Cancers

6 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes et castrées chirurgicalement, elles reçoivent la greffe d'un fragment de tumeur humaine puis jusqu'à trois administrations quotidiennes, pour tester des traitements contre des cancers hormono-résistants du sein, de l'ovaire et de la prostate. Le porteur présente ces xénogreffes issues de patients comme "les seuls" modèles reconstituant la complexité des tumeurs humaines et affirme que ce travail sur animal "ne peut être remplacé". L'efficacité clinique des molécules testées reste hypothétique, l'objectif immédiat étant de les sélectionner avant un éventuel passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer représente la deuxième cause de mortalité dans les pays développés et de nombreux cancers sont connues pour être favorisé par certaines hormones, il s’agit principalement des cancers du sein et des ovaires chez la femme et de la prostate chez l’homme. Ces tumeurs hormonodépendantes, qui présentent des récepteurs hormonaux peuvent être traitées par hormonothérapie, cependant, ce traitement hormonal n'a qu'un effet transitoire, d'une durée variable, et bloque la prolifération du cancer sans le guérir. En dépit de l’amélioration constante de la prise en charge de ces patients, de nombreux progrès restent à faire et de nombreux travaux sont actuellement menés afin de mettre sur le marché de nouveaux traitements thérapeutiques anti-tumoraux visant ces tumeurs hormono-résistantes.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de déterminer in vivo sur des animaux castrés porteurs de tumeurs hormonorésistantes, les propriétés anti-tumorales de traitements innovants (petite molécule et/ou biothérapie) afin d’identifier ceux potentiellement efficaces en clinique. L’évaluation de ces traitements innovants permettra de définir leur efficacité anti-tumorale ainsi que les informations nécessaires pour choisir leur posologie en vue de leur utilisation future en clinique. Ce projet se base sur l’utilisation de modèles de tumeurs humaines greffées sur souris castrées ou PDX pour Patient Derived tumor Xenografts. Ces modèles développés au cours des dernières années sont donc des souris castrées porteuses d’une tumeur humaine. Ce sont actuellement les seuls qui permettent de reconstituer sur animal la complexité des tumeurs humaines. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine. Nous disposons actuellement d'une collection de 24 PDX différentes représentatives des tumeurs hormono-résistantes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales distinctes d’une durée de 30 minutes maximum par souris, toutes deux réalisées sous anesthésie générale : 1/ Implantation interscapulaire d'un fragment tumoral 2/ Castration chirurgicale par incision cutanée bilatérale inférieure à 1cm au niveau de l’aine pour les mâles ou au niveau des reins pour les femelles. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les traitements, les animaux recevront au maximum 3 administrations quotidiennes. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles, des prélèvements de sangs pourront être effectués, dans le respect des directives européennes.

Impact sur les animaux

Actes chirurgicaux d’implantation tumorale et de castration. Hypothermie au moment de l’anesthésie. Stress physique au moment des prélèvements sanguin.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) qui pourraient avoir un impact négatif sur les résultats d'une autre étude.

Remplacement

Il est essentiel, avant toute administration à l’Homme, de valider le potentiel thérapeutique de chaque traitement innovant dans des modèles permettant d’étudier tous les paramètres observables, depuis l’administration jusqu’à l’élimination des composés administrés tout en prenant en compte les interactions possibles avec les cellules non-tumorales de l’organisme. Ces études in vivo constituent une des nombreuses étapes du développement préclinique d’un médicament mais ce travail sur animal ne peut être remplacé.

Réduction

Les modèles de PDX utilisés sont parfaitement maitrisés et permettent de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études in vitro permettant la réduction du nombre de groupe à tester. Il sera, de plus, possible d’évaluer plusieurs traitements au sein d’une même étude, sur un même modèle tumoral (1 seul groupe contrôle pour plusieurs traitements différents) et ainsi réduire le nombre total d’animaux inclus dans le projet. Toujours d’après les résultats in vitro, seuls les traitements démontrant les meilleurs effets anticancéreux seront testés in vivo permettant au mieux de réduire le recours aux études in vivo aux traitements ayant le meilleur potentiel thérapeutique anticipé.

Raffinement

Nous utiliserons toutes les données compilées préalablement dans le cadre du développement préclinique du traitement à évaluer. Ceci permettra de prédéfinir les doses potentiellement efficaces et minimisant les effets secondaires. Nous pourrons ainsi raffiner l’étude en étant certain de travailler à des doses permettant d’évaluer l’efficacité des traitements et non leur toxicité, en minimisant ou supprimant tout effet secondaire indésirable pouvant masquer l’objet de l’étude. Les animaux seront acclimatés au moins 7 jours avant d’être greffés, puis seront greffés sous anesthésie avec un mélange d'anesthésique et de tranquillisant. Seuls les animaux présentant des tumeurs en croissance et inclus dans la phase de traitement seront castrés. Outre la surveillance quotidienne post-greffe et castration, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pendant le traitement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement dans le comportement ou l’état de santé des animaux. En cas de modification du comportement normal ou de l’état de santé des animaux surveillés, des actions visant à prévenir douleur ou angoisse comme par exemple interruption du traitement seront appliquées. Le projet dont la durée sera de 5 années sera constitué de 40 études visant à évaluer différents traitements innovants sur différents modèles de PDX. Les études comprendront chacune 163 animaux au maximum, soit un total de 6520 animaux au maximum.

Choix des espèces

Différentes souches de souris toutes immunodéficientes, afin de ne pas rejeter les fragments tumoraux d’origine humaine, provenant d'éleveurs agréés, peuvent être utilisées dans le cadre du projet. Les animaux seront tous des souris adultes âgées de 5 à 13 semaines en fin de période d'acclimatation, afin d’optimiser la prise de greffe car le système immunitaire résiduel qui se développe avec l’âge peut empêcher les tumeurs de pousser. La majorité des études (90%) nécessitant une castration sera réalisée sur des souris mâles (modèles prostates).

1 020 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau puis subissent injections, gavages, huit prélèvements sanguins, neuf séances d'imagerie et des mesures de tumeur, avant d'être tuées pour les analyses. Le porteur reconnaît une douleur liée à la croissance tumorale, souvent associée à une perte de poids. Il présente la souris comme "le modèle de choix et de référence" pour valider in vivo un agent censé renforcer les lymphocytes T contre le cancer.

Objectifs

Ces dix dernières annéees, les immunothérapies ont révolutionné la prise en charge des patients atteints de cancer. En éduquant nos défenses immunitaires à reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales, ces traitements permettent en effet de guérir du cancer avec peu de toxicité et de façon durable, à la différence des traitements standards de chimiothérapie et radiothérapie. Malgré ces avancées majeures, les immunothérapies sont efficaces chez une minorité (

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider à terme l’intérêt clinique d'un agent pharmacologique récemment identifié, pour lequel des résultats obtenus in vitro montrent une potentialisation des outils cellulaires à la base des immunothérapies dans le contexte du cancer.

Procédures

Au cours des différentes expériences, les animaux seront soumis à : - 8 prélévements sanguins (1 goutte), la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 9 séances d'imagerie, la durée de ce geste est évaluée à 3 minutes - 6 mesures de la tumeur à l'aide d'un pied à coulisse, la durée de ce geste est évaluée à 2 minutes - 4 administrations par gavage, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 9 injections intrapéritonéales, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 injection sous-cutanée, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute - 1 séance de rasage du flanc droit à l'aide d'un rasoir électrique, la durée de ce geste est évaluée à moins de 2 minutes - 1 injection intraveineuse, la durée de ce geste est évaluée à moins d'une minute

Impact sur les animaux

Des nuisances potentielles pourraient résulter du stress généré lors des injections et plus globalement par la manipulation hebdomadaire des animaux, mais également de la douleur résultant de la croissance tumorale qui est souvent associée à une perte de poids

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort, afin de réaliser les prélévements nécessaires à l'étude.

Remplacement

Les expériences exposées dans ce projet reposent sur un grand nombre d’expériences ex vivo montrant une potentialisation des fonctions antitumorales après traitement par un inhibiteur pharmacologique nouvellement identifié. Le recours aux modèles animaux permettra de valider in vivo, dans des modèles précliniques, le gain résultant de l'utilisation de cet inhibiteur sur des approches d'immunothérapies au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Un suivi longitudinal de la croissance des tumeurs sera réalisé par palpation des tumeurs et par imagerie afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les groupes d'étude sont faits le plus souvent en même temps afin de réduire le nombre de groupes contrôles. Le nombre de souris utilisées a été estimé sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature montrant que 18 à 24 souris par groupe permettent de mettre en évidence des différences significatives, en termes de réduction de la croissance des tumeurs. Les variations seront comparées par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les interventions (injections intraveineuses et prélèvements sanguins) seront précédées d'une anesthésie générale, afin de prévenir la douleur. Nous utiliserons l'imagerie pour un suivi de la charge tumorale, ce qui nous permettra de définir un critère d’efficacité des immunothérapies basé sur cette approche pour les études ultérieures. Les souris seront surveillées quotidiennement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement de comportement ou d'état de santé des animaux. L’atteinte des points limites définis en amont entraina une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix et de référence pour l'étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. Les modèles murins permettent en effet d'apprehender la complexité de la réponse tumorale. Ces modèles permettent notamment d'apprehender la possibilité de rencontre des cellules de l'immunité et des cellules tumorales au sein de l'organisme. Ces modèles permettent également de prendre en compte la survie des cellules immunes et le maintien de leur activité antitumoral au sein du microenvironement tumorale, qui le plus souvent met en place des mécanismes pour inhiber la réponse immune. Dans le projet proposé les souris utilisées seront des souris âgées de 8 à15 semaines (système immunitaire mature).

1 008 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sur un ou deux flancs, puis des traitements par différentes voies, avant un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie, pour tester un anticorps contre un modèle de neuroblastome, un cancer de l'enfant. Le porteur décrit une nécrose tumorale qui peut atteindre la surface et former une plaie s'agrandissant par frottement ou "cannibalisme", tout en la présentant comme un signe d'efficacité. Il justifie l'usage de l'animal par une exigence "réglementaire" de tester le médicament sur deux modèles avant l'humain.

Objectifs

La neurotensine (NTS) est une hormone du tractus gastro-intestinal. Son action est transmise à la cellule par des récepteurs, le plus important étant le récepteur de haute affinité, le NTSR1. Nous avons pu démontrer la contribution de ce couple dans l’agressivité tumorale, par ses actions sur la croissance tumorale avec des effets sur la prolifération cellulaire et l’apoptose, mais aussi sur les processus métastatiques en modifiant la migration, l’invasion et l’adhérence cellulaire. Le récepteur est surexprimé dans les cancers solides. Nous avons montré que l’expression élevée de NTSR1 est un marqueur de mauvais pronostic pour les cancers du poumon, et pour de nombreux autres cancers. La présence du récepteur NTSR1 associé à son ligand la NTS sont également associés à la résistance aux traitements anticancéreux. Nous avons donc cherché à développer des stratégies thérapeutiques pour antagoniser ce couple, afin de faire baisser l’agressivité des tumeurs et sensibiliser les cellules tumorales aux traitements thérapeutiques. Dans le but d’inhiber les effets de la neurotensine, nous avons développé un anticorps neutralisant dirigé contre la forme longue de la NTS, la LF-NTS. Notre stratégie est de diminuer l’activité du NTRS1. La preuve de concept expérimentale a été réalisée dans des modèles de cancer du poumon et du sein. Il nous ait demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un autre modèle de cancer avant de mettre en place un essai clinique. Nous avons donc décidé de nous orienter vers une maladie orpheline de l’enfant, le neuroblastome. A l’heure actuelle, les données montrent que 50 % des enfants atteints de ce type de cancer récidivent, et 10 % en survivent. Les points forts qui ont orienté ce choix sont d’une part que le récepteur de la neurotensine et les signalisations oncogéniques associées sont activés de manière permanente lors l’exposition chronique à l’agoniste de la neurotensine. D’autre part, l’étude des données publiques montre clairement un lien significatif entre l’expression de la neurotensine, la gravité de la maladie, la résistance aux traitements et la survie.

Bénéfices attendus

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront acclimatés durant une semaine puis ils seront soumis à une injection sous-cutanée de cellules tumorales sur animal vigile (15 secondes/animal) sur un flanc ou sur les 2 flancs. Après la validation de l’apparition d’une tumeur solide les animaux seront traités avec les molécules thérapeutiques par injection intraveineuse au sinus retro-orbitaire, par injection per os sur animaux vigils 5 jours de suite, et par une injection de notre anticorps thérapeutique à J1, J8 et J15. Enfin, les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement mise à mort sans réveil de l’animal. Le developpement des métastases est possible.

Impact sur les animaux

L’implantation des cellules tumorales sur le flan de l’animal provoque le développement d’une tumeur solide. Les tumeurs ne sont à priori pas innervées et elles n’entrainent donc pas de douleur en tant que telle. En revanche la taille de la tumeur peut provoquer des difficultés de déplacement des souris surtout si après l’implantation en sous-cutanée la tumeur se développe dans le creux de la patte postérieure. Ce phénomène arrive parfois, il n’est pas contrôlable. L’efficacité de la thérapie que nous développons se traduit par une réduction de la taille tumorale, ralentissement de la pousse, mais aussi par une possible nécrose plus ou moins importante qui démarre au centre de la tumeur. Ce phénomène de nécrose peut atteindre la surface de la tumeur et provoquer une plaie. Cette plaie peut s’agrandir soit par frottement soit par cannibalisme. Dès l’apparition d’un point de nécrose, nous appliquons des soins adaptés. Cependant, plus le traitement est efficace plus la nécrose va se développer à l’intérieure de la tumeur. C'est un phénomène inévitable que nous prenons en compte pour évaluer l’efficacité de la thérapie.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à la fin de la période de maintien prévu ou plus tôt en cas d’atteinte de points limites afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires aux analyses.

Remplacement

Nous avons établi la preuve de concept de l’efficacité d’un anticorps murin et humain dirigé contre les formes longues de la neurotensine sur la croissance tumorale, invasion métastatique et la réponse aux chimiothérapies. Ces résultats ont été publiés. L’étape suivante est de mettre en place un essai clinique, mais il nous est demandé de prouver l’efficacité de notre anticorps sur un cancer plus rare et au pronostic sombre qui validerait ce que nous avons montré sur d’autres modèles cancéreux (cancer du sein triple négatif, et du poumon non à petites cellules). La règlementation exige que les médicaments destinés à la thérapie humaine soient testés sur des modèles animaux et sur différents cancers. Les tests de l’efficacité thérapeutique de ces anticorps dans un modèle murin sont une étape préalable, nécessaire et obligatoire avant de poursuivre vers les études règlementaires de toxicologie et un essai clinique.

Réduction

Nous limitons au minimum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 10 souris pour chaque groupe expérimental est prévu afin de pouvoir réaliser des études statistiques. Un total de 796 souris, qui a été défini par une approche statistique, sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. Les 3 phases de ce projet se dérouleront séquentiellement à partir du moment où la phase précédente est validée. Phase 2 sera mise en place si la phase 1 est validée. Phase 3 sera mise en place après la sélection des lignées cellulaires en phase 2. La phase 4 sera réalisée qu’après la validation de la phase 3.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bienêtre animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la règlementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bienêtre des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites adaptés) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Dans ce projet, l’administration des traitements devrait apporter un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression tumorale. De plus, l’ensemble des gestes techniques qui sont réalisés sur animal vigile sont pratiqués par des personnes formées et expérimentées avec du matériel adapté permettant de réduire significativement les nuisances liées aux actes techniques.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le choix de l’espèce est justifié à travers différents aspect : - La physiologie de la souris qui est un mammifère comme l’Homme ; - La possibilité de recréer un modèle de neuroblastome - Une espèce couramment utilisée et reconnue en oncologie - Un modèle ayant permis de déterminer l’importance du protocole d’administration, l’influence du volume tumoral et la toxicité des traitements - La réglementation demande à ce que tout développement de médicaments soit testé chez deux modèles animaux différents avant administration chez l’humain. Description du ou des modèle(s) : La souris Nude est le standard pour les études précliniques relatives à l'évaluation in vivo des effets anti-tumoraux sur des cellules humaines. Nous utiliserons la souche NMRI Nude-Foxnu afin de faciliter la greffe et le développement de cellules d’origine humaine. Selon la fiche research models de la souche NMRI-Foxn1nu/nu proposée par le fournisseur, le poids des animaux se stabilise entre 28 et 35 jours d’âge. Ce stade de développement est couramment utilisé et validé par la communauté scientifique. Description de l’identification : L’identification par bague est privilégiée, car la plus pratique pour identifier les souris. Elle sera réalisée au cours de la semaine d’adaptation. En cas de perte les animaux seront bagués de nouveau ou à défaut des marquages au feutre de couleur des queues pourront également être réalisées pour sécuriser l’identification.

1200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, des séances d'irradiation localisée et des injections répétées d'immunothérapie, avant leur mise à mort pour analyser les tumeurs, afin d'étudier l'association d'une radiothérapie à faible dose et d'une immunothérapie. Le porteur renvoie au conditionnel d'éventuels bénéfices pour les patients réfractaires à l'immunothérapie. Il présente cette association comme une "source d'espoirs" contre les cancers métastatiques.

Objectifs

Il y a trois objetifs. 1) Evaluer l'efficacité anti-tumorale de la radiothérapie délivrée à faible dose en combinaison avec une immunothérapie en utilisant un modèle préclinique de lignée tumorale murine greffée chez des souris immunocompétentes. 2) Etudier les mécanismes par lesquels la radiothérapie à faible-dose est capable d'induire une réponse immunitaire anti-tumorale potentialisée par l'immunothérapie et ainsi expliquer l'effet synergique du traitement associant radiothérapie à faible dose et immunothérapie. 3) Déterminer le rôle des macrophages dans l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et immunothérapie.

Bénéfices attendus

Malgré une amélioration sans précédent du pronostic de nombreux cancers grace à l'immunothérapie, de trop nombreux patients présentent une réponse insuffisante à ces nouvelles thérapies. L'optimisation et la compréhension des traitements combinés associant une radiothérapie à faible dose et une immunothérapie pourrait à terme bénéficier aux patients réfractaires à l'immunothérapie et présentant un cancer à un stade avancé inaccessible à une radiothérapie standard qui serait trop toxique pour les organes et tissus sains adjacents. Dans ce cadre, la mise au point du meilleur schéma de radiothérapie faible dose à utiliser en combinaison à l'immunothérapie, ainsi que la compréhension des mécanismes à l'origine de l'efficacité d'une telle association doivent être recherchés sur modèle animal préclinique avant une transposition au patient.

Procédures

Irradiation sur la tumeur uniquement : 1 à 2 séances d'environ 1 minute chacune. Injections sous-cutanées de cellules tumorales: 1 seule injection, 1 minute. Injections intra-péritonéales d'immunothérapie ou d'IgG contrôle : 1 injection d'une minute tous les 3 jours pendant un total de 9 jours, soit 4 injections au total. Injections intra-tumorales : 1 minute, 1 injection unique/souris

Impact sur les animaux

Ils sont liées aux injections en intrapéritonéales ou sous-cutanées sous anesthésie locale, aux injection intra-tumorales après anesthésie gazeuse et aux séances d'irradiations localisées. Les séances d'irradiation seront effectuées sur la tumeur uniquement grâce à des caches adaptés, le risque de dommages aux tissus et organes sains adjacents est donc très limité. Aucun effet indésirable de ces irradiations localisées n'est donc à prévoir.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir procéder à des analyses de laboratoire sur les tumeurs prélevées.

Remplacement

Le cancer est aujourd’hui la 1ère cause de décès chez l’homme et la 2ème chez la femme en France. Malgré la révolution thérapeutique que constitue l’immunothérapie, seul un nombre limité de patients présente une réponse tumorale significative aux inhibiteurs de checkpoints immunitaires utilisés seuls. Un nombre croissant de données suggère que de faibles doses de radiothérapie délivrées sur la tumeur pourraient augmenter la réponse anti-tumorale induite par l’immunothérapie, le tout avec un excellent profil de tolérance. La compréhension des mécanismes soutenant cette stratégie d’association est source d’espoirs pour de nombreux patients atteints de cancers métastatiques présentant une réponse insuffisante à l’immunothérapie et un pronostic réservé. Le recours à un modèle animal est nécessaire car les interactions entre radiothérapie, immunothérapie, tumeur et système immunitaire de l'hôte font appel à des processus cellulaires et moléculaires complexes impossibles à reproduire de façon fiable sur des modèles alternatifs. De plus, l’étude de l’efficacité de l’association entre radiothérapie à faible dose et immunothérapie sur une tumeur constituée ne peut se vérifier que sur un modèle in-vivo.

Réduction

Nous allons tester plusieurs schémas d’irradiation à faible dose délivrés en 1 ou 2 séances, associés ou non à une immunothérapie anti PD-L1. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux nécessaire, nous avons réalisé une analyse statistique à priori à l’aide du logiciel GPower, version 3.1. Afin de calculer le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives, nous avons choisi le test ANOVA avec les paramètres suivants : effect size f = 0.25 ; puissance = 0.9 ; risque d’erreur α = 0.05. En considérant un total de 48 lots, nous avons besoin de 25 souris par lot, soit 1200 souris au total : 1) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 1 fraction associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle), 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul), 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée), 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en une séance (monofractionnée). 2) Efficacité de la radiothérapie faible-dose délivrée en 2 fractions associée à l’immunothérapie anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec IgG contrôle (groupe contrôle) 1 lot non-irradié avec immunothérapie anti PD-L1 (groupe anti PD-L1 seul) 7 lots avec IgG contrôle + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée). 3) Influence des macrophages sur l'efficacité de la combinaison thérapeutique associant radiothérapie faible dose et anti PD-L1 : 16 lots, 25 souris/lot soit 400 souris au total. Dans le détail : 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 + injection intra-tumorale de PBS, 1 lot non-irradié avec anti PD-L1 et injection intra-tumorale de clodronate, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de PBS, 7 lots avec anti PD-L1 + des doses croissantes d’irradiation délivrées en 2 séances (bifractionnée) + injection intra-tumorale de clodronate. Dans le but d’utiliser le moins d’animaux possible, une analyse statistique a été effectuée a priori. Celle-ci a estimé le nombre de souris nécessaire à 1200.

Raffinement

Des stratégies d’expérimentation et d’observation visant à réduire au minimum la souffrance des animaux ont été instaurées. Dans ce cadre, les administrations d’immunothérapie s’effectueront sous anesthésie locale pour réduire le risque de stress et de douleur. L'administration intra-tumorale de clodronate sera effectuée après anesthésie gazeuse à l'isoflurane 3%. Par ailleurs, les souris seront hébergées en groupe, avec nourriture et eau ad libitum, ainsi qu’un environnement enrichi en coton et nids en carton pour respecter leur bien-être. Une surveillance du poids et du volume tumoral sera effectuée régulièrement. Le respect des points limites et d’un volume tumoral limite seront strictement observés.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie, utilisée dans la quasi-totalité des études dans ce domaine. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues, ce qui facilite le transfert en clinique des résultats acquis lors des expérimentations précliniques dans cette espèce. Les animaux seront utilisés entre l’âge de 8 et 10 semaines bien après sevrage, âge à partir duquel les souris peuvent supporter les rayonnements ionisants.

2 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et 275 non greffés réutilisés pour de la formation. Une tumeur leur est induite par injection dans le péritoine, parfois précédée d'une irradiation, puis ils reçoivent des composés à tester par voies multiples, avec prélèvements sanguins et imagerie répétés. Le porteur indique que les prélèvements de sang sont le geste le plus stressant et que les animaux greffés ne peuvent plus servir à autre chose. Il décrit les reconstructions de tumeurs en 3D comme marginales et difficilement transposables à l'Homme.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Parmi les cancers, le cancer colorectal est le deuxième plus mortels (plus de 900 000 décès en 2020 pour environ 1,93 million nouveaux cas). Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer coliques déjà mis en place dans notre établissement ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter ces tumeurs viscérales coliques chez l’homme. Pour cela, nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des cancers de la cavité abdomino-pelvienne ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier, dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, les mécanismes d’évolution des cancers ou de métastases dans la cavité abdomino-pelvienne. Grâce à ces études et dans un environnement adapté (ajout de cellules immunitaires humaines ou dans un système immunocompétent), il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). - Selon les modèles, les animaux seront transportés vers le site où ils seront irradiés (une seule fois, 2 heures). - Selon les modèles, un implant sous cutané sera posé sous anesthésie (une seule fois, 5 minutes) - Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). - Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisants administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention avec ou sans anesthésie générale (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. - Pesée des animaux (moins de 1 minute) - Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). - Recueil d’urine en hébergement individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). - Techniques d’imagerie, potentiellement répétées : sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal : -Identification des animaux : implantation d’un transpondeur, clips d’oreilles ou tatouage (1 minute) -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation (2 heures) -Pose d’un implant Sous Cutané (5 minutes) -Induction tumorale par IP (1 minute) -Radiothérapie (1heure) -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée (1 minute) -Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie, 1 heure) Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique (1 minute) Au début de l’étude, les animaux seront distribués dans des groupes de traitement. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger pendant 1 à 2 jours. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation (30 minutes) Les prélèvements de sang en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal (5 minutes).

Devenir

Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée. Tous les animaux greffés et inclus dans les groupes de traitement seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux non greffés et surnuméraires peuvent être réutilisés pour formation.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations interindividuelles. Entre 10 et 20 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle ou d’amplification tumorale) à 15 groupes. Le nombre d’animaux par groupe peut varier généralement entre 3 et 15, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisées dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. Pour les modèles de cancer dont l’induction est réalisée en intrapéritonéale un nombre d’animaux surnuméraire de 5% pourra être utilisé (pour 100 animaux, 105 seront greffés).

Raffinement

De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations vétérinaires en termes d’anesthésie, de volume, fréquence et antalgie. Ces actes seront réalisés sous anesthésie (sauf pour les administrations orales) avec l’analgésie appropriée pour les injections en intramusculaire/intradermique (opiacés). Les traitements par radiothérapie seront faits sous anesthésie générale. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal permettant d’atteindre l’objectif de l’étude plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un groupe contrôle d’animaux non porteur de tumeur sera utilisé pour monitorer la prise de poids moyen naturelle des animaux au cours de l’étude. La croissance tumorale de chaque animal sera suivie par la différence de prise de poids de l’animal de l’étude par rapport à la prise de poids moyenne d’animaux non porteur de tumeur. Un pourcentage de prise de poids supérieur à 10% constituera un point limite.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à partir de l’âge de 6 semaines afin que leur morphologie facilite l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester et le développement de la tumeur.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Atteintes de mucoviscidose, elles reçoivent des injections de cellules tumorales ou des injections répétées d'uréthane pour induire des cancers, afin d'étudier le sur-risque tumoral lié à la maladie. Le porteur affirme que ses modèles de culture in vitro suffisent pour la majorité des expériences mais qu'une approche sur "organisme entier" reste "nécessaire" pour la tumorigenèse. Il renvoie les développements thérapeutiques à de possibles pistes futures.

Objectifs

Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.

Bénéfices attendus

Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales (1 seule injection), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 4 semaines). Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 4 injections par animal.

Impact sur les animaux

Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (4 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 4ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.

Devenir

Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.

Remplacement

Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexe et sur le long terme comme la tumorigénèse.

Réduction

Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Notre projet nécessitera 168 animaux au total.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.

Choix des espèces

L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement tumoral. Nos précédents travaux publiés ont utilisé le modèle de souris envisagé dans ce projet, et mis en lumière des défaut vasculaires qui pourraient expliquer l’apparition de cancers. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris particulier au travers de différents modèles tumoraux nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature

1 576 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse de cellules tumorales issues de patients, puis des traitements par gavage, dans l'eau de boisson ou par voie intrapéritonéale, avec une imagerie hebdomadaire, avant sacrifice pour analyser l'infiltration tumorale. Le porteur indique que l'injection de cellules tumorales peut provoquer une perte de poids rapide et une hépatite, et vise à tester des traitements contre un lymphome intestinal compliquant la maladie cœliaque. Il affirme que la réponse des cellules malignes ne peut être reproduite in vitro.

Objectifs

La maladie coeliaque est une maladie intestinale inflammatoire fréquente induite par l’ingestion de gluten un protéine présente dans les farine (blé, orge, seigle). Une complication rare mais sévère est l’émergence de lymphomes intestinaux chez des patients ne répondant pas au régime sans gluten. L'accumulation de lymphocytes intestinaux peut donner naissance, chez certains patients coeliaques à un lymphome intestinal aussi appelé maladie coeliaque réfractaire de type II. Les cellules formant le lymphome contiennent des mutations hautement récurrentes augmentant l'activité d'une enzyme et/ou d'un facteur de transcription ainsi qu’un spectre de complémentaire d’autres mutations. Notre hypothèse est que ces mutations confèrent un avantage dans l’environnement intestinal inflammatoire des patients coeliaques. Le clone de cellules mutées pourrait ainsi s’expandre aux dépends des cellules normales et aboutir à un lymphome intestinal. Ce lymphome évolue initialement à bas bruit mais peut dans 40-50% des cas évoluer vers un lymphome invasif de très mauvais pronostic. Un objectif important est la mise au point de traitements capables d’éliminer les cellules mutées précocement avant l'aggravation de la maladie. Il semble en particulier important de tester les inhibiteurs spécifiques de l'enzyme et du facteur de transcription muté. Néanmoins la présence d’un nombre important de mutations additionnelles expose au risque de résistance des cellules au traitement. Notre but est de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques dans un modèle de souris obtenu par injection de lignées cellulaires malignes issues des biopsies intestinales de patients atteints de maladie coeliaque réfractaire de type II. Nous chercherons à évaluer leur efficacité sur le développement tumoral mais aussi le risque de sélection de cellules tumorales résistantes aux traitements, ceci afin d’évaluer les bénéfices et risques des traitements pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de tester l’efficacité des différentes molécules ciblant les voies de signalisations impliquées sur le développement des cellules tumorales et de tester un possible échappement. Seules des drogues déjà autorisées en clinique humaine seront utilisées, suggérant qu’il n’y aura pas de toxicité excessive. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des traitements permettant de prévenir ou stopper le développement de lymphomes chez les patients coeliaques.

Procédures

Injection de cellules tumorales de patient (réalisée sur 1576 souris) : Les lignées cellulaires humaines transduites ou non seront injectées par voie intraveineuse rétro-orbitaire avec des seringues menues d’aiguilles à insuline(durée de l’injection : 5 secondes). Administration de traitements (réalisé sur 1176 souris) : - un traitement délivré en per os dans l’eau de boisson tous les deux jours (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes) - deux traitements administrés par gavage oral tous les jours à l’aide d’une aiguille de gavage d (réalisé sur 588 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). - un traitement administré par voie intra-péritonéale deux fois par semaine (réalisé sur 294 souris) (durée de l’injection : 5 secondes). Imagerie intra-vitale (réalisée sur 616 souris) : Les souris seront imagées à l’aide de l’IVIS spectrum 1 fois par semaine depuis l’injection des cellules tumorales jusqu’au sacrifice. Le temps d’imagerie dépend de la puissance du signal mais ne dépasse pas 30 min par animal.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Les souris génétiquement modifiées que nous souhaitons utiliser ne présentent pas de phénotype dommageable dans nos conditions d'utilisation. L'injection de cellules tumorales humaines est succeptible d'entrainer une perte de poids rapide ainsi qu'une hépatite.

Devenir

Les animaux seront tous sacrifiés à la fin de chaque procédure afin d'analyser l'infiltrat de cellules tumorales dans les différents organes (rate, foie, sang, rein et intestin).

Remplacement

La réponse de cellules malignes à un traitement est un mécanisme complexe qui ne peut être récapitulée in vitro. Nous avons dans un premier temps utilisé des cultures primaires in vitro pour cerner les drogues d’intérêt, nous permettant de réduire fortement l’utilisation d’animaux. Les cellules de patients étant fragiles et difficiles à cultiver in vitro, l’utilisation de modèle murin nous permettra de les amplifier dans un contexte riche en IL-15 afin de tester plusieurs stratégies thérapeutiques et de déterminer les effets de ces molécules sur les cellules transformées et d’évaluer le risque d’échappement tumoral favorisant leur progression vers des lymphomes invasifs.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible en tenant compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse, incluant pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles et de la nécessité de reproduire les résultats. Le nombre de 5 souris/lot est choisi pour permettre les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre de souris, la viabilité cellulaire sera quantifiée avant toute injection pour optimiser la prise de greffe.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages adaptées aux rongeurs, mâles et femelles séparés, et le nombre d’individus par cage limité entre 2 et 5 individus pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes d'agréssion ou de stress engendrés par une population trop importante. Nous serons aussi très attentifs au bien-être des animaux. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement par la mise à dispositionde boules de coton, de maisonnettes en carton, de bâtonnets à ronger et d’un tunnel. La surveillance du bien-être des animaux sera assurée au quotidien par le personnel de l’animalerie et hebdomadaire par les expérimentateurs. Les expériences et en particulier l’injection de cellules seront réalisées par des personnes expérimentées et qualifiées afin d'éviter toutes fausses manipulations ou un éventuel stress pour les animaux. Les procédures d’injection sont peu douloureuses mais l’utilisation d’anti-inflammatoires ou analgésiques pourrait compliquer l’interprétation des résultats sur la progression tumorale. Les animaux seront alors particulièrement surveillés lors de ces procédures. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, les prélèvements de sang se dérouleront sous anesthésie locale avec de la tétracaïne et les injections de cellules malignes humaines sous anesthésie générale . Le réveil se déroulera dans un environnement calme et silencieux. Des points-limite ont été établis, consuisant à la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera surveillé de façon quotidienne et selon la progression des symptômes observés via une grille d’évaluation, la prise de greffe et les variations de poids corporel.

Choix des espèces

Les souris immunodéficientes constituent un modèle d’étude reconnu pour la réalisation de greffes humaines. L’expression d'un facteur de croissance humain que nous savons indispensable à l’expansion des cellules malignes in vitro et qui assurera l'expansion des cellules de patients après injection chez la souris immunodéficiente. Les souris utilisées seront des souris adultes d’environ 8 semaines.

105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules souches humaines, elles reçoivent des injections répétées à doses croissantes d'un traitement anticancéreux, des prélèvements sanguins et une imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine, avant euthanasie. L'objet est le développement préclinique d'une immunothérapie contre des cancers du sang avant un essai clinique, les retombées pour les patients restant renvoyées à ce projet futur. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut se modéliser in vitro et invoque l'effet de l'organisme entier.

Objectifs

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR in vivo (stratégie d’immunothérapie cellulaire) ciblant un marqueur tumoral que nous souhaitons mener jusqu’à la démonstration de sa sécurité et de son efficacité thérapeutique dans des indications de cancers du sang. Ces résultats sont un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2022. Il s’agit d’évaluer l’efficacité anti-tumorale lorsque notre CAR in vivo est injecté et distribué entre les différents compartiments de l'organisme dans un modèle murin humanisé. Ce projet nous permettra également de démontrer chez l’animal que la modification des cellules sanguines est bien spécifique des lymphocytes T (globules blancs du système immunitaire) ciblés et que notre CAR in vivo est bien toléré lors d’administrations répétées à des doses croissantes. Ces problématiques ne peuvent être abordées que via l’expérimentation animale. Aussi nous explorerons l’efficacité anti-cancéreuse, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines. Le choix de la souris NSG-hCD34+ est justifié car c’est un modèle de référence en oncologie très largement caractérisé́ et dont la prédictibilité a été démontrée dans de nombreuses études en immunothérapie.

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR T-cell in vivo dirigé contre le marqueur tumoral CD19 qui doit nous permettre de démontrer sa sécurité et son efficacité thérapeutique dans des modèles de cancers hématologiques. Cette preuve de concept d’efficacité anti-cancéreuse est un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2023 chez les patients atteints de cancers hématologiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à 5 temps différents (J-7, J+3, J+10, J+17, fin de projet). Ils seront aussi soumis à des injections par perfusions ou injections, ces perfusions/injections seront au nombre de 3 à 5 d'affilé. Ils passeront ensuite des examens d'imagerie par bioluminescence 1 à 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isolflurane

Remplacement

La biodistribution d'un composé implique une interaction forte entre les différents compartiments de l'organisme, c'est à dire un échange entre le sang et les organes. Actuellement, il n'est pas possible de modéliser cette répartition tissulaire in vitro. Par ailleurs, même si l'innocuité des composantes de notre produit (lentivecteur + polymère + agent de ciblage anti-CD3) a déjà été vérifiée dans nos tests cellulaires et in vivo (par d’autres groupes), l'effet de l'organisme entier sur le lentivecteur associé au polymère ne peut être complétement évalué. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l’efficacité, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris NSG (NOD scid gamma) immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines. L’expérimentation chez la souris est nécessaire pour démontrer que la transduction des cellules cibles est toujours efficace quand notre produit injecté en systémique et distribué entre les différents compartiments de l'organisme.

Réduction

Afin de minimiser la consommation inutile des 105 souris qui pourraient être exposées à des doses dépassant la dose maximale tolérée, nous avons prévu 3 procédures qui seront lancées de manière séquentielle après avoir vérifié que les doses et protocoles d’injections de la procédure précédente ne présentent pas de toxicité macroscopique particulière. Le nombre de souris par groupe nécessaire et suffisant pour pallier à la forte variabilité interindividuelle observée en imagerie de bioluminescence et en cytométrie de flux a été défini. De plus il permet de démontrer l’efficacité du traitement par rapport aux groupes contrôles grâce à l’analyse statistique des résultats (tests one-way ANOVA et Kaplan-Meier) avec une signification suffisante (valeur p

Raffinement

Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement est aussi quotidiennement contrôlé et l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose)

Choix des espèces

La souris est le modèle de référence en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. La multitude de références bibliographiques en fait donc un modèle de choix. Par ailleurs, de nombreuses études en immunothérapie ont montré de bons résultats dans le modèle murin NSG-hCD34+. Ces animaux sont greffés avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines et se caractérisent par une excellente maturation des cellules T et la présence de cellules CD4+ et CD8+ dans la circulation et autres tissus. Cette souche constitue un modèle idéal pour vérifier in vivo la spécificité pour les lymphocytes T des promoteurs humains et des aptamères anti-CD3 développés en interne. Enfin le modèle de lymphome choisi et basé sur l’injection systémique de cellules Ramos humaines exprimant la Luciférase est également un modèle reconnu qui a été utilisé pour l’évaluation préclinique de différents agents anti-cancéreux. Les animaux utilisés seront adultes. Ce choix est nécessaire pour pouvoir injecter des volumes d’au moins 250 µL en iv ou 450 µL en perfusion contrôlée et lente (22,5 µL/min) étant contraints par les titres (nombre de particules virales infectieuses) de nos préparations de lentivecteurs. Après réception dans l’animalerie et observation de la quarantaine, une période supplémentaire de 2 semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et régime alimentaire sera respecté afin de réduire autant que possible l’état de stress des individus et ainsi avoir des animaux dans un état général optimal pour supporter des anesthésies générales répétées.