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Mécanismes de récupération de l’héminégligence chez le singe écureuil
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour chercher comment le cerveau récupère d'une héminégligence, perte de perception d'une moitié du champ visuel après un AVC, 15 singes écureuils vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leur cerveau. Tous ont déjà subi des procédures légères dans un projet antérieur. Dix d'entre eux subissent une lésion chirurgicale du cerveau sous une anesthésie pouvant durer huit heures, et jusqu'à trois singes du groupe témoin reçoivent, après retrait d'une partie du crâne, un dispositif de fixation de la tête, avec jusqu'à quatre chirurgies chacun. Tous passent jusqu'à quatre IRM et des enregistrements cérébraux sous anesthésie, et les singes implantés en font aussi éveillés, pendant des tests visuels que le résumé ne détaille pas. Les singes lésés sont tués trois ou douze mois après la lésion. Le porteur écrit que chez les primates la récupération est "rapide et spontanée", grâce à un mécanisme "qui n'existe pas chez l'être humain", et juge pourtant le primate non-humain le plus "pertinent" pour une transposition à l'humain.
Objectifs
Une très large majorité des cas d’accident vasculaire cérébral droit montre des troubles de la perception consciente qui conduisent à des symptômes neuropsychologiques handicapants tels que l’héminégligence. Ce trouble se caractérise par une perte de la perception de la moitié du champ visuel. Les patients héminégligents semblent vivre dans un monde amputé d’une moitié ; ils ne mangent pas la partie gauche de leur plat, ne voient pas les obstacles situés sur le côté gauche, mais plus important encore, la vie quotidienne d’un patient héminégligent présente plusieurs dangers, qui incluent des risques d'accidents de la route et des chutes graves. Seulement 40% des patients héminégligents récupèrent une capacité visuelle normale dans les 6 mois qui suivent leur accident vasculaire. Cela signifie que chaque année, 480.000 nouveaux patients européens resteront héminégligents, ce qui nuit à leur qualité de vie et les empêche de retourner au travail. Il a récemment été démontré qu'une bonne communication entre deux aires du cerveau (le lobe frontal et le lobe pariétal) est essentielle à la récupération de l’héminégligence. Cependant, chez l’animal, la récupération de l’héminégligence est rapide et spontanée même dans les cas de coupure de communication entre ces deux régions du cerveau. Les primates utilisent donc un mécanisme de récupération qui n’existe pas chez l’être humain. C’est pourquoi ce projet propose d’étudier la récupération de l’héminégligence chez le primate afin de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques chez l’être humain.
Bénéfices attendus
En étudiant la récupération de l’héminégligence chez le primate, ce projet a pour objectifs de mieux en comprendre les mécanismes et ainsi d’en déduire de nouvelles pistes thérapeutiques. A terme un traitement pourrait améliorer la récupération des patients souffrant d’héminégligence suite à un accident vasculaire cérébral. De plus, en validant l'utilisation du primate comme modèle d’héminégligence et en proposant des tests d’évaluation de ce trouble adaptés, notre étude apporte une base indispensable aux tests de traitements pharmacologiques. Cette étape est nécessaire avant la mise en place des essais chez l’être humain. Cela représente un gain de temps important dans le processus de développement d’éventuels traitements.
Procédures
• Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) : Les 15 animaux (le groupe contrôle et les deux groupes lésés) réaliseront au maximum 4 IRM (séquences complètes) avec une durée d’anesthésie maximale de 7 heures pendant toute la durée du projet. • Afin de maintenir la tête des animaux pendant les enregistrements, un dispositif doit être implanté sur la tête de l’animal. Ce dispositif comprend également une chambre d’enregistrement dans laquelle une partie du crâne a été retirée pour permettre l’enregistrement de l’activité cérébrale. Cette chirurgie aura lieu une fois pour 1 à 3 animaux du groupe contrôle avec une durée maximale d’anesthésie de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. Il est possible que d’autres chirurgies soient effectuées (3 au maximum par animal) dans le cas où l’animal perdrait le dispositif ou si les soins d’entretiens deviennent difficiles. Ces 1 à 3 animaux du groupe contrôle auront ainsi au maximum 4 chirurgies (1 pour la pose de la chambre d’enregistrement/retrait d’une partie du crâne, 1 pour la remise en place du dispositif et 2 pour entretiens du dispositif). • Afin de créer le trouble de l’héminégligence, une lésion chirurgicale du cerveau est réalisée durant une chirurgie chez 10 animaux (les 2 groupes lésés) avec une durée d’anesthésie maximale de 8 heures. Afin d’éliminer la douleur durant la chirurgie et après l’opération, les animaux recevront des anti-douleurs. • Les animaux implantés du dispositif d’observation (3 animaux du groupe contrôle) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réalisent des tests visuels. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux anesthésiés (15 animaux) participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau. Ces enregistrements dureront au maximum 2 heures sur une période comprise entre 3 et 12 mois. • Les animaux (15 animaux) seront euthanasiés. Les deux groupes ayant eu une lésion (2 groupes de 5 animaux chacun) seront euthanasiés respectivement 3 et 12 mois après la lésion. Le groupe contrôle (5 animaux) seront euthanasiés après que l’euthanasie des deux autres groupes ait été réalisée.
Impact sur les animaux
Il est attendu que la lésion réalisée induise une perception altérée de la moitié de leur vision et impacte leur comportement (déplacement et alimentation difficiles pouvant entraîner une perte de poids). Les animaux ayant eu une chirurgie (retrait d’une partie du crâne, lésion et pose de chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête) pourront ressentir de la douleur à la suite de la chirurgie. La chirurgie peut, dans certains cas, causer une accumulation de liquides et/ou abîmer la couche de tissu protectrice du cerveau. Les animaux soumis à une anesthésie pourront présenter des difficultés à se déplacer (de 1 à 4 jours). L’implantation d’une chambre d’enregistrement/système de fixation de la tête peut induire une difficulté à se déplacer et des collisions à cause de l’encombrement (pendant quelques jours avec une variabilité individuelle). L’isolement nécessaire aux tâches comportementales peut induire un stress chez l’animal concerné. Celui-ci peut notamment se manifester par des stéréotypies (gestes répétitifs, rythmés sans but apparent) ou des dépilations. Suite à des bagarres, une chute ou un choc, l’animal pourrait perdre son dispositif composé de la chambre d’enregistrement et du système de fixation de la tête. L’installation de la chambre d’enregistrement peut faciliter une infection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures afin de pouvoir effectuer différents prélèvements (cerveau…) pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet a pour objectifs de comprendre et de manipuler à des fins thérapeutiques les processus de récupération du cerveau suite à un accident vasculaire chez le primate. Ces processus sont complexes ce qui rend difficile/impossible à l’heure actuelle leur modélisation. Dans ce contexte, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux vivants par des méthodes alternatives. Par ailleurs, il est indispensable d’obtenir des données d’études sur les modèles animaux avant de pouvoir tester de nouvelles approches thérapeutiques chez les patients humains. Le modèle animal et en particulier l’utilisation du primate non-humain est donc le plus pertinent pour espérer une transposition à l’homme la plus fiable possible.
Réduction
La taille des groupes et le nombre total d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminée par des calculs de puissance. Il a été ainsi établi que 3 groupes de 5 animaux pour 15 animaux au total seraient essentiels pour la réalisation de ce projet. Des tests statistiques seront nécessaires pour obtenir une interprétation fiable des résultats. Tous les animaux de ce projet ont déjà réalisé des procédures de classe légère lors d’un précédent projet validé par le comité d’éthique et ayant obtenu un agrément.
Raffinement
Etat Général : - Entraînement des animaux avec renforcement positif (récompense) pour créer une routine qui limite les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. - Adaptation de l’hébergement, de l’enrichissement et l’alimentation pour stimuler les animaux (recherche nourriture, jeux, vidéo…) et limiter les comportements anormaux (mouvements répétitifs, immobilité…). Chirurgies et IRM : - Actes réalisés sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après l’opération), surveillance accrue de l’animal anesthésié pour éviter toutes les complications (déshydratation, baisse de la température, rythmes cardiaque et respiratoire, infection…). Ces risques sont bien identifiés et une réponse est apportée à chaque point. Par exemple : tapis chauffant pour la température, gel ophtalmique pour l’hydratation des yeux, désinfection et utilisation de matériel stérile pour éviter l’infection, anesthésique local pour l’intubation et l’installation des barres d’oreilles (dispositif de maintien de la tête fixe), intubation pour sécuriser la respiration, matériel chirurgical permettant d’avoir un geste précis et en limitant les saignements… - Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie… - Limitation des IRM à une fois toutes les 2 semaines. Post-opératoire : - A chaque anesthésie, la récupération de l’animal doit être complète avant la poursuite du reste du projet. - Après lésion, les animaux sont hébergés par 2 dans des cages ajustables pour prévenir les chutes. Ces cages conservent des aménagements permettant une stratification de l’espace tout en préservant l’animal des risques de chute. Une alimentation riche pourra être proposé pour faciliter la récupération. - Suite aux différentes chirurgies, les comportements alimentaires et sociaux des animaux peuvent être modifiés, ils feront donc l’objet d’une surveillance augmentée. Des observations post-anesthésie et post-chirurgie régulières et rigoureuses seront faîtes pour détecter le moindre inconfort de l’animal. Points scientifiques : - Dès que les données permettant de répondre à nos questions scientifiques seront obtenues, les expérimentations impliquant les animaux seront arrêtées.
Choix des espèces
La complexité des processus de récupération d'un accident vasculaire cérébrale rend indispensable d’utiliser un modèle suffisamment proche de l’Homme pour tester ensuite de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le primate non-humain est ainsi un modèle particulièrement approprié pour notre étude. De plus, les capacités d’apprentissage des singes permettent la réalisation de tâches comportementales similaires à celles réalisées par l’Homme. La complexité du cerveau rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation de ces processus. Il est primordial d’étudier ces aspects dans un modèle primate non-humain. Il y a plusieurs raisons motivant le choix du singe écureuil par rapport à d’autres espèces de primates : Le choix de cette espèce a été fait car le singe écureuil est plus facile d’accès et est particulièrement adapté à ce genre d’étude en comparaison du macaque. La taille de cette espèce est un paramètre intéressant puisqu’il permet d’utiliser des appareils IRM plus puissants dont le diamètre d’entrée est plus petit. De plus, le choix ne s’est pas porté sur les rongeurs car contrairement aux primates non humains, les rongeurs ne semblent pas présenter de symptômes d’héminégligence. Par ailleurs, nous n’avons pas choisi le macaque car il a été démontré qu’une lésion de la zone cérébrale causant le trouble de l’héminégligence chez cette espèce induisait des symptômes qui pouvaient perdurer plusieurs mois, voire même plusieurs années. Ces différents points expliquent les raisons pour lesquelles nous avons décidé d’utiliser le modèle du singe écureuil pour ce projet. Les animaux utilisés seront tous adultes (âge supérieur à 3 ans). Étant donné que l’âge est un facteur de risque pour les accidents vasculaires cérébraux, nous utiliserons des animaux les plus âgés possibles. En effet, il a été observé chez d’autres espèces de primates que par rapport aux plus jeunes, les animaux âgés étaient plus sensibles à la lésion et que le syndrome obtenu était généralement plus stable.
Nouveaux complexes organométalliques en tant que radiosensibilisants dans le traitement du cancer
- Recherche appliquée
- Cancers
230 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de tumeur du col de l'utérus, des injections d'un composé de platine et des irradiations pouvant provoquer une toxicité cutanée. Le porteur teste de nouveaux complexes radiosensibilisants ayant fait l'objet d'un brevet européen, en évoquant une valorisation industrielle et une étude de marché. Il indique que les résultats obtenus en culture cellulaire doivent être vérifiés sur un organisme vivant avant la clinique.
Objectifs
La combinaison de la chimiothérapie (à base de cisplatine) avec la radiothérapie est une stratégie habituelle dans le traitement de certains cancers. Si cette stratégie a fait ses preuves, pour certains cancers le taux de survie globale des patients reste faible, des résistances apparaissent fréquemment et le cisplatine induit des effets indésirables avec de fortes toxicités secondaires. Le projet a pour objectif de développer une nouvelle série de complexes de platine aux capacités radiosensibilisantes supérieures à celles du cisplatine. Le choix s’est porté sur le cancer du col de l’utérus pour lequel les traitements actuels restent insuffisants, en particulier avec le développement des phénomènes de résistance. Nous avons montré que ces nouveaux complexes agissent en synergie avec la radiothérapie sur différentes lignées de cellules cancéreuses du col de l’utérus (qui sont résistantes à plusieurs chimiothérapies), ce qui les distingue du cisplatine puisque celui-ci n’exerce qu’un effet additif avec la radiothérapie. De plus, certains de ces complexes exercent leur effet radiosensibilisant à des doses n’engendrant pas de toxicités, permettant de réduire ainsi la toxicité intrinsèque de chacun des deux traitements et donc d’envisager un réel bénéfice pour le traitement des patients. Nous devons maintenant apporter la preuve de concept in vivo, sur des xénogreffes de tumeur du col de l’utérus d’intérêt. Cette étude permettra de valider sur des modèles in vivo les résultats démontrés sur les lignées cellulaires. Elle a pour but de déterminer si les complexes choisis pourraient être envisagés comme de potentiels nouveaux médicaments qui, administrés en combinaison avec la radiothérapie, surmonteraient les résistances médicamenteuses acquises des cancers du col de l’utérus
Bénéfices attendus
Les expériences programmées in vivo ont pour but de valider la stratégie de combinaison radiothérapie-chimiothérapie avec de nouveaux complexes de platine sur les xénogreffes de tumeurs du col de l’utérus dérivées de patientes résistantes à plusieurs traitements chimiothérapeutiques. Ainsi, si la preuve de concept que la combinaison des deux traitements apporte, au niveau de cette étude préclinique, un effet synergique comparé aux traitements isolés, ces complexes pourraient donc être envisagés dans le cas des cancers ayant développé des résistances et être pertinents également dans le cas d’autres cancers incurables pour lesquels la combinaison chimiothérapie/ radiothérapie est déjà préconisée. Les travaux sur ces complexes innovants ont conduit au dépôt d’un brevet européen revendiquant leur synthèse et leurs propriétés radiosensibilisantes, et une extension internationale a été déposée. Cette étape permet donc d’envisager une valorisation industrielle de ces complexes A court terme, si les résultats sont positifs, nous pourront envisager de regarder leurs activités sur d’autres cancers présentant encore à l’heure actuelle une impasse thérapeutique comme les cancers de l’œsophage (programme de prématuration qui débutera en septembre 2022) A plus long terme, nous pourrons envisager, après étude de marché lors du projet de prématuration, un programme ultérieur de maturation pour l’activité radiosensibilisante d’un complexe identifié comme pertinent sur des cancers dont le traitement actuel est insuffisant, en collaboration avec un industriel afin de faire bénéficier les patients de ces avancées thérapeutiques
Procédures
Dans la première procédure visant à caractériser la radiosensibilité des modèles tumoraux, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée sur le flanc aux animaux vigiles (une fois au cours de l’expérience) (durée du geste inférieure 1 minute). Quelques jours/semaines après la greffe, les animaux vigiles seront placés dans des systèmes de contentions avant d’être exposés au niveau de la tumeur aux rayonnements ionisants. L’irradiation de la tumeur sera réalisée 1 ou 5 fois en fonction des lots expérimentaux (durée du geste inférieure 15 minutes). Dans la deuxième procédure visant à évaluer l’efficacité de la combinaison des composés avec un traitement par radiothérapie, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée sur le flanc aux animaux vigiles (une fois au cours de l’expérience) (durée du geste inférieure 1 minute). Quelques jours/semaines après la greffe, les animaux vigiles seront traités une première fois (Jour 1) avec les composés ou le véhicule en utilisant la voie d’administration retenue à l’issue des expériences préliminaires (injection directement dans l’abdomen, injection en sous-cutanée autour de la tumeur ou administration orale). Le lendemain (Jour 2), les animaux vigiles recevront le traitement de radiothérapie retenu après la réalisation de la première procédure (durée du geste inférieure 15 minutes. Le troisième jour (Jour 3) sera réalisée la deuxième injection de composé sur animaux vigiles (durée du geste inférieure 1 minute).
Impact sur les animaux
L’administration des traitements peut induire une perte de poids observée pendant 7 à 15 jours. L’inoculation de tumeur conduira au développement de tumeurs en sous-cutanée qui seront mesurées régulièrement. L’irradiation en elle-même n’est pas douloureuse mais une toxicité cutanée (dépilation, plaies) peut apparaitre pour les doses les plus élevées.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Nous avons mené des études in vitro sur des cellules humaines issues de cancer de col de l’utérus afin de valider nos hypothèses. Pour l'évaluation pré-clinique des traitements, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un système plus physiologique représentant un organisme vivant intégré tel que la souris avant une application clinique chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux a été défini à l’aide d’outils statistiques de façon à limiter les animaux utilisés tout en s’assurant d’obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
Conformément aux recommandations internationales, les souris seront suivies deux fois par semaine pour s’assurer de leur bien-être et les expériences seront arrêtées si un des point limite défini dans la grille de score est atteint. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux Dans le cas d’une perte de poids liée aux traitements, les animaux recevront des aliments gélifiés en première intention. Une réhydratation parentérale sera également mise en œuvre. En cas d’apparition d’une toxicité cutanée suite à l’irradiation, une crème cicatrisante sera appliquée.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les animaux seront utilisés au stade adulte du fait que le cancer du col de l’utérus est une tumeur de l’adulte. Les souris Swiss nude et BALB/c nude arriveront à l'animalerie, âgées de 6 semaines. Après une période d'adaptation de 7 jours à l'animalerie, les animaux seront alors utilisés à l'âge de 8 semaines de manière à favoriser la reproductibilité des résultats.
Développement d’outils moléculaires permettant l’amélioration des processus cognitifs dans un modèle de souris Alzheimer
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale pour injection virale, avec douleur post-opératoire, puis une restriction alimentaire faisant perdre 10 à 15 % de leur poids pour les motiver aux tests de mémoire. Le porteur teste des molécules censées retarder le déclin cognitif dans un modèle de maladie d'Alzheimer, les pistes thérapeutiques restant attendues. Il indique que l'évaluation de la mémoire ne peut se faire que sur des animaux.
Objectifs
L’hippocampe est une des premières structures cérébrales atteintes dans la maladie d’Alzheimer. Une dysfonction de ce dernier entraîne des troubles de la mémoire épisodique, celle qui permet la mémorisation de nos expériences passées. Deux processus cognitifs sous-tendent cette mémoire : le pattern separation – qui permet la discrimination de deux souvenirs plus ou moins similaires – et le pattern completion – qui permet de reconstruire une information globale à partir de souvenir partiels. Des défauts en pattern separation et pattern completion ont été observés chez des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ainsi que chez les modèles animaux de cette pathologie. Notre équipe a récemment découvert des molécules permettant d’améliorer le pattern separation et du pattern completion, chez la souris non-transgénique, sans aucun effet délétère. A la suite de cette découverte, nous souhaitons les utiliser afin d’améliorer le pattern separation et le pattern completion dans un modèle de souris Alzheimer. L'objectif de ce projet est de tester si ces nouvelles molécules permettent de retarder le déclin cognitif des souris modélisant la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Nos résultats préliminaires montrent que les souris non-transgéniques injectées avec un virus permettant d’exprimer une molécule candidate, ont une amélioration du pattern separation par rapport aux souris non-injectées. Ainsi, en injectant les souris modélisant la maladie d’Alzheimer (MA) avec ce même virus, nous espérons retarder leur déclin cognitif. En utilisant d’autres constructions virales liées à cette molécule candidate, nous souhaitons restaurer à la fois le pattern separation et le pattern completion chez les souris modélisant la MA. Ce projet permettra donc la caractérisation et l’utilisation de molécules pouvant retarder le déclin cognitif, nous offrant de nouvelles pistes thérapeutiques. En fonctions des résultats obtenus, nous pourront développer une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires et cellulaires engagés dans la maladie d’Alzheimer (MA). Il est à noter que les virus utilisés servent uniquement à faire exprimer une molécule dans une zone précise du cerveau et n’ont aucun effet nocif ou délétère sur les animaux.
Procédures
Nous souhaitons retarder le déclin cognitif de souris modélisant la maladie d'Alzheimer en injectant directement dans le cerveau des virus non-infectieux qui vont permettre l'expression de molécules candidates. Pour ce faire, les animaux seront injectés sous anesthésie avec un volume très restreint de virus. La durée de la chirurgie est d'environ 40 minutes. Une fois injectés, les capacités cognitives des animaux seront testées quotidiennement avec des tests comportementaux non-aversifs. Le cerveau des animaux sera finalement prélevé pour vérifier la localisation de l'injection et la présence de la molécule candidate.
Impact sur les animaux
Nous devons pratiquer une chirurgie stéréotaxique nous permettant d’injecter des virus dans une zone très précise du cerveau, particulièrement touchée dans la maladie d’Alzheimer. Cette méthode est stressante pour les animaux et entraîne une douleur post-opératoire pendant environ 48h. L’évaluation des capacités cognitives de nos souris nécessite l’utilisation de tests comportementaux. Nous avons deux tests non-aversifs basés sur le principe de récompense qui nécessite une restriction alimentaire, afin de motiver nos animaux à apprendre ces tests. Cette restriction alimentaire entraine une perte maximale de 10 à 15% du poids initial des souris, privation classiquement utilisée dans ce test, qui peut entraîner un stress léger mais ne met pas en péril le bien-être des animaux.
Devenir
Les animaux injectés passés en tests expérimentaux ne seront pas gardés en vie à la fin de l'expérience et seront utilisés pour des analyses biochimiques ou histologiques.
Remplacement
Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires réalisés dans le laboratoire. Beaucoup d’études « in-vitro » sont donc effectuées sur des cellules en amont de l’utilisation de lignées d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. L'évaluation de la cognition et de la mémoire doit se faire via des études comportementales qui ne peuvent se faire que sur des animaux. De plus, les modèles de souris Alzheimer que nous utilisons dans ce projet sont bien référencés et caractérisés.
Réduction
Afin d’utiliser le nombre minimal d'animaux mais de garantir la validité scientifique et statistique des résultats, nous avons évalué via la bibliographie et une étude empirique qu’un nombre minimum de 15 animaux par groupe est nécessaire pour nos tests comportementaux et que 6 animaux par groupe étaient nécessaire pour nos analyses morphologiques et biochimiques.
Raffinement
Pour améliorer au maximum le bien-être des animaux, toutes les mesures sont mises en place tout au long du projet. Le transport est réalisé plusieurs jours avant le début des expérimentations, pour permettre une acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et réduire le stress du transport. Les animaux sont élevés en cage collective enrichie avec un nid végétal, sont surveillés régulièrement et des points limites suffisamment précoces ont été mis en place. De plus concernant la chirurgie, un anti-inflammatoire et un anesthésique local sont administrés avant la chirurgie ainsi qu’un analgésique et anesthésique (gazeux) pendant la chirurgie. Nous effectuons également un suivi post-opératoire biquotidien pendant 48h (weekend compris), pour lequel nous avons établi des points limites précoces et des mesures conservatoires adaptées à chaque point limite. Concernant les tests comportementaux (non-aversifs en eux-mêmes) nous devons effectuer une restriction alimentaire chez nos animaux, entraînant une légère perte de leur poids initial.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris, animal pour lequel la manipulation génétique est possible, ce qui permet de produire des modèles mimant les pathologies humaines telles que la maladie d’Alzheimer. De plus, notre laboratoire possède une expertise et le matériel nécessaire pour étudier la mémoire et la cognition chez la souris, ce qui facilitera la mise en place des tests comportementaux chez ces lignées murines. Nous souhaitons évaluer les souris modélisant la maladie d’Alzheimer et leurs contrôles à plusieurs stades de développement afin de 1. Caractériser leur déficit en pattern separation et pattern completion et 2. Tester nos molécules candidates afin de stopper ou retarder ces déficits en intervenant à un âge précoce de la maladie d’Alzheimer. Ainsi, nous utiliserons des souris à deux stades de développement (âge précoce : 4-7 mois ; âge tardif : > 7 mois).
Jeûne/réalimentation : un modèle d’étude sans gavage du métabolisme hépatique du canard
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
345 canards vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont soumis à des cycles de jeûne de 23 heures suivis de réalimentation, et une partie provient d'œufs incubés à température augmentée pour programmer l'engraissement du foie. Le porteur cherche à activer l'engraissement hépatique sans gavage, dans le but affiché d'optimiser la production de "foie gras" du canard mulard. Il présente ce modèle comme une amélioration du "bien-être animal" pour les seules phases expérimentales, la finalité restant la production.
Objectifs
Il a récemment été montré, qu’une hausse de température d’incubation des œufs de canard pouvait programmer le métabolisme du foie et ainsi provoquer un plus fort engraissement lors du gavage. L’objectif de ce projet est de mettre au point un modèle expérimental permettant d’activer les voies cellulaires de l’engraissement du foie sans gaver les animaux, afin d’étudier les mécanismes de cette programmation. Le modèle que nous proposons est basé sur l’activation du métabolisme hépatique lors de phases de jeûne et de réalimentation et permettrait d’accélérer les phases expérimentales. De nombreux points communs ont été mis en évidence entre le gavage et la réalimentation d’une durée d’une heure, après un jeûne de 23h. Toutefois, la quantité de lipides totaux dans le foie n’est pas modulée lorsque les mesures sont faites 4h après la réalimentation. Ce paramètre étant essentiel pour pouvoir mettre en parallèle la technique de gavage et le modèle expérimental, nous souhaitons maintenant optimiser le protocole pour obtenir un début d’engraissement hépatique mesurable (comparé à la fin de période de jeûne). Pour cela, nous souhaitons soumettre des canards âgés de 8 semaines à un jeûne de 23h, puis à différentes modalités de réalimentation (1h de réalimentation, 16h de réalimentation ou deux fois 1h de réalimentation séparées de 6h). Pour cette première partie du protocole, un total de 225 animaux sera utilisé. Dans un second temps, afin de mesurer l’impact de la programmation thermique embryonnaire sur le métabolisme lors de ce challenge alimentaire, deux groupes d’animaux seront soumis au meilleur protocole (ayant permis de mesurer une hausse du taux de lipides). Les œufs de canard seront incubés selon deux protocoles différents : un groupe avec une température d’incubation dite « contrôle » et un groupe dit « programmé » dont la température d’incubation sera augmentée de 1,7°C pendant 10 jours embryonnaires, 16h/24. Pour cette seconde partie dont l’objectif sera de mesurer des différences de réponses liées à la programmation thermique embryonnaire, 120 canards seront utilisés. La totalité de ce projet (optimisation du challenge alimentaire et programmation thermique) concernera donc un total de 345 animaux.
Bénéfices attendus
La filière « foie gras » se doit de chercher de nouvelles méthodes de production, notamment pour tenter de trouver des alternatives à la pratique du gavage, encore inexistantes chez le canard. Ce projet a pour objectif de mettre au point un protocole qui permettrait d’étudier le métabolisme du foie des canards et notamment l’impact de la programmation embryonnaire, sans avoir à gaver les animaux lors des phases expérimentales. La mise au point de ce protocole de jeûne/réalimentation nous permettrait de tester différentes techniques en vue d’optimiser le métabolisme hépatique des canards, que l’on pourrait ensuite appliquer dans des modèles classiques de production, mais également dans des nouvelles pratiques sans gavage. Notre équipe s’intéresse depuis quelques années à la programmation thermique embryonnaire, qui a déjà démontré son efficacité sur la production de foie gras par gavage, mais qui nécessite encore des optimisations. Ces optimisations pourront naitre d’une meilleure compréhension des mécanismes liés à la programmation. L’existence d’un protocole nous permettant d’étudier le métabolisme hépatique du canard sans avoir à gaver les animaux permettrait non seulement d’accélérer les études (les prélèvements étant plus flexibles et les mesures étant moins variables que lors du gavage), mais également de remplir l’objectif d’amélioration du bien-être animal, au moins pour les phases expérimentales. Si nous parvenons à obtenir une hausse de la quantité de lipides dans le foie lors de ces cycles de jeûne/réalimentation, nous pourrons alors tester de nombreuses conditions de programmations embryonnaires, et in fine les appliquer dans des modèles classiques de gavage mais également dans des modèles d’alternatives à venir.
Procédures
Les canards ne seront soumis à aucune intervention autre que la mise à jeun. Ils seront pesés et prélevés après leur euthanasie. La phase de préparation au gavage correspond à l’enchainement de 28 cycles identiques de jeûne/réalimentation, sans que cela n’entraine de stress particulier ou de perte de poids significative. Nous supposons donc que cette procédure n’entrainera pas de nuisances particulières. La faim provoquée par le jeûne imposé ne devrait pas entrainer une hausse significative de l’agressivité entre individus. Lors de la réalimentation, les aliments seront mis à disposition en quantité suffisante pour que tous les animaux puissent y avoir accès. Les embryons seront soumis à une hausse de température d’incubation de 1,7°C, parallèlement à une hausse de l’humidité relative afin d’éviter la déshydratation des œufs (65%), durant 10 jours embryonnaires (E11-E21) et de façon discontinue (16h/24h). Ces conditions permettent généralement de limiter les nuisances pour les embryons et de maintenir une éclosabilité identique aux embryons incubés en conditions normales.
Impact sur les animaux
Il ne devrait pas y avoir d’effet indésirable notable car la phase de préparation au gavage utilisée couramment en élevage, et consistant à rationner les animaux à une seule heure d’alimentation par jour afin de les habituer à consommer une grande quantité d’aliments, correspond à l’enchainement d’une trentaine (28) de cycles de jeûne/réalimentation sur une durée de 4 semaines. Cette pratique n’entraine pas de problème de comportement, ni de baisse de poids des animaux. Nous pouvons donc supposer que l’étude de ces cycles de jeûne/réalimentation ne produira pas de stress excessif ou de baisse de poids significatifs. De même il a été montré que la hausse de température d’incubation des oeufs, lorsqu’elle est pratiquée de manière modérée (inférieure à 2°C), de façon discontinue (16h/24h) et pendant les phases les moins précoces de l’embryogenèse permettait de limiter les impacts négatifs sur la survie des embryons. Dans cette étude nous utiliserons une hausse de température de 1,7°C maximum pendant 10 jours embryonnaires (du 11eme au 21eme jour) et de façon discontinue (16h/24), dans l’objectif de maintenir l’éclosabilité au même niveau que le groupe ne subissant pas de hausse de température.
Devenir
La totalité des animaux sera euthanasiée en fin de procédure, les prélèvements prévus ne pouvant se faire sur animaux vivants.
Remplacement
Le remplacement total des animaux dans le cadre des études de métabolisme hépatique dans la filière « foie gras » n’est à ce jour pas possible. Les mesures physiologiques de variation de poids et de composition du foie ne peuvent se faire qu’in vivo.
Réduction
Ce projet en lui-même représente une méthode permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés pour l’étude des mécanismes de la stéatose hépatique (engraissement du foie). En effet, le protocole de jeûne/réalimentation permettrait de stimuler des voies analogues à celles stimulées lors du gavage, mais la variabilité de réponse étant beaucoup moins importante le nombre d’animaux nécessaires en serait réduit d’autant (passant de 38 animaux par groupe pour notre précédente étude avec gavage à 15 animaux par groupe pour celle-ci, donc une réduction d’environ 60% des effectifs lors des phases expérimentales).
Raffinement
Les animaux seront installés dans des loges de 18m² (à raison de 45 animaux maximum par loge, assurant ainsi 0,4m² par animal), avec un accès extérieur de 6m² lorsque les conditions environnementales le permettent (donc hors claustration imposée en cas de crise de grippe aviaire). Jusqu’à l’âge de 3/4 semaines, selon la taille de leur pattes, les canetons sont installés sur de la litière pour éviter qu’ils ne se blessent sur les caillebotis. Les animaux auront accès à un seau d’eau, où ils pourront plonger leur tête et projeter de l’eau sur leur corps. Différents enrichissements seront mis en place de façon périodique avec mise à disposition successive de chainettes métalliques de jeu, de flotteurs suspendus par une corde, de tas de copeaux de bois, afin de stimuler leur curiosité et le jeu en vue de réduire les comportements agressifs. Au cours de l’élevage et pendant la période de jeûne, une observation biquotidienne des animaux sera réalisée, afin de s’assurer du bon état de chaque animal. Toute observation de boiterie, blessure, prostration ou refus de se réalimenter (point limite strict spécifique du projet) entrainera un consignation sur la feuille d’élevage et l’évolution de l’état de l’animal sera suivi à chaque passage de l’éleveur. Celui-ci jugera de la conduite à tenir. Si son état se dégrade, il sera retiré de l’expérimentation, isolé pour être surveillé plus attentivement et soigné si nécessaire. Si son état ne s’améliore pas, il sera euthanasié sous la directive du vétérinaire.
Choix des espèces
De nombreuses différences entre espèces ont été relevées quant à la capacité à produire du foie gras, et aujourd’hui le canard mulard est utilisé pour plus de 90% de la production. Notre étude visant à comprendre les mécanismes de la programmation thermique embryonnaire sur le métabolisme du foie dans l’objectif d’optimiser les méthodes de production actuelles, le canard mulard est donc l’espèce de choix. Les animaux seront utilisés depuis le début de l’embryogenèse (arrivée rapide des œufs après le jour de ponte) et jusqu’à la huitième semaine de vie post-éclosion. La programmation embryonnaire nécessite l’application de notre stimulus thermique pendant la période d’incubation. Et nous avons choisi de mettre en place notre stimulus alimentaire (jeûne/réalimentation) à la huitième semaine de vie post-éclosion, car elle correspond habituellement à l’âge auquel les animaux sont mis en préparation au gavage et commencent donc à subir ces cycles de jeûnes/réalimentation, sans impacts néfastes pour leur santé.
Evaluation in vivo de la synergie de traitement par le composé MER-1, le temozolomide et la radiothérapie dans un modèle de greffe orthotopique de cellules de glioblastome humain chez la souris immunodéprimée. (EU1/2)
- Recherche appliquée
- Cancers
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de glioblastome humain dans le cerveau, puis des séances de radiothérapie, des anesthésies répétées et l'administration d'un composé. Le porteur teste la combinaison de ce composé avec la chimiothérapie et la radiothérapie, en évoquant un brevet européen et une valorisation industrielle. Il affirme que le remplacement par des méthodes alternatives n'est "pas possible" pour un phénomène dépendant du statut hormonal.
Objectifs
Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles de rongeurs indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche majeur. Dans une étude préliminaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de glioblastomes et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons montré pour la première fois que l'activation de ce récepteur par une molécule bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison de cette molécule avec le traitement de radio et chimiothérapie actuellement prescrit contre les glioblastomes conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer dans une étude "in vivo" (sur modèle animal), en étudiant les réponses selon le sexe.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet constitueront une base pour proposer l'utilisation du composé étudié pour le traitement des glioblastomes. En effet, ce projet innovant permettra de mieux comprendre les processus responsables des différences de survenue des glioblastomes et de réponse au traitement entre les hommes et les femmes. En cas de résultats probants, cela permettra d'apporter de nouvelles voies de stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant des agonistes (molécules interagissant avec des récepteurs membranaires) de certains récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de tumeurs chimiorésistantes marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).
Procédures
- Xenogreffe intracérébrale (1 seule itération à J0) : durée=45 min - Imagerie bioluminescence (au minimum 10 injections itératives IP) : durée 15 min - Traitement par radiothérapie (6 itérations) : durée 10 min pour chaque session - Traitement par le composé +/- combiné au temozolomide (12 itérations) : durée 1 min par traitement. Test d'éviction d'obstacle (3 fois par semaine ) : durée 5 min.
Impact sur les animaux
La première nuisance attendue sur les animaux est liée à l’implantation même du glioblastome (apparition d’une tumeur cérébrale avec des effets délétères attendus, non réversibles. Schéma de traitement par radiothérapie (itérations répétées) et imagerie par bioluminescence (2 ou 3 fois par semaine selon le timing dans le projet) nécessitent un transport et une anesthésie répétés des animaux. Une accoutumance liée à la répétition des anesthésies chimiques (kétamine) peut être observée. Les administrations quotidiennes du composé étudié conduisent à un dérangement journalier des animaux. Les injections intra-péritonéales répétées pourront conduire à une réaction cutanée modérée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. Ainsi 80 souris seront mises à mort dès lors de l'atteinte d'un point limite (étude efficacité/survie : 40 souris femelles et 40 souris mâles) ou plus précocement à l'issue du schéma de traitement de chaque groupe (souris "satellites" : 24 souris femelles et 24 souris mâles ). La mise à mort des souris "satellites" à la fin du schéma de traitement est justifiée de part la nécessité de réaliser des analyses histologiques et biochimiques pour pouvoir caractériser l'impact de chaque modalité de traitement.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris mâles ou femelles ...). En l'occurrence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
- Dans le cadre de ce projet, les expérimentations seront menées de façon prospective, tout d’abord en réalisant l’étude sur les animaux « satellites » mâles et femelles de chaque groupe (24 souris mâles et 24 souris femelles avec un effectif de 6 souris par groupe de traitement). Si nos hypothèses concernant l’analyse des signatures moléculaires sont vérifiées (franchissement de la BHE=barrière hémato-encéphalique (barrière agissant comme un filtre protégeant le cerveau)), alors le projet sera secondairement mené sur les souris dédiées à l’étude d’efficacité/survie (de la même façon 40 souris mâles et 40 souris femelles avec un effectif de 10 souris par groupe de traitement). En raison du nombre important de souris dans l’étude, notre démarche consistera à réaliser successivement plusieurs séries d’animaux. Ces dernières seront ainsi constituées de représentants de chaque groupe et de chaque sexe pour éviter un biais expérimental. - Concernant le nombre de souris satellites : il s’agira de comparer, indépendamment chez les mâles ou les femelles, l’effet des traitements par rapport au groupe contrôle par l’analyse de marqueurs histologiques et moléculaires. Ces types d’analyses sont très fiables et ne nécessitent qu’un effectif réduit pour mettre en lumière un effet, s’il existe. Ainsi on estime - à priori - que même si l’effet des traitements sera faible, un effectif de 6 souris / groupe sera suffisant pour révéler une différence significative via des tests statistiques. Concernant le nombre de souris en suivi de croissance tumorale, de la même façon la comparaison se fera indépendamment chez les mâles et les femelles. Ainsi, sur la base de nos précédentes études, on estime que l’effet des traitements aura un effet faible sur la croissance tumorale. Au minimum 6 mesures (bioluminescence) seront réalisées en suivi de traitement. Après simulation, le nombre minimum d’animaux nécessaires par groupe est ainsi trouvé à n = 10 pour garantir une approche statistique pertinente.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique mélange kétamine/xylazine, désinfection plaie, chirurgie aseptique, suivi post-opératoire rigoureux) puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois/semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale). Une vigilance accrue sera également menée lors de la fenêtre temporelle d'administration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'état sanitaire individuel des animaux, conditions de transport de façon à éviter au maximum stress des animaux). Un suivi quotidien garantissant le bien-être optimal des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau de boisson et nourriture ad libitum, enrichissement sous forme de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger, hébergement en portoir ventilé). Quel que soit le groupe, nous ne laisserons en aucun cas les animaux mourir de mort dégradée et anticiperons cette dégradation en réalisant nous-mêmes la mise à mort dès que les points limites définis apparaitront (perte de poids et problème de motricité essentiellement).
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles rongeurs (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris mâles ou femelles seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
Recherche de biomarqueurs de santé digestive chez le poulet
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
480 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent trois prélèvements sanguins et, pour la moitié, un vaccin surdosé pouvant perturber leur digestion, avant d'être tués pour prélever le tube digestif. Le porteur cherche des biomarqueurs de santé digestive chez le poulet de chair, dans une visée d'élevage et de production. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne permet d'atteindre cet objectif chez cette espèce.
Objectifs
Le maintien de l’homéostasie intestinale - équilibre entre l'hôte, le microbiote intestinal et les composés alimentaires présents dans le tube digestif - est essentiel pour assurer la santé et le bien-être du poulet. Cependant, plusieurs facteurs inhérents à la qualité des aliments, à la gestion des oiseaux et à l'environnement peuvent affecter cette homéostasie et engendrer potentiellement de multiples perturbations avec des conséquences négatives sur la santé, le bien-être et des rejets dans l'environnement.
Bénéfices attendus
Ce programme contribuera à proposer : - des biomarqueurs de santé les moins invasifs possibles pouvant être utilisés pour quantifier la robustesse du poulet et proposer des stratégies de prévention. -un socle de connaissances sur la l’homéostasie digestive des volailles peu étudiée de façon globale. - un ou plusieurs outils de suivi en élevage ne nécessitant pas de procédure invasive pour les animaux.
Procédures
A J8, J21 et J35, les animaux subiront une prise de sang au sinus occipital , cette intervention prend 5 secondes.
Impact sur les animaux
Le prélèvement au niveau du sinus occipital peut engendrer du stress lié à la contention de l’animal et un hématome. Cette procédure est assurée par des personnes expertes qui maitrisent parfaitement la technique réduisant le risque de stress et d’hématome pour l’animal. De plus, le régime alternatif intégrant des matières premières plus locales et alternatives au soja (importé) sont susceptibles d’entrainer dans certains cas des désordres digestifs. Ces désordres sont malheureusement fréquents sur le terrain ; ils affecteraient près de 50% des lots. Pour la moitié des animaux, un challenge vaccinal (anticoccidien surdosé) sera appliqué pouvant induire une perturbation temporaire de la santé digestive des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en respectant la règlementation en vigueur (annexe 4 del’arrêté du 1/02/13) afin de réaliser les prélèvements des différentes parties du tube digestif, les organes annexes et digesta.
Remplacement
Les connaissances sur la physiologie digestive et sur les possibles liens entre matrices invasives (tissu, contenu digestif), peu invasive (sang) et non invasive (fientes) sont encore très éparses et ne permettent d'envisager une expérimentation in silico. L’utilisation de l’animal ne peut être remplacée par un modèle d’étude in vitro ou in silico.
Réduction
Les animaux seront élevés en groupe et au sol dans un bâtiment d’élevage standard. Il a été estimé qu’un nombre de 20 poulets par condition était nécessaire pour identifier une différence significative entre les groupes en termes de santé digestive et biologiquement pertinente au regard de la bibliographie . Considérant une mortalité de 5% (3 animaux par traitement), il est nécessaire de considérer 63 animaux par traitement (20 animaux * 3 dates + 3 mortalités possibles).
Raffinement
Le comportement des animaux sera suivi quotidiennement afin de détecter tout risque de souffrance ou de mal-être. Toute manifestation de symptômes comportementaux persistants définis par un point limite (animal prostré plus de 24 h et ayant cessé de s’alimenter et de s’abreuver) entrainera le retrait de l’animal de l’expérimentation. Le milieu sera enrichi avec des enrichissements permettant aux animaux de grimper et de se cacher.
Choix des espèces
Le projet est un programme de recherche finalisée visant à identifier des biomarqueurs de la santé digestive chez le poulet de chair afin de proposer des méthodes d’évaluation peu ou non invasives. Il n’existe pas de modèle mathématique ni de test in vitro permettant d’atteindre cet objectif. L’objectif premier de ce projet est d'identifier des biomarqueurs peu ou non invasives de santé digestive spécifiquement chez le poulet qui sera le modèle d’étude.
Etude de l’implication du facteur de virulence PB1-F2 dans la pathogénicité des virus influenza aviaires chez le modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par voie nasale avec des virus de la grippe aviaire, une partie servant à établir la dose létale 50, l'infection pouvant provoquer une anorexie sévère et une perte de poids supérieure à 20 %. Le porteur étudie un facteur de virulence pour prédire le potentiel pandémique de souches émergentes, cet outil de prédiction restant un objectif à long terme. Il indique que les cultures cellulaires et les organoïdes ne reproduisent pas l'organisme complet et conclut au recours au modèle souris.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de déterminer l’impact de PB1-F2 dans la pathogénicité de souches de virus influenza aviaires (souches H5N8). Le projet est très novateur car il vise à déterminer les bases moléculaires de la pathogénicité associée à PB1-F2 dans des modèles animaux pertinents, ici le modèle murin. Les virus mutants seront générés grâce au système de génétique inverse que nous maitrisons dans le laboratoire puis éprouvés en modèle souris en termes de morbidité (mesure des signes cliniques et analyses anapathologiques) et de mortalité. L’objectif ultime étant d’être capables de mieux prédire le potentiel pandémique d’une souche de VIA émergente (VIA = virus influenza de type A).
Bénéfices attendus
Les virus influenza représentent un problème majeur en santé publique comme en santé vétérinaire. Les virus influenza de type A (VIA) sont à l’origine de zoonoses, c’est-à-dire qu’ils sont capables de franchir les barrières d’espèce et d’infecter un large spectre d'hôtes allant des oiseaux aquatiques (constituant le réservoir viral) à d'autres espèces aviaires (oiseaux de rente, volailles) mais également des mammifères dont l’Homme. Depuis 2013-2014, le monde est frappé par une panzootie due à l'émergence d'une nouvelle constellation virale H5Nx dérivant des virus H5N1 de 2003. Les virus H5Nx ne cessent de se diversifier génétiquement et causent d'importantes pertes économiques et des campagnes d'abattages massifs (déjà 16 millions de volailles abattues en France cette année). PB1-F2 est un facteur de virulence des VIA. Notre projet s’appuie sur l’étude de ces souches directement issues du terrain. L’objectif à court terme de ce projet est de comprendre les déterminants de cette adaptation à l'hôte mammifère et de l’exacerbation de la pathogénicité des souches associées à PB1-F2. A plus long terme, les résultats obtenus dans ce projet permettront de développer des outils de prédiction du potentiel pandémique des souches émergentes de VIA.
Procédures
Les souris seront anesthésiées chimiquement par voie intrapéritonéale afin de les infecter par une administration en intra-nasale de virus (durée 1 min). Elles seront ensuite surveillées quotidiennement avec une mesure de leur poids et de leur température ainsi qu’une observation des signes cliniques liés à l’infection. Des prélèvements de sang seront effectués à J3, J5 et avant l’euthanasie des souris à la fin du protocole expérimental. Expérience 1 : 2 prises de sang à J3 et J15, durée 1 à 2 min. Expérience 2 : 1 prise de sang le jour de l’euthanasie, durée 1 à 2 min.
Impact sur les animaux
L’aspect dommageable de ce protocole réside dans l’infection virale elle-même. Les virus que nous souhaitons utiliser ont des virulences variables et peuvent générer des symptômes très légers à très sévères chez la souris. Le suivi quotidien est donc indispensable afin d’effectuer un contrôle drastique des signes cliniques. Les dommages principaux liés à l’infection sont : anorexie sévère avec perte de poids supérieure à 20% du poids initial, chute de température. Le suivi quotidien sera renforcé et 2 visites journalières seront faites par le personnel.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront tous euthanasiés afin de prélever les organes et tissus nécessaires à l’analyse des effets de l’infection par les VIA dans ces différents organes.
Remplacement
Le modèle d'infection grippale par le virus influenza chez la souris reproduit très bien les mécanismes inflammatoires que nous souhaitons étudier. L'emploi du modèle souris pour étudier les mécanismes pathologiques liés aux virus influenza est extrêmement puissant car il permet de comprendre la dynamique de l'inflammation pulmonaire et de suivre l'afflux de cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. D’autre part, le virus grippal induit une pathologie marquée qui peut être potentiellement mortelle pour la souris mais qui nous permet de déterminer le pouvoir pathogène d’une souche donnée chez l’hôte mammifère et par extension chez l’homme. De telles expériences ne peuvent pas être réalisées sur des cultures cellulaires qui ne permettent pas de reconstituer les communications entre les différents organes et notamment les recrutements de cellules immunitaires. D’autre part, l’usage d’organoïdes, malgré les récents progrès dans ce domaine, ne permettent pas d’étudier le tropisme viral au sein d’un organisme complet, ce qui est un des objectifs du projet.
Réduction
Une attention particulière sera apportée à l’emploi d’un nombre minimal d’animaux tout en maintenant des effectifs compatibles avec l’analyse bio-statistique. Une expérience pilote repose sur l'étude de lots de 5-10 animaux pour minimiser le nombre de souris tout en gardant des résultats statistiquement relevant. Ainsi dans la première partie de l’expérience visant à établir la dose létale 50 (LD50) des 6 souches virales étudiées, nous réduirons les effectifs des lots à 5 souris (5 lots par dose virale soit 150 souris infectées auxquelles il faut ajouter un groupe témoin de 5 souris soit 155 souris pour la première expérience). La détermination de la LD50 nous permettra de designer plus finement la seconde et de ne pas avoir à tester plusieurs charges virales infectieuses. Nous infecterons ainsi à une dose sous-létale nous permettant d’étudier la réponse inflammatoire. Pour cette seconde partie du projet, nous infecterons des lots de 20 souris, avec les 6 différents virus à tester (+ un groupe de 20 souris témoin recevant du PBS) soit une estimation à 140 souris. Le total de souris nécessaires pour le projet est donc de 295 souris.
Raffinement
Les animaux seront élevés en groupe sociaux dans des cages (5 animaux maximum dans une cage). Concernant l’enrichissement du milieu, nous ferons au mieux mais les conditions et contraintes de manipulation en animalerie de niveau 3 ne nous permettent pas un enrichissement équivalent à ce qui pourrait être mis en place en zone conventionnelle (confinement minimum). En effet, les souris sont en cages qui elles-mêmes sont dans un isolateur. Du papier absorbant sera ajouté pour enrichir le milieu. Nous pouvons voir pour mettre des aliments de récompense après leur manipulation. Pour l’administration des virus (par voie intranasale), les souris seront anesthésiées chimiquement par voie intrapéritonéale. L’état de santé des animaux fera l'objet d'une attention particulière, les souris seront surveillées tout au long de l’expérience et l'état pathologique sera évalué grâce à des critères stricts basés sur la perte de poids, et la température corporelle. En cas de perte de poids supérieure à 20% ou une température inférieure à 35°C, les animaux seront euthanasiés. Une grille de suvi clinique sera utilisée afin de suivre l’état général de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle d’infection grippale chez la souris permet de reproduire les mécanismes de la réponse inflammatoire que nous souhaitons étudier. Le modèle souris permet notamment d’étudier la dynamique de l’inflammation pulmonaire ainsi que l’afflux des cellules immunitaires au niveau des voies respiratoires. Le virus de la grippe induit une pathologie potentiellement mortelle chez la souris permettant l’étude du pouvoir pathogène des souches étudiées chez l’hôte mammifère donc par extrapolation chez l’Homme. Dans le cadre de cette étude, nous utiliserons des souris adultes âgées d’au moins 6 semaines.
Mise au point d’un modèle d’infection in vivo du virus de l’encéphalite à tiques par voie alimentaire et rôle du microbiote intestinal
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le virus de l'encéphalite à tiques, par voie alimentaire ou sous-cutanée, l'infection pouvant provoquer des troubles neurologiques, une perte de poids et la mort. Le porteur cherche à mettre au point un modèle d'infection alimentaire, en lien avec des cas humains liés à des fromages au lait cru, et double l'effectif "afin de répliquer l'expérience si nécessaire". Il affirme que l'étude "ne peut se faire que sur un modèle animal" et qu'il n'existe pas d'alternative.
Objectifs
Le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV) est un virus transmis principalement par la tique. TBEV est retrouvé en Europe et en Asie. Il existe une autre voie de contamination par TBEV : ingestion de produits laitiers non pasteurisés. Il est responsable, chez l’Homme, de l’encéphalite à tiques (TBE), une infection du système nerveux grave dont le taux de mortalité est d'environ 1 % et qui entraîne des séquelles graves chez 10 à 30 % des patients. Le nombre de cas de TBE en France est en constante augmentation depuis quelques années, avec notamment les premiers foyers dus à des fromages frais de chèvre contaminés survenus en 2020 (44 cas) et 2021(2 cas). L’infection par la piqûre de tique a été très étudiée et des modèles animaux d’infection sont déjà bien établis. Cependant, un manque de connaissances est observé sur l’ensemble des facteurs conduisant à l’apparition d’encéphalites suite à la consommation de produits laitiers crus contaminés. L’objectif global de notre projet est de mettre en place un modèle animal d’infection pour TBEV par la voie alimentaire dans le but d’identifier les facteurs pouvant influencer le pouvoir infectieux de TBEV lors d’une infection à la suite d’une ingestion de produits laitiers contaminés. Pour la mise en place de ce modèle d’infection, il est d’abord nécéssaire d’identifier la souche de souris qui répondra au mieux à nos interrogations (reproduire la maladie observée chez l’Homme). Pour aller plus loin, nous suivrons ensuite la progression au sein des tissus du virus à la suite d’une ingestion et nous comparerons cette progression avec celle observée à la suite d’une piqûre de tique. En effet, il a été observé que les symptômes neurologiques apparaissaient plus tôt lors d’une infection par la voie alimentaire et nous tenterons d’expliquer la raison en testant différentes hypothèses. Parmis les différentes hypothèses, l’implication de la flore intestinale de l’hôte et des composants chimiques et biochimiques des produits laitiers dans la virulence de TBEV est à investiguer.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de combler un manque de connaissances sur les facteurs impliqués dans l’apparition plus précoce d’encéphalites suite à l’ingestion de produits laitiers crus contaminés. Il permettra la mise en place d’un modèle animal d’infection pour TBEV par la voie alimentaire et d’investiguer le rôle de la flore intestinale et des composants chimiques et biologiques des produits laitiers dans la virulence de TBEV. Ce projet apportera des données permettant une prise de décision et l’instauration de mesures de prévention dans le cadre de la réglementation alimentaire sanitaire.
Procédures
Les souris seront infectées soit par la voie sous-cutanée soit par la voie alimentaire. Pour cela une contention de quelques secondes sera nécessaire (environ 30 secondes). Des prélèvements sanguins seront réalisés sur souris vigiles par des personnes formées à cette pratique. Le prélèvement sanguin ne dure que quelques secondes – manipulation de 30 secondes à 1 minute).
Impact sur les animaux
Les souris « contrôles positifs d’infection » peuvent ressentir de la douleur lors de l’injection du virus par la voie sous-cutanée. Un stress peut être induit lors de l’administration per os (contention). Les souris sont sensibles à l’infection par TBEV. Les signes cliniques décrits sont l’apparition de signes neurologiques (troubles de l’équilibre, motricité…), la perte de poids, l’inactivité et la mort. Les animaux seront contrôlés tous les jours.
Devenir
Dans le cadre de nos interrogations (multiplication et progression de TBEV dans les tissus,…), nous avons besoin, pour nos analyses, des organes des souris nécessitant la mise à mort de tous les animaux.
Remplacement
L’étude de l’infection de TBEV à la suite d’une contamination par la voie alimentaire ne peut se faire que sur un modèle animal. Il n’existe pas de modèle alternatif.
Réduction
Un total de 640 souris sera utilisé pour cette étude. L’infection expérimentale de souris par la voie alimentaire avec TBEV a très peu été étudiée (2 études jusqu’à ce jour), le nombre de souris a été doublé afin de nous permettre de répliquer l’expérience si nécessaire et de pouvoir faire face à tout aléa. Le nombre de souris par groupe est un compromis pour utiliser le moins de souris possible tout en ayant assez pour avoir des résultats robustes statistiquement.
Raffinement
Les souris seront plusieurs par cage (5/cage) avec un enrichissement de leur milieu (petite cabane, papier,..). Au cours de l’expérimentation, une surveillance quotidienne des souris sera mise en place. Un point limite adapté pour l’infection expérimentale de souris par TBEV a été défini.
Choix des espèces
Les souris (comparativement à d’autres modèles animaux) sont sensibles à l’infection par le virus de l’encéphalite à tiques (TBEV). Les rongeurs sont notamment impliqués dans le cycle de transmission naturel de TBEV. Les souris représentent donc le modèle idéal en laboratoire. Les souris auront entre 8 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire mature et d’être assez grosses pour permettre des prélèvements sanguins sans altération de leur état de santé.
Evaluation de l’efficacité d’une nouvelle approche de cellules T progéniteurs porteurs d’un récepteur chimérique (CAR-ProT cell) pour son activité contre une tumeur à cellules B
- Recherche appliquée
- Cancers
482 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie sont des souriceaux nouveau-nés soumis à des injections dans le foie pour caler le geste technique, avec une mortalité attendue, les autres reçoivent une greffe tumorale et des injections répétées sur plusieurs semaines. Le porteur teste des cellules progénitrices modifiées contre un lymphome, l'application clinique restant présentée comme un espoir à valider. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'obtient des globules blancs matures et que seule la xénogreffe le permet.
Objectifs
Une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les patients atteints de cancer consiste à prélever leurs globules blancs en les modifiant pour leur permettre de reconnaitre et de cibler des protéines présentes à la surface des cellules cancéreuses. Après réinjection aux patients, ces cellules modifiées sont ainsi capables de reconnaitre et de détruire spécifiquement les cellules cancéreuses. Elles représentent aujourd’hui un espoir dans le traitement de certaines leucémies réfractaires ou en rechute et ont considérablement amélioré le résultat global des patients. Cependant plusieurs obstacles restent à résoudre dans ce domaine. Tout d'abord, malgré un taux élevé de patients montrant une réponse complète à ce traitement par thérapie cellulaire, la rechute de la maladie reste un défi important avec des taux de survie sans progression inférieurs à 50 %. Après le traitement, la survie à 3 ans est de seulement 16,1 %. Plusieurs raisons expliquent cet échec à obtenir des rémissions durables. La perte précoce, la faible expansion et l'épuisement des cellules thérapeutiques modifiées, sont des facteurs d’échec importants. La reconstitution tardive des cellules immunitaires effectrices possédant une activité anti-tumorale après la thérapie cellulaire, représente un autre défi important. Cette immunodéficience augmente non seulement les risques de rechute, mais entraîne également un taux important d’infection post-greffe. Dans ce contexte, une stratégie d'implantation de cellules progénitrices pourrait contourner certains de ces principaux défis (disponibilité immédiate, expansion efficace et réponse antitumorale durable) en accélérant la reconstitution d'un thymus chez les patients. Le modèle animal développant une tumeur de lymphome, ainsi que l’efficacité des cellules thérapeutiques modifiées matures ont été validés précédemment. Dans le cadre de ce projet, nous allons évaluer l’effet thérapeutique des cellules progénitrices, en suivant notamment la régression des tumeurs, la maturation des cellules anti-cancéreuses et leur persistance in vivo.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de valider et justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant des cellules progénitrices, et donc d'une plateforme de développement de ces cellules à visée d'utilisation clinique. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. Cette stratégie pourrait offrir des réponses anti-cancéreuses durables et efficaces en contournant les obstacles majeurs reportés à ce jour dans le domaine des immunothérapies pour le cancer.
Procédures
Durant cette étude, nous procéderons à : - des injections intrahépatiques (1X; durée 5 sec); - des injections par voie sous-cutanée (1X/sem pendant 5 semaines; durée 5-10 sec); - des injections par voie intraveineuse (1 ou 2X selon la procédure; durée 2-3 minutes); - des injections par voie intrapéritonéale (6X/sem pendant 6 à 14 semaines selon la procédure; durée 5-10 sec); - des anesthésies sous isoflurane (1X/semaine, pendant 5 à 13 semaines selon la procédure; durée 20 min maximum ); - des prélèvements sanguins par ponction dans la veine temporale superficielle (1X ou 3X maximum selon la procédure; durée 2-3 min); - un prélèvement sanguin par ponction intracardiaque (1X, après euthanasie).
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Lors de la mise au point de la technique d’injection intra-hépatique, une perte du nombre d’animaux peut être attendue en raison du jeune âge des animaux, ainsi que du rejet de la mère après les manipulations. Par ailleurs, les cellules matures pourraient occasionner au long cours une réaction des globules blancs humains contre les tissus de souris. Cet effet peut être observé chez la souris immunodéficiente greffée depuis plus de six mois avec des cellules-souches sanguines humaines. Bien que cet effet soit moins attendu avec les cellules progénitrices grâce à leur maturation dans le thymus de la souris, et donc une tolérance contre les cellules murines, la durée de nos études ne dépassera pas six mois pour éviter cet éventuel effet indésirable. D'autre part, ce projet comprenant l’apparition de tumeurs, le bien-être des animaux sera surveillé de manière attentive. Le poids des animaux et la croissance tumorale suivie par imagerie seront ainsi enregistrés tout au long de l’étude. Enfin, des difficultés respiratoires peuvent apparaitre, signe de présence de cellules tumorales au niveau des poumons, ou de métastases.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever le sang en vue d'analyses post-mortem.
Remplacement
Toutes les étapes visant à améliorer la performance du produit de thérapie cellulaire ont été mises au point avec des expériences exclusivement in vitro et notamment des caractérisations du produit final par des méthodes de séquençage et d'analyse de populations cellulaires. Néanmoins il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’obtenir les globules blancs matures du point de vue fonctionnel. La seule méthode existante consiste en un système de co-culture des cellules-souches sanguines avec des cellules-souches nourricières . Bien que ce modèle permette d’obtenir des globules blancs exprimant les marqueurs de différenciation, les cellules n’atteignent pas la maturité fonctionnelle. Seule l’injection dans un modèle de xénogreffe permettra de répondre à ce point, modèle où le greffon provient d'une espèce différente du receveur, respectivement cellules d'origine humaine implantées dans un modèle de souris. Cette xénogreffe permettra la maturation et la différenciation complète des progéniteurs des globules blancs dans l’environnement du thymus de la souris. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique.
Réduction
La première étape de ce projet vise à acquérir le geste technique d’injection intra-hépatique chez le souriceau nouveau-né, notamment la reproductibilité du mode opératoire et l’inter-opérabilité, ainsi que le suivi de la survie des animaux. Nous utiliserons à cet effet 4 portées par stade post-natal, soit environ 152 souriceaux agés de 0 à 3 jours. Il n'y aura pas d'analyse statistique pour cette première étape de mise au point technique. La deuxième étape du projet consiste à injecter les cellules progénitrices et à valider leur effet thérapeutique dans un modèle de cancer . Le produit avec lequel nous envisageons d’effectuer les tests fonctionnels in vivo a été optimisé au préalable, augmentant ainsi la probabilité d’obtention de réponses favorables dès les premières séries d’expérimentations. Par ailleurs, le modèle animal choisi dans cette étude est un modèle murin immunodéficient, utilisé avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules-souches sanguines humaines. L’utilisation de ces souris nous permettra d’obtenir des résultats homogènes et de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental; nous utiliserons ainsi 6 souris par groupe et par condition. En utilisant des tests statistiques non paramétriques, selon le paramètre mesuré (croissance tumorale, poids des souris, analyse des globules blancs), nous réaliserons des études permettant de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en hébergement en cage individuelle ventilée et manipulés sous hotte par du personnel compétent pour éviter tout risque d’infection lié à leur immunodéficience. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux sera assurée, avec un suivi de leur poids et de la croissance tumorale. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes sont utilisées avec succès comme souris receveuses de greffe de cellules humaines. Cette lignée ne présente pas de phénotype dommageable. Le profond déficit immunitaire de ces souris permet la prise de greffe de cellules-souches sanguines humaines, et offre la possibilité d’étudier l’effet d’immunothérapies avec des cellules humaines dans un hôte murin. Ce modèle est notamment très utilisé pour tester l’efficacité anti-cancéreuse de globules blancs modifiés ou de leurs cellules progénitrices. Par ailleurs, le thymus de ces souris, tout comme celui des patients atteints de déficits immunitaires ou conditionnés pour recevoir une allogreffe de cellules-souches sanguines (greffon et hôte de même espèce), sont caractérisés par une atrophie majeure et une architecture altérée. Ces souris présentent donc un environment similaire à celui des patients. Nous utiliserons des souris nouveaux-nés (P0), permettant une bonne prise de greffe des cellules progénitrices. Nos précédentes études ont démontré que les cellules progénitrices pourraient se greffer dans le thymus sans conditionnement (irradiation ou chimiothérapie) chez les souriceaux nouveau-nés (0 à 3 jours post naissance). Une fois cette période passée, afin d’obtenir une prise de greffe dans le thymus, il faut irradier les animaux et co-administrer les cellules progénitrices modifiées avec les cellules souche hématopoïétiques.
Etude de l’accumulation tissulaire et de l’impact sur l’ativité mitochondriale et sur la composition des fibres musculaires d’un composé X en développement après administration chronique chez la souris adulte et chez la souris âgée
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration orale quotidienne pendant huit semaines et des pesées hebdomadaires, avec un risque de fausse route lors du gavage. Le porteur mesure l'accumulation musculaire d'un composé X pour le compte d'un client, un éventuel médicament contre la faiblesse musculaire restant renvoyé aux étapes suivantes. Il affirme qu'il n'existe "pas de modèle de substitution suffisamment prédictif" pour un traitement chronique chez l'animal entier.
Objectifs
Le présent projet constitue une étape préliminaire visant à étudier la capacité du composé X à s'accumuler au niveau tissulaire (et tout particulièrement au niveau musculaire) afin d'atteindre des quantités seuils nécessaires à son activité biologique. Il s'agit donc d'une étude d'accumulation tissulaire à long terme (56 jours d'administration). L'étude sera néanmoins optimisée par une analyse de la composition des fibres musculaires afin d'obtenir des premiers indices d'efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet constitue une phase préliminaire dans le développement du composé X visant, en premier lieu, à étudier la propriété pharmacocinétique d'accumulation tissulaire. Si ce paramètre s'avère satisfaisant, le développement du composé X sera poursuivi dans les étapes précliniques (efficacité et sécurité) et clinique. A terme, le composé X pourrait devenir un médicament visant à traiter la faiblesse musculaire chez l'adulte pathologique ou liée au vieillissement.
Procédures
Les animaux seront pesés une fois par semaine pendant 10 semaines. Ils recevront également des administrations quotidiennes par voie orale pendant 9 semaines (1 semaine pour les habituer à la voie d'administration et 8 semaines de traitement).
Impact sur les animaux
L'ensemble des traitements quotidiens par voie orale et les pesées hebdomadaires peuvent être source de nuisances pour les souris. En effet, ces procédures nécessitent une brève manipulation des animaux qui peut être source de stress. Par ailleurs, bien que cela soit extrêmement rare, les traitements par gavage sont susceptibles d'être source de fausses routes. Dans ce cas, l'animal concerné serait immédiatement euthanasié.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Les composés testés ont d'abord été développés à l'aide de méthodes sur cultures cellulaires (myocytes) et sur explants tissulaires (muscle gastrocnémien) afin de déterminer leur action sur l'activité mitochondriale. Des résultats positifs ayant été obtenus dans ce cadre, il est nécessaire de vérifier que les données restent cohérentes sur l'animal entier. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe pas de modèle de substitution suffisamment prédictif pour garantir une bonne accumulation tissulaire d’un composé dans le cadre d'un traitement chronique chez l'animal entier.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire et par notre client sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de réaliser les dosages tissulaires du composé X (4 animaux/groupe) et de réaliser par ailleurs les analyses relatives à l'activité mitochondriale et à la composition des fibres musculaires (5 animaux/groupe). Nous avons donc fixé à 9 le nombre d'animaux nécessaire pour chacun des groupes. Concernant les groupes constitués de souris âgées (21 mois à réception), nous avons ajouté 3 animaux supplémentaire par groupe afin de prendre en compte la mortalité naturelle attendue entre 21 et 23 mois d'âge. Le projet emploiera donc un total de 2 x 9 + 2 x 12 = 42 souris.
Raffinement
Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 par cage afin de leur permettre de maintenir une interaction sociale. Un enrichissement sera apporté sous forme de dômes en cartons et de matériel de nidification spécifiques pour rongeur de laboratoire. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie (buprénorphine) pour soulager la douleur le cas échéant.
Choix des espèces
La physiologie musculaire est bien documentée dans la littérature chez la souris c57Bl/6, ce qui permettra des comparaisons avec les résultats obtenus au cours de la présente étude. Par ailleurs, le client de l'étude a déjà obtenus des résultats préliminaires sur ce même modèle avec d'autres composés en développement et souhaite donc conserver le modèle à des fins de comparaison. La partie des animaux seront au stade jeune adulte (8 semaines) alors que l'autre sera au stade de souris âgées (21 mois). Ces stades de développement correspondent aux âges des population cibles du composé X en développement (jeune adulte pathologique ou sujets âgés).
Rôle de l’Angiopoiétine-like 4 (ANGPTL4) dans la fuite capillaire associée au syndrome de réponse inflammatoire systémique secondaire à un modèle de choc septique.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 360 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de LPS provoquant un choc septique, avec chute de pression, troubles de conscience puis coma, suivie d'échographies et de prélèvements intracardiaques. Le porteur étudie le rôle d'une protéine, l'ANGPTL4, dans la fuite capillaire, l'objectif d'un traitement pour les patients restant à long terme. Il indique que des études in vitro préalables ne reproduisent pas les voies physiologiques en jeu et conclut au recours "nécessaire" au modèle animal.
Objectifs
Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60% soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, nous avons identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier l’ANGIOPOÏETINE-LIKE 4 (ANGPTL4), cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Plusieurs données suggèrent un rôle protecteur de l’ANGPTL4 dans l’intégrité des vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept que la modulation de l’activité de l’ANGPTL4 permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique.
Bénéfices attendus
Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.
Procédures
Les animaux recevront chacun une injection en intra-péritonéal (IP) de LPS (d’une durée de moins d’une minute) puis d’ANGPTL4 qui se fera soit en IP de la façon précédemment décrite, soit en intraveineuse (au niveau caudal, procédure d’une durée d’environ 3 minutes), soit par minipompes (durée d’environ 10 minutes par souris pour l’implantation de cette dernière). Ensuite, une échographie (d'une durée totale de 20 minutes) suivie d’un prélèvement intracardiaque (typiquement 1 à 2 minutes) seront réalisés sur une partie des souris. Sur une autre partie, une mesure de la pression artérielle (également d’une durée de 20 minutes) sera réalisée. Enfin, une injection prophylactique d’antalgique (buprénorphine) sera réalisée systématiquement en IP en début d'expérimentation pour limiter la souffrance des animaux (durée de moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables liés à l'injection de lipopolysaccharides (LPS) sont les suivants : une baisse de la pression artérielle, insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience (endormissement puis coma).
Devenir
Mise à mort, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du SRIS. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et l’ANGPTL4 régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit à celui requis pour une validité statistique des résultats. Le nombre d’animaux nécessaires est calculé a priori. Le dimensionnement de notre étude a été réalisé grâce à un test de puissance.
Raffinement
À des doses modérées de LPS, le choc induit s’accompagne d’un effet analgésique, puis de troubles de conscience entraînant un coma, limitant l’inconfort des animaux. Cependant, les doses plus importantes utilisées ici peuvent davantage engendrer l’apparition de douleurs physiques et psychologiques entre l’injection de LPS et le stade de coma. Pour diminuer l’inconfort lié à cette phase précédent le coma, une antalgie prophylactique par une injection sous-cutanée (SC) de buprénorphine sera réalisée. Durant l’ensemble du projet, l’inconfort sera systématiquement dépisté par la « mouse grimace scale » toutes les 2h heures et complétée par le score validé par le comité éthique s’il est ≥ 2. Si ce score est ≥3 un traitement antalgique par buprénorphine sera administré par voie SC. Néanmoins, si malgré l’administration de buprénorphine, l’utilisation de tapis chauffants, l’enrichissement présent dans les cages et le suivi régulier des animaux, les expérimentateurs détectent une souffrance importante chez l’animal à l’issue d’une intervention comme les injections de LPS (en IP, en IV ou par le système de diffusion passive), les examens d’imagerie ou simplement dans le cadre du suivi (animal prostré, tremblant, isolé ou présentant une nécrose d’un membre ou une difficulté respiratoire), l’expérience sera interrompue par dislocation cervicale sous anesthésie profonde par isoflurane. Les animaux seront ainsi exclus de l’étude et rapportés dans un fichier spécifique. Concernant l’étude de survie, en plus des précautions prises ci-dessus, les animaux seront davantage surveillés (3 fois/jour). Enfin, les animaux sont élevés dans les conditions usuelles d’hébergement, en groupe, validées par la structure bien-être de l’animal au sein du centre de recherche agréé. Chaque chercheur demandeur du projet APAFIS est détenteur du niveau 1 d’expérimentation animale et du diplôme de chirurgie expérimentale.
Choix des espèces
Les souris ont été choisies car le protocole précis de SRIS (Syndrôme de Réponse Inflammatoire Systémique) au LPS est établi chez la souris et il permettrait la démonstration de la preuve génétique de l'implication de l’ANGPTL4 dans ce modèle. Ces expériences permettront de définir si l’ANGPTL4 peut être une nouvelle cible thérapeutique potentielle dans le traitement de la fuite capillaire au cours du SRIS chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris de 10 à 12 semaines, le modèle de SRIS étant bien défini dans la littérature pour ce stade de développement.
Détermination des effets thérapeutiques d’une molécule sur le syndrome de sécheresse oculaire
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
1170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une sécheresse oculaire est provoquée par mutation génétique ou par instillation quotidienne d'un conservateur allergène, puis des tests de douleur et des échographies sont menés, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique qu'aucun analgésique ne peut soulager cette douleur oculaire, c'est le paramètre évalué. Il présente les résultats obtenus chez le rat comme "très encourageants" et défend une molécule sous brevet.
Objectifs
La sècheresse oculaire (Dry Eye Disease ou DED) est l’un des premiers motifs de consultation en ophtalmologie. Sa prévalence varie de 5 à 35 % chez des sujets âgés de plus de 50 ans. Cette pathologie du segment antérieur de l’oeil est caractérisée par des sensations de douleur variables en intensité, allant du simple inconfort à une douleur oculaire prononcée. Les douleurs oculaires sont très difficiles à traiter et leurs mécanismes physiopathologiques demeurent peu connus. Nous avons récemment conçu une molécule qui induit la sécrétion d’eau à partir des glandes lacrymales. Une simple goutte de cette molécule dans les yeux de rats augmente la production de larmes pendant 24h au moins. Notre projet a pour but d’apporter la preuve de concept nécessaire pour proposer cette molécule comme thérapie de la sécheresse oculaire en recherchant 1) si la composition des larmes induites est équilibrée et stable au cours du temps et 2) si, en induisant cette sécrétion naturelle, la molécule prévient l’inflammation et réduit l’activation des nocicepteurs responsables de la douleur oculaire. Nous utiliserons deux modèles de souris complémentaires, validés pour l’étude du DED : l’un, pharmacologique, permettant d’étudier la mise en place et la progression du syndrome, et l’autre, génétique, présentant une anomalie des glandes lacrymales pouvant mimer une sécheresse oculaire modérée. Les effets de la molécule d’intérêt (sous brevet) seront analysés dans chaque modèle in vivo en utilisant différents tests (nociception, volume des larmes et aspect de la cornée) et post mortem par des techniques de biologie cellulaire et histologie. Cette étude chez l'animal est un prérequis pour évaluer de manière intégrée les conséquences d'un traitement du DED par notre molécule. Au total ce projet utilisera au maximum 1170 animaux dans le respect de la règle des 3R. Grâce à nos études préalables in vitro, nous avons déjà caractérisé le mode d'action de la molécule et ses effets (remplacement). Le recours aux séances d'habituation et à l'anesthésie gazeuse légère et rapide permet de limiter le stress des animaux (raffinement). Enfin, les prévisions obtenues avec l'utilisation de logiciels statistiques nous permet d'anticiper le nombre optimal d'animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles et nous réduirons en cours de projet ce nombre dès lors que nos résultats nous indiqueront que nos données sont suffisamment robustes (réduction).
Bénéfices attendus
La sécheresse oculaire est à l’origine d’une douleur oculaire chronique pouvant être accompagnée de troubles de la vision, de photoallodynie (sensibilité accrue à la lumière) et de dommages de la surface oculaire, et elle représente l’un des principaux motifs de consultation en ophtalmologie. C’est le plus important signe d’alerte en réaction à une inflammation ou à un traumatisme des structures du segment antérieur de l’oeil (cornée, conjonctive, sclère et structures uvéales). Elle affecte la qualité de la vie et près de 60 % des patients se déclarent gênés dans leurs activités quotidiennes. En outre, 80 % des patients qui souffrent de douleur oculaire ne l’estiment pas suffisamment prise en considération tant par leur entourage que par leur médecin. La douleur chronique oculaire est très difficile à traiter et les mécanismes physiopathologiques, de nature neurogène et/ou inflammatoire, demeurent de nos jours très mal connus. Les traitements actuels sont invasifs, peu efficaces et diminuent la qualité de vie des patients. De ce fait, la sécheresse oculaire est considérée comme un désert thérapeutique malgré son incidence grandissante liée au vieillissement global de la population, l’augmentation du recours à la chirurgie réfractive, l’usage des écrans et la pollution environnementale. La molécule que nous avons caractérisée représente donc une stratégie thérapeutique prometteuse: en effet, une expérience pilote menée sur le rat a montré clairement que l'administration de cette molécule permet de restaurer une production de larmes équivalente à celle des rats contrôles, ce qui nous permet d'envisager que cette molécule soulagera efficacement la sécheresse oculaire. Le protocole mené chez la souris sera similaire à celui utilisé chez le rat, à la simple différence que rats et souris sont caractérisés par des seuils de sensibilité légèrement différents mais très bien caractérisés que nous prendrons en compte. Les bénéfices suceptibles de découler de ce projet sont une avancée significative dans la prise en charge de la sécheresse oculaire et un premier pas vers la création du médicament et l'industrialisation de ce traitement.
Procédures
Un phénotype de sécheresse oculaire modérée sera induit chez les animaux soit génétiquement soit pharmacologiquement par administration quotidienne dans l'oeil pendant 7 jours d'un produit conservateur allergène. Chaque procédure dure 5 à 6 semaines. Le test d'évaluation de la gêne/douleur associée à la sécheresse oculaire dure environ 1h. Les tests de mesure du volume et de la stabilité des larmes et l'échographie Dopler seront réalisés sous anesthésie légère (15-20 minutes). Les groupes d'animaux étudiés subiront entre 1 et 4 fois fois la série de tests (avec une semaine d'intervalle entre chaque série de tests).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la sécheresse oculaire qui sera induite soit par le BAC (conservateur traditionnellement utilisé dans les gouttes pour les yeux et le nez chez l'homme et décrit pour induire une sensibilisation) soit par la mutation Tabby qui induit une réduction de la taille des glandes lacrymales et donc une réduction de la production de larmes. Ces deux modèles murins présentent donc une sécheresse oculaire d'intensité modérée. Cette sécheresse oculaire engendre potentiellement un inconfort voire une douleur (comme chez certains patients humains) qui ne pourront être soulagés par des analgésiques puisque c’est ce paramètre (et son soulagement) que nous évaluerons. Nos résultats pilotes obtenus sur le rat indiquent clairement que notre molécule soulage efficacement cet inconfort et nous laissent envisager des résultats très positifs pour ce projet puisque nous utiliserons le même protocole. Nous compenserons et limiterons l'inconfort et les nuisances infligées aux animaux par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Les effets du traitement seront évalués sur 28 jours puis les animaux seront mis à mort. Les animaux auront 3 mois lors de leur entrée en procédure. La durée des nuisances et effets indésirables auxquels ils seront exposés sera donc de 6 semaines maximum pour les souris BAC (habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, 1 semaine d'établissement du phénotype et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests) et de 4,5 mois pour les souris Tabby (à l'âge de 3 mois, habituation aux tests la semaine précédant le démarrage du protocole, et entre 1 et 4 semaines de traitement et de tests).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables ont permis de caractériser et de breveter la molécule d'intérêt, de déterminer sa structure et son mode d'action dans différentes cultures cellulaires sur le transport de chlore. De plus, nous avons établi une première collaboration qui nous a permis de montrer que l'administration de cette molécule dans l'oeil de rat wild-type induit la sécrétion naturelle de larmes et qu'elle restaure un volume normal de larmes dans un modèle de rats atteints de sécheresse oculaire. Ces résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet et sa prématuration pour développer et industrialiser la molécule comme stratégie thérapeutique novatrice. Cette phase de prématuration du projet exige maintenant un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant pour caractériser précisément et quantifier les effets de la molécule in vivo. Le syndrome de sécheresse oculaire est d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Son apparition et sa gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts (neuro-inflammation etc) et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro à ce stade du projet. Néanmoins, nous mènerons en parallèle des analyses protéomiques sur des cultures immortalisées de cellules de l'oeil.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs. Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus ne sera pas réalisée. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs et en particulier si les deux sexes donnent des résultats similaires. Les rares médicaments utilisés pour réduire la sécheresse oculaire sont peu efficaces et nécessitent des administrations quotidiennes répétées (3 à 6 fois), ce qui représente un inconvénient majeur pour les patients. Nous avons donc décidé d'administrer notre molécule 1 ou 2 fois par jour maximum, et d'évaluer son effet après 1 ou 2 applications. Cependant, l'effet après 1 application sera évalué en 1ere intention, l'effet après 2 applications étant évalué seulement si les résultats avec 1 application montrent une efficacité partielle. Si l'étude après 1 seule application donne les résultats escomptés, nous ne procèderons pas à l'analyse de 2 applications et le nombre d'animaux sera donc réduit de moitié. Au total, nous utiliserons 1170 animaux maximum.
Raffinement
Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests dans laquelle nous pouvons moduler l'intensité lumineuse et avec un équipement spécialement conçu pour la bonne réalisation des procédures. Ainsi, nous mettrons en place des séances d'habituation en amont de chaque test et nous réaliserons certains de ces tests sous anesthésie gazeuse légère. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant de mettre en oeuvre des points limites précoces et un arbre décisionnel: utilisation de solutions analgésiques oculaires en fonction de l'aspect de l'oeil (oeil fermé, sécrétions) et du comportement de l'animal (démangeaisons...) ou mise à mort en cas de souffrance. Les animaux seront hébergés avec un environnent enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Enfin, l'utilisation de l'imagerie par échographie-Dopler représente un avantage dans le respect de la règle des 3R et permet non seulement de réduire le nombre d'animaux mais de diminuer leur manipulation car c'est une technique non invasive et rapide sous anesthésie.
Choix des espèces
Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les deux modèles murins reproduisant le syndrome de l’œil sec (DED, Dry Eye Disease) sont des modèles validés et classiquement utilisés dans la littérature. Des animaux âgés de 3 à 5 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l'efficacité de notre molécule sur la physiologie oculaire en nous affranchissant de biais potentiels liés au vieillissement.