Cancers

480 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de tumeur sous la peau puis des injections repetees de traitements, avant d'etre tue pour analyser la tumeur. Le porteur affirme que les souris vivent sans contrainte majeure jusqu'a la fin et suit quotidiennement la taille des tumeurs pour ne pas depasser un point limite. Les rubriques objectifs et benefices reprennent mot pour mot la meme liste d'objectifs, sans decrire le benefice attendu pour les patients.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont: - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la prévention et le ralentissement de la croissance tumorale. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la survenue de métastases pulmonaires. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm en combinaison avec une immunothérapie ou une chimiothérapie sur la croissance tumorale. - D'évaluer l'implication des lymphocytes T CD8 dans la réponse anti-tumorale induite par la stratégie vaccinale.

Bénéfices attendus

Les objectifs de ce projet sont: - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la prévention et le ralentissement de la croissance tumorale. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm vectorisé sur la survenue de métastases pulmonaires. - D'évaluer l'efficacité d'une stratégie vaccinale à base d'ARNm en combinaison avec une immunothérapie ou une chimiothérapie sur la croissance tumorale. - D'évaluer l'implication des lymphocytes T CD8 dans la réponse anti-tumorale induite par la stratégie vaccinale.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sous-cutané lors de la greffe des tumeurs (1 fois, 20 secondes) et à des injections intrapéritonéales pour l'admisnitration des traitements (entre 3 et 6 sur toute la durée du protocole; 15 sec par injection)

Impact sur les animaux

La greffe des tumeur sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables particuliers en réponse aux traitements. Les immunothérapies, la stratégie vaccinale et la chimiothérapie ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitemetns n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires. Le niveau de nuisance dûe à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur, cependant, les souris vivent sans contrainte majeure jusqu'à la fin du protocole.

Devenir

A l'issue de chaque procédure le sacrifice des animaux sera effectué afin de procéder aux analyses des tumeurs.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, les évaluations de nouveaux agents thérapeutiques en oncologie doivent être réalisées sur les organismes vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux minimum requis est calculé afin d’assurer une fiabilité statistique. Aussi, afin de réduire l’utilisation de souris, nous évaluerons sur le même animal la fonction des lymphocytes et la croissance tumorale lors d’expérience nécessitant l’utilisation de traitements sur des temps longs.

Raffinement

Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi quotidien de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Ce suivi individuel permettra la surveillance du bien-être des animaux qui seront hébergés par groupe de cinq à dix dans un établissement agréé.

Choix des espèces

La souris, outre l’avantage lié à ses caractéristiques physiologiques, est la seule espèce animale pour laquelle des anticorps bloquants variés sont commercialisés (aPD-1 ; aCD8β) facilitant les investigations expérimentales et l’utilisation de combinaisons thérapeutiques. Ces modèles murins sont commercialisés, donc accessibles facilement, et permettent de standardiser au maximum nos expériences. D’autres part le modèle OVA n’existe que chez la souris et nous possédons les lignées tumorales murines exprimant l’OVA. Enfin les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique chez l’humain. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 10 et 20 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

1848 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de tumeur sous la peau puis des traitements, avant d'etre tue pour des prelevements, le resume restant tres bref sur le deroule des procedures. Le porteur prevoit une mise a mort par dislocation des qu'un point limite est atteint et administre le butyrate dans l'eau de boisson pour limiter les manipulations. Il qualifie le recours a l'animal d'"incontournable", jugeant impossible de reproduire le systeme immunitaire et ses interactions hors d'un organisme vivant.

Objectifs

Les acides gras sont naturellement présents dans la circulation sanguine et sont utilisés comme source d’énergie par le corps humain. Lorsque ces acides gras possèdent 6 atomes de carbones ou moins, ils sont qualifiés d’acides gras à chaines courtes (AGCC). Lors d’une précédente étude, nous avons démontré que des souris recevant une boisson enrichie en butyrate (AGCC possédant 4 atomes de carbones) et traitées avec un anticorps monoclonal (médicament fabriqué en laboratoire qui est capable de se fixer spécifiquement sur une cible désignée) présentaient une réponse anti-tumorale significativement réduite par rapport aux souris également traitées mais buvant de l’eau normale. Une observation similaire a été faite dans une étude clinique chez l’homme : des concentrations plus élevées en AGCC (butyrate ou propionate, respectivement 4 et 3 carbones) ont été mises en évidence dans le sang des patients n’ayant pas répondu à un traitement par anticorps monoclonal. Ce projet a pour but de déterminer si l’efficacité d’un traitement par un type d’anticorps monoclonal (anticorps actuellement le plus fréquemment utilisée chez l’homme pour combattre le cancer) pouvait également être altérée par le butyrate. Si c’est le cas, le butyrate pourrait alors devenir une molécule prédictive de la réponse au traitement anti-cancéreux. Evaluer les effets des acides gras à chaine courte (AGCC) sur la réponse anti-tumorale et mettre en évidence les mécanismes immunosuppresseurs induits par les AGCC (butyrate et propionate) induisant une résistance aux médicaments ciblant et bloquant les checkpoints immunitaires.

Bénéfices attendus

Le butyrate (et dans une moindre mesure le propionate) sont décrits comme pouvant réduire l’activité du système immunitaire : en grandes quantités, ils vont faire pencher la balance immunitaire en faveur d’une tolérance (pouvant expliquer la tolérance vis-à-vis de la tumeur). La compréhension des mécanismes d’actions permettrait de proposer des molécules bloquant l’action des AGCC qui pourraient, à terme, être utilisées chez l’homme en combinaison des traitements actuels pour augmenter les chances de réponses.

Procédures

Greffes de tumeurs par voie sous-cutanée.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à la présence de tumeurs greffées en sous-cutané, et d'administrations de médicaments.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses.

Remplacement

Ce projet nécessite de travailler sur des souris vivantes car il est actuellement impossible de reproduire les mécanismes du système immunitaires ex-vivo du fait de sa complexité . Les modèles in-silico et in-vitro sont importants et permettent de tester les hypothèses développées dans une certaine mesure. Cependant ces modèles présentent rapidement leurs limites : ce projet s’intéresse à la modulation du système immunitaire en fonction de la concentration en AGCC. Les expérimentations font donc appel aux interactions s’établissant entre plusieurs systèmes complexes (système digestif, système immunitaire …) qui ne peuvent être reproduit in-vitro. Le caractère incontournable du recours à l’animal est de nous permettre d’étudier, dans sa globalité, la modulation du système immunitaire (et ses interactions avec les autres systèmes complexes). Pour l’heure, il reste impossible de reproduire le système immunitaire et ses interactions avec les autres systèmes ex-vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre de souris nécessaire grâce au logiciel G*Power et d’après le critère le plus pertinent : le volume tumoral. Le nombre d’animaux a été calculé à l’aide d’un test Wilcoxon-Mann-Whitney et d’après les moyennes et les écarts types obtenus après 23 jours de croissance tumorale (plus grande différence de surface entre les groupes de souris). Les variables obtenues et utilisées dans le calcul sont les suivantes : « effect size d » = 0.954, α=0.05 et « Power » =0.85.

Raffinement

Les injections seront faites sous anesthésie locale (lidocaïne) ou générale (isoflurane). Les prélèvements de sang se feront au niveau la veine submandibulaire pour réduire la douleur au long terme induite par ce genre de procédure. De plus, au moment du prélèvement, les souris seront maintenues sous anesthésie par isoflurane (1 à 1.5L/min d’air à une concentration de 1.5 à 2% d’isoflurane) et nous vérifierons que les souris sont bien endormies avant de procéder à la piqûre. Les souris seront également surveillées jusqu’à leur réveil pour contrôler le bon rétablissement après anesthésie. Les cages seront enrichies avec du sizzle nest et des tubes en carton permettant de réduire le stress induit à chaque fois qu’elles seront manipulées. De plus lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris seront placées en quarantaine pendant 1 semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les acides gras administrés aux souris seront directement présents dans l’eau de boisson. Cela réduit fortement l’angoisse et la douleur engendrées chez les souris car cela évite des administrations de produit quotidiennement par gavage ou par injection intrapéritonéale. Enfin les souris ayant reçues des cellules tumorales seront surveillées quotidiennement et la détection de points limites entrainera un sacrifice par dislocation.

Choix des espèces

Le butyrate a montré qu’il était capable d’inhiber de la réponse anti-tumorale aux immunothérapies chez la souris. Il est donc cohérent de poursuivre la caractérisation des mécanismes d’actions dans ce modèle animal. Les anticorps bloquant les checkpoints immunologiques CTLA-4 et PD-1 que nous souhaitons étudier ont été développés et optimisés chez la souris et ont fait leurs preuves. Nous utiliserons deux modèles syngéniques : BALB/c et C57Bl/6. Ces modèles sont capables de porter des tumeurs décrites comme sensibles aux immunothérapies (CT26 et MC38 et B16K1). Les souris BALB/c et C57Bl/6 possédant des fonds génétiques différents, les mécanismes impliqués dans la réponse anti-tumorale varient également. Un parallèle peut être fait avec l’homme dont la diversité génétique explique les variabilités de réponse face aux traitements. Nous intéresserons également à un modèle tumorale capable de faire de la dissémination métastatique (4T1) qui ne peut être greffé que sur le modèle BALB/c. Les souris qui seront utilisées auront au minimum 8 semaines. Elles auront d’une part atteint la maturité sexuelle et d’autres part, elles auront fini de développer leur système immunitaire. Travailler sur le système immunitaire mature des souris permettra, en partie, de faire le parallèle avec celui de l’homme.

578 souris immunodeprimees vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de cellules de glioblastome humain dans le cerveau par ouverture du crane, puis des seances hebdomadaires d'imagerie sous anesthesie et des instillations nasales de candidats-medicaments, une moitie etant en plus irradiee, avant d'etre tuee pour analyser la progression tumorale. Le porteur decrit surtout le stress lie aux anesthesies repetees et prevoit une mise a mort des qu'un point limite de degradation est atteint. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, les organoides cerebraux ne reproduisant pas selon lui la complexite du microenvironnement tumoral.

Objectifs

Avec plus de 3000 nouveaux cas par an en France, les récidives de gliomes de bas grade ainsi que les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales avec un mauvais pronostic et pour lesquelles les traitements sont lourds mais peu efficaces. Néanmoins, la chirurgie en association à la radiothérapie et la chimiothérapie permet de prolonger de quelques mois la survie. En effet, la survie des patients après diagnostic n’excède pas 2 ans y compris après un traitement. Dans des études in vitro, nous avons sélectionné de nouvelles molécules qui en association avec la radiothérapie réduisent la croissance des cellules tumorales. Nous proposons de tester ces nouvelles molécules dans un modèle préclinique. La transplantation intracérébrale de cellules issues de gliomes humains chez des souris est le modèle de choix pour tester l’efficacité d’approches pharmacologiques en combinaison avec la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique permettra d’évaluer l’efficacité in vivo de molécules pour réduire la croissance de cellules de gliomes. Ce travail pourra servir de référence pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques du cancer du cerveau le plus fréquent chez l’Humain adulte.

Procédures

L’opération de xénogreffe comporte 4 étapes : injection d’un antalgique, une anesthésie, ouverture minime de la boîte crânienne et injection de cellules issues de gliomes humains dans le cerveau de l’animal, pour une durée totale de l’opération de moins de 20 min par souris. L’imagerie par bioluminescence sera réalisée de façon hebdomadaire durant 5-9 semaines. Cette mesure nécessite une anesthésie gazeuse de l’animal pour 15-20 min et l’administration intrapéritonéale d’un composé. Deux mois après la greffe, les candidats-médicaments seront administrés par instillation nasale sous anesthésie légère à raison de 5 fois par semaine et pour 1 ou 3 semaines selon la procédure. L’administration est réalisée sous anesthésie gazeuse et dure moins de 5 min. Les jours de mesure de bioluminescence, l’administration sera réalisée au cours de la même anesthésie. La moitié des animaux sera exposée à une radiothérapie sous anesthésie gazeuse pour une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure attendue de cette expérimentation concerne le stress provoqué par les anesthésies gazeuses répétées (opération de transplantation, instillations nasales). L’opération de transplantation est un acte chirurgical qui représente des effets indésirables mais celui-ci est bien maîtrisé et les animaux se rétablissent rapidement après l’opération. L’instillation nasale d’un petit volume d’une solution saline est une méthode non-invasive permettant l’administration de petites molécules qui vont diffuser dans le cerveau. Le stress lié à cette approche réside dans les anesthésies répétées, la contention et l’obstruction momentanée d’une narine. La radiothérapie requiert une anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal mais l’exposition à l’irradiation ne génère pas de souffrance et la dose utilisée n’engendre pas d’effets néfastes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever le cerveau afin de réaliser des analyses histologiques et d’évaluer l’effets des composés pharmacologiques sur la progression tumorale.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune alternative à l’utilisation d’animaux pour l’étude du glioblastome, particulièrement en raison du microenvironnement tumoral qui joue un rôle défavorable et ne peut être reproduit dans un système in vitro. Des cultures d’organoïdes cérébraux sont en cours de développement mais ce modèle expérimental, dépourvu de certains types cellulaires impliqués dans la croissance tumorale, ne représente pas à ce jour toute la complexité du modèle in vivo.

Réduction

Dans ce projet, deux candidats-médicament seront évalués dont l’un d’entre eux est connu pour ne pas présenter d’effet indésirable in vivo. Des essais de non-toxicité pour la deuxième molécule seront réalisés au préalable et en cas d’effets cliniques néfastes, son utilisation sera interrompue ; l’étude sera limitée à la première molécule. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été défini en fonction de la littérature et notre expérience sur la variabilité des expériences de transplantation. Plusieurs types de cellules de glioblastomes représentant différentes caractéristiques des glioblastomes sont inclues dans cette étude. Les expérimentations seront réalisées indépendamment pour chacun des types de cellules de glioblastome et de façon séquentielle si bien qu’en cas d’évolution tumorale défavorable le protocole pourra être interrompu plus précocement et éviter l’utilisation de tous les groupes d’animaux.

Raffinement

Afin de protéger d’une éventuelle contamination par l’environnement, ces animaux immuno-déficients seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes dans des cages avec un système de ventilation contrôlée. Mise en place d’un protocole d’anesthésie/analgésie. Mise en place d’un suivi clinique régulier avec l’aide d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Des critères de point limite ont été établis et leur expression justifiera l’interruption de l’expérience et la mise à mort de l’animal pour lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules humaines sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour éviter tout rejet. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris présentant un thymus rudimentaire, connu pour supporter la transplantation et la croissance de cellules de gliomes humains dans leur cerveau. Par ailleurs, ce modèle de souris présente une faible radiosensibilité et permet l’étude de la radiothérapie contrairement à d’autres modèles de souris immunodéficientes. Le gliome est une tumeur cérébrale fréquente chez l’adulte qui affecte sans distinction les mâles et les femelles. Nous utiliserons donc des animaux adultes mâles et femelles.

2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intraveineuses de candidats médicaments et des prélèvements sanguins répétés à la veine submandibulaire, réalisés sous simple contention sans anesthésie, avant une mise à mort par dislocation cervicale pour analyse des organes. Le porteur reconnaît que la toxicité inconnue des molécules testées peut provoquer des douleurs non prévues et que les manipulations génèrent inconfort et angoisse. Il indique avoir limité la phase in vivo grâce à des modèles cellulaires et des organoïdes, tout en la jugeant nécessaire pour évaluer toxicité et efficacité des cinq candidats anticancéreux.

Objectifs

Le développement de traitements anti-cancéreux demeure un sujet d’actualité. Ce développement comporte différentes phases qui vont de l’identification de la cible thérapeutique jusqu’aux dernières phases d’essais cliniques. Entre la phase de l’identification de la cible thérapeutique impliquée dans l’agressivité de cette maladie et l’entrée en phases d’essais cliniques, il est nécessaire de sélectionner le candidat médicament le plus efficace et le moins toxique (phase de recherche et de développement préclinique). Cette phase préclinique a pour but de bien caractériser le mécanisme d’action du candidat médicament, de valider son efficacité et sa bonne innocuité. Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place afin de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire pour la réalisation des études de toxicité (identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), des études pharmacocinétiques (caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant) et des études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Durant ces différentes études expérimentales, des administrations, des suivis tumoraux et des prélèvements divers sont réalisés sur les animaux. L'objectif principal est de valider le mécanisme d'action de 5 nouveaux candidats médicament (à raison de un candidat/an), de s'assurer de leur bonne innocuité, de bien caractériser leurs paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques afin d’avoir une efficacité antitumorale optimale. Cette caractérisation préclinique est primordiale afin d’identifier les meilleurs schémas de traitement et de préparer au mieux les futurs essais cliniques avec ces nouveaux candidats médicament anti-cancer. Les études se porteront sur les cancers suivants : les cancers du pancréas, du sein, des ovaires et du poumon.

Bénéfices attendus

Ces études représentent une phase essentielle dans l’estimation du bénéfice/risque des nouveaux candidats médicaments développés pour le traitement du cancer.

Procédures

Dans le présent projet, les études sont réalisées sur des souris immuno-déficientes et immunocompétentes. Pour la majeure partie de ces gestes techniques, l’animal vigile est maintenu sous contention. Différents protocoles expérimentaux sont réalisés. Des greffes de cellules tumorales par injection en sous cutanée sur souris vigile (1 injection de 5 secondes). Des administrations en intraveineuses (1 fois par semaine) des candidats médicaments sur souris non anesthésiées (5 à 10 secondes par injection), en utilisant différents schémas de traitement pendant la durée de l’expérimentation. A la suite de l’administration, des prélèvements sanguins (2 prélèvements par souris, 10 secondes par acte) sont effectués à la veine submandibulaire sur souris non anesthésiées à différents temps (9 temps). Le sang est recueilli dans un tube de prélèvement adapté et est par la suite analysé selon les besoins de l’étude. Les organes ainsi que les tumeurs seront récupérés pour les analyses ex-vivo. Une contention manuelle est réalisée pour l’injection de cellules tumorales en sous-cutanée, le puçage des souris en sous-cutanée (10 secondes par manipulation) pour effectuer l’identification et le suivi tumoral, de l’injection des cellules tumorales jusqu’au prélèvement sanguin à la veine submandibulaire. Une contention mécanique est réalisée pour les injections intraveineuses des candidats médicaments (boites à contention).

Impact sur les animaux

Un des protocoles peut induire des douleurs non prévues, inhérentes au fait de la toxicité des candidats médicaments n'est pas connue. Un autre protocole peut induire un inconfort et une angoisse liés à la manipulation de la souris et aux prises de sang effectuées. Les deux derniers peuvent induire un inconfort, une angoisse liée à la manipulation des souris, des douleurs liées à l'administration des cellules tumorales et aux injections en intraveineuses.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale pour analyses des organes principaux.

Remplacement

Différentes études in vitro sur des modèles de cellules tumorales et des modèles plus « sophistiqués » comme des « avatars » de tumeurs (structures 3D et organoïdes) ont été mises en place pour permettre de bien caractériser les candidats médicaments sur des modèles relevant, et limiter ainsi la nécessité de recours à plusieurs expérimentations sur des modèles animaux in vivo. Ceci a permis de limiter cette phase in vivo au stricte nécessaire qui sont les études de toxicité (pour identifier la dose maximale tolérée du candidat médicament), les études pharmacocinétiques (pour caractériser le profil d’absorption du candidat médicament et sa distribution dans l’organisme vivant), et les études pour valider l’efficacité anti-tumorale du candidat médicament. Toutefois, l’évaluation du rapport entre la dose toxique et la dose efficace sur des tumeurs nécessite le recours à des organismes modèles de l’Homme. En effet, l’efficacité antitumorale est liée à la disponibilité de la molécule dans la tumeur. L’essai de nouveaux traitements sur des patients nécessite une évaluation préalable de l’efficacité et de la tolérance sur des animaux conformément à la directive 2001/20/CE.

Réduction

Les études visant à déterminer la DMT (dose maximale tolérée) sont menées sur 6 souris par groupe. Ce nombre est lié à la variabilité intrinsèque des signes cliniques observées chez des souris d’une même cage. Ces études ainsi que les études de pharmacocinétiques et d'efficacité antitumorale sont menées avec des analyses statistiques afin de s'assurer de la significativité statistique des résultats obtenus en fonction du nombre de souris par groupe et du nombre de groupes. Par conséquent, pour les études d'efficacité, le nombre d’animaux sera fixé de 15 animaux par groupe. Ce nombre est issu d’un compromis entre la variabilité du succès de l’induction tumorale et du volume tumoral nécessaire pour la détection d’un effet.

Raffinement

Une phase d’observation et un suivi quotidien des animaux est réalisé pour évaluer leur état général. Ce suivi régulier de l’état clinique des souris est nécessaire pour tous les protocoles. L’utilisation d’une grille unique de scoring est mise en place et est décrite dans tous les protocoles. Pour les souris porteuses de tumeurs, la taille de la tumeur sera mesurée 3 fois/semaine afin de surveiller l’aspect et la croissance tumorale. Toutes les observations liées à l’aspect et au volume tumoral sont décrites dans la grille de scoring. Les critères concernant l'apparence, la mobilité et le comportement des animaux sont détaillés. Le changement de poids de l'animal est analysé. Les animaux bénéficient de raffinement tel que : maisonnette, carrés de coton, bâtonnets à ronger. La détermination des points limites et l’utilisation d’une grille de score permettent de réduire, supprimer ou soulager au maximum l'inconfort, la douleur et l'angoisse subis par les animaux. Dès l’atteinte d’un point limite, les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l’isolflurane.

Choix des espèces

Dans le présent projet, nous utiliserons comme petit modèle de rongeur la souris, car les études règlementaires de toxicité et de pharmacocinétique requièrent un modèle rongeur et un modèle non rongeur. Pour les études d’efficacité antitumorale (procédure 3), la souris est un modèle de choix car la majorité des modèles tumoraux sont développés sur des souches de souris. De plus, la souris est un modèle de mammifère dont le profil pharmacologique permet une utilisation préclinique. Jeunes adultes de 6 semaines. Les animaux plus âgés ne sont pas souhaités dans la mesure où la présence de graisse peut entrainer une modification de la biodisponibilité de la molécule. Ces souris (jeunes adultes de 6 semaines) peuvent finir leur croissance ; les animaux à cet âge supportent mieux le transport de l’élevage jusqu’à l’animalerie ainsi que l’anesthésie.

20 primates non-humains, dix macaques à longue queue et dix macaques rhésus, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans mise à mort à l'issue. Chaque animal subit neuf examens d'imagerie sous anesthésie générale pouvant durer jusqu'à cinq heures, avec pose d'une voie artérielle et prélèvements sanguins, pour suivre la distribution de radiotraceurs et de candidats médicaments. Le porteur reconnaît que ces anesthésies répétées et longues peuvent être fatigantes et prévoit la réutilisation des animaux sur décision du vétérinaire. Il retient le primate non-humain pour la proximité de sa physiologie avec celle de l'humain, afin d'extrapoler les résultats.

Objectifs

L’objectif de cette étude est l’évaluation préclinique de la distribution tissulaire de candidats médicaments pour traiter des maladies telles que le diabète, certains cancers et des pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Pour y parvenir, nous synthétiserons des composés radiomarqués que nous injecterons à des primates non humains. La distribution tissulaire sera suivie grâce à une technique d’imagerie non invasive. Cette technique d’imagerie non invasive (tomographie par émission de positons ou monophotonique) consiste à injecter un analogue de composé radiomarqué par différents isotopes à demi-vie courte utilisés en médecine humaine. La distribution tissulaire des composés radiomarqués peut ainsi être mesurée par des approches d’imagerie non-invasive correspondant à chacun des isotopes utilisés. Cette étude permettrait d’évaluer l’exposition tissulaire par le composé radiomarqué, en présence d’un candidat médicament. Les candidats médicaments étudiés ciblent le diabète, le cancer, les pathologies neuropsychiatriques comme l’addiction. Il peut s’agir également de candidats médicaments neuroprotecteurs. Trois séances d’imagerie seront nécessaires. La première imagerie permet d’établir les paramètres pharmacocinétiques initiaux des composés radiomarqués. La seconde imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqués dans des modèles d’une pathologie. La troisième imagerie permet d’étudier la spécificité de la fixation tissulaire des composés radiomarqué en présence d’un candidat médicament. Les doses de médicament seront choisies en fonction de la littérature et du recul de l’utilisation de cette molécule chez l’homme ou chez le primate non-humain.

Bénéfices attendus

Les retombées de ce projet sont majeures puisqu’elles permettront d’apporter des informations indispensables sur l’exposition tissulaire aux doses de radiotraceurs et sur les spécificités de la distribution tissulaire et de l’élimination des candidats médicaments étudiés. Ces résultats peuvent être extrapolés chez l’Homme.

Procédures

Les animaux auront une séance d’imagerie anatomique (IRM) puis trois séances d’imagerie dynamique (TEP) par radiotraceur. Toutes les imageries (IRM et TEP) se dérouleront sous anesthésie générale (durée 300 minutes maximum) pour une acquisition d’une durée de 240 minutes maximum. Il n’y aura pas de prélèvements sanguins pendant l’imagerie IRM, par contre il y aura des prélèvements sanguins à chaque imagerie TEP qui seront séparés de 15 jours au minimum. Une voie artérielle sera positionnée en début d’anesthésie (durée de la pose inférieure à 5 minutes) afin de faire les prélèvements sanguins (durée inférieure à 5 secondes) durant l’examen. Cette voie artérielle sera retirée à la fin de l’examen. Pour 1 des 3 imageries TEP, les animaux recevront une dose pharmacologique du candidat médicament par injection intraveineuse sur 1 minute.

Impact sur les animaux

L’effet indésirable prévu est un stress associé à la contention physique (durée inférieure à 2 minutes) qui précède l’injection de l’anesthésique par voie intra-musculaire ainsi qu’un stress pendant la phase de réveil (durée inférieure à 1 heure). La réalisation d’anesthésies répétées et relativement longues avec injections des médicaments et prélèvements sanguins, peut être fatigante pour l’animal. La mise à jeun la veille au soir pour le lendemain matin et le contrôle hydrique 2 heures avant l’induction de l’anesthésie, peuvent constituer des stress modérés.

Devenir

Le protocole expérimental ne nécessite pas d’euthanasier les animaux. Les animaux pourront être réutilisés sur décision du vétérinaire à la fin de l’étude.

Remplacement

Compte-tenu de la complexité des phénomènes étudiés, il n’existe aucune méthode alternative permettant d’étudier les effets d’un candidat médicament sur un organisme entier et permettre ainsi d’extrapoler les résultats à l’Homme. Afin d’obtenir des données convaincantes d’un point de vue clinique, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier dont l’anatomie et la physiologie se rapprochent au maximum de celles de l’Homme. Cette étude ne peut être envisagée qu’in-vivo chez des primates non-humains dont les déterminants pharmacocinétiques et la physiologie sont plus proches de ceux de l’Homme que ceux des rongeurs.

Réduction

L’approche statistique envisagée permet la comparaison des trois conditions expérimentales entre elles avec suffisamment de puissance pour mettre en évidence un phénomène pharmacocinétique notable, global ou régional. Cette estimation prend en compte la variabilité des mesures observées lors d’études précédentes réalisées chez les primates non-humains. Dans une perspective de réduction du nombre d’animaux nécessaires à l’étude, seulement 20 primates non-humain seront inclus. Chaque animal participera à 9 examens afin d’obtenir des données répétables et représentatives des phénomènes étudiés.

Raffinement

Pendant toute la durée de cette étude, il y aura la mise en place d’un renforcement positif avec un remplacement hebdomadaire (physique) et journalier (alimentaire, sensoriel) des enrichissements de l’environnement. Les primates non-humains seront surveillés quotidiennement par les zootechniciens et les expérimentateurs. Toutes les procédures expérimentales se réalisent sous anesthésie générale. Juste avant le début de la procédure, un examen clinique de l’animal sera systématiquement réalisé. Durant les examens d’imagerie, la température corporelle est monitorée et maintenue à l'aide d'une couverture chauffante à air, suppléée par une perfusion de liquide à 37°C. Les paramètres physiologiques et de ventilation sont suivis et sont utilisés comme indicateurs pour adapter la profondeur d’anesthésie et comme témoins de la gestion de l’analgésie. Durant ces examens la surveillance des animaux est renforcée jusqu’au réveil complet de l’animal (animal debout). Certains animaux possèdent une sensibilité accrue aux agents anesthésiants. Des protocoles ont été mis en place afin d’identifier et de prévenir cette susceptibilité.

Choix des espèces

La physiologie des barrières biologiques des primates non-humains est plus proche de celle des primates humains que de celle des rongeurs. Les niveaux d’expression de nombreux transporteurs de radiotraceurs sont très différents entre les Hommes et les rongeurs. Il a été montré que les primates non-humains constituent un modèle plus prédictif de l’activité de ces transporteurs lors des études de pharmacocinétique. Aussi, afin d’étudier les effets de ces transporteurs sur la pharmacocinétique des médicaments et extrapoler les résultats chez l’Homme, l’utilisation de primates non-humains est particulièrement pertinente. Le projet sera conduit sur des individus adultes, car nous avons besoin que l’ensemble des tissus d’intérêts soit pleinement développés (mature).

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte des cellules de mélanome humain sous la peau ou dans le sang, puis on les traite par des oligonucléotides et un gavage quotidien jusqu'à une tumeur de deux centimètres cubes. Le porteur prévoit la mise à mort dès ce point limite ou à la fin, puis des analyses moléculaires. Il présente le projet comme une preuve de concept ouvrant une collaboration avec l'industrie pharmaceutique et écarte les cultures cellulaires, jugées insuffisantes pour reproduire la tumorigenèse.

Objectifs

Ce projet vise à démontrer que l'inhibition de longs ARNs non codants in vivo altère la formation de mélanome et la progression des métastases, en association avec les traitements déjà existants. Ce projet est destiné à prouver que certains longs ARNs non codants sont de potentielles cibles thérapeutiques Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique pour développer des inhibiteurs spécifiques pouvant être testés dans des essais précliniques

Bénéfices attendus

Cette expérimentation doit permettre de caractériser les changements dans la formation et la croissance tumorales suite à l'inhibition d'un ARN longs non codant associée ou non à un traitement complémentaire déjà utilisé et ceci dans un contexte physiologique que ne permettent pas les cultures cellulaires in vitro. Ce projet devrait permettre la validation d'une nouvelle cible thérapeutique pour le mélanome cutané. Ces preuves ouvriront la possibilité de collaborer avec l'industrie pharmaceutique afin d’étudier l’effet de notre approche d'inhibition des ARNs longs non codants, dans l'objectif final d'identifier de nouveaux traitements pour le mélanome cutané.

Procédures

Toutes les souris seront injectées une fois avec des cellules tumorales humaines (200 microlitres). Les injections de cellules par voie sous-cutanée ou intraveineuse rétroorbitale sont réalisées sous anesthésie gazeuse et durent une dizaine de secondes. Les injections sous-cutanée d'ASO (ASO : "Anti-Sense Oligonucleotides" : petites molécules d'ADN simple brin) (tous les deux jours, 100 microlitres) ou intrapéritonéales de luciférine (une fois par semaine, 100 microlitres) sont faites sur animal vigile et durent quelques secondes. Le gavage oral sera quotidien à raison de 100 microlitres, est réalisé sur animaux vigiles et dure une dizaine de secondes. Les traitements durent au maximum trois semaines.

Impact sur les animaux

L'injection de cellules tumorales par voie sous-cutanée va provoquer la croissance d'une tumeur primaire à l'endroit de l'injection et/ou la formation de métastases distantes, notamment dans les poumons. La tumeur primaire pourra générer un inconfort physique lors des déplacements des souris. Cette tumeur primaire devrait apparaitre à partir de 5 jours suivant l'injection et croitre assez rapidement. La durée totale de l'expérimentation sera de trois semaines. Les souris seront sacrifiées en cas d'atteinte du point limite du volume tumoral de 2cm3. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Lors des expériences précédentes d'injection de cellules tumorales dans le laboratoire, les souris ont dû être sacrifiées du fait de la taille de la tumeur primaire et non d'effets dus aux métastases. Les cellules tumorales injectées par voie intraveineuse devraient se fixer sur les organes de préférence métastatique, à savoir les poumons en premier. Les métastases ne seront pas visibles mais pourront entraîner une perte de poids, d'appétit et d'autres effets biologiques liés à la perturbation des organes vitaux touchés. Le suivi des cellules du fait de leur luminescence permettra de suivre la croissance tumorale pour les deux voies d'injection. Les traitements subséquents devraient réduire la formation et la croissance des tumeurs.

Devenir

Il est prévu de mettre à mort tous les animaux pendant ou à la fin du projet : l'injection de cellules tumorales devant conduire à la formation de tumeurs voire de métastases chez les souris, les animaux seront mis à mort pendant le projet si la taille de(s) tumeur(s) atteint les points limites, en cas de signes de souffrance ou à la fin du projet. Après euthanasie, des prélèvements seront effectués pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Les procédures expérimentales proposées visent à étudier l’effet du traitement par des oligonucléotides antisens (ASO) sur la croissance tumorale in vivo. Nous estimons que ces approches sont très importantes et ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation des souris. Les expériences in vitro nous ont permis de valider nos techniques d’expérimentation et d’apporter de premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes de substitution in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques de la tumorigenèse in vivo et donc ne pourront pas apporter le niveau d'information requis.

Réduction

Le nombre total de souris expérimentales sera de 180 réparti comme suit : 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie intraveineuse (IV) rétroorbitale avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 1 cohorte de 30 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 1 lignée de cellules tumorales puis traités ou non avec les ASOs, 2 cohortes de 60 animaux injectés par voie sous-cutanée (SC) avec 2 lignées cellulaires différentes, puis traités ou non avec les ASOs en présence ou en absence d'une thérapie ciblée complémentaire. Cet effectif correspond au nombre d’animaux nécessaires afin que les résultats obtenus soient exploitables et reproductibles (statistiquement valides). Le paramètre étudié sera la taille de la tumeur (mesurée avec un pied à coulisse) ainsi que sa vitesse de croissance pour les souris injectées par SC et le développement des métastases pulmonaires pour les souris injectées par IV. Les mélanomes humains sont des tumeurs hétérogènes et leur étude n'a pas permis d'isoler une lignée cellulaire modèle unique, il est donc nécessaire de tester plusieurs lignées cellulaires dans les deux voies d'injection. Pour l'analyse statistique, nous utiliserons le logiciel GraphPad Prism. Pour comparer deux groupes, un test t de Fisher à deux intervalles sera appliqué. Pour plus de deux groupes, une analyse de la variance à sens unique (ANOVA) sera suivie d'une analyse post hoc de Tukey pour comparer les moyennes entre deux groupes.

Raffinement

Des souris femelles seront utilisées : moins agressives entre congénères que les mâles, elles pourront être hébergées en cohorte afin de conserver l’interaction sociale, ce qui confortera le résultat des expériences. Les femelles et les mâles répondent de la même manière aux traitements, il ne devrait donc pas y avoir de biais expérimental du au sexe. Les expérimentateurs établiront le contact avec les cohortes au moins 8 jours avant le début de l’expérimentation pour habituation à la manipulation et réduction de l’angoisse des animaux. Les cages seront agrémentées de coton type « nestlet ». Nous mesurerons la taille de la tumeur primaire trois fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) à l'aide d'un pied à coulisse tout au long de la croissance tumorale jusqu’à l'atteinte de la taille limite de la tumeur de 2 cm3 par souris. La vitesse de croissance des tumeurs n’est pas connue, nous adapterons donc la période de mesure pour chacune des lignées cellulaires utilisées. Nous surveillerons également quotidiennement l'état des souris après injection des lignées tumorales afin de détecter tout effet dommageable. La migration des cellules métastatiques sera suivie par l'utilisation du système d'imagerie in vivo (IVIS) une fois par semaine. En plus du suivi de la taille de la tumeur primaire, la "painscore sheet" servira à l'évaluation de la douleur des animaux. Ce suivi permettra la mise en place d'une éventuelle analgésie (niveau 2) qui pourra être suivie de l'euthanasie si le score de douleur augmente encore (niveau 3).

Choix des espèces

In vitro, nous avons validé nos techniques expérimentales et obtenu des premiers résultats encourageants. Cependant, ces méthodes in vitro ne reproduisent pas toutes les étapes caractéristiques environnementales de la tumorigenèse in vivo et ne peuvent donc fournir le niveau d'information requis. L'utilisation du modèle de xénogreffe chez la souris ne peut être remplacée par d'autres méthodes expérimentales, il est fiable et facile à manipuler et déjà largement utilisé. De plus, les données que nous produirons à partir de nos tumeurs (cinétique tumorale, séquençage d'ARN, quantifications de protéines) seront comparées à celles collectées par notre laboratoire et nos collaborateurs dans des modèles similaires pour d'autres études. Nous utiliserons des souris ayant atteint le stade adulte (6 semaines) qui seront injectées avec les cellules tumorales par voie sous-cutanée dans le flanc ou intraveineuse rétroorbitale.