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Etude pré-clinique de l’efficacité de la radiothérapie à faible dose associée à l’immunothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris reçoivent sous la peau une greffe de cellules tumorales, puis une ou deux séances d'irradiation à faible dose sur la tumeur et quatre injections dans l'abdomen, sur neuf jours, d'une immunothérapie anti-PD-L1 ou d'anticorps témoins. 800 souris immunocompétentes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tumeurs. Le projet cherche le meilleur schéma d'irradiation à associer à l'immunothérapie, une association qui "pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie" selon le porteur. Parmi les effets indésirables, il ne cite que ceux des injections et de l'irradiation, sans un mot sur la croissance des tumeurs, et annonce un "volume tumoral limite" sans en donner la valeur.
Objectifs
Il y a deux objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie.
Bénéfices attendus
Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.
Procédures
Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total.
Impact sur les animaux
Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grace à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirables de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.
Remplacement
Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.
Réduction
Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 32 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 800 souris au total. 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 800.
Raffinement
Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux seront mises en oeuvre. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapies s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Etude de l’efficacité de nouvelles thérapies combinatoires utilisant des anticorps bloquants anti-PD-1 chez la souris PD-1 humanisée.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des souris génétiquement humanisées pour le récepteur PD-1 reçoivent une inoculation de tumeur par voie sous-cutanée, intraveineuse ou chirurgicale, puis des injections répétées de traitement, pour évaluer de nouvelles combinaisons d'anticorps anti-PD-1 contre le cancer. Le porteur indique que les modèles orthotopiques, notamment pulmonaire, sont sévères et peuvent provoquer douleur, perte de poids et mobilité réduite. Il affirme que ces modèles permettent de valider l'effet des traitements à l'échelle de l'organisme avant un essai clinique.
Objectifs
Dans le but d’échapper au système immunitaire, les cellules tumorales créent un microenvironnement suppresseur pour inhiber la réponse des lymphocytes T via la voie PD-1/PD-L1. La molécule PD-L1 exprimée à la surface des cellules tumorales interagit avec son récepteur PD-1 exprimé à la surface des lymphocytes T et bloque leur capacité anti-tumorale. Pour réactiver la réponse immunitaire antitumorale, des anticorps thérapeutiques bloquants PD-1 (Pembrolizumab, Nivolumab) ou PD-L1 (Avelumab) ont été développés. Ces anticorps ont démontré une efficacité clinique impressionnante chez les patients atteints de mélanome ou de cancer du poumon et sont aujourd’hui utilisés comme première ligne de traitement. Malgré le succès de cette thérapie, seulement des sous-groupes de patients sont répondeurs. Il est donc nécessaire de tester de nouvelles cibles thérapeutiques et de les combiner avec des anti-PD-1/PD-L1 pour induire une réponse immunitaire anti-tumorale efficace. Au laboratoire, nous avons identifié des cibles capables d’améliorer l’effet des anticorps anti-PD1 sur la réponse immunitaire anti-tumorale. Pour simultanément cibler le récepteur PD-1 et les cibles que nous avons identifiées, nous avons généré de nouveaux formats d’anticorps dit « bispécifiques » en fusionnant un anticorps anti-PD-1 à ces cibles. L’objectif du projet est d’étudier l’effet thérapeutique de ces anticorps bispécifiques dans des modèles tumoraux murins : leucémie, cancer du pancréas, cancer du poumon et mélanome.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet en complément du projet pourrait permettre de développer et valider des traitements innovants efficaces contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toute ces évaluations pré-cliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, intraveineuse ou via intervention chirurgicale sous anesthésie (un modèle par animal). Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéale pour les traitements (environ 3 fois par semaine) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape #3 du projet, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L’induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques : -cancer du poumon : altération de la respiration (point-limite). Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si l'état de la tumeur se détériorent (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 1500mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanées sont considérés comme des procédures modérés. La durée de ces effets est dépendant du type d’expérimentation : - évaluation de l’effet thérapeutique du traitement (étape #2) : étude de la survie de la souris. Les effets indésirables seront présents jusqu’à la mise à mort de l’animal. Celle-ci intervient lors de l’accumulation de ses effets ou l’apparition d’un effet considéré grave (points-limites). - évaluation mécanistique des traitements (étape #3) : mis à mort de l’animal avant l’apparition de points limites (à la fin de la séquence thérapeutique) afin d’étudier l’impact des traitements sur le système immunitaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
Les traitements évalués lors de ce projet ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro chez l’homme sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de lignées cellulaires, PBMC humains frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris humanisée pour le récepteur PD-1 nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique chez l’homme.
Réduction
Ce projet nécessitera 1380 animaux au maximum. Ceci est une estimation haute qui sera surement réduite en fonction des résultats. Ce nombre d’animaux comprend la mise en place de six modèles au sein de notre laboratoire, ce qui est essentiel pour la suite des études et permet de générer à long terme un savoir-faire pour tous nos projets présents et futurs en cancérologie. Pas de tests statistiques seront nécessaires durant l’étape #0 et #1 du projet, le nombre d’animaux est donc réduit à 4 par condition. Idéalement, l’entrainement à la chirurgie du modèle du cancer du Pancréas (étape #0) sera effectué sur des souris recyclées de l’animalerie issue d’élevage (animaux surnuméraires ou issu du tri génétique ; pas de réutilisation d’animaux) afin de maitriser le geste. Autrement, les entrainements seront effectués sur des souris C57BL6 issues d’un élevage commercial. Au total, 156 animaux maximum sont estimés pour ces étapes de mise au point. Pour l’étape #2, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 960 animaux en considérant que six modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. En réalité, nous pensons avoir besoin que de 1 à 4 modèles. Pour l’étape #3, le nombre total d’animaux pour cette étape a été estimé à 264 animaux, en considérant que maximum quatre modèles tumoraux seront utilisés pour étudier les 4 types d’anticorps bispécifiques. Cette étude sera menée si et seulement si un effet thérapeutique a été observé à l’étape #2. Les étapes #2 et #3, un nombre de 5 souris sera utilisé pour le groupe contrôle et 7 souris seront utilisées pour les traitements. Ces étapes nécessitent des résultats statistiques pour démontrer l’efficacité du produit thérapeutique. Ce nombre d’animaux a été estimé par des tests statistiques d’échantillonnage. Dû à la variabilité de la prise tumorale et de l’effet de thérapeutique interindividuelle, ce nombre est nécessaire pour avoir une bonne reproductibilité et obtenir des résultats statistiquement fiables. L’étude statistique choisie est le test de Mann-Whitney (ou Wilcoxon si le nombre de groupes à comparer est de 2) qui repose sur l’analyse de données non paramétriques déterminée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 3 jours minimum pour les souris issues de l’élevage sur site et de 5 jours minimum pour les souris commerciales sera respectée avant inclusion dans des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress et l’inconfort, les animaux sont maintenus dans des cages ventilées dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté ainsi qu’un nombre maximum de 5 animaux/cage et un enrichissement frisottis pour s’enfouir et se cacher. Un enrichissement supplémentaire sera ajouté chez les mâles (dôme ou tunnel) afin de prévenir de potentielles agressions. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères, il sera isolé dans une cage individuelle avec deux enrichissements (frisottis + dôme/tunnel). Nous avons aussi mis en place une procédure non invasive pour visualiser par imagerie de bioluminescence la croissance de la tumeur. Cette technique nous permet d’exploiter au mieux les résultats et ce, sans souffrance pour l’animal. Le suivi des animaux sera quotidien une fois que le protocole est considéré comme sévère et la gestion de la douleur maîtrisée le plus adéquatement possible afin d’apporter les soins nécessaires le plus rapidement aux animaux. Comme décrit dans les paragraphes des procédures expérimentales ci-dessous, des analgésiques seront utilisés avant et après chirurgie. Pour limiter l’inconfort de l’anesthésie, les animaux seront anesthésiés dans une boîte à induction placée sur tapis chauffant. Enfin des points limites ont été mis en place afin de réagir rapidement en cas d’inefficacité des traitements ou de souffrance animale.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la lignée de souris PD-1 humain Knock In (hPD-1KI) dont le fond génétique C57BL/6 est une référence pour la recherche fondamentale/préclinique et pour lequel plusieurs modèles tumoraux ont été établi au sein du laboratoire (APAFIS15700) ou par la communauté scientifique. Ces souris hPD1KI exprimant la version humaine du gène PD-1 se développent normalement et présentent les mêmes fonctions immunitaires que les souris sauvages C57BL/6. Ce modèle est donc très relevant d’un point de vue clinique car nous pouvons tester directement les effets thérapeutiques et biologiques de nos traitements anti-PD-1 bispécifique humain dans des modèles de tumeurs sans passer par un anticorps substitutif ciblant la molécule PD-1 de souris. Des souris C57BL/6 pourront être utilisées pour mettre en place certains modèles tumoraux et maitriser la chirurgie associée. Des adultes de 6 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.
Etude des mécanismes d’invasivité des adénomes hypophysaires chez le rat et évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
32 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis trois séances d'IRM sous anesthésie et des prélèvements sanguins, pour étudier la propagation d'un adénome hypophysaire et tester un médicament candidat. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner une perte de poids et une altération de l'état général. Il affirme que le recours au modèle animal est "indispensable", des cultures cellulaires ayant servi en amont sans pouvoir le remplacer.
Objectifs
L’objectif de notre projet est double. Il d’agit d’une part de suivre l’évolution de ces tumeurs afin de les caractériser et de comprendre les mécanismes de propagations dans les tissus cérébraux. D’autre part, nous évaluerons également l’efficacité thérapeutique d’un médicament candidat (la Sitagliptine) sur la base de la taille de la tumeur mesurée de façon non invasive par IRM. En effet, parmi toutes les modalités d'imagerie permettant d'étudier de manière non invasive les tissus, l'IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) est l'une des plus prometteuses : elle est capable de fournir des images à haute résolution du cerveau, qui permettent ainsi une mesure précise des altérations des structures cérébrales et des tumeurs en elles-mêmes. Dans ce projet, un suivi longitudinal sera effectué par IRM, ce qui permettra de caractériser la vitesse de propagation des cellules tumorales à travers les tissus environnants et d’évaluer la sensibilité des différentes structures péri-hypophysaires. Afin d’étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la tumorigenèse hypophysaire et ceux à l’origine de l’invasion des structures cérébrales adjacentes par des cellules hypophysaires, nous souhaitons étudier le comportement de cellules hypophysaires sur-exprimant les gènes d’intérêt in vivo. L’utilisation de modèles animaux dans l’étude des mécanismes de dissémination tumorale est nécessaire pour reproduire au mieux le microenvironnement tumoral humain.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine de la survenue d’une tumeur hypophysaire et ceux à l’origine de sa propagation vers les structures cérébrales adjacentes. En plus des connaissances fondamentales sur la croissance tumorale de ce type de tumeurs, un des bénéfices majeurs du projet est l’évaluation de l’effet thérapeutique d’un médicament candidat. La substance active du médicament évalué ici est la Sitagliptine qui est déjà connue et commercialisée : elle est administrée à l'homme depuis longtemps sans effet secondaire significatif ainsi qu’à l’animal. A court terme, les résultats pourront être valorisés sous forme de publication scientifique qui bénéficieront à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant sur ce type de tumeurs cérébrales. A plus long terme, les connaissances acquises, en particulier sur le candidat médicament, permettront d’envisager son utilisation dans des études cliniques.
Procédures
Injection intra-hypophysaire de cellules tumorales (durée) Ce geste sera réalisé dans le laboratoire de l’équipe partenaire pour lequel une saisine a déjà été validée. Tous les animaux impliqués dans cette procédure ne subiront qu’une seule chirurgie au cours de leur vie. Caractérisation par IRM 14 jours après l’injection des cellules tumorales, les animaux seront imagés par IRM. Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane (3%) dans une boite à induction afin d’être positionnés dans le cadre stéréotaxique compatible avec l’IRM. Une fois positionné dans le cadre stéréotaxique, l’animal sera positionné dans l’aimant pour réaliser l’acquisition des images. 3 sessions d’IRM seront réalisées à J+14, J+28 et J+49 après injection des cellules tumorales. La durée totale de l’examen IRM est de 30min. Prélèvements à la veine saphène Les animaux seront anesthésiés à l’isoflurane pour effectuer le prélèvement de sang (durée) à la veine saphène. 3 sessions de prélèvements seront réalisées à J+10, J+35 et J+56 après injection des cellules tumorales. Traitement médicamenteux La moitié des animaux sera traitée par un médicament candidat luttant contre la propagation tumorale. Ce traitement sera administré quotidiennement par ajout dans l’eau de boisson et ce durant toute la durée de l’hébergement. Perfusion intracardiaque L’euthanasie interviendra à J+56 après injection des cellules tumorales ou du PBS (durée). Juste après le dernier examen IRM, et avant leur réveil, les animaux seront euthanasiés par administration de pentobarbital (Exagon 1ml/kg, soit 400mg/kg de pentobarbital) afin de préparer les tissus en vue d’utilisation pour des analyses post-mortem.
Impact sur les animaux
La nuisance principale attendue dans ce projet est liée à la croissance tumorale. En effet, la croissance des tumeurs hypophysaires est susceptible d’entrainer une perte de poids des animaux et une altération de l’état général. Pour prendre cela en compte, l’état des animaux sera surveillé quotidiennement et l’ensemble des signes associés au développement tumoral attendu chez les animaux sera surveillé de manière hebdomadaire. Concernant l’administration du médicament, nous n’attendons pas d’effet secondaire particulier car la substance active est déjà bien connue et a déjà été administrée à l’homme comme à l’animal sans effet secondaire notoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux pour l’étude du développement tumoral et pour l’étude d’un inhibiteur pharmacologique est indispensable. - Des cultures cellulaires ont également déjà été utilisées en parallèle pour étudier la migration et l’invasion des cellules traitées ou non par les inhibiteurs pharmacologiques ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. Seules les cibles ayant déjà prouvées leur efficacité sur des cultures cellulaires sont étudiées in vivo. - Seule l’utilisation de modèles animaux in vivo mimant le plus fidèlement le microenvironnement tumoral permettra d’étudier de manière spécifique le rôle des voix de signalisation étudiées dans la croissance tumorale et dans la migration des cellules tumorales vers les structures cérébrales adjacentes. - Seule l’utilisation de modèles animaux vivant permettra de confirmer le rôle inhibiteur des molécules sur la croissance tumorale et de mimer la maladie tumorale humaine.
Réduction
Dans une première étude, nous avons utilisé des groupes de 6 animaux par condition expérimentale. Nous avions estimé que c’était un nombre raisonnable au vue de la reproductibilité du modèle tumoral mis en place. Le nombre d’animaux par groupe avait été déterminé en utilisant un calcul de puissance statistique. Pour comparer les 2 groupes de rats (traités vs non-traités), nous avons utilisé un test non-paramétrique de Mann-Whitney. Dans le cas des mesures répétées (comparaison de la croissance tumorale ou du poids corporel dans le temps), des ANOVA à mesures répétées suivies des tests post-hoc adéquats ont été utilisés. Rétrospectivement, nous pouvons utiliser la différence observée lors de la première étude (N=6) pour améliorer le calcul de puissance statistique (logiciel G-Power et la formule de Cohen d = (M2 - M1) ⁄ SD, avec M1 et M2 les moyennes des volumes tumoraux des deux groupes et SD la déviation standard). Les études précédentes ont déterminé une moyenne de volume tumoraux, 0.1213 +/- 0.077 cm3 et 0.031 +/- 0.03 cm3 respectivement. Nous obtenons donc une valeur de d=1.52 selon la formule de Cohen. Avec un risque alpha de 5% et une puissance de 95%, nous obtenons N = 11 par groupe, soit 5 animaux supplémentaires par groupe. Afin de s’affranchir d’éventuelles pertes lors de la chirurgie, il est préférable d’ajouter 2 animaux par groupe soit N=13 par groupe.
Raffinement
Une acclimatation de 7 jours sera respectée à l’arrivée dans notre animalerie. Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées à leur taille (2 par cage, portoirs ventilés, environnement à température contrôlée, cycle diurne-nocturne de 12h, eau et nourriture fournies ad libitum). Un examen quotidien sera effectué par les zootechniciens, sous la supervision permanente du vétérinaire. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable et renouvelé à chaque changement de cage sera fourni, selon nos procédures standards. - Les examens IRM et les prélèvements de sang à la veine saphène seront réalisés sous anesthésie isoflurane avec soutien thermique et suivi de la fréquence respiratoires et de la température de l’animal. - Nous utilisons un scoring quotidien pour surveiller le,bien être animal. 5 composantes seront évaluées : apparence (qualité du poil, propreté des yeux et du nez), posture, mobilité, comportement et signes cliniques. Si necessaire nous demanderons conseil auprès de notre vétérinaire pour envisager la mise en place ou la poursuite d’un traitement analgésique Si un point limite est atteint l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Pour des raisons immunologiques, des rats seront utilisés pour l’injection des cellules hypophysaires de rats (GH3). L’apparition d’un phénotype tumoral chez les rates après injection de cellules GH3 a déjà été observée par le passé . Ce choix d’utiliser une injection dans l’hypophyse repose sur la création d’un modèle fidèle de tumeur hypophysaire mimant le microenvironnement tumoral et permettant d’étudier de manière plus spécifique l’envahissement des structures cérébrales adjacentes. Par ailleurs, les rats sont adaptés pour étudier le cerveau car leur petite taille permet de les examiner dans des scanners IRM performants. De plus, nous disposons d’une antenne IRM spécifique pour cerveau de rat, ce qui permet de diminuer le temps d’acquisition et donc les durées d’anesthésie des animaux. Tous les rats arriveront dans notre animalerie à l’âge de 9 semaines. La procédure expérimentale débutera après 1 semaine d’acclimatation. L'utilisation de rats au stade de 9 semaines correspond à la maturité sexuelle des animaux afin d'obtenir un environnement oestrogenique favorable au développement de la tumeur.
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris NSG immunodéficientes reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales humaines puis des injections hebdomadaires de lymphocytes T, une grosseur tumorale se développant dans le flanc. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, ou plus tôt si trois signes cliniques notables ou un signe sévère apparaissent. Le porteur reconnaît que davantage d'animaux par lot serait préférable statistiquement mais retient cinq souris pour des raisons éthiques, et affirme que les cellules tumorales se comportent différemment in vitro et in vivo.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers métastatiques, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer la tumeur. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie passive par transfert adoptif repose sur l’administration à un patient de cellules du système immunitaire reconnaissant un antigène tumoral spécifiquement exprimé par les cellules à éliminer. Des essais cliniques d’injection de lymphocytes ont déjà été réalisés et, s’ils ont montré une bonne tolérance, ils ont eu une efficacité anti-tumorale encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement des cancers, de nouvelles approches d’immunothérapie passive par transfert adoptif de différents types d’effecteurs lymphocytaires T anti-tumoraux. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, un modèle de développement de xénogreffes de cellules tumorales et d’administration d’effecteurs lymphocytaires T humains optimisés sera établi dans les souris immunodéficientes NOD-SCID-IL-2Rγ [NSG]. Compte-tenu de la diversité importante des cancers, les différentes stratégies thérapeutiques pourront être testées dans deux modèles de cancers humains hautement immunogènes : le mélanome et le cancer colorectal. Les effecteurs lymphocytaires T humains utilisés seront des : - lymphocytes T cytotoxiques spécifiques d'antigènes tumoraux. - lymphocytes T modifiés génétiquement pour inactiver l'expression des gènes codant pour des Immune Checkpoint (IC), dont les ligands sont exprimés par les cellules tumorales préalablement injectées.
Bénéfices attendus
En conclusion, l’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés par modification génétique visant à inactiver un ou plusieurs IC, dans le traitement des cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certains de ces IC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection sous-cutanée de 50µL de tampon PBS stérile (avec ou sans cellules) dans le flanc à J0 dans chaque procédure. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir de J7) en intraveineuse de 100µL de PBS stérile (avec sous sans cellules) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute. La procédure d’injection des cellules tumorales dans le flanc sera réalisée sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé pour induction puis 2%/air comprimé pour le maintien).
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrisèque à l’injection (piqûre) dans le flanc, de cellules dans un volume donné (50 à 100µL) de tampon phosphate salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie gazeuse. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc est attendu.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'homme du bénéfice thérapeutique de l’administration d’effecteurs immunitaires, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant l’immunothérapie anti-tumorale, il est établi que les cellules tumorales se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la lyse et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration de lymphocytes T injectés sur le site tumoral), et de définir les modalités optimales d’administration des effecteurs lymphocytaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris et les résultats seront analysés statistiquement par des tests de comparaison : test de Wilcoxon ou Mann -Whitney. D'un point de vue statistique, l'utilisation de plus d'animaux par lot semble préférable mais d'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé est réduit au minimum. Plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec enrichissement (frisottis et/ou dôme) et accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne s’il y a présence de signes cliniques notables (cf annexe « gestion de la douleur »)). De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort, après une anesthésie gazeuse à l’isoflurane (4%/air comprimé) par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie anti-tumorale, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients (évite le rejet de greffe) tels que les souris NSG qui sont dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation d'effecteurs T d'origine humaine. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-10 semaines) pour des raisons de maturité du développement squelettique et nerveux, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules tumorales et de lymphocytes T mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques (transfert clinique chez des patients adultes).
Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines virales en utilisant des souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque paire de souris reçoit deux injections d'antigène dans la patte, à douze jours d'intervalle, puis est tuée par dislocation cervicale deux jours plus tard pour prélever les ganglions poplités et en extraire les lymphocytes. Le porteur affirme qu'aucune méthode de remplacement n'existe pour obtenir des anticorps monoclonaux de souris et que les méthodes de prédiction informatique ne sont pas prouvées pour des antigènes complexes. Il retient la souris plutôt que le rat ou le lapin au motif d'un coût plus faible.
Objectifs
Le but des travaux est d’obtenir des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre des protéines virales de polyomavirus et coronavirus. Ces travaux permettent d’obtenir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus et potentiellement de développer des immunothérapie. Après une semaine d’acclimatation, les souris (2 souris/ antigène) seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution contenant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées). Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration sera réalisée. Les souris seront mises à mort 2 jours après la seconde injection et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes. Les souris seront utilisées par paires en fonction des besoins, une paire de souris permettant de réaliser des anticorps monoclonaux pour un antigène. Ainsi, nous prevoyons un total de 40 souris pour 20 antigènes sur la periode de validité de la saisine (5 ans).
Bénéfices attendus
Le projet vise à produire des anticorps monoclonaux dans le but d'avoir des réactifs immunologiques indispensables à l’étude de ces virus. De plus, dans le cas ou ces anticorps sont neutralisants, ils pourront par la suite servir au développement de nouvelles immunothérapies dans des pathologies liées aux Polyomavirus et aux coronavirus.
Procédures
Après une semaine d'acclimatation, les souris seront immunisées par voie intrapodale avec 50μl/patte de solution comportant 5 μg d’antigène et 2 μg de QuilA (Adjuvant de l'immunité permettant de renforcer l'immunogénicité des protéines injectées) Cette intervention dure environ 1 minute. Après 12 jours, une seconde injection avec la meme posologie et voie d'administration et la même durée d'intervention sera réalisée. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale 2 jours après la seconde injection (duré d'intervention inférieur à 1 minute) et les ganglions poplités seront récupérés afin d’en extraire les lymphocytes.
Impact sur les animaux
La seule douleur qui sera ressentie sera celle des inoculations par voie intrapodale (aiguilles 26G). L’adjuvant utilisé n’induit qu’une inflammation légère et le volume injecté n'est que de 50 μl/patte. Au vu de la durée de l'expérimentation et de sa nature, génération d'une réponse immunitaire, les animaux n'ont aucune raison rationnelle de developper un syndrome algique suite à l'injection, il n'existe donc pas de point limite strict liée à l'immunisation . Néanmoins, toute dégradation de l’état de santé des animaux (prostration, pelage hérissé) conduira à leur euthanasie au CO2.
Devenir
Les 40 souris (2/antigène) à J14 seront euthanasiées par dislocation cervicale et prélèvement des ganglions poplités.
Remplacement
Aucune méthode de remplacement n’existe pour l’obtention d’anticorps monoclonaux de souris, l’induction d’une réponse immunitaire in vivo est nécessaire pour l’obtention de ces réactifs. Les methodes informatiques par prédiction n'ont pas encore fait l'objet de preuve de concept pour des antigènes complexes comme des particules virales.
Réduction
Le nombre de souris utilisé (N=2/ antigène) est le nombre minimum de souris requis pour l’obtention d’anticorps monoclonaux, nombre suffisant de lymphocytes.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement physique des cages d'hébergement systématique (abris en plastique rouge transparent et papier absorbant) ainsi qu'un enrichissement social (2/cage)
Choix des espèces
La souris est actuellement l’espèce de référence pour la génération d’anticorps monoclonaux. Les autres espèces utilisables, rat et lapin, sont d’un coût plus élevé. 7 semaines (incluant semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance
Evaluation de l’activité anticancéreuse de nanomédicaments à base de vecteurs synthétiques biodégradables sur un modèle de greffe sous-cutanée de cellules tumorales
- Recherche appliquée
- Cancers
221 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souris nude immunodéprimées reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis des séances d'imagerie et des administrations hebdomadaires de traitement pendant trois semaines, la tumeur pouvant métastaser et provoquer des douleurs. Les animaux sont tués une fois un point limite atteint, dont un volume tumoral dépassant 1500 mm3. Le porteur affirme que la distribution et la toxicité d'un médicament doivent être analysées dans un "organisme entier" et que les systèmes 3D existants, dépourvus de vaisseaux, ne peuvent pas remplacer l'animal.
Objectifs
Le projet global de l’équipe est de fabriquer de nouvelles formulations galéniques injectables par voie sous cutanée (SC), de type nanoppolymères contenant des molécules à visée thérapeutique dans le domaine du cancer. La plupart des chimiothérapies anticancéreuses actuelles présentent une toxicité systémique importante limitant l’augmentation des doses administrées et donc les résultats thérapeutiques. Les nanomédicaments, qui incorporent des molécules médicamenteuses dans des véhicules de taille nanométrique (milliardième de mètre), représentent un espoir important pour le traitement de cette pathologie de par leur capacité à cibler des tissus ou des cellules malades. Afin de permettre aux patients en oncologie de s'injecter en autonomie par voie sous cutanée leur chimiothérapie (i.e., Paclitaxel, PTX), 6 nanopolymeres ont été développés et ont fait preuve de résultats prometteurs in vitro (cytotoxicité, injectabilité, diffusion sous cutanée, innocuité, relargage du PTX). Des études d’innocuité permettant de vérifier que ces nanopolymères n’ont pas d’effet toxiques au niveau du tissu sous-cutané, ainsi que des études de pharmacocinétiques permettant d’évaluer la biodisponibilité du principe actif dans le sang après injection SC ont également déjà démontré des résultats prometteurs. L'objectif de cette étude est alors de tester l’efficacité anti-tumorale de ces nouveaux polymères couplés au paclitaxel en comparaison au paclitaxel standard intra-veineux (IV), ainsi que leur biodégradabilité et leur toxicité éventuelle. La définition du schéma d'administration optimal sera guidé par un modèle mathématique de type PK/PD (pharmacocinétique/pharmacodynamique). Des études de biodistribution des nanopolymères pourront être menées en parallèle afin de notamment pouvoir expliquer le différentiel d'efficacité observé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendues sont la définition du nanopolymère et de son schéma d'administration optimaux, permettant l'administration sous cutanée du PTX chez le patient. Bien que ce projet soit effectué sur le cancer du sein, le PTX est indiqué dans bien d'autres types de cancer (bronchopulmonaires non à petites cellules, ovaire, sarcomes de Kaposi associés au sida) et donc ce nanopolymère pourra être bénéfique chez un grand nombre de patients.
Procédures
Greffe de cellules cancereuses murine sur animal anesthésié (1 greffe par animal), Imagerie sur animal anesthesié (1 fois par semaine par animal) Administration des traitements (1 fois par semaine pendant 3 semaines par animal)
Impact sur les animaux
Les animaux seront greffées de cancer du sein pouvant métastaser et donc engendred de la douleur. Les injections des tratitement se font par voie sous cutanée et et voie intraveineuse rétro orbitale, ainsi une douleur courte au site d'injection peut apparaitre. Les animaux seront anesthésiés à l'aide d'une cage à induction ce qui peut les stresser quelques minutes avant l'endormissement. La mesure quotidienne du volume tumoral sur animal vigile peut également être stressant pour l'animal.
Devenir
Pour les deux procédures, les animaux seront mis à mort une fois le point limite atteint.
Remplacement
Le développement de nouveau médicament nécessite la mise en place d’expérience chez l’animal car la distribution du médicament et sa toxicité éventuelle doivent être analysés dans un organisme entier pour tenir compte des mécanismes de défense et de métabolisation qui seront mis en place par l’organisme et qui ne peuvent pas être reproduit in vitro du fait de l’implication de nombreux systèmes biologiques (système immunitaire notamment). Il existe des systèmes 3D mais ils sont construits avec seulement deux/trois types de cellules et ils manquent de vaisseaux. Ils ne permettent pas de mimer l’extravasation des nanomédicaments et leur pénétration dans la masse tumorale. Seule une étude chez l’animal permettra de reproduire l’interaction des nanomédicaments avec les composants du sang, leur passage de la circulation vers les organes et la tumeur et ainsi d’évaluer leur efficacité thérapeutique.
Réduction
Le nombre de souris par groupe expérimental a été calculé avec un test de puissance pour s’affranchir des variations individuelles et pour garantir la validité statistique de l’étude (risque fixé à 5% et puissance à 80%). La variable de jugement principal est la taille de la tumeur avec une moyenne dans le groupe contrôle de 1.3 cm3 et dans les groupes traités de 0,9 cm3 avec un écart-type de 0,3. Le nombre a été évalué à 8 souris. Compte tenu du taux de prise de greffe qui est d’environ 80%, 20% d’animaux supplémentaires seront ajoutés à l’étude. L’analyse statistique des données sera effectuée avec un test Anova avec un post test «Bonferroni». Nous prenons comme controle uniquement les nanopolymères seuls à DMT et non à DMT et 15mg/kg. Notre projet comprend une étape de modélisation mathématique permettant de réduire le nombre de tests à effectuer pour définir les modalités d'administrations optimales. Les études de biodistribution sont faites par imagerie et sont donc longitudinales et non invasives.
Raffinement
Le bien être animal est respecté: - temps d'acclimatation de 10 jours avant toute procédure - souris hébergées en groupe - enrichissement des cages (dômes (Plast Hut) et cotons prédécoupés spécifiques/stériles (Cell Nest) (Fournisseur Safe), - prévention de la douleur(40 mg/kg/jour d'ibuprofène , réduction du stress (les manipulations telles que les administrations, biodistribution) seront conduites sous anesthésie générale et aucun stress ou souffrance particulière n’est attendue au cours des diverses étapes des tests) - définition des points limites et évaluation quotidienne (volume tumoral au-delà de 1500mm3, difficultés respiratoires importantes, prostration, atonie, défaut d'alimentation avec perte de poids supérieure à 15%, ou toute autre manifestation de comportement anormal)
Choix des espèces
Les médicaments, durant leur transport dans l’organisme, vont interagir avec les éléments du système immunitaire et être soumis à une métabolisation (hépatique, rénale, …) qui peut provoquer l’apparition de métabolites pouvant être plus ou moins actifs voire toxiques. Cette chaine de phénomènes complexes ne peut pas être modélisé ou mimée in vitro. Il est donc nécessaire de mener ces études sur des animaux vivants pour reproduire tous ces processus et évaluer la toxicité et la fraction de substance active qui arrive dans le sang. La plupart des études publiées dans la littérature concernant l’évaluation de nouveaux médicaments anticancéreux sont effectuées sur la souris. Nous utiliserons des souris nude athymiques pour la greffe de cellules tumorales humaines (SWISS nude nu/nu). Les souris nude étant dépourvues de réponse immunitaire T, elles seront dans l’incapacité de rejeter les cellules cancéreuses humaines qui seront implantées. Les données bibliographiques se réfèrent principalement à des études effectuées sur des souris de 4-6 semaines. L'utilisation d’animaux de cet âge permettra une comparaison plus aisée avec les données déjà publiées dans la littérature et permettra ainsi de mieux évaluer la performance de nos nanopolymères. De plus le cancer touche généralement une population adulte.
Etude d’un modèle murin de myélofibrose primitive
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
891 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Souris doubles mutantes prédisposées aux tumeurs à partir de six mois, elles subissent des prélèvements sanguins réguliers sous anesthésie, une irradiation létale suivie d'une greffe de moelle osseuse, ou des traitements par inhibiteurs, avant d'être mises à mort. Le projet étudie un modèle de myélofibrose primitive, une maladie du sang du sujet âgé. Le porteur indique n'avoir pas réalisé de calcul statistique du nombre d'animaux, l'ayant estimé d'après son expérience, et affirme qu'il faut replacer la cellule souche dans son contexte par le recours aux modèles murins.
Objectifs
La moelle osseuse, qui est la source de toutes les cellules sanguines, subit des défauts fonctionnels au cours du vieillissement, provoquant des maladies du sang comme la myélofibrose primitive (MFP). LA MFP se développe chez les personnes âgées et est caractérisée par une moelle osseuse défectueuse en raison de la présence anormale de fibres, un nombre anormal de cellules dans le sang et une splénomégalie. Dans 90% des cas, cette maladie résulte de mutations connues, alors que dans 10% des patients, l’origine de la maladie reste inconnue. Dans le cadre d’un précédent projet, nous avons développé un modèle de souris porteuses d'une double mutation (des gènes Cdkn2a et PLZF , Cf projet #5645 joint) basé sur nos travaux antérieurs ayant validé que PLZF (codé par le gène Zbtb16lu/lu ) est impliqué dans la régulation du vieillissement du système sanguin, et par ailleurs il est connu que les souris Cdkn2a-/- sont prédisposées à l’apparition de tumeurs. Ces dernières années, nous avons donc pu analyser le phénotype associé à cette double mutation et montré que les animaux doubles mutants présentaient une proportion très augmentée de néoplasmes sanguins ayant toutes les caractéristiques de la MFP. Il apparaît donc important maintenant d'étudier l'effet de la double mutation sur les différents acteurs de la maladie et de définir les voies de régulation altérées. Nous souhaitons pour cela étudier en détail les différents types de cellules sanguines ainsi que leurs altérations moléculaires et fonctionnelles.
Bénéfices attendus
Nous attendons des résultats de ce projet qu’ils révèlent de nouveaux acteurs dans le développement de la myélofibrose primitive, qui pourraient potentiellement être utilisés comme cibles thérapeutiques et / ou marqueurs de la production anormale de cellules sanguines dans cette maladie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins tous les 15 jours, sous anesthésie, le temps de la procédure. Les animaux receveurs de greffe seront soumis à une irradiation léthale et une transplantation de moelle osseuse . Les animaux de la procédure 3 seront soumis à des traitements inhibiteurs (durée 4 semaines, injections 3 fois / semaine)
Impact sur les animaux
Les principaux effets délétères attendus correspondent à l'apparition spontanée de tumeurs liée à la mutation Cdkn2a-/-. Nos souris Cdkn2a-/- et Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu sont donc prédisposées à l’apparition de tumeurs au delà de 6 mois d'âge. Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie. Lors des transferts adoptifs, l'irradiation et la greffe reconstitutive qui s'ensuit entraînent une période de fragilité immunitaire des animaux récipients, que nous compenserons par l'administration d'une antibiothérapie (amoxicilline fournie dans l'eau de boisson) maintenue sur une durée de deux semaines à 1 mois après la greffe. Lors des traitements par les inhibiteurs des potentiels candidats, nous prendrons soin de nous assurer de la bonne tolérance des animaux à ces drogues et d'optimiser les doses administrées.
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Le but du projet est de mieux comprendre les processus conduisant à certaines pathologies sanguines. Ces pathologies sont le fait de mécanismes propres aux cellules souches du système sanguin , mais aussi d'une communication avec des facteurs microenvironnementaux dans la moelle osseuse. Ces deux types de mécanismes sont entièrement imbriqués du fait d’un dialogue permanent entre les cellules sanguines et les cellules de soutien de la moelle. Il est donc nécessaire de replacer la cellule souche dans son contexte et d’avoir recours aux modèles murins. Cependant, dans la mesure du possible, nous testerons in vitro les inhibiteurs candidats retenus, en nous assurant au préalable de leur absence de toxicité aux doses recommandées dans la littérature sur des lignées cellulaires.
Réduction
Bien que le recours aux modèles murins soit rendu nécessaire par l’existence reconnue de mécanismes de régulation des cellules du sang par le microenvironnement, nous limiterons au maximum le nombre d'animaux. Pour cela, nous utiliserons les techniques novatrices d’analyses moléculaires à l’échelle de la cellule unique (largement optimisées et maîtrisées au sein du laboratoire) afin de pallier la problématique de l’hétérogénéité tumorale, et réduire ainsi le nombre d’animaux pour résoudre cette hétérogénéité. Par ailleurs, nos souches murines génétiquement altérées ont été «backcrossées» sur un fond pur afin d’atteindre un nombre de générations suffisant pour considérer que les animaux issus de ces croisements puissent être utilisés comme contrôles, ceci dans un souci de réduction. Nous avons estimé le nombre d’animaux à produire pour les 4 génotypes d’intérêt sur la base de notre expérience passée du modèle, c’est la raison pour laquelle nous n’avons pas réalisé de test statistique.
Raffinement
Le suivi du développement des pathologies se fera par des mesures cinétiques précoces et prédictives, notamment par le suivi des formules sanguines grâce aux appareils dédiés à l’hématologie vétérinaire disponibles au sein de l’animalerie, les prélèvements étant réalisés sous anesthésie. Les conditions d’hébergement respectent les besoins physiologiques et le bien-être des animaux. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvellement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). La nourriture et l’eau sont fournies ad libitum. Afin de respecter leur instinct grégaire, l’hébergement des animaux se fait en confinement en cages individuellement ventilées à raison de 3 à 5 souris par cage. L’environnement est enrichi à l’aide de coton, de lanières de papier utiles à la nidification, et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score spécifique de ces modèles de pathologie, avec mise en place si nécessaire d’une analgésie spécifique.
Choix des espèces
Bien que des formes ancestrales de systèmes sanguins aient été identifiées chez les Urochordés (Ciona Intestinalis), l’hématopoïèse donnant naissance à un système immunitaire adaptatif n’est présente que chez les vertébrés, parmi lesquels la souris est l'un des modèles génétiques les mieux caractérisés. La disponibilité des modèles souris dans l’étude des pathologies sanguines ainsi que notre expertise dans les outils développés chez cette espèce conduisent logiquement à l'utilisation de la souris comme le modèle le plus pertinent pour les expérimentations proposées. Toutes les expérimentations seront conduites chez des souris adultes: Les souris des 4 génotypes d'intérêt seront âgées de 6 à 12 mois, ce qui correspond à la fenêtre d'apparition des hémopathies dans notre modèle Cdkn2a-/- Zbtb16lu/lu. Les greffes par transfert adoptif s'effectuent sur des animaux receveurs C57BL6/J Ly5.1 agés de 8 à 10 semaines, qui correspond à une fenêtre optimale de prise de greffe.
Etude des seuils de toxicité (dose range finding) d’un nouveau candidat médicament chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
350 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer les seuils de toxicité d'un candidat médicament à doses croissantes. Ils reçoivent le produit par diverses voies, dont intrathécale, puis subissent des prélèvements de sang, d'urine, de liquide céphalo-rachidien et de moelle osseuse. Le champ structuré déclare les 350 animaux réutilisés, mais le porteur indique qu'ils pourront aussi être mis à mort pour prélèvement d'organes selon la demande du "donneur d'ordre". Il affirme que ces études de toxicité sont "indispensables" et que la proximité avec l'humain justifie le recours au primate.
Objectifs
Pour presque tous les types d’effets toxiques (organospécifiques, neuro-comportementaux, immunologiques, cancérogènes épigénétiques...), on estime généralement qu’il existe une dose ou une concentration en dessous de laquelle aucun effet indésirable ne se produit : il existe un seuil de toxicité. L’objectif est alors de d terminer la dose ou la concentration en dessous de laquelle la probabilité de survenue de l’effet critique sera en théorie nulle : la dose maximale sans effet nocif observable (DMSENO). Plus précisément, elle correspond à la dose la plus élevée pour laquelle aucune augmentation statistiquement (ou biologiquement) significative en fréquence ou en sévérité d’un effet nocif n'est observée dans un groupe exposé à la substance par rapport un groupe non exposé . L'objectif de ce projet est donc de tester différentes doses (en commençant par la plus faible puis en l'augmentant progressivement) d'un nouveau candidat médicament afin de déterminer la DMSENO. Les groupes de doses (un ou plusieurs animaux par dose) seront décalés dans le temps afin de pouvoir adapter la dose suivante en fonction des résultats du groupe précédent.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'évaluer la tolérance d'un candidat médicament après une à une exposition répétée ou non, de doses croissantes et d'estimer les marges de sécurité pour lesquelles aucun effet indésirable n'est observé. Ces marges de sécurité permettront par la suite de déterminer une dose initiale "sûre" pour la réalisation des essais cliniques chez l'Homme.
Procédures
Après une période d’acclimatation suffisante (15 jours minimum), les animaux recevront de façon répétée ou non la molécule d’intérêt, ou la combinaison de molécules, par voie entérale, parentérale, respiratoire, intra-articulaire ou intrathécale selon les recommandations du donneur d’ordre. Par exemple, pour une injection intraveineuse en bolus, l'animal pourra être contenu manuellement et pour une injection intraveineuse lente, l'animale sera contenu en siège. Pour d'autres types d'administration, les animaux pourront être sédatés ou anesthésiés. La méthode de contention dépendra aussi du poids de l’animal. Pour un animal de plus de 5 kg, une contention en siège sera priviligiée pour la sécurité du personnel. Les animaux seront entrainés à la méthode de contention Après chaque administration, des prélèvements sanguins seront effectuées pour l’étude des paramètres biologiques (hématologiques, biochimiques, immunologiques, de coagulation) de chaque animal afin de mettre en vidence une toxicité potentielle. Des prélèvements d’urine et de fécès pourront également survenir. Des prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) et de moelle osseuse (MO) sous anesthésie générale pourront galement être réalisés. Les volumes de sang, de LCR et de MO préleves et le temps de repos accordés aux animaux entre chaque prise seront en accord avec les recommandations éthiques.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables éventuels dépenderont de la molécule injectée et de la dose. Avant chaque étude, les effets indésirables seront discutés avec le client afin de mettre en place un suivi et un traitement adapté en cas d'apparition de signes indésirables.
Devenir
Les animaux seront réutilisés si le protocole le permet et si la fréquence et le volume des prélèvements ont respecté le pourcentage du volume sanguin circulant (VSC) ainsi qu'une période de repos. Le sort des animaux sera préalablement discutés avec la structure chargé du bien-être animal et approuvé par le vétérinaire. De plus, les animaux pourront être mis à mort pour récolte d'organes selon le protocole défini avec le donneur d'ordre.
Remplacement
Les études de toxicité in vivo chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de déterminer la toxicité de la molécule en fonction de la dose administrée et affine la connaissance des caractéristiques de l’effet principal et des effets indésirables éventuels. Les résultats de ces tests permettront ainsi d’ajuster la dose optimale à administrer chez l’Homme indispensable à la poursuite des essais réglementaires en clinique.
Réduction
Dans ce projet, les approches de dosage échelonnées ("en escalier": doses croissantes) permettent d'atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés. Une fois la première dose administrée à un faibe effectif, les observations sont ensuite notées et utilisées pour informer la dose suivante, qui peut être supérieure ou inférieure selon la nature des observations observées. Le nombre d'animaux dosés à chaque niveau doit être petit dans les études initiales (par exemple un ou deux de chaque sexe) avec des tailles de groupe augmenté une fois qu'une dose-réponse est établie.
Raffinement
Les animaux seront suivis individuellement et quotidiennement tout au long de l’ étude afin de détecter tout signe clinique de douleur ou de détresse (grille d' évaluation du bien-être). Comme les animaux ou groupes d'animaux seront injectés par groupes de dose (à savoir de la plus faible à la plus forte dose- administration en "escalier"), les données obtenues pour les premières doses serviront à affiner la dose suivante et le suivi clinique en fonction des signes cliniques observés. Des périodes de récupération suffisantes seront accordées aux animaux entre les prélevements ainsi qu’entre les administrations de la ou des molécule(s) étudiée(s). Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable de la procédure. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des volières conformes aux recommandations et bénéficieront du programme d’enrichissement défini par la structure du bien-être animal de l'installation, notamment la mise disposition de jouets dans les hébergements. Une rotation du matériel d’enrichissement, incluant une désinfection, sera organisée une fois par semaine pour éviter la lassitude et renouveler l’intérêt des animaux. Des friandises seront galement distribuées systématiquement en fin de journée aux animaux. De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendé par les manipulations. Dans le cas où les animaux feront l’objet d’une réutilisation, un avis vétérinaire sera obligatoire pour justifier du bon état de santé de l’animal. Il sera veillé à ce que la gravité des procédures expérimentales ne dépasse pas le stade modéré .
Choix des espèces
Le primate non humain (macaque cynomolgus) est choisi pour sa proximité phylogénétique avec l'Homme et du fait des similitudes des réponses immunitaires. Les molécules en développement étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinant. Il est donc légitime de penser que les résultats observés chez le primate non humain seront très utiles pour prédire les mêmes phénomènes physiologiques et comportementaux chez l’Homme. Le stade de deloppement des animaux (juvénile à adulte) ainsi que le sexe (mâle et/ou femelle) dépendra de la demande du donneur d'ordre et des objectifs des études.
Identification de nouveaux traitements pour le cancer de la prostate.
- Recherche appliquée
- Cancers
416 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant jusqu'à sévère. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, une castration chirurgicale et un traitement hormonal quotidien pendant trois semaines, puis sont euthanasiées. Le projet cherche de nouveaux traitements du cancer de la prostate résistant à la castration. Le porteur indique que les mâles hébergés ensemble peuvent se battre jusqu'à se blesser, et affirme que l'usage d'animaux est le "seul moyen" de répondre à ses questions, la culture cellulaire ne mimant pas la pathologie humaine.
Objectifs
Le cancer de la prostate se situe au troisième rang des décès par cancer chez les hommes en France, avec 8100 décès en 2018. La thérapie conventionnelle est la castration chimique par chimiothérapie, ou la castration chirurgicale, traitements de base pour les hommes atteints d'un cancer de la prostate avancé et très efficace. Cependant, la progression de la maladie vers un cancer métastatique et résistant à la thérapie conventionelle est inévitable. Ils sont alors traités par chimiothérapie. Nous avons identifié des nouvelles cibles impliquées dans la résistance. Nous souhaitons démontrer qu'un traitement visant ces nouvelles cibles en combinaison avec la chimiothérapie conventionelle favoriserait l'effet anti-tumoral et améliorerait la réponse au traitement.
Bénéfices attendus
Si notre nouveau traitement est efficace nous devrions observer une diminution de la taille de la tumeur chez les souris traitées, voire même une disparition complète de la tumeur. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre l’implication de ces nouvelles cibles dans la résistance au traitement du cancer de la prostate. A terme ce projet permettra de proposer une nouvelle ligne de traitement pour les cancers de la prostate résistant à la castration et ainsi augmentera les chances de survie des patients atteints de ce cancer.
Procédures
Les souris seront soumise à une greffe de cellules par injection sou cutanée (20 secondes /souris y compris contention), à une castration chirurgicale (10min/ souris y compris anesthésie). Elles seront traitées quotidiennement pendant 3 semaines par voie orale (10 secondes /souris y compris contention) ou par injection intrapéritonéale (5 secondes /souris y compris contention) avec une hormonothérapie.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les animaux sont la présence d'une masse tumorale, d'une chute hormonale et une possible perte de poids (mais pas obligatoire) d'une fatigue et d'une déshydratation suite à la chirurgie.
Devenir
A la suite de l'étude, les animaux seront euthanasiés car le traitement subi ne leur permettront pas d'intégrer d'autres études.
Remplacement
L’alternative possible à l’utilisation d’animaux est l’utilisation de cellules en culture, notamment la culture de cellules en 3D qui comprend plusieurs types cellulaires (comme les cellules tumorales avec les cellules immunitaires). Nous utilisons ce type de modèles au laboratoire, ce qui nous permet de réaliser beaucoup d’experimentations préliminaires sur ces cultures de cellules, et d’éviter, autant que nous le puissions, les experimentations in vivo. Cependant cette alternative ne permet pas de connaitre les effets de nos traitements sur un organisme complexe vivant, ni de mimer la pathologie existante chez l’homme. Ainsi l’utilisation d’animaux est le seul moyen de répondre aux questions scientifiques de notre projet sur le cancer de la prostate résistant à la castration.
Réduction
Les biostatisticiens nous conseillent de travailler avec 8 à 10 animaux. Ce nombre d’animaux par groupe ne doit pas être vue comme une augmentation de la quantité d’animaux nécessaires, mais au contraire comme une réduction, car si l’expérience est concluante, les données statistiques seront solides, et donc il n’y aura pas la nécessité de reproduire l’expérience.
Raffinement
Les mesures destinées à réduire la contrainte, la souffrance et l’angoisse des animaux prévus sont: -Contact social: Le contact social entre congénère constitue la meilleure stimulation. L’hébergement par groupe de 4 ou 5 animaux par cage sera effectué. Il faut savoir que notre projet necessite l’utilisation de males (cancer de la prostate) il pourra donc arriver que les animaux se battent jusqu’à se blesser. Nous devrons donc les séparer si tel est le cas. - Contact humain: Les animaux seront visités tous les jours, et seront manipulés avec précaution lors des traitements et du changement des cages. - La présence de coton ou « petites maisons » afin de créer un enrichissement de l’hébergement. - Les souris seront hébergées en zone SOPF, cette zone permet au statut dommageable de ne pas apparaitre - Le milieu sera enrichi à l’aide de litière (sciure de peuplier dépoussiérée) mélangée à des copeaux et de matériel de nidification (coton compactée) et des rouleaux pour se cacher. Les mesures destinées à réduire la douleur mises en place sont : - Un suivit quotidien afin de surveiller l’état général des animaux. - L’administration d’analgésiques afin de soulager la douleur. - Une anesthésie générale par inhalation d’isoflurane avec une injection d'analgesique sera nécessaire lors de la castration.
Choix des espèces
Les souris sont le meilleur modèle représentatif de l’homme pour ce type d’expérience, et le moins onéreux. Nous utilisons des souris agées d'au moins 7 semaines pour qu'elles soient sexuellment mature. Nous utilisons des souris immunodépripmées afin d'éviter le rejet de la greffe de cellules tumoarles humaine.
Evaluation de nouvelles thérapies et étude des mécanismes de progression des tumeurs du foie dans un modèle murin immunocompétent
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans le foie par chirurgie ou sous la peau, parfois un traitement par injection ou par plasma froid, un suivi par imagerie sous anesthésie, puis sont euthanasiées pour prélèvements. Le projet cherche à évaluer de nouvelles thérapies contre le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome. Le porteur affirme qu'on ne peut recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier" et retient des souris immunocompétentes pour préserver le microenvironnement immunitaire.
Objectifs
Les cancers primitifs du foie (carcinome hépatocellulaire et cholangiocarcinome) représentent 7000 et 2000 nouveaux cas par an en France. Ce sont deux tumeurs de très mauvais pronostic. Les traitements curatifs (ablation de la tumeur, transplantation du foie) ne peuvent être proposés qu'à un nombre restreint de patients (40%). Cependant, l'efficacité des traitements curatifs est grevée par la récidive tumorale liée à la dissémination métastatique ou à l’émergence d’une nouvelle tumeur si le foie malade cirrhotique est laissé en place. Il n'existe pas de traitement de prévention de la récidive. Les patients ayant un CHC non opérable bénéficient depuis 2008 d'un traitement systémique palliatif, le sorafenib, mais son efficacité est limitée et l'émergence de résistances est rapidement objectivée. Aucun traitement palliatif montrant un bénéfice sur la survie ne peut être proposé aux patients ayant un cholangiocarcinome non opérable. Dans ce contexte, la recherche que nous menons a pour objectif de caractériser et quantifier l’activité de nouvelles thérapies (médicaments, traitement physique) pour le traitement des tumeurs hépatiques et de poursuivre les études dans des modèles précliniques. La preuve d’activité/efficacité anti-tumorale des nouvelles thérapies sera faite au préalable in vitro sur des lignées humaines de carcinome hépatocellulaire ou de cholangiocarcinome. Des évaluations seront ensuite conduites in vivo dans un nouveau modèle que nous souhaitons développer (fait l’objet de la présente demande), greffes syngéniques (orthotopique) et ectopiques (sous la peau). Cependant, certaines thérapies pourraient s'avérer aussi efficaces pour limiter la dissémination métastatique et le modèle de xénogreffe sous-cutanée ou orthotopique chez la souris immunodéprimée ne permet d'étudier cet aspect car la composante immunitaire est essentielle à la progression tumorale et conditionne la réponse aux traitements. Dans ces modèles, nous étudierons les traitements pour lesquels nous aurons montré au préalable in vitro un effet sur les capacités proliférative/migratoires et invasives des cellules cancéreuses. Afin que le bien-être animal soit au mieux respecté, des critères précis d’interruption du protocole seront définis.
Bénéfices attendus
Le carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome sont des tumeurs primitives du foie de mauvais pronostic pour lesquelles il n’existe que très peu d’options thérapeutiques systémiques et locales. Ce projet a pour objectif d’améliorer les thérapies existantes et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans le traitement des tumeurs hépatiques.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront soumis à différents gestes techniques liés à la mise en place des modèles de carcinome hépatocellulaire et le cholangiocarcinome et à leurs traitements. Pour cela, les animaux seront soumis dans un premier temps à une greffe de cellules tumorales orthotopique (cellule transplanté au niveau de l’organe cible par chirurgie sous anesthésie et analgésie) ou ectopique (injection sous-cutanée sur animal vigile). Une partie des animaux sera ensuite impliquée dans différents traitements seul ou en combinaison : injection intra-péritonéale ou plasma froid atmosphérique sous anesthésie. Les animaux seront suivis de manière longitudinale par imagerie non invasive effectuée sous anesthésie générale pour suivre la croissance tumorale. Enfin, les animaux seront euthanasiés en vue des différents prélèvements nécessaires aux analyses Tout au long du projet, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie où point limites. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Impact sur les animaux
La principale contrainte concerne le développement tumoral intrinsèquement lié à la question scientifique du présent projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés au développement tumoral avec de possible effets secondaires mais qui restent très limité. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement afin de détecter toute anomalie. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (analgésique, soins, etc.) et la SBEA et/ou le vétérinaire pourront être sollicité, le cas échéant.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet (n=576) seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses ultérieures.
Remplacement
Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement et l’évaluation de thérapies innovantes anti-cancers. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Nous souhaitons pour nos études développer un modèle de greffe syngénique (de même espèce, c.-à-d. injection de cellules de souris tumorales chez des souris immunocompétentes) i/ orthotopique (dans le foie) et ii/ ectopique (sous la peau). L’utilisation d’un modèle murin de greffes de cellules cancéreuses du foie de souris (même espèce) se justifie à double titre : tout d’abord, il permet de recréer au plus près l’environnement dans lequel prolifèrent les cellules tumorales, en particulier le microenvironnement immunitaire. Deuxièmement (concerne le modèle orthotopique), il permet d’analyser la capacité des cellules tumorales à métastaser et d’étudier l’efficacité des thérapies sur la dissémination métastatique.
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 576 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.).
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Nous travaillons avec des souris immunocompétentes afin de préserver le microenvironnement immunitaire et car ces animaux constituent des modèles validés pour l’étude de la progression tumorale et tester de nouveaux traitements. Description du ou des modèle(s) : Les lignées murines de cancer du foie dont sont issues de tumeurs de souris C57BL/6j. Nous utiliserons donc des souris de même fond génétique commerciales ou transgéniques pour nos gènes d’intérêt. Justification des stades/sexe : Des animaux de sexe femelle ou mâle seront utilisés entre 6 et 8 semaines d’âge. A cet âge, les souris sont jeunes et la croissance tumorale est optimale, et ce quel que soit le sexe. Dans le cadre de ce projet nous utiliserons indifféremment des femelles ou des males afin d’avoir une représentation du genre dans nos expériences. Quel que soit le sexe, la croissance tumorale est similaire.
Immunothérapie anti-Galectine 9 dans le cancer du sein triple négatif: preuve de concept chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée à partir de cellules cancéreuses, puis elles reçoivent jusqu'à huit injections d'un anticorps, avant mise à mort au plus tard trente jours après. Le porteur décrit une perte de poids et des difficultés respiratoires possibles liées au développement de métastases. Il annonce espérer démontrer l'efficacité d'une immunothérapie et juge le modèle animal seul capable de reproduire ces mécanismes tumoraux.
Objectifs
Un des cancers du sein les plus agressifs, qui représente 15 à 20% des cancers du sein, présente un taux élevé de rechute. L’absence de thérapies spécifiques le rende difficile à traiter. Nos données montrent que les cellules de cancer du sein triple négatif résistant à une irradiation présentent de façon plus abondante une protéine particulière appelée Gal9. Cette protéine pourrait servir de cible thérapeutique pour lutter plus efficacement contre cette maladie. L’objectif scientifique de ce projet est de tester l’efficacité thérapeutique d’un anticorps ciblant Gal9 dans un modèle de cancer du sein triple négatif chez la souris. Notre projet consistera dans un premier temps à faire pousser des tumeurs à partir de cellules irradiées in vitro. Les cellules seront irradiées puis injectées dans la glande amammaire. La croissance des tumeurs sera suivie et comparée à des tumeurs issues de cellules non irradiées. La deuxième phase de notre projet dépendra de l’efficacité de notre première procédure. Elle consistera à injecter des cellules irradiées ou non irradiées à des souris et de traiter immédiatement ces souris avec un anticorps ciblant Gal9. Ce traitement devrait permettre de minimiser le développement du cancer, en particulier chez les souris dont les tumeurs expriment fortement Gal9.
Bénéfices attendus
Nous espérons démontrer l'efficacité d'une thérapie ciblant Gal9 dans ce cancer particulièrement agressif. Les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif et soumises à de la radiothérapie pourraient être particulièrement éligibles à cette thérapie.
Procédures
1 Injection sous-cutanées sous anesthésie gazeuse (10 minutes) Injections intra-péritonéales sur animaux vigiles (jusqu’à 8, à raison de 2 par semaine)
Impact sur les animaux
Le développement des tumeurs pourrait s'accompagner d'une perte de poids en plus d'une gêne physique pour les animaux. Des effets indésirables liés à la présence de métastases sont envisageables ; ils se traduiraient par des difficultés respiratoires plus ou moins prononcées. La grille de points limites que nous proposons permettra de tenir compte de ces potentiels effets indésirables. En ce qui concerne l'injection d'anticorps anti-(gal9), plusieurs papiers ont déjà été publiés à ce sujet et ne montrent pas d'effets indésirables particuliers.
Devenir
Les animaux seront systématiquement mis à mort à la fin de chaque procédure, au maximum 30 jours après le début du traitement. Les raisons sont les suivantes: - le score maximum de points limites sera atteint, - les souris n'auront pas de tumeur primaire mais seront susceptibles d'avoir développé des métastases pulmonaires - les souris auront bien répondu à l’immunothérapie et l’analyse des réponses immuno-inflammatoires sera nécessaire pour l'expliquer.
Remplacement
Nous avons accumulé de nombreuses expériences sur modèles cellulaires mais nous devons maintenant tester l’utilité de notre traitement sur l’animal puisqu’il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes complexes impliqués dans le développement tumoral et les réponses immunitaires associées.
Réduction
Un test statistique adapté a été utilisé pour calculer le nombre nécéssaire et suffisant de souris. Pour chaque condition expérimentale, un nombre de 10 souris par groupe pour un total de 70 souris.
Raffinement
L’état général des souris sera contrôlé visuellement quotidiennement en ouvrant chaque cage. Les tumeurs seront mesurées tous les 2 jours (lundi au vendredi). La grille sera également utilisée tous les 2 jours. La souffrance des animaux ne devrait pas dépasser un niveau de contrainte équivalent à l’introduction d’une aiguille. Cependant, une grille d’évaluation de la douleur, adaptée à ce projet, a été élaborée pour surveiller l’état général de l’animal, son apparence et son comportement, révélateurs du niveau de douleur. En cas d’atteinte d’un niveau défini de points limites, la mise à mort de l’animal sera anticipée.
Choix des espèces
Ce projet s’inscrit dans la continuité d’études réalisée dans des modèles développés in vitro et vise à valider la pertinence de notre travail dans le cancer du sein triple négatif. Il est essentiel de tester la pertinence de notre cible thérapeurique dans un modèle beaucoup plus complexe que des cultures cellulaires et de tester son action anti-cancéreuse. La souris est une espèce qui permet de récapituler assez fidèlement les étapes du développement du cancer du sein en intégrant les réponses des cellules de l'immunité observées chez l'humain. Le cancer mammaire est majoritairement présent chez l'adulte. Pour cette raison, nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines.