliqués dans le rejet de greffes. Il n’existe à l’heure actuelle, aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité de ce mécanisme dans son intégralité. Seuls les animaux, tels que les modèles murins, permettent de comprendre le processus dans sa globalité, avec toutes les interactions que cela implique et c’est pourquoi il est nécessaire d’avoir recours à ces animaux pour atteindre les objectifs de notre projet. De plus, les modèles murins transgéniques utilisés ici permettent d’étudier l’impact d’une voie de signalisation dans le rejet de greffe de façon globale.

Réduction

Les rejets de greffe seront quantifiés par un score entre 0 et 5 et seront comparés entre les groupes à l'aide de tests de comparaison de moyenne. Les effectifs par groupe (n=4) sont associés à des tailles d'effet de 2.05, pour un test de comparaison de 3 moyennes, un risque de 5% et une puissance de 80%. Ceci correspond à des effets forts, compatibles avec la question biologique. Le plan expérimental mis en œuvre est emboîté. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe avec une litière appropriée, à base de cellulose quand les animaux sont greffés, et des matériaux de nidification. Les animaux recevront un traitement antalgique en prévention de la douleur avant l’opération. Ils seront réhydratés par injection en sous-cutané de sérum physiologique, puis auront accès à des gels de réhydratation adaptés. Les animaux seront maintenus au chaud sur une tablette chauffante pendant toute la phase de chirurgie. Celle-ci est réalisée en condition aseptique, et un antispetique en application locale sera utilisée. Les animaux recevront ensuite un antalgique en suspension orale pendant 3 jours après l’opération. Si des signes de souffrance persistent 3 jours après la chirurgie, une injection d’antalgique sous-cutanée, renouvelable si besoin, sera effectuée. Si des signes évidents de souffrance persistent malgré le traitement antalgique, les animaux sont mis à mort. Les animaux sont observés et pesés quotidiennement afin de détecter les signes éventuels de souffrance, vérifier l’intégrité des bandages et nettoyer la partie génitale régulièrement car le bandage empêche l’accès à cet endroit par l’animal pour l’auto-toilettage.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est un modèle de choix pour l’étude de la réponse immunitaire, processus intervenant dans le cadre des rejets de greffes. En effet, un grand nombre d’outils ont été développés pour étudier la réponse immunitaire des souris. Le recours à ces outils permettra de contrôler et de caractériser les processus conduisant au rejet des tissus transplantés de la façon la plus pertinente possible, en prenant en compte les spécificités du modèle murin par rapport à l'homme. De plus, la souris est un modèle qui peut être modifié génétiquement, ce qui nous permet d’étudier l’impact de l’expression de gènes dans le rejet des greffes. Nous utiliserons des souris adultes, d’au moins 8 semaines. Ces animaux sont suffisamment âgés pour avoir un système immunitaire en place mais également pour favoriser la greffe de peau, que ce soit du point de vue de la réalisation de la procédure que de la prise du greffon.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules de mélanome humain sous la peau ou dans le sang, puis on les traite par des oligonucléotides et un gavage quotidien jusqu'à une tumeur de deux centimètres cubes. Le porteur prévoit la mise à mort dès ce point limite ou à la fin, puis des analyses moléculaires. Il présente le projet comme une preuve de concept ouvrant une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et écarte les cultures cellulaires, jugées insuffisantes pour reproduire la tumorigenèse.

Objectifs

Ce projet vise à démontrer que l'inhibition de longs ARNs non codants in vivo altère la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ce projet est destiné à prouver que certains longs ARNs non codants sont de potentielles cibles thérapeutiques Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques

Bénéfices attendus

Cette expérimentation doit permettre de caractériser les changements dans la formation et la croissance tumorales suite à l'inhibition d'un ARN longs non codant associée ou non à un traitement complémentaire déjà utilisé et ceci dans un contexte physiologique que ne permettent pas les cultures cellulaires in vitro. Ce projet devrait permettre la validation d'une nouvelle cible thérapeutique pour le mélanome cutané. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d'inhibition des ARNs longs non codants, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections de cellules par voie sous-cutanée ou intraveineuse rétroorbitale sont réalisées sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections sous-cutanée d'ASO (ASO : "Anti-Sense Oligonucleotides" : petites molécules d'ADN simple brin) (tous les deux jours, 100 microlitres) ou intrapéritonéales de luciférine (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparaitre à partir de 5 jours suivant l'injection et croitre assez rapidement. La durée totale de l'expérimentation sera de trois semaines. Les souris seront sacrifiées en cas d'atteinte du point limite du volume tumoral de 2cm3. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont dû être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases. Les cellules tumorales injectées par voie intraveineuse devraient se fixer sur les organes de préférence métastatique, à savoir les poumons en premier. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Le suivi des cellules du fait de leur luminescence permettra de suivre la croissance tumorale pour les deux voies d'injection. Les traitements subséquents devraient réduire la formation et la croissance des tumeurs.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Après euthanasie, des prélèvements seront effectués pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par des oligonucléotides antisens (ASO) sur la croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 180 réparti comme suit : 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie intraveineuse (IV) rétroorbitale avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 2 cohortes de 60 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 2 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec les ASOs en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Le paramètre étudié sera la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance pour les souris injectées par SC et le développement des métastases pulmonaires pour les souris injectées par IV. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes et leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique, il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires dans les deux voies d'injection. Pour l'analyse statistique, nous utiliserons le logiciel GraphPad Prism. Pour comparer deux groupes, un test t de Fisher à deux intervalles sera appliqué. Pour plus de deux groupes, une analyse de la variance à sens unique (ANOVA) sera suivie d'une analyse post hoc de Tukey pour comparer les moyennes entre deux groupes.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les femelles et les mâles répondent de la même manière aux traitements, il ne devrait donc pas y avoir de biais expérimental du au sexe. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d'imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine. En plus du suivi de la taille de la tumeur primaire, la "painscore sheet" servira à l'évaluation de la douleur des animaux. Ce suivi permettra la mise en place d'une éventuelle analgésie (niveau 2) qui pourra être suivie de l'euthanasie si le score de douleur augmente encore (niveau 3).

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétroorbitale.