Recherche appliquée

1080 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou en profondeur, elles subissent des injections, des séances d'imagerie et une illumination laser de la tumeur sous anesthésies répétées, avant la mise à mort pour analyse des organes. Le porteur résume les bénéfices attendus au "développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer". Il affirme que la biodistribution ne s'obtient que sur l'animal, sans autre modèle possible.

Objectifs

La PDT (thérapie photodynamique) consiste à sensibiliser les tissus cancéreux à l’action de la lumière par l’injection préalable d’une molécule photosensibilisante préférentiellement captée et retenue dans les tumeurs cancéreuses. Après injection intraveineuse du photosensibilisant en soi inactif, celui-ci va être capté et fixé préférentiellement par les tumeurs cancéreuses pour des raisons diverses. Dans un deuxième temps, l’exposition de la tumeur à une lumière de type laser va provoquer une photo activation définie par le changement d’état des molécules chromophores induit par la lumière. La molécule excitée possède un excès d’énergie qu’elle va perdre rapidement et spontanément soit sous forme de chaleur, soit en émettant une fluorescence (photo diagnostic), soit enfin, en passant par un état intermédiaire dit «triplet» responsable des phénomènes de photosensibilisation. La cytotoxicité induite par la PDT est donc principalement le fait de phénomènes d’oxydation entraînant la dégradation des acides aminés, de certaines bases nucléiques et des lipides composant les membranes cellulaires et les mitochondries. La thérapie photodynamique est une méthode thérapeutique originale et séduisante ; après une période de doute, un renouveau apparaît grâce à l’apport de nouvelles technologies, notamment au niveau des sources de lumières laser plus accessibles sur le plan financier et technique et aussi par le développement actuel de nouvelles molécules photosensibilisantes plus adaptées aux différentes pathologies cancéreuses. Le but ici sera d'évaluer l'efficacité de plusieurs nouvelles nanoparticule PDT.

Bénéfices attendus

Développement de nouvelles nanoparticules PDT et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Dans le cadre du développement de tumeurs sous-cutanée, les animaux subiront des injections sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (1 fois, 2 minutes). Dans le cadre du développement de tumeurs orthotopiques, les animaux subiront des procédures chirurgicales d'implantations orthotopiques de cellules cancéreuses dans leur environnement, sous anti-douleurs et sous anesthésie gazeuse (1 fois, 10 minutes) puis des injections intrapéritonéales chaque semaine dans le cadre du suivi par bioluminescence (1 fois par semaine, 1 minute)suivi d'une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie (1fois par semaine, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie, les animaux subiront une injection IV sous anesthésie gazeuses (1 fois, 2 minutes) puis seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité PDT les animaux subiront une illumination de la tumeur sous anesthésie gazeuse (3 fois, 5 minutes).

Impact sur les animaux

Dans cette étude la principale nuisance attendue sera une exposition répétée à l'anesthésie gazeuse (pour l'implantation de tumeurs, pour l'imagerie et pour l'illumination des tumeurs). Certaines souris subiront une chirurgie pouvant également entrainer des nuisances (contrôlées grace à des antidouleurs). Ces souris auront également chaque semaine une injection intrapéritonéale.

Devenir

A l'issus des procédures 1 et 2, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en fluorescence invivo. A l'issus des procédures 3 et 4, les animaux sont mis à mort pour analyse des organes en histologique

Remplacement

Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés/particules à tester ainsi que le nombre de lignées de cellules. Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés afin d’obtenir des résultats significativement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. (test satistique utilisé : Mann and Whitney). De plus, comme expliqué dans le projet, si la bioditribution d'une nanoparticule n'est pas satisfaisante, nous ne la passeront à l'étape P2, ce qui permettera de réduire le nombre d'animaux réelement utile à l'étude.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales seront réalisées dans un établissement autorisé et en stricte conformité avec le comité local de protection des animaux, les lignes directrices de l'UE (directive 2010/63/UE) et le Comité national français (2010/63). Les animaux seront hébergés et surveillés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément. La conception et l’application des procédures expérimentales, le soin et l’hébergement des animaux seront effectuées par du personnel compétent et formé. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Les souris immunodéprimées permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. La souris est l’espèce la plus adaptée et la mieux décrite pour la mise en oeuvre de protocoles de thérapie in vivo. Les souris seront utilisées à 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale.

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras pendant quinze semaines, elles subissent un jeûne, un régime cétogène ou un gavage d'antidiabétique, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et des prélèvements sanguins répétés, avant l'euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur signale une hypoglycémie et une hypothermie possibles lors du jeûne. Il affirme travailler sur "l'animal entier" au motif qu'aucune méthode alternative ne peut mimer les voies métaboliques en jeu.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Ces maladies représentent la deuxième cause de transplantation de foie et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer la capacité de différentes traitements ou interventions nutritionnelles et pharmacologiques à diminuer l'obésité, le diabète et la stéatose hépatique et à en comprendre les mécanismes. Ainsi pour cette étude, des souris mâles et femelles seront nourries avec un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l'Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes interventions : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène, un traitement avec un anti-diabétique utilisé en clinique. Les effets de ces différentes interventions seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir les effets de différentes interventions sur la progression de l'obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2ème cause de transplantation de foie dans le monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime obésogène riche en graisses pendant 15 semaines. A l'issue de ces 15 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles ou pharmacologiques suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 4 semaines , un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 4 semaines, un traitement par gavage oral avec un anti-diabétique (inhibiteur du transporteur de glucose rénal SGLT2, 10 mg/kg/jour dans un volume maximum de 200 ul)) utilisé en clinique pendant 4 semaines, un régime standard pendant 4 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 4 semaines. Le gavage oral avec l'anti-diabétique durera moins de 30 sec (contention comprise) par animal et par jour. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Pour les tests de réponse au glucose (OGTT) et à l’insuline (ITT), des prélèvements d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stétaose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et d'insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale afin de réaliser des bilans sanguins et des analyses sur des prélèvements postmortem de différents tissus (foie, tissus adipeux brun et blanc) dans le but d'évaluer les effets des différentes interventions sur l'obésité, le diabète de type 2 et la stéatose.

Remplacement

Nous travaillons sur l’animal entier car les phénomènes biologiques étudiés (voies métaboliques) font intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d'hébergement : hébergement collectif (4 ou 5 animaux/cage) et environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans les cages afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l'expérimenteur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l'apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de véridier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l'évaluation des ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l'animal sera aussitôt retiré de l'étude.

Choix des espèces

L'utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet de mimer rapidement la pathologie étudiée grâce à l'utilisation de régimes obésogènes. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7 semaines d'âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l'individu adulte.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections, une greffe sous-cutanée de cellules de lymphome puis des injections intraveineuses d'immunoliposomes, avec un prélèvement sanguin. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre 1500 mm3 et provoquer une détresse de l'animal isolé. Il affirme qu'après une validation in vitro, le remplacement "n'est plus possible à ce stade" du projet préclinique.

Objectifs

Le Lymphome représente la moitié des cancers du sang, c’est un cancer des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération cancéreuse des cellules lymphocytaires matures. Le lymphome se caractérise par la prolifération excessive des lymphocytes au niveau des ganglions, du foie, de la rate, plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. Les principaux symptômes consistent donc en une augmentation de la taille des ganglions. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (liposomes) que nous avons validé dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines dans des souris immunodéficientes ou des greffes de cellules lymphomateuses murines dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec ces liposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de Lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels ou liposomes biologiques issus de la culture cellulaire des cellules de Lymphome) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des Lymphomes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des traitements par voie intra péritonéale (i.p.) 15 et 7 jours (J-15 et J-7) avant l’injection des tumeurs. Les animaux seront soumis à des transplantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) dans leur flanc. Une seule injection est prévue par souris, durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J+6, J+9, J+12, durée par injection de 5 secondes). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, durée de 1 minute) sera réalisé à J+15 jours après la greffe.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables causés durant les actes expérimentaux sont des injections intraveinales et intraperitonéales, des contentions des souris dans un tube de contention afin de prélever le sang, des coupures sur la veine caudale pour prélever le sang. Les animaux vont développer des cancers, avec une multiplication proliférative des cellules lymphomateuses au niveau de la zone d’injection du flanc de l’animal, jusqu’à 1500 mm3. Ce développement tumoral peut engendrer une détresse de l’animal qui peut se trouver isolé. L’ensemble de ces nuissances justifient la classe de sévérité des expérimentations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des expériences

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testé in vitro sur des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnelles sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possibles, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Les effectifs des souris seront déterminés et nos résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent plusieurs fois par jour à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Ces informations seront par ailleurs transmises au personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules Lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires établies et commercialisées. Trois jours après l’injection, les cellules lymphomateuses forment une boule qui peut être palpable au niveau du site de l’injection sous cutané. Ces études ne peuvent se réaliser que dans le modèle murin (A1, mus musculus). L’étude sur l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme est c’est ce modèle qui est choisi dans la littérature afin de réaliser des études précliniques sur les Lymphomes en général. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux.

104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses par une alimentation grasse, elles reçoivent un gavage quotidien puis le composé anti-obésité par gavage, et passent 72 heures en cages métaboliques en hébergement individuel. Le porteur reconnaît que l'isolement "peut induire une nuisance" chez ces animaux sociables, mais le juge "incontournable" et lié à la "nécessité" de mesurer les dépenses énergétiques. Il conclut que l'utilisation d'animaux devient "indispensable" faute de méthode de substitution, l'étude étant menée pour un client industriel.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de composés développés en tant que traitements anti-obésité sur le métabolisme énergétique chez la souris rendue obèse par une alimentation enrichie en graisse.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur les dépenses énergétiques, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les animaux recevront des administrations quotidiennes de véhicule par gavage pendant 7 jours avant traitement pour les habituer à la procédure d'administration. Le traitement en lui-même est aigu et donc limité à une seule administration, également par gavage. Le poids corporel des animaux sera mesuré 7 fois au cours de l'étude. Les animaux seront hébergés dans des cages équipées d'un système de mesure par calorimétrie indirecte pendant 72h (24h d'habituation suivies de 48h de mesure).

Impact sur les animaux

L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les souris qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer les dépenses énergétiques, l'activité locomotrice et la prise alimentaire individuels lors du passage dans les cages métaboliques. Si les animaux n’étaient isolés que pendant les mesures en cages métaboliques, cet isolement soudain pourraient induire un stress sur les animaux et perturber la validité des mesures. C’est pourquoi nous préférons isoler les animaux dès réception, et les laisser s’habituer à cet état pendant ls 14 jours que précèdent la mesure en cages métaboliques. Il est à noter que pour ces dernières, les méthodes d'enregistrement employées sont totalement non-invasives. Les traitements par voie orale et les mesures de poids corporel à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les organes prélevés (tissus adipeux, foie) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

Les composés testés par le client ont tout d'abord été développés sur la base d'une approche computationelle des données existantes sur les cibles d'intérêt (ici la thermogenèse adptative). Ces approches ont permis de développer des composés ciblant théoriquement la thermogéenèse adaptative. Dans un second temps, des données préliminaires ont été acquises par le client par le biais d'approches sur cultures cellulaires d'adipoytes et sur explants tissulaires. Ces travaux ont permis de mettre en évidence un impact des composés tests sur la thérmogénèse adaptative, notament par une forte activations du gène UCP-1. A ce stade de développement, l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques devient indispensable car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact global d’un composé sur les dépenses énergétiques, le poids corporel, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le fait de travailler avec des animaux préconditionnés par le fournisseur permet de limiter la variabilité du phénotype obtenu, les animaux livrés ayant tous répondus au régime (pas d'animaux résistants). Ceci permet de limiter les effectifs de chaque groupe (pas d'animaux résistants).

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisement l'impact du composé sur la prise alimentaire individuelle des animaux. Néanmoins, les animaux conserveront des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout de dômes en carton et de matériel de nidification spécifiques pour rongeurs. Les expérimentateurs en charge de la manipulation des animaux et des administrations orales sont rodés à ce type de pratique. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle de souris rendues obèse par une alimentation enrichie en graisse est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment employé dans les études précliniques de composés visant les troubles métaboliques. Ce modèle à pour avantage majeur de présenter une étiologie de la pathologie similaire à celle responsable de l'obésité chez l'humain.

50 moutons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une création d'infarctus par occlusion des artères coronaires, des séances d'imagerie, une ablation cardiaque par électroporation et des prises de sang répétées, avant l'euthanasie pour prélever le cœur. Les bénéfices annoncés pour les patients atteints de tachycardie ventriculaire, une procédure plus efficace et une meilleure qualité de vie, restent au conditionnel. Le porteur affirme que le remplacement "n'est actuellement pas possible" et présente un jumeau numérique en développement comme un remplacement futur.

Objectifs

La tachycardie ventriculaire est un trouble du rythme cardiaque complexe grave qui peut entraîner une mort subite. Dans la grande majorité des cas (>70%), les tachycardies ventriculaires surviennent dans un contexte d’infarctus du myocarde ancien. Le remodelage du tissu cardiaque suite à un infarctus permet la création d’hétérogénéités qui favorisent les tachycardies ventriculaires. L’ablation par cathéter de ces zones hétérogènes du cœur, est une thérapie qui peut significativement réduire les nombres de tachycardies ventriculaires des patients, en améliorant leur qualité de vie. Une nouvelle forme d’ablation, utilisant un champ électrique pulsé de haute amplitude appelée ablation par électroporation ou Pulsed Field Ablation (PFA), est une nouvelle technique de traitement pour obtenir une thérapie plus efficace, notamment si elle est combinée avec des techniques d’imagerie qui permettent d’avoir un modèle, trois dimensions du cœur du patients (jumeau numérique) pendant l’opération. Dans ce projet, nous souhaitons investiguer les effets et les propriétés de cette technique d’ablation dans un modèle animal ovin pathologique, avec l’assistance de jumeaux numériques. Les objectifs scientifiques sont les suivants : mieux caractériser les lésions de la technique innovante d’ablation PFA dans le tissu hétérogène du cœur en utilisant de techniques d’imagerie non invasive ; développer un modèle mathématique pour optimiser et personnaliser l'administration de la thérapie ; et l'inclure dans un logiciel de traitement d’images pour les procédures cliniques existantes, ce qui fournira un nouveau outil à la thérapie des patients.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’optimiser une technique d’ablation innovante (PFA) et de révéler des aspects importants de l'effet de cette technique sur les tissus d’intérêt du cœur (sur le modèle pathologique post infarctus développé). Il permettra un meilleur dosage de l’énergie d'électroporation et d’adapter le protocole en fonction de l’anatomie individuelle du cœur et de l’origine de la tachycardie ventriculaire. Le projet ouvrira également de nouvelles perspectives dans le domaine du traitement des images cardiaques en trois dimensions (jumeau numérique) grâce à cette première application pour la tachycardie ventriculaire. Cette technologie pourrait permettre de l’étendre à d’autres formes de maladies cardiaques. Autant de thèmes encore largement ignorés mais capitaux pour éviter les récidives et les interventions ultérieures sur les patients atteints de tachycardie ventriculaire. Les patients bénéficieront non seulement d’une procédure plus efficace et plus sûre, mais aussi d'une meilleure prise en charge pendant et après la procédure, avec une meilleure qualité de vie après le traitement. Ce travail permettra à cette technique d’ablation PFA de devenir progressivement le traitement de choix pour l’ablation des tachycardies ventriculaires.

Procédures

Les animaux utilisés subiront des interventions de création d’infarctus, d’imagerie et d’ablation par electroporation sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie anti-algique appropriée. La procédure de création d’infarctus (150 minutes) se déroule, sous guidance des rayons X, par occlusion progressive, sous surveillance, de deux ou trois branches des artères coronaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’infarctus (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et de dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, les séquences d’imagerie sont de type non-invasif, soit par IRM cardiaque et/ou une échocardiographie par sonde thoracique/transoeasophagienne et/ou par scanner cardiaque (environ 180 minutes). L’ablation par cathéter (90 minutess) est effectuée sous anesthésie et administration d’héparine pour prévenir la formation de caillots. Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des tachycardies ventriculaires. Une prise de sang avant (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) et 24 après l’ablation (animal vigile, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état inflammatoire (cytokine) et des dégâts subis par le tissu cardiaque (troponine). Apres 4-6 semaines de récupération, une imagerie (environ 180 minutes) et une cartographie de contact diagnostique (90 minutes) de suivi sont prévus pour évaluer les effets du protocole d’ablation par electroporation. Une prise de sang avant l’euthanasie (animal sous anesthésie générale, 30 secondes) de 5 ml nous permettra de mesure l’état final du contexte inflammatoire et du remodelage cardiaque.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables éventuels peuvent être liés aux anesthésies (hypothermie) réalisées aux différentes phases du projet notamment lors du réveil de l'animal (désorientation, apathie), ces effets disparaissent rapidement car les moyens nécessaires pour faciliter le réveil des animaux (lampe chauffante, molécules de réanimation par exemple si besoin) sont mis en place. Les examens d’imagerie (échocardiographie, IRM et cartographie de contact) sont effectués sous anesthésie générale et thérapie antalgique. La création de l’infarctus aura lieu durant la perfusion continue d’anti-arythmiques et de bétabloquant, dont le débit sera ajusté en fonction des signes cliniques observés sur le monitoring. Pendant l’ablation, notamment avec la PFA, on pourrait observer une paralysie temporaire du nerf phrénique ou du diaphragme, mais ces conditions n’empêchent pas la ventilation mécanique. En phase d’étude diagnostique pendant la cartographie de contact, des déclenchements de tachycardie ventriculaire et potentiellement débordants en fibrillations, seront traitées immédiatement par un défibrillateur toujours présent en salle. Des saignements mineurs peuvent avoir lieu aux sites d’introduction des cathéters pour la cartographie.

Devenir

Afin de prélever le cœur et effectuer des études ex vivo d’histologie et de microscanner, qui nous permettront de mieux comprendre la structure des cicatrices induites par l’infarctus et l’ablation, l'ensemble des animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Pour répondre aux questions d’ordre clinique, pour développer et optimiser la prise en charge des patients, des modèles animaux de pathologies humaines sont nécessaires. Le remplacement des animaux n’est actuellement pas possible. En effet, l'étude des mécanismes physiologiques complexes dans leur globalité nécessite d’avoir recours à un modèle animal et il n'existe pas à ce jour de modèle de modélisation numérique ou in vitro. Au cours des dernières années, un travail est en cours sur une technologie de traitement des images préopératoires permettant de construire un jumeau numérique du cœur sain et malade. En utilisant cet outil en clinique, nous évitons aujourd’hui d’utiliser des animaux pour l’optimisation des protocoles d’ablation. Ce projet permettra à terme d’obtenir un modèle numérique remplaçant l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Notre stratégie pour réduire le nombre d'animaux utilisés repose sur la création, dans notre modèle, de plusieurs cicatrices, ce qui nous permettra d’obtenir des sites d’ablation. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer la taille des lésions entre les groupes et pour définir la vulnérabilité à la tachycardie ventriculaire avant et après la thérapie. Cela nous donnera une idée de la variabilité individuelle liée à la structure du tissu et au remodelage du tissu cardiaque. Nous allons également minimiser les temps des différents examens, pour que nous puissions utiliser les mêmes animaux pour différentes techniques d’imagerie non invasive l'une après l'autre, notamment l’IRM ou l'échographie. Dans le meilleur des cas, cela nous permettra de diminuer jusqu’à 50% le nombre d’animaux nécessaires. En phase de création du modèle nous allons utiliser certains animaux comme leurs propres contrôles. Cette dernière stratégie nous permettra de ne pas inclure d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Au cours du projet, les animaux reçoivent un protocole analgésique approprié, ils sont sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et les constantes vitales sont suivies en permanence lors des opérations. Tout le nécessaire est mis en place pour leur prise en charge : opération réalisée par du personnel formé, anti-arythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire, défibrillateur disponible... Pendant la phase de suivi, l'animal est hébergé dans des locaux adaptés et les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce sont mise en place (groupe social notamment). Les animaux sont suivis quotidiennement par le personnel, qui peut intervenir rapidement. Le vétérinaire et le responsable du projet adapteront les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l'état de santé au point d'atteindre l'un des points limites sans qu'aucune action ne puisse permettre un retour à l'état basal alors le protocole sera interrompu.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme (mouton, porc, chèvre, chien), le mouton a été retenu car ce modèle est une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques, de plus le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ce modèle. Le mouton atteint la fin de son développement entre 1 et 2 ans, à ce stade de développement, l’organe d’intérêt de l’étude, à savoir le cœur aura donc une taille et une maturité nécessaire pour répondre aux objectifs du projet.

82 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une colite leur est provoquée par du dextran sulfate de sodium dans l'eau de boisson, avec un gavage quotidien pendant seize jours et un hébergement individuel de vingt-trois jours. Le porteur reconnaît que l'isolement constitue une nuisance pour ces animaux sociables, mais le juge "incontournable" pour mesurer la prise alimentaire. Toutes les souris sont tuées pour prélever le côlon, afin de tester quatre composés contre les inflammations chroniques de l'intestin.

Objectifs

Le présent projet vise à tester l'efficacité d'une série de 4 composés d'intérêt thérapeutique en développement préclinique et visant à traiter les inflammations chroniques de l'intestin (maladie de Crohn ou colite ulcérative).

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la colite, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.

Procédures

Les souris recevront une administration journalière par gavage pendant 16 jours (véhicule pendant 7 jours puis traitement pendant 9 jours). Hormis pour le groupe expérimental contrôle du modèle de colite, elles seront exposées à du Dextran sodium sulfate (DSS 3%) via leur eau de boisson. Les souris seront pesées deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant les 9 jours de traitement. Enfin, à l'issue de l'étude, les souris seront anesthésiées et mises à mort après anesthésie. Les souris seront hébergées individuellement pendant les 23 jours de l'étude.

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de colite. Le taus de DSS employé ici (3%) est de nature à induire une colite modérée chez la souris. L'hébergement individuel peut induire une nuisance chez les souris qui sont des animaux sociables, mais il s'avère incontournable de par la nécessité de mesurer la prise alimentaire individuelle qui est un des paramètres principaux de l'étude. L'ensemble des traitements par voie orale et les pesées quotidienne à l'état vigile peuvent être source de stress ou de nuisances.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur l’inflammation colique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats préliminaires obtenus lors d’études antérieures menées par le client. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Un total de 82 souris Balb/cJ sera utilisé, divisé en 5 groupes de 7 (groupe contrôle du modèle) ou 15 (autres groupes) animaux. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 7 animaux puisqu'il ne présente pas de colite, réduisant la variabilité des mesures réalisées.

Raffinement

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration de DSS chez la souris qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration) et à établir des points limites appropriés. Les animaux seront hébergés individuellement (du fait des mesures de prise alimentaire et des récoltes de matière fécale imposées par le protocole) et une enrichissement de leur environnement sera mis en place sous forme de briquette de bois spéciales pour rongeurs et de dômes en cartons.

Choix des espèces

Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration de DSS chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 5 semaines d'âge et les traitement débuterons à 7 semaine d'âge. Chez la femelle, cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.