Cancers

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes sous-cutanées de cellules tumorales prostatiques, une partie subit une ablation des testicules, puis des injections quotidiennes de deux médicaments pendant vingt-huit jours et des gavages, avant la mise à mort au point limite ou pour prélever tumeur et organes. Le porteur reconnaît que le gavage comporte un risque de perforation de l'œsophage et de détresse respiratoire, et que les tumeurs peuvent devenir douloureuses. Il décrit des travaux préalables in silico et in vitro mais affirme être "contraint" de recourir à la souris, aucun système in vitro ne reproduisant selon lui la récidive tumorale après castration.

Objectifs

Le cancer de la prostate est le cancer le plus diagnostiqué chez les hommes en France et le second en termes de mortalité par cancer. Pour les cancers de la prostate invasifs, la seule thérapeutique proposée est la castration chimique (déprivation en androgène) qui est efficace, dans un premier temps, mais dans 100% des cas la tumeur récidive en étant agressive (métastases). Dès lors, il n’existe aucun traitement efficace conduisant inéluctablement au décès du patient. Une équipe de recherche a identifié des cellules potentiellement initiatrices de cette récidive tumorale dans la prostate chez la souris. Dans un modèle de souris génétiquement modifié développant un cancer de la prostate résistant à la castration, la proportion de ces cellules est fortement augmentée. Ces cellules ont pu être isolées et caractérisées, ce qui a permis de déterminer deux cibles thérapeutiques théoriques exprimées par ces cellules. En utilisant deux drogues, chacune agissant sur une de ces cibles, nous montrons que ces drogues sont très efficaces pour tuer ces cellules et que leur effet est additif dans un modèle de culture en 3D, et ce en présence et en absence d’androgène. Ces cellules ont aussi été identifiées chez l’Homme. Sur une lignée cellulaire humaine de ce type de cellules issue d’une tumeur prostatique de patient, nous avons montrés la même efficacité de ces drogues. L’objectif de ce projet est d’évaluer/confirmer l’impact thérapeutique de ces deux composés chimiques, administrés seul ou en combinaison, sur le développement et la récidive tumorale chez la souris ayant reçue préalablement une greffe de ces cellules tumorales. La première partie du projet est réalisée à l’EU 110, sous un statut conventionnel obligeant à utiliser des isocages. Pour préserver ses animaux immunodéficients de tout pathogène. La suite des expériences sera réalisée dans une animalerie SOPF, EU0054 permettant une manipulation sécurisée plus simple des animaux mais aussi l’utilisation d’un système d’imagerie par bioluminescence, finalement localisé dans l’EU0054.

Bénéfices attendus

Pour améliorer la survie des patients développant des cancers de la prostate résistant à la castration, il est nécessaire d’identifier les cellules responsables de la récidive tumorale et de les cibler de façon thérapeutique. Les études préliminaires in silico et in vitro nous ont permis d’identifier une nouvelle population cellulaire possédant les propriétés requises à l’initiation de la récidive et en faisant donc une population cellulaire candidate. Des expériences in vitro, qui inhibent les capacités progénitrices et prolifératives de ces cellules nous ont permis de trouver deux protéines cibles. Ce projet permettrait de définir in vivo, chez la souris, si leurs inhibiteurs, administrés seuls ou en combinaison, sont capables d’inhiber le développement tumoral et/ou faire régresser une tumeur déjà établie dans un contexte naïf (présence d’androgènes) ou d’hormonothérapie (castration). Ces tests seront faits sur des tumeurs d’origine murine mais aussi humaine.

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : - 1- Des injections sous-cutanées de cellules tumorales primaires ou de lignées humaines. - 2- Des observations des tumeurs sous anesthésie gazeuse durant 30 min (isoflurane) après maximum trois mois de développement tumoral. - 3- Des chirurgies (ablations de testicules) de 15 min sous anesthésie gazeuse et sous analgésique (injection sous cutanée 30 min avant l’intervention puis à J+1 et à J+2 si nécessaire). - 4- Des traitements en injections (de moins d’une minute) intra péritonéal de drogues quotidiennement pendant 28 jours. - 5- Des traitements en gavage (de moins d’une minute) tous les quatre jours pendant 28 jours. Chaque animal subira une combinaison de ces interventions au cours des procédures : Pour la première partie, l’ensemble des souris (32), réparti en deux lots, sera soumis aux interventions 1 et 2. Pour les deux autres parties, les animaux seront soumis aux interventions 1 et 2 et les autres interventions dépendront ensuite des groupes : - le groupe A (96 souris) subira une chirurgie de castration (intervention 3) puis les animaux recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5. - le groupe B (96 souris) recevront des traitements comme suit : • 32 souris seront soumises à l’intervention 4 uniquement ; • 32 souris seront soumises à l’intervention 5 uniquement ; • 32 souris seront soumises aux interventions 4 et 5.

Impact sur les animaux

Toutes les souris de la demande d’autorisation recevront par voie sous cutanée (bas du dos) deux injections (une à droite et une à gauche) mais toutes n’auront pas de développement de tumeur. S’il y a prise de greffe et formation de tumeur sous cutanée, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une certaine douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau à l’origine de démangeaison et d’irritation. L’ablation des testicules (procédures 2 et 3) est un acte non douloureux car réalisé sous anesthésie et analgésie mais il peut occasionner une hypothermie, une déshydratation et l’asséchement des yeux. Suite à la chirurgie, les animaux peuvent souffrir et la plaie chirurgicale peut présenter des signes d’inflammation ou d’infection. Les anesthésies lors des chirurgies et des séances d’imageries sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections intra péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection.

Devenir

Chaque animal sera mis à mort : - soit parce qu’il atteint avant la fin un score supérieur ou égal à 3 de la grille d’évaluation indiquant une souffrance nécessitant sa mise à mort. - soit parce qu’il a dû être exclue (pas de prise de greffe tumorale). En revanche il ne sera pas mis à mort tout de suite si sa présence peut éviter l’isolement d’un individu encore en procédure. - soit parce qu’il est un animal d’intérêt ou contrôle pour lequel il est nécessaire à la fin de la durée de la procédure de prélever différents organes et la tumeur afin d’évaluer l’efficacité du traitement testé. Cet animal pourra appartenir soit à la branche des animaux témoins servant de référence, soit à une branche d’animaux traités.

Remplacement

Nous avons dans un premier temps mené l’étude par différentes approches pour aborder ces questions, incluant, des études de prédiction par analyse bio-informatiques de données transcriptomiques, des cultures cellulaires 2D et 3D in vitro, selon le principe de Remplacement. Pour remplir nos objectifs, nous sommes contraints d’utiliser des modèles murins, car aucun système in vitro et aucun modèle d’organismes plus simples ne permet de reproduire les différents stades du développement tumoral prostatique et de sa récidive post-castration.

Réduction

Selon le principe de Réduction, le nombre d'animaux utilisé est calculé de manière à obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. En supposant une efficacité de greffe de cellules tumorales de 50%, il faudrait alors doubler l’effectif car une greffe sur deux ne se développera pas. Cependant, nous avons prévu deux injections de cellules par animal soit 1 prise de greffe par animal, ce qui compense cette efficacité faible. Comme indiqué précédemment, si la prise de greffe se montre plus élevée que 50%, nous ajusterons le nombre d’animaux à la baisse pour les étapes suivantes. Au contraire, si un des types cellulaires testés ne génère pas de tumeur, les expériences se basant sur l’injection de ces cellules ne seront pas réalisées. En revanche, des animaux pourraient être écartés de l’étude, il est donc nécessaire de prévoir un effectif supérieur à celui calculé dans cette section. C’est pour cette raison que nous avons fixé un nombre final de 16 animaux par condition, tenant compte de tous ces paramètres.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la croissance des greffes tumorales, elles bénéficieront de coton, de maisonnettes, de tunnels et de bâtonnets de bois à ronger afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un nid. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie et lors des mesures de tumeur par la personne en charge du protocole afin de détecter tout signe de douleur. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré en pré- et post-opératoire. A la suite de la chirurgie la souris sera réveillée au chaud et surveillée pendant les heures qui suivent et la bonne cicatrisation sera observée tous les jours durant la semaine qui suit l’opération par la personne en charge du protocole. Des points limites spécifiques à chaque étape ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort. Si, pour des raisons de protocole (mise à mort de certains congénères ayant atteint un point limite), une souris devait se retrouver seule dans une cage, l’enrichissement sera augmenté.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De plus, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale. Enfin, les modèles animaux créent le lien indispensable entre les tests in vitro et les études cliniques. Le modèle ici utilisé est préféré aux autres modèles de souris car c’est le meilleur modèle connu pour éviter toute réaction immunitaire et rejet de greffe de cellules tumorales tout particulièrement pour les cellules humaines.

1 040 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des cellules de cancers du sang humains par la veine ou sous la peau, puis des injections dans l'abdomen cinq jours par semaine pendant trois à six semaines, avec des prélèvements sanguins hebdomadaires. Le porteur indique que la maladie peut provoquer une paralysie des membres postérieurs et une perte de poids, et que les injections répétées peuvent irriter le site et y provoquer une douleur. Il affirme l'animal "indispensable" pour étudier l'effet des molécules sur un organisme entier, quatre peptides ayant d'abord été sélectionnés in vitro.

Objectifs

Les cellules cancéreuses sont caractérisées par leur capacité à échapper au processus de mort cellulaire programmé. Pour résister à la mort cellulaire, elles inhibent les mécanismes de mort, augmentent l'action des facteurs de survie ou effectuent ces deux actions simultanément. Nos travaux ont montré que la protéine de survie AAC-11, conférait aux cellules cancéreuses une résistance aux agents thérapeutiques. Cette protéine pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante, en particulier dans les cancers du sang, dans lesquels AAC-11 est fortement exprimée. Nous avons développé et optimisé une série de petites molécules capables d’empêcher l’action protectrice de cette protéine in vitro. Il est maintenant nécessaire de poursuivre l’évaluation de ces petites molécules en tant qu’agents thérapeutiques à l’aide de modèles animaux pour différents types de cancer du sang. Nous utiliserons en particulier des modèles de lymphome de Burkitt, myélome multiple et leucémie lymphoïde chronique, qui sont des modèles de cancers du sang dans lesquelles nos petites molécules semblent particulièrement efficaces dans nos tests in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre l’évaluation de petites molécules ayant un potentiel thérapeutique dans le traitement des cancers du sang. En raison de la stratégie originale mise en place pour développer ces molécules et sur leur mode d’action, les bénéfices de ce projet à long terme seraient de proposer une alternative thérapeutique efficace et mieux tolérée par les patients les plus fragiles car ciblant spécifiquement les cellules cancéreuses.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous réaliserons dans un premier temps une étape de mise en place des modèles en injectant les cellules tumorales soit dans la veine de la queue soit sous la peau (au niveau d'un flanc) dans deux types de souris présentant un système immunitaire défectueux (l'absence de système immunitaire chez ces souris leur permet d'accepter la greffe de cellules d'origine humaine). L'injection dans la veine de la queue est réalisée sur souris éveillées et dure 30 secondes. L'injection sous la peau se fait sous anesthésie généralegazeuse et dure environ 2 min. Le développement de la tumeur sera suivi soit par prélèvement sanguin à la veine de la joue (une fois par semaine sur souris éveillée, d’une durée de 10 secondes) soit par la mesure de la tumeur lorsque celle-ci est apparente (mesure au pied à coulisse sur souris éveillée, d’une durée de 30 secondes, ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque les lignées tumorales expriment le gène de la luciférase seront utilisées. L'acquisition par IVIS sera réalisée sur des souris placées dans une chambre d’analyse équipée d’un plateau chauffant (37°C), d’un système d’anesthésie gazeuse (isoflurane 3% pour l’induction puis 1,5-2% pour la suite de la procédure) et d’une caméra permettant la mesure de la bioluminescence émise par les cellules tumorales. La durée maximale d’acquisition des données de bioluminescence sera de 20 min. Après avoir déterminer la meilleure lignée de souris pour les différents types de cancer, nous évaluerons l'effet thérapeutique de nos petites molécules. Quel que soit le modèle de cancer utilisé (injection des cellules tumorales dans la veine de la queue ou sous la peau), le protocole thérapeutique consistera à injecter les petites molécules dans l’abdomen des souris éveillées 5 jours par semaine pendant 3 à 6 semaines. Le suivi impliquera des prélèvements de sang hebdomadaire sur toute la durée du protocole (modèles avec injection des cellules dans le sang) ou une mesure de la taille de la tumeur au pied à coulisse ou par imagerie in vivo par bioluminescence lorsque celle-ci est apparente.

Impact sur les animaux

L’injection des petites molécules thérapeutiques dans l'abdomen peut entrainer un stress une douleur avec possible risque d'irritation au site d’injection en particulier lorsque celle-ci sera répétée dans le temps (1 fois par jour, 5 jours/semaine, pendant 3 à 6 semaines). Comme tous les médicaments qui doivent entrainer la mort de certaines cellules, ils sont susceptibles d’avoir des effets indésirables sur le bien-être (perte de poids, diarrhée). La mise en place des différents modèles de cancer implique des injections. Dans le cas des injections sous la peau au niveau du flanc, nous pourrons observer dans le temps un inconfort lié à la croissance de la tumeur (gène dans la locomotion des souris). L’injection dans le sang des cellules tumorales pourra également conduire à une douleur de l’animal au cours du temps (développement de la pathologie) avec apparition d’une paralysie des membres inférieurs notamment et/ou perte de poids. Les prélèvements sanguins pourront générer un stress transitoire de l’animal lié à sa manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d’analyser de manière la plus exhaustive possible l’effet thérapeutiques des petites molécules (prélèvement du sang, des organes et des tissus cancéreux). Dans tous les cas, l’euthanasie se fera au bout de 6 mois maximum ou de manière anticipée en cas d'atteinte de points limites prédictifs et précoces.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux. Il est a noté que les 4 peptides testés ont été sélectionnés par des études in vitro préalables.

Réduction

Grâce à une analyse statistique et à notre expertise sur ce type d’expériences, nous avons réduit le nombre de souris utilisées au maximum tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi (présence de papier kraft pour la création de nid et de buchette en bois à ronger). Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Deux fois par semaine, nous réaliserons un suivi clinique des animaux à l'aide d'une grille de score permettant de déterminer des points limites précoces qui conduiront à un renforcement du suivi en cas dès les premiers signes de soufffrance suivi par l'euthanasie des animaux.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère pour laquelle de nombreux modèles de cancer sont déjà bien caractérisés. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes car les modèles de cancers sont bien établis dans ces conditions.

23 souris porteuses de tumeurs du côlon vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intratumorale, pour certaines une prodrogue par voie veineuse et un prélèvement à la jugulaire, puis un suivi par imagerie sous anesthésie avant la mise à mort pour prélever leurs organes. Le porteur indique que la tumeur peut gêner les mouvements et provoquer un amaigrissement, l'étude devant s'arrêter au seuil de taille tumorale fixé. Il précise que les molécules ont d'abord été testées in vitro mais juge ces données insuffisantes pour prédire leur distribution dans un organisme.

Objectifs

L'objectif de cette étude est d'évaluer les propriétés pharmacocinétiques d'un nouvel agent thérapeutique dans le domaine de l'oncologie préclinique. Cet agent se compose de deux produits : l’un qui sera administré par voie intratumorale et un second contenant une pro-drogue (chimiothérapie rendue inactive) qui ne sera activé qu’en présence du premier. L’objectif de ce travail est de valider que les produits se localisent bien au niveau tumoral et y restent suffisamment de temps pour exercer leurs actions. Le développement de ces nouveaux agents est nécessaire pour faire progresser le traitement du cancer (i.e. optimiser le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables). Dans un premier temps, les composés seront évalués in vitro pour connaître leurs propriétés de base. Cependant, il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, notamment sa pharmacocinétique, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent. Par conséquent, pour s'assurer que les produits nouvellement développés présentent des propriétés pharmacocinétiques favorables, ils seront d'abord testés in vivo sur de petits rongeurs. Après cette étape, leurs propriétés anticancéreuses pourront être évaluées dans d’autres travaux

Bénéfices attendus

En cancérologie, les enjeux actuels sont d’améliorer le choix du traitement et ainsi limiter les effets indésirables. Ce projet permettra de réaliser la preuve de concept qu’il est possible d’activer une chimiothérapie au niveau de son site d’action en optimisant son efficacité et limitant ses effets secondaires dans le reste de l’organisme.

Procédures

- Observation des souris (poids, volume tumoral, santé générale) : toutes les souris, sur des animaux vigiles, deux fois par semaine. Durée : quelques secondes par souris - Injection intratumorale d’un composé : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Injection intraveineuse d’une prodrogue inactive : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes - Prélèvement sanguin par veine jugulaire : n=6 souris, sur des animaux anesthésiés, une fois. Durée : quelques minutes. - Imagerie : toutes les souris, sur des animaux anesthésiés, au maximum 4 points d'imagerie sur une période de six jours après l'injection de l'agent d’imagerie. Durée : maximum 60 minutes d’anesthésie - Euthanasie et prélèvement des différents organes : toutes les souris, les souris seront profondément anesthésiées et euthanasiées avant que la procédure n'ait lieu, dernière expérience.

Impact sur les animaux

La croissance de la tumeur pourrait avoir des effets négatifs sur les animaux, comme une gêne des mouvements de l’animal ou des pertes de poids (cachexie). L'évolution de la taille de la tumeur sera donc suivie très régulièrement et l'étude sera terminée arrêtée lorsqusie les tumeurs auront atteignent la taille mentionnée dans les points limites. L’état général de l’animal ainsi que son poids seront aussi suivis et un complément alimentaire sous forme de gel pourrait être fournis pour limiter les nuisances. Les procédures (injection intraveineuse ou intratumorale, prélèvements sanguin et imagerie) sont réalisées sous anesthésie sur lit ou plaque chauffante réduisant la douleur et l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Peu ou pas d'effets indésirables dus à l’injection des différents produits sont attendus : l'injection intratumorale du produit 1 a déjà été réalisée chez l’animal sans effet secondaire, la dose de radioactivité qui y sera ajoutée est très faible et ne causera pas d’effet sur l’animal. Si la molécule de chimiothérapie active peut avoir des effets secondaires se caractérisant surtout par une perte de poids, la prodrogue a été testée chez l’animal et ne possède aucun effet secondaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés, car les organes seront prélevés pour une évaluation ultérieure par des techniques ex vivo. Ces informations visent à renforcer les données d'imagerie.

Remplacement

Toutes les molécules qui seront évaluées dans ce projet ont été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Ces données sont souvent insuffisantes pour prédire la biodistribution in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types de cellules et/ou de tissus sont impliqués. En cas d’observation d’effet secondaire lié à l’administration du traceur ou de la prodrogue, l’étude sera stoppée.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les nouveaux agents seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo. En comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant. Le nombre d'animaux utilisés a été déterminé en partie sur la base de plans expérimentaux précédents et a été confirmé à l'aide de différents tests statistiques. Cela donne un total de 18 souris nécessaires, soit 6 souris par groupe. Pour garantir qu'un nombre suffisant d'animaux puisse être inclus, des animaux résiduels seront également ajoutés comme décrit dans le paragraphe 3.4.10.

Raffinement

L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les expériences sont menées, dans une très large majorité sur des animaux avec de petits volumes tumoraux. Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité du modèle et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupes de 3 à 10 individus en fonction de la taille des cages et le nombre d’animaux par groupes mais l’hébergement individuel sera proscrit. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera mis dans chaque cage (sizzle-dri ou tubes en polycarbonate).

Choix des espèces

Les souris sont l’espèce de référence pour les études en oncologie. Les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. D’autre part, de nombreux modèles de cancers sont en place et très bien caractérisés chez la souris par l’établissement producteur permettant d’éviter une mise en place de modèle qui nécessiterait beaucoup plus d’animaux. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines minimum à la date de début d’étude d’imagerie) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

198 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur cerveau est irradié sous anesthésie sur une à cinq séances, avec trois prélèvements sanguins et une batterie de tests comportementaux répétés pendant six mois (open field, rotarod, reconnaissance d'objet, labyrinthe aquatique), pour comparer des schémas de radiothérapie FLASH. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer détresse, perte de poids et des dépilations, croûtes ou ulcérations au point d'irradiation. Les bénéfices affichés, des essais cliniques en oncologie pédiatrique et contre les gliomes, restent renvoyés à la suite du projet, tandis que le porteur juge "indispensable" le modèle animal pour étudier un "organisme vivant intégré".

Objectifs

La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique (ratio entre l’efficacité du traitement et les effets indésirables) en essayant de réduire la toxicité de ces techniques innovatrices en explorant différents schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains des différents schémas temporels, son impact n’étant pas connu dans cette nouvelle technique de radiothérapie pour le moment.

Bénéfices attendus

Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus sains. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques d’évaluation de la toxicité qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.

Procédures

Dans la procédure visant à étudier l’influence du schéma de fractionnement temporel de la dose sur la préservation des tissus sains et des fonctions cognitives, émotionnelles et motrices, les animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau (environ 20 minutes d’anesthésie). Ces irradiations seront réalisées 1 fois par jour pendant soit 1 ; 2 ; 3 ou 5 séances consécutives (espacées de 48 h). Trois prélèvements sanguins sur les animaux anesthésiés seront réalisés 24h avant la première irradiation, 24h après la dernière irradiation et 7 jours après la dernière irradiation. Tous les animaux seront ensuite évalués par les tests comportementaux suivants : Open Field : évaluation du niveau d’anxiété, de l’activité locomotrice et exploratrice des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), il se déroule en 1 session de 5 min, à partir d’une semaine avant la première irradiation. Rotarod : évaluation de la coordination motrice, quantification de l’équilibre, l’endurance et la force d’agrippement. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’un mois après la première irradiation, il se déroule en 2 sessions de 5 min par jour pendant 4 jours. Reconnaissance d’objet : évaluation des capacités mnésiques des animaux. Les rats l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois), à partir d’une semaine avant la première irradiation, il se déroule en 3 phases : Phase d’habituation (Jour 1 : 2 fois 3 min d’exploration) ; Phase d’acquisition (Jour 2 : 5 min d’exploration) ; Phase de test (Jour 2 : 5 min d’exploration). Labyrinthe aquatique : évaluation d’une potentielle altération des capacités mnésiques par l’irradiation. Les rats l’effectueront 2 fois : à court terme (1 mois après la première irradiation) et à long terme (6 mois après la première irradiation). Ils réaliseront 4 essais par jour pendant 8 à 13 jours. Cage d’activité : cages de vie adaptées, équipées d’une roue de grand diamètre pour mesurer l’activité spontanée des rongeurs sur de longues périodes de stabulation, maximum 7 jours consécutifs. Ils l’effectueront plusieurs fois (maximum 1 fois par mois pendant 6 mois).

Impact sur les animaux

Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant 3 à 5 jours. Les animaux peuvent également présenter des dépilations, croûtes et même ulcérations au site d’irradiation pendant 5 à 6 jours. Les nuisances liées aux prélèvements sanguins sont comparable à celles occasionnées par une coupure superficielle. Pendant les tests de comportement, une légère baisse de poids transitoire peut être observée due à l'augmentation de l’activité physique. Les animaux retrouvent leur poids quelques jours après l'arrêt des tests. L'exposition à un nouvel environnement peut générer un léger stress initial chez le rat, ils sont donc habitués progressivement aux salles de comportement et les tests sont répétés plusieurs fois.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des procédures pour analyses histologiques post-mortem.

Remplacement

Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains (en particulier l’impact cognitif). De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. C'est donc impossible de faire nos d’études avec des approches in vitro ou en utilisant des organoïdes. Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d'outils statistiques. Les animaux seront suivis 6 mois maximum. Ce délai est considéré long-terme pour évaluer la possible apparition des effets secondaires sur le tissu sain chez les animaux survivants à long-terme et ainsi pouvoir évaluer l’augmentation de la fenêtre thérapeutique.

Raffinement

Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, tout d’abord, nous veillerons régulièrement au bien-être des animaux (une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux) pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être, puis nous utiliserons un enrichissement adapté avec des objets placés dans les cages d'accueil (des tunnels en carton). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale adaptée aux interventions mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours) pour y remédier, des aliments appétants sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croûtes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours), une crème apaisante cicatrisante pendant au minimum une semaine. Une grille de score permettra d’évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte d’un point limite conformément à la grille de score, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les animaux utilisés seront des adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.

1 716 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses pour provoquer des métastases, dans un modèle génétiquement modifié de cancer du sein triple négatif. Le porteur annonce des tumeurs pouvant s'ulcérer et saigner, une gêne respiratoire et des fractures spontanées liées aux métastases osseuses, les souris étant tuées pour prélever les organes colonisés. Il reconnaît écarter les souris au mauvais génotype issues de l'élevage et juge une étape in vivo "nécessaire", les débouchés thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les principaux obstacles de l'étude des métastases sont qu'elles se produisent dans un délai inconnu, qu'elles sont visuellement et expérimentalement inaccessibles, qu'elles sont généralement complexes, et qu'il est difficile de maintenir cette complexité dans un système in vitro. Par conséquent, la plupart des études sur les maladies métastatiques se sont concentrées sur le stade ultérieur du développement métastatique, une fois que les métastases sont déjà formées. Bien que ces études aient amélioré nos connaissances sur la capacité des cellules cancéreuses à métastaser, elles ne nous ont pas informés sur la façon dont les cellules cancéreuses s’adaptent à leur nouvel environnement pour former des tumeurs. Décrypter les mécanismes cellulaire et moléculaire de la colonisation métastatique est essentiel pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter la récidive métastatique. L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Pour cela, nous proposons d’utiliser le modèle murin génétiquement modifié C3(1)-Tag qui développe des tumeurs et des métastases similaires aux patients. L’étude de la colonisation métastatique de ce modèle nous permettra de caractériser des acteurs moléculaires pertinents pouvant être cibler par une thérapie innovante. Le projet global consiste à étudier la formation de métastases de carcinomes mammaires, de l’arrivée des cellules cancéreuses dans un nouvel organe à la formation de tumeurs secondaires afin de définir : 1. Les différents phénotypes cellulaires présents au cours de la formation métastatique par séquençage à ARN des cellules cancéreuses à différents temps. 2. Le rôle des marqueurs mésenchymateux dans les cellules cancéreuses au niveau du site métastatique. 3. Les différences de colonisation métastatique entre les organes distants (poumons, foie, os). 4. L’impact du système immunitaire sur la colonisation métastatique.

Bénéfices attendus

Les patientes atteintes du cancer du sein triple négatif (TNBC) connaissent souvent une récidive métastatique et ont donc un pronostic plus sombre. Ces cancers agressifs constituent un groupe de cancers caractérisés par l'absence de récepteurs hormonaux (progestérone et œstrogènes) et de la protéine HER2 à la surface de leurs cellules. Ils ne sont donc pas éligibles aux traitements ciblant ces trois types de marqueurs. Pour atteindre l'objectif ultime de guérir les TNBC, il est important de développer des stratégies qui préviennent ou guérissent la maladie métastatique. Une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation et au développement des métastases de TNBC est une première étape cruciale vers le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler la maladie métastatique. Le projet de recherche proposé a un potentiel important pour faire progresser notre compréhension des métastases de TNBC et donc de réduire la mortalité des patientes. La réussite de ce projet fournira de nouvelles informations sur la manière dont les cellules cancéreuses se disséminent au niveau des sites distants et si différentes stratégies thérapeutiques doivent être développées en fonction du site métastatique. De plus, les résultats obtenus ouvriront de nouvelles voies de recherche pour identifier des thérapies ciblées contre la maladie métastatique des TNBC.

Procédures

Les animaux pourront recevoir l’une des procédures suivantes : - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans les veines caudales latérales (durée : 5 minutes) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans l’artère caudale (durée : 5 minute) - Une injection de cellules cancéreuses C3(1)-Tag dans la veine porte sous anesthésie générale (durée : 30 minutes)

Impact sur les animaux

Le modèle C3(1)-Tag est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose centrale par hypoxie, associée à des remaniements cutanés ulcératifs et hémorragiques entraînant une douleur pour l’animal. L’induction de métastases par injection chez la souris peut entrainer des difficultés fonctionnelles au niveau des organes colonisés. Notamment, au niveau du poumon une dyspnée peut être observée due à la présence mécanique des métastases. Des fractures spontanées peuvent être observées due à la présence mécanique de la masse dans le fût osseux. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites majeurs.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après chaque procédure. Pour la procédure 1 (élevage des souris C3(1)-Tag), les souris n’ayant pas le bon génotype seront euthanasiées (car elles ne peuvent être utilisées dans d'autres procédures).Lles souris femelles développant des tumeurs mammaires seront euthanasiées pour le prélèvement des tumeurs, les souris mâles trop âgées pour le croisement ou présentant des tumeurs seront euthanasiées. Pour les procédures 2 et 3 les souris seront euthanasiées aux différents temps nécessaires à notre étude sur la formation de métastases (de la colonisation d’un nouvel organe à la formation d’une tumeur secondaire) afin de collecter les organes contenant des métastases pour analyse.

Remplacement

Le projet s’intéresse à la caractérisation des mécanismes de colonisation métastatique. Il est très compliqué de mimer in vitro une implantation métastatique ectopique complexe dans un terrain pulmonaire ou autre, riche en divers éléments micro-environnementaux. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau la niche métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité phénotypique des cellules cancéreuses in vivo. Toutefois, avant implantation in vivo dans la souris, le phénotype des cellules cancéreuses sera étudié ex vivo sur des cultures en 3 dimensions d’organoïdes fraichement isolés et en culture de tranches de poumons. Par exemple, l’effet de l’amplification ou délétion de gènes d’intérêts sera évalué ex vivo afin d’éliminer les cibles n’ayant pas d’effet sur le phénotype des cellules cancéreuses.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, le personnel est formé aux outils statistiques appliqués à l'expérimentation animale (planification, randomisation et analyse) par l’utilisation de traitements statistiques des données (ANOVA, Bartlett,…). Les protocoles d’injection issus de la bibliographie sont validés et robustes permettant une prise tumorale optimale sur l’ensemble des individus de la cohorte, limitant l’utilisation d’animaux dont les prélèvements se révèlent non analysables. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé en se basant sur notre expérience de ce modèle et pourra être réduit en fonction des résultats préliminaires qui seront obtenus ex vivo. L’ensemble du protocole expérimental sera précisément défini en amont afin de limiter les biais de non-homogénéité entre lots de souris. De plus, nous allons utiliser le modèle de culture de tranches de poumons. Brièvement, après injection des cellules cancéreuses par voie intraveineuse au niveau de la queue de souris, l’animal est euthanasié et les poumons sont rapidement récupérés et coupés en tranches fines puis mis en culture. Pour chaque poumon isolé, nous pouvons générer environ 20 tranches ce qui permet de tester in vitro jusqu’à 10 conditions différentes en utilisant un seul animal. En effet, selon notre expérience, au moins la moitié des tranches de poumons présentent des cellules cancéreuses. Cet essai est particulièrement utile pour étudier l’effet de molécules sur les cellules cancéreuses et le tissu pulmonaire en amont de test in vivo.

Raffinement

Le bien-être des animaux de l’étude sera particulièrement porté à l’attention du personnel qui veillera aux meilleures conditions d’élevage possible, notamment via un maintien des groupes sociaux (4- 5 animaux par cage) et l’enrichissement de l'habitat (frisottis de papier ajoutés aux cages). La gestion du stress des animaux sera maximisée, par une contention la plus rapide et la moins fréquente possible. Nous avons une grande expérience des injections intraveineuse caudales qui nous permet de les réaliser rapidement en limitant le stress chez l’animal. La douleur des animaux utilisés sera fréquemment monitorée par un examen clinique des animaux tous les 2-3 jours afin de déterminer la présence de signes cliniques puis quotidiennement si l’état générale des animaux se dégrade afin d’adapter le plus précocement possible les points critiques chez un animal et d’adapter le protocole d’anesthésie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle C3(1)-Tag de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie. - Concordance du modèle C3(1)-Tag murin avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif. - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (absence du système immunitaire pour mettre en lumière le rôle de ce dernier dans la colonisation métastatique). - Modèle C3(1)-Tag : les souris C3(1)-Tag développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 22 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront au moins une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant. - Modèle NSG : les souris seront utilisées entre 10 et 12 semaines, âge adulte permettant aux souris de supporter le développement de métastases. - Modèle REAR : similaire au modèle NSG, les souris seront injectées avec des cellules cancéreuse C3(1)-Tag entre 10 et 12 semaines pour permettre le développement de métastases.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection dans le sinus veineux situé derrière l'œil sous anesthésie, puis subit jusqu'à neuf prélèvements de sang par la joue sur deux à trois semaines, pour comparer des anticorps produits à partir de microalgues à des anticorps classiques. Le porteur présente l'enjeu comme économique, réduire le coût de production des anticorps, et annonce le bénéfice pour les patients à terme. Il affirme qu'après vérification in vitro il était "nécessaire" d'étudier ces anticorps dans un organisme au système immunitaire mature.

Objectifs

L’industrie pharmaceutique mise de plus en plus sur les anticorps thérapeutiques pour satisfaire les besoins de santé, encore nombreux. Cependant, l’industrie française a pris du retard dans ce domaine. Malgré une consommation importante de médicaments par la population française, seuls trois anticorps thérapeutiques sont produits en France (omalizumab, canakinumab, sécukinumab). Avec la prévalence croissante des maladies chroniques comme les cancers, les maladies autoimmunes et infectieuses telles que la COVID-19, le besoin en médicaments de type anticorps s’accroit considérablement. Ces médicaments sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Le coût de production de ces anticorps est très élevé. En conséquence, il devient indispensable de développer des systèmes alternatifs de production d’anticorps qui permettent de décroître leurs coûts de production et ainsi de les rendre plus accessibles. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels dirigés contre des virus comme le virus de l’Hépatite B ou le virus de Marburg. Nous produisons actuellement des bio-similaires d’anticorps anti-cancéreux. L'objectif du projet est donc de comparer la pharmacocinétique de ces anticorps produits à partir de microalgues par rapport aux anticorps génériques.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude, si ils valident le système alternatif de production d'Ac à partir de microalgues va permettre de diminuer considérablement leur coût de production et ainsi les rendre plus accessibles.

Procédures

Chaque souris recevra à J0 une injection intraveineuse unique via le sinus rétro-orbitale de 5 mg/kg d’anticorps dans un volume total de 200µl de PBS. Cette injection sera pratiquée sous anesthésie générale. Chaque souris aura des prélèvements sanguins, un total de 9 sur 2 à 3 semaines. Prélèvements de sang via les veines submandibulaires. L’ensemble des prélèvements sera effectué sous anesthésie générale à l’isoflurane 2.5% après une induction à l’isoflurane 5% dans l’air. Le volume de chaque prélèvement sera de 50µl récupéré dans des capillaires calibrés. Après chaque ponction une pommade antiseptique cicatrisante sera appliquée (Biseptine Cica gel).

Impact sur les animaux

Les gestes expérimentaux sur les animaux se limitent à une injection intraveineuse et des prélèvements sanguins qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre.

Devenir

Tous les animaux de l'étude seront mis à mort.

Remplacement

Les anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma ou son immunogénicité. Après vérification in-vitro de ces différentes interactions anticorps récepteurs il était nécessaire d’étudier leur comportement dans un organisme vivant avec un système immunitaire mature et fonctionnel.

Réduction

Au-delà de l’utilisation du nombre minimum d’animaux pour obtenir une modélisation correcte de la pharmacocinétique de chaque anticorps, cette étude à terme permettra de remplacer les milieux de culture riches en sérum de veaux foetal par de l’eau de mer pour la production de ces anticorps. Le problème éthique majeur du sérum de veau foetal vient du fait qu’il provient du sang de foetus de vache, prélevé au moment de l'abattage de vaches gestantes. Le foetus est retiré du ventre de sa mère, et la totalité de son sang est prélevé par ponction cardiaque, le plus souvent sans anesthésie afin de garantir la qualité de l’échantillon. Ce nouveau mode de production permettra donc à court et à long terme moins d’utilisation de sérum de veaux foetal et donc d’animaux donneurs.

Raffinement

L’injection intraveineuse ainsi que les différents prélèvements seront pratiqués sous anesthésie générale à l’isoflurane. Afin de limiter le nombre de prélèvement sur chaque souris tout en garantissant un suivi sérologique optimal pour l’étude pharmacocinétique, les 16 souris seront divisées en 4 groupe de 4. De cette façon le nombre de prélèvements par individu sera divisé par 4, de plus les prélèvements seront alternés coté droit et gauche de la mandibule. L’innocuité de ces anticorps devant être totale, des points limites extrêmement précoces basés sur le mouse grimace scale et le poids seront appliqués :

Choix des espèces

La souris est un très bon modèle qui permet d'évaluer après modélisation le profil pharmacocinétique d'un anticorps monoclonal. La demi vie d'un anticorps et sa bio distribution au sein des différents tissus d'un organisme vivant sont dûs à un récepteur aux Fc des immunoglobulines G, le FcRn. Chez la souris il est totalement fonctionnel pour les IgG humaines ce qui permet d'évaluer la demi vie et la courbe de distribution par dosage cinétique des concentrations résiduelles dans le sang (volume périphérique) d'un anticorps choisi. Ces anticorps sont actuellement produits en utilisant des cellules de mammifères comme usines cellulaires. Récemment, les microalgues ont été utilisées avec succès pour produire des anticorps fonctionnels, malgré une structure protéique identique certaines modifications post-traductionnelles peuvent intervenir et par conséquent modifier l'affinité des parties constantes pour les différents récepteurs aux FcGamma. Cette étude chez la souris permettra donc d'évaluer ces modifications potentielles. Les souris seront utilisées à l’âge de 7 semaines pour que leur système immunitaire soit mature. Elles arriveront dans notre animalerie à l’âge de 6 semaines et seront acclimatées pendant 7 jours période nécessaire au développement d'un microbiote dépendant de notre animalerie.

6 098 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, des injections dans le ventre, des médicaments par gavage et des prélèvements de sang, pour tester huit inhibiteurs de la protéine eIF4A censés lever la résistance des mélanomes et cancers du poumon aux thérapies ciblées. Le porteur situe l'essai clinique et le bénéfice pour les patients dans un temps ultérieur, l'objectif immédiat restant de mesurer l'effet des composés sur la tumeur. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est assez robuste et que le recours à un modèle animal "comparable au corps humain" est "indispensable".

Objectifs

Le mélanome est la première cause de décès par cancer des jeunes adultes. Les thérapies ciblées actuelles augmentent la durée de vie des patients porteurs d’une mutation sur le gène BRAF mais n’empêchent pas l’apparition d’un phénomène de résistance au traitement dans la grande majorité des cas. Nos récentes études ont montré que l’inhibition de la protéine eIF4A impliquée dans la traduction de l’ARN en protéine entraine une levée de cette résistance in-vitro. Ces découvertes encourageantes ont initié l’étude de l’utilisation d’inhibiteurs de la protéine eIF4A en combinaison avec les thérapies ciblées usuelles. Actuellement plusieurs dizaines de candidats sont en cours de caractérisation in-vitro afin de sélectionner les 8 inhibiteurs les plus prometteurs qu’il est indispensable de tester in vivo. L’objectif de ce projet est de démontrer l'efficacité in vivo de 8 inhibiteurs eIF4A, dans différents modèles de mélanome et de cancer du poumon qui est également très répandu. Ces modèles ont été choisis parce qu’ils modélisent plusieurs types de thérapies ciblées usuellement utilisées en cancérologie et qu’ils présentent différents degrés de sensibilité à celles-ci nous permettant ainsi de mimer différentes situations cliniques. Les souris recevront une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, permettant d’obtenir un modèle rapide et reproductible, avec une mesure de la croissance tumorale directe et des métastases rares.

Bénéfices attendus

A l’heure actuelle aucun inhibiteur eIF4A n’a reçu d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) pour le traitement des mélanomes et du cancer du poumon. Cela serait une avancée considérable dans la prise en charge des patients avec le recul du risque de rechute qui est malheureusement prévisible dans la plus grande majorité des cas. Les expériences in-vitro réalisées sur ces inhibiteurs présentent des conclusions très prometteuses lors de la combinaison avec une thérapie ciblée sur le phénomène de résistance. L’objectif par la suite sera de mettre en place un essai clinique dès qu’un inhibiteur eIF4A aura fait ses preuves dans le modèle animal afin de permettre aux patients d’en bénéficier dès que possible.

Procédures

Greffes de tumeurs en sous-cutanée sous anesthésie générale (durée 15 minutes). Injections en intrapéritonéale (durée 10 minutes). Administration de médicaments par gavage (durée 1 minute). Prélèvements de sang sous anesthésie générale, durée 2 minutes.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à la présence de tumeurs unique sur le flanc en sous-cutanée.

Devenir

Mise à mort pour prélèvements post-mortems d'organes et de tissus aux fins d'analyses.

Remplacement

Il n'existe, à ce jour, pas de modèle in vitro modélisant suffisamment robuste pour tester ces synergies ni les interactions entre tumeur et système immunitaire. La variété et la complexité des cancers, ainsi que leur incidence élevée, rendent l’utilisation de modèles animaux cruciale pour comprendre comment le cancer se développe et pour améliorer les stratégies préventives, de diagnostiques et thérapeutiques. L'utilisation de modèles animaux comparables par de nombreux aspects au corps humain est donc indispensable pour l'évaluation des nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Des études préliminaires sur cultures cellulaires ont permis d’affiner les tests d’optimisation et de cibler les analyses à effectuer et ainsi réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats statistiques significatifs. Ainsi, le nombre d’animaux a été défini pour utiliser l’effectif minimal d’animaux possible. Des études antérieures conduites dans les mêmes modèles d'étude et avec des cibles thérapeutiques différentes ont montré que 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour obtenir des effets significatifs sur la croissance tumorale par rapport à des souris contrôle non traitées (procédures 3 et 4). De plus, les résultats de la procédure 3 nous permettront de réduire le nombre d'inhibiteurs à tester aux 5 les plus efficaces dans les modèles immunodéficients. La procédure 1 étant une étape préliminaire pour vérifier l’absence de toxicité in vivo, 3 animaux par groupe seront suffisants. La procédure 2 étant une étape d’optimisation, elle nécessitera également un nombre réduit de souris à savoir 3 animaux par groupe pour déterminer la dose et l’intervalle optimaux. Le nombre d'animaux indiqué est un nombre maximal qui pourra être réduit si le nombre de composés à tester diminue pour des raisons de toxicité ou autre raison.

Raffinement

Les animaux seront surveillés tous les jours lors des procédures qui sont raffinées par l’établissement de points limites précoces, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. De plus, des médications appropriées (anesthésiques et analgésiques) seront utilisées lors des greffes pour réduire la douleur et le stress de l’animal. La présence de souffrance sera recherchée en utilisant les critères habituels (état général, sous-alimentation, état du pelage, prostration). Les souris seront également surveillées quotidiennement afin de déceler le plus rapidement possible l’apparition de points limites précoces. Trois fois par semaine, les animaux seront pesés et les tumeurs mesurées.

Choix des espèces

Le génome de la souris a été séquencé et de nombreux outils ont été développés pour étudier ce modèle. De plus, on observe une croissance tumorale rapide chez ce modèle et son poids permet d’utiliser des doses de produits moins importantes. La souris est donc le modèle de choix pour l'étude des cancers. Le projet nécessite des souris adultes (5-8 semaines) sans plus de contraintes sur l’âge. Ceci se justifie par l’âge de la population humaine touchée par le mélanome et le cancer du poumon et ciblée par les éventuels traitements.