Troubles cardiaques

Pour tester deux molécules censées prévenir les troubles du rythme cardiaque, 288 souris porteuses d'une mutation provoquant une cardiomyopathie dilatée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit sept gavages, douze échocardiographies sous anesthésie, six électrocardiogrammes sur animal vigile et trois prises de sang, entre l'âge de 28 jours et 7 mois. Le porteur décrit un phénotype qui débute à 4 mois par une cardiomyopathie légère, évolue vers l'insuffisance cardiaque à 7 mois et s'accompagne d'une cyphose et d'une perte de poids d'environ 20 %. Aucun point limite intermédiaire n'interrompt cette évolution, les souris étant mises à mort systématiquement à 7 mois pour prélever leurs organes.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde avec près de 18 millions de morts chaque année et constituent des facteurs de comorbidité pour de nombreuses autres maladies. Malgré l’amélioration des méthodes de diagnostic, de la prise en charge des personnes et de la prévention sur les facteurs de risques tels que la consommation de tabac, les maladies cardiovasculaires restent un groupe d’affections fortement mortelles. Parmi les maladies cardiovasculaires, les cardiomyopathies sont des atteintes du muscle cardiaque qui causent des dysfonctionnements électriques et/ou mécaniques. Parmi les maladies cardiovasculaires, la cardiomyopathie dilatée se caractérise par une augmentation de la masse du coeur, une dilatation des ventricules et une augmentation de la fibrose interstitielle. Avec une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la cardiomyopathie dilatée sont l’insuffisance cardiaque (70 pour cent) et les arythmies cardiaques (30 pour cent). Le but de ce projet est de tester un traitement pharmacologique préventif des arythmies cardiaques. L'inhibition d’une enzyme impliquée dans développement du cœur, prévient la cardiomyopathie dilatée. Bien que ce traitement ait un effet bénéfique sur le remodelage cardiaque, son impact sur les arythmies et les défauts de conduction reste à étudier. Nous supposons qu'un traitement avec un inhibiteur de lenzyme d'interet agirait à la fois sur les défauts de conductions directs et sur ceux induits par la fibrose. Nous proposons dans ce projet de traiter un modèle murin de cardiomyopathie dilaté avec deux molécules inhibitrices de l'enzyme concernée et d’en étudier l’impact, sur la fonction cardiaque, remodelage et activité électrique, in-vivo. Nous étudierons aussi l’impact du traitement sur les voies de signalisations moléculaires et cellulaires qui participent à l’apparition des défauts de conductions et des arythmies associés la cardiomyopathie dilatée.

Bénéfices attendus

Les données générées par ce projet collaboratif contribueront à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée. Ces résultats seront utilisés comme une preuve de principe qui permettra de proposer un essai clinique pour les jeunes patients. Étant donné que la cardiomyopathie dilatée partage de nombreuses caractéristiques communes avec d'autres cardiomyopathies à l'éthologie différente, nos résultats ouvriront des perspectives thérapeutiques pharmacologiques pour traiter celles ci.

Procédures

Les animaux subiront 6 interventions différentes. 1. Un gavage sur une période de 3 semaines. Les molécules thérapeutiques sont diluées dans l’eau de boisson. Elles sont bien tolérées par l’organisme et n’entrainent pas d’effets indésirables à la concentration fixée dans ce protocole. Les animaux seront traités 7 fois, de 28 jours à 49 jours d'âge. Chaque intervention dure une trentaine de seconde. 2. Une échocardiographie sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront suivis tous les 15 jours à partir de 2 mois jusqu’a 7 mois, soit un total de 12 échocardiographies par animal. Chaque intervention dure entre 5 et 10 minutes. 3. Un électrocardiogramme sur animaux vigiles. Chaque animal sera évalué de 2 mois à 7 mois tous les mois, soit un total de 6 électrocardiogrammes par animal. Chaque intervention dure entre 2 et 4 minutes. 4. Un électrocardiogramme sous anesthésie gazeuse. L’intervention est réalisée une fois et dure 10 minutes. 5. Un prélèvement sanguin. Les animaux seront prélevés trois fois à un moi d’intervalle. L’intervention dure environ 2 minutes. 6. Une chirurgie sous anesthésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois cette chirurgie, soit un prélèvement d’organe sous anesthésie et analgésie. 50 pourcent des animaux subiront une fois ce prélèvement.

Impact sur les animaux

Le phénotype dommageable des souris débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique de type oxydatif, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. L’ensemble des procédures liées à ce projet peuvent générées un stress lié à la manipulation de l’animal. De plus certaines de ces procédures peuvent engendrées de légères irritations, des lésions et des hémorragies avec risque d’infection. Les procédures avec anesthésie comportent un risque de stress thermique (refroidissement de la température de l’animal) et dans de rares cas de détresse respiratoire. La chirurgie peut induire une douleur et des risques d'infection.

Devenir

Tous les animaux (n = 288) seront euthanasiés pour prélèvement d’organe à 7 mois. Le prélèvement d'organe est indispensable pour étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'expérimentation.

Remplacement

Les études précliniques nécessitent une validation sur des modèles animaux qui ne peut pas être remplacée par des modèles cellulaires. De plus, les cardiomyocytes (cellules cardiaques) adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Bien qu’il existe des lignées cellulaires, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal. D'autre part, aucun modèle cellulaire ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte, ni récapitule dans son ensemble les caractéristiques d’un cœur entier dans son environnement physiologique.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, commerciaux et atteints de cardiomyopathie dilatée. Les fonds génétiques des animaux commerciaux et transgéniques sont identiques. La lignée développant la cardiomyopathie dilatée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux commerciaux seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet (288), nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Afin de diminuer la douleur et le stress des animaux, une analgésie et/ou une anesthésie sera réalisée pour les procédures le nécessitant. L’isolement des animaux est évité au maximum, cependant il est possible que certains animaux se retrouvent isolés de manière imprévue (seul mâle d’une portée, animal arrivé seul d’un fournisseur, agression entre congénères, dernier animal dans la cage…). Dans ce cas, l’animal bénéficiera d’un enrichissement supplémentaire dans sa cage. Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable. Le phénotype dommageable débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois (environ 20g). Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Afin de réduire la contrainte liée au phénotype dommageable, une fiche de scoring est utilisée pour suivre l’évolution du phénotype et les animaux sont mise à mort systématiquement à l’âge de 7 mois.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant une mutation responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Pour les traitements, les animaux seront utilisés à 28 jours (âge auquel les animaux passe à une alimentation entièrement solide). Pour obtenir un effet optimum, l’âge de début du traitement doit être le plus précoce possible. Pour l’exploration fonctionnelle du cœur, les animaux sont utilisés entre 2 et 7 mois.

260 souris vont être utilisées, chacune passant onze échographies cardiaques sous anesthésie entre deux et sept mois, et 120 d'entre elles recevant en plus 75 gavages, un tous les deux jours pendant cinq mois. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à sept mois, le cœur prélevé lors d'une chirurgie terminale. La lignée utilisée développe à partir de quatre mois une cardiomyopathie dilatée qui évolue en insuffisance cardiaque, avec une cyphose, environ 20 % de perte de poids et une espérance de vie réduite. Le porteur écrit que la complémentation alimentaire testée "ne provoque aucune nuisance" et devrait plutôt être bénéfique, sur des animaux dont la maladie est justement ce qui les rend utiles.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre la contribution d’une voie de signalisation moléculaire à la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée (CMD) et d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques. La CMD se caractérise par une dilatation du ventricule gauche, une réduction de la fonction systolique possiblement associée des arythmies. Malgré l'efficacité des traitements classiques de l'insuffisance cardiaque, la CMD présente un taux élevé d'hospitalisations qui impose une charge financière aux systèmes de santé, liée à l’implantation de stimulateurs cardiaques et/ou des procédures de transplantation. Il est donc nécessaire de poursuivre l’étude des mécanismes physiopathologiques pour identifier des cibles thérapeutiques actionnables afin d’arrêter ou inverser le cours de cette maladie cardiaque. Plusieurs études ont montrées que la modulation la voie de signalisation moléculaire étudiée à l’aide de petites molécules présentent un intérêt croissant pour le traitement de la CMD. Si un nombre important de ces études expliquent les effets bénéfiques par l’activation de voies cellulaires connues, peu d'entre elles ont exploré l'impact de cette voie de signalisation dans la CMD. Des recherches complémentaires sont nécessaires pour comprendre dans quelle mesure cette voie de signalisation moléculaire étudiée joue joue un rôle dans le développement de la CMD. Nous proposons d’identifier l’ensemble des protéines impliquées dans cette voie de signalisation dans le cœur d’un model murin de CDM, d’identifier les protéines d’intérêt et d’étudier le rôle de ces protéines dans la CDM. Pour y parvenir, nous administrerons des molécules régulatrices de cette voie de signalisation par gavage ou injection intraveineuse. La fonction cardiaque des animaux sera évaluée en échographie. Apres traitement nous procèderons à l’analyse protéomique, biochimique et moléculaire des cœurs extrait des animaux traités.

Bénéfices attendus

Le bénéfice premier de cette étude est de mettre en évidence un nouveau mécanisme de signalisation moléculaire impliqué dans le développement de la cardiomyopathie dilatée. L’identification de ce nouveau mécanisme ouvrira la voix à de nouvelles perspectives thérapeutiques qui seront étudiées à la suite de ce projet. La cardiomyopathie dilatée à une incidence estimée supérieure à 1 pour 2500 individus, les principales causes de mortalité de la CMD proviennent d’insuffisance cardiaque (70 pourcent) et d’arythmies (30 pourcent). Le développement de nouvelles approches thérapeutiques est donc d’un intérêt majeur en matière de politique de santé publique.

Procédures

Evaluation de la fonction cardiaque en échographie. 260 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tout les quinze jours sur animal anesthésié. Soit 11 échographies par animal. Chaque échographie dure environ 5 minutes. Traitement par gavage. 120 animaux de l’âge de 2 à 7 mois tous les deux jours sur animal vigil. Soit 75 gavages par animal. Chaque gavage dure environ 30 secondes. Injection intra péritonéales. 164 animaux à l’âge de 7 mois sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Injection intraveineuse. 160 animaux, une fois à l’âge de 3-5 jours sur animal vigil. Soit une fois par animal. Une injection dure environ 30 secondes. Chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie: 164 animaux à l’âge de 7 mois. Soit une fois par animal. Une chirugie dure environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

Le modèle murin de cardiomyopathie à un phénotype dommageable qui débute à 4 mois avec l’apparition progressive d’une cardiomyopathie dilatée d’abord légère et qui évolue vers 7 mois en insuffisance cardiaque. Cette progression de l’atteinte cardiaque est corrélée à une atteinte progressive et moins sévère des muscles squelettique, l’apparition d’une cyphose légère et une perte de poids d’environ 20 pour cent par rapport au poids de l’animale à 4 mois. Ce phénotype réduit l’espérance de vie des animaux. Le régime alimentaire des animaux sera complémenté par un composé impliqué dans la voie de signalisation moléculaire d’intérêt. Cette complémentation ne provoque aucune nuisances ou d’effets indésirables sur les animaux à long terme et devrait plutôt avoir un effet bénéfique. Toutefois, la méthode de délivrance par gavage peut générer un stress et une légère irritation au niveau de l’œsophage. Les injections nécessaires à ce projet peuvent générées un stress et une légère douleur lors de l’injection intraveineuse et en post injection pendant quelques jours.

Devenir

L'ensemble des animaux (260) sera euthanasié pour prélèvements d'organes. Le prélèvement des organes et notamment le cœur est indispensable pour effectuer les analyses nécessaires pour répondre à la question scientifique abordée dans ce projet.

Remplacement

Les cardiomyocytes adultes ayant atteint un état de différenciation terminale ne se divise pas. Il est par conséquent impossible d’en dériver une lignée cellulaire stable. Les cardiomyocytes adultes se conservent en culture primaire que quelques jours et ne peuvent pas être transfecté par des agents de transfection non viraux. D'autre part, aucun modèle d'expression in vitro ne reproduit les conditions physiologiques spécifiques du cardiomyocyte (expression de protéines spécifiques dans des domaines cellulaires spécifiques). Bien qu’il existe des lignées cellulaires derivée de cellules souches, celles ci ne récapitulent la physiologie d’un cœur que partiellement. Elles seront toutefois utilisées pour tester certaine de nos hypothèses qui ne nécessitent pas de modèle animal.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous utiliserons les contrôles les mieux adaptés et nous n'utiliserons que des préparations virales dont le titre aura été évalué afin d'utiliser la dose minimum efficace dans la transduction in vivo. Nous utiliserons les données acquises sur tous les animaux : mâles et femelles, sauvages et mutés. Les fonds génétiques des souris sauvages et transgéniques sont identiques. La lignée mutée produisant exclusivement des animaux homozygotes mutés, les animaux sauvages seront achetés auprès d’un fournisseur agréé. Le fait d'injecter les virus chez des souriceaux entre 3 et 5 jours de vie nous permettra d'exploiter toutes les naissances, quel que soit le jour de la semaine où elles surviennent du fait des accouplements continus (pas d'injection le week-end) et ne pas faire naître d'animaux non nécessaires au projet. Pour n’utiliser que le nombre d’animaux nécessaire à ce projet, nous avons recourt au service d’un biostatisticien pour nous épauler dans l’élaboration de notre plan expérimental. Au total nous utiliserons 260 animaux.

Raffinement

Les animaux seront observés tous les jours par les membres qualifiés de l'animalerie et tout comportement anormal sera directement communiqué à la personne responsable du projet. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, 6 par cage maximum pour les cages après sevrage, jusqu'à 15 (souriceaux et reproducteur) pour les cages de reproduction. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire au maximum toute douleur, souffrance ou angoisse que pourraient subir les animaux: enrichissement du milieu (lanières de papier Kraft, maisons en carton), acclimatation d'une semaine avant toute manipulation, hébergement en groupe, formation technique des utilisateurs. Les points limites seront évalués régulièrement. Si un animal dépasse ces points limites, il sera euthanasié. Afin de prévenir au maximum l’irritation liée au gavage, nous utilisons des sondes de gavage en plastique souple dont la longueur et le diamètre sont adaptés à la morphologie de l’animale. Afin de réduire au maximum la douleur chez les animaux utilisés, nous privilégierons les injecterons par voie systémique afin d’éviter une chirurgie cardiaque lourde. Dans le but de limiter au maximum le nombre de manipulations réalisées sur les souriceaux, leur stress ainsi que celui de leur mère pour favoriser leur survie, nous identifierons par tatouage les souriceaux injectés. Pendant tout le temps que durera l'injection d'une portée, les souriceaux seront séparés de leur mère et gardés ensemble dans un peu de litière provenant de leur cage, puis ils seront rendus ensemble à leur mère en les déposant hors du nid. Nous vérifierons qu'ils sont bien repris en charge par la mère et ramenés au nid. Les caractéristiques physiologiques cardiaques de la maladie seront évaluées par des méthodes non invasives. Un protocole d’anesthésie/analgésie est mis en place pour tous les animaux impliqués dans la procédure de chirurgie sans réveil.

Choix des espèces

La souris est l’animal choisi pour ce projet en raison des similitudes de son système cardiovasculaire avec celui des humains et de l’existence d’une lignée génétiquement modifiée portant la mutation d'intérêt responsable à l’état homozygote de cardiomyopathie dilatée chez l’humain. Cette mutation est aussi présente dans notre modèle cellulaire de cardiomyocyte dérivés de cellules souches, ce qui rend comparable les résultats obtenus dans les deux modèles d’études. De plus, la souris est le modèle animal le plus utilisé dans ce champ de recherche, permettant ainsi des comparaisons avec d’autres études ou d’utiliser les résultats d’autres études afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons des souris à différents stade de la progression de la pathologie étudiée (3, 5, et 7 mois) afin d’avoir une analyse complète du phénomène. De plus nous utiliserons des souriceaux pour l’injection de molécules d’intérêts. Cela présente l’avantage de diffuser ces molécules à l’ensemble des organes de l’animal, de limiter la réponse immunitaire et d’éviter un acte chirurgical lourd dans le cas de l’utilisation d’animaux plus âgés.

Tuées à la fin de l'étude pour que leurs artères et la prothèse implantée soient examinées au microscope, 12 brebis adultes de cinq à huit ans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent quatre anesthésies générales, une chirurgie des carotides, quatre scanners avec produit de contraste et une échographie hebdomadaire pendant trois mois, entre deux établissements séparés par cinq heures de route. La liste des atteintes attendues comprend la douleur postopératoire, les infections, les risques hémorragiques ou thrombotiques et le stress du transport. Le porteur indique que le dispositif a déjà été testé sur simulateurs, et affirme que la complexité du système cardiovasculaire "impose" désormais l'essai sur un animal.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont le stress, la douleur, les infections, et les risques hémorragiques ou thrombotiques. Mise à jeun la veille le l'intervention (stress). Isolement des animaux pour l'induction de l'anesthésie (stress). Contention des animaux (stress) lors des manipulations, soins, traitement et échographies doppler réalisées sur animal vigile. Mise en place d'une perfusion veineuse (hématome, saignement, inconfort au passage de la peau) : douleur, infection, Intubation, mise sous respiration mécanique et anesthésie générale. Incision des zones opératoires, pose des prothèses artérielles, sutures au niveau des incisions : douleur, risque hémorragique, risque d'occlusion vasculaire en post opératoire. Injection de produit de contraste iodé lors des scanner (réaction allergique). Douleur post opératoire. Transport des animaux entre les établissements utilisateurs (stress).

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable sur des simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à 7 jours, 21 jours, et 4 mois après chirurgie par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste; et de 1 mois à 4 mois (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place d'une perfusion, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

Quatre anesthésies générales, deux incisions de dix centimètres au niveau des carotides, treize séances d'échographie doppler en contention et deux transports routiers de cinq heures entre établissements : 12 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le prélèvement des artères et de la prothèse sert à confirmer par histologie ce que les images ont montré. L'objet du projet est la validation d'un instrument chirurgical destiné aux pontages artériels périphériques pratiqués sur des patients âgés. Le choix de la brebis tient au diamètre de ses artères, stable avec l'âge, contrairement au porc qui atteindrait 300 kg et rendrait le suivi impossible.

Objectifs

En France, environ 13 000 pontages artériels périphériques sont réalisés chaque année, chez des patients souvent fragiles et âgés, présentant des lésions artérielles étendues, pour lesquels les résultats des techniques endovasculaires actuelles sont médiocres. Selon leur localisation, ces pontages sont grevés d’une mortalité variant de 2,3 à 4,1 %, et une morbidité de 16 à 36,8 %. Ce projet a pour objectif la validation d'un instrument chirurgical innovant dans le cadre de la réalisation d’un pontage artériel, qui est employé pour la prise en charge de ces pathologies vasculaires. Cette étude sera réalisée dans deux établissements utilisateurs différents car les deux établissements ont des spécificités, des matériels et des expertises différentes nécessaires aux différents stades de l’étude.

Bénéfices attendus

A l’issue de cette étude, le dispositif innovant sur lequel porte ce projet pourrait permettre de réaliser des pontages artériels sans arrêt circulatoire. Ces pontages seront utilisés dans le traitement de certaines pathologies vasculaires. Le dispositif d’intérêt pourrait permettre de faciliter le geste technique chirurgical et de limiter la morbidité associée à la chirurgie et, ainsi, d’améliorer la prise en charge de ces pathologies vasculaires.

Procédures

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28, après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Impact sur les animaux

Les animaux de l'étude auront 4 anesthésies générales au total. Dans l'établissement utilisateur EU1, tous les animaux auront une procédure chirugicale (2 incisions d'environ 10cm) au niveau des carotides (évaluée à 2h30: Après 30 minutes de préparation, 1h30 de chirurgie et 30 minutes d'imagerie scanner). Les animaux auront chacun 4 sessions d'imagerie médicale (contrôles scanographiques) effectuées 7 jours, 1 mois et 4 mois après l'intervention chirurgicale (durée de 45 min maximum à chaque fois). Dans l'établissement utilisateur EU2, les animaux recevront également une échographie doppler toutes les semaines de J21 à M4, soit environ 13 sessions, chacune d'une durée évaluée à 30 minutes maximum (la contention sera réalisée dans des cages de contention spéciales pour ovins). Les animaux seront transportés deux fois pendant la durée de l’étude. Le premier transport sera effectué entre J21 et J28 (de l'EU1 vers l'EU2), après récupération de l’anesthésie réalisée pour le scanner. Les animaux seront transférés d'un établissemnt utilisateur à un autre (durée du transport évalué à 5h). Le deuxième transport (de l'EU2 vers l'EU1) sera effectué à 4 mois (M4), les animaux retourneront dans le premier établissement utilisateur (durée du transport évalué à 5h). Deux changements d'environnement lors des transferts d'établissement.

Devenir

Tous les animaux (n=12) du projet seront mis à mort à la fin de l'étude. Le prélèvement des artères et de la prothèse est indispensable afin de pouvoir confirmer les données d'imagerie par des analyses histologiques.

Remplacement

Le dispositif a été testé au préalable surdes simulateurs. Cet instrument doit encore être éprouvé in vivo afin de finir la validation de la mise en œuvre technique et appréhender l’efficacité et les risques associés à plus long terme. A l’état actuel des connaissances scientifiques, la complexité du système cardiovasculaire impose de tester le dispositif sur modèle animal. Les tailles des artères de la brebis sont proches de celles de l'humain, ce modèle permet donc de tester le dispositif dans sa version finale, identique à celle qui pourra être utilisée chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au maximum en veillant toutefois à obtenir un nombre suffisant de dispositifs implantés pour réaliser une évaluation de l'efficacité. La procédure a été préalablement sécurisée par la réalisation d’études ex vivo sur banc d’essai et d’études préalables sans réveil ou courte sur un nombre restreint d’animaux. Cette étude sera réalisée sur 6 brebis . Cependant, en cas de mort prématurée d'un animal en cours d'intervention chirurgicale ou lors de la phase de suivi, ou dans le cas ou une amélioration du dispositif apparaitrait comme nécessaire, cette étude pourra être reconduite sur un maximum de 6 animaux. Ils ne seront commandés qu'après étude et analyse des résultats sur les six premiers animaux.

Raffinement

Toutes les procédures expérimentales ainsi que l’environnement d’hébergement ont été optimisées. Les animaux arriveront et seront hébergés par groupe sociaux (au minimum 2 par box) afin de respecter leur comportement grégaire. Ils seront hébergés dans un box sur litière (fibre de bois ou paille) avec des objets d'enrichissement (jouets, ballots de foins), une période d'acclimatation de 5 jours sera respectée avant le début de la procédure. Les gestes interventionnels (chirurgie, imagerie doppler avec injection de produit de contraste, imagerie par échographie doppler) seront toujours réalisés par du personnel formé permettant un temps interventionnel réduit au maximum, afin de prévenir la souffrance et l’angoisse des animaux. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale. Les contrôles effectués pour le suivi de l’efficacité du dispositif tout au long de la procédure se feront par imageries médicales (échographie doppler, scanner) qui sont des approches non invasives, et qui ne sont pas source de douleur. Au temps basal puis à J7, J21, et M4 par scanner sous anesthésie générale avec administration de produit de contraste, et de M1 à M4 (tous les 7 jours) par échographie doppler sur animal vigile. La douleur post opératoire sera évaluée selon une grille d'évaluation de la douleur et prise en charge par un traitement analgésique adapté. Le bien-être des animaux sera contrôlé en veillant aux conditions d'hébergement et au comportement des animaux. Des observations bi-quotidiennes seront réalisées par une personne compétente basées sur l'apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (bruits...). Ces contrôles permettent de repérer tout animal malade ou blessé pour prendre des mesures appropriées. Tout constat d'un mal-être est remonté au responsable du bien-être des animaux pour examen approfondi, traitements adaptés et/ou consultation du vétérinaire référent. L’utilisation de la contention physique douce, possible chez la brebis, pour la mise en place de la voie veineuse jugulaire externe, l’échographie doppler, les administrations des traitements est préférable à l’administration d’une prémédication intramusculaire source de douleur et de stress.

Choix des espèces

La brebis est un animal proche de l’Homme d’un point de vue physiologique et anatomique (taille, structure et morphométrie des organes, etc.). Les dispositifs médicaux de la clinique humaine peuvent directement être utilisés chez l’ovin. L'utilisation d'équipements d'imagerie médicale destinés à l'Homme permet d'avoir une qualité d'imagerie équivalente à celle obtenue chez l’humain. D’autre part, contrairement au Porc, la Brebis possède une stabilité dans le diamètre des vaisseaux qui n’augmente pas de manière significative à partir d’un certain âge. Cette caractéristique permet au dispositif de rester en place tout au long de la période de suivi post-chirurgical dans le cadre de l’étude d'efficacité. Cette étude pourra également servir de référence si une autre étude avec un suivi sur du long terme (1an) est nécessaire. En effet, ceci serait impossible chez le Porc qui atteindrait un poids d'environ 300kg. Les animaux seront des Brebis adultes (de 5 à 8 ans). En effet, la taille des artères doit être suffisante pour pouvoir mettre en place le dispositif et surtout leur diamètre ne doit plus varier pendant le temps de suivi.

Tuées une heure, trois heures ou vingt-quatre heures après l'injection pour que leurs organes soient prélevés, 48 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une injection intraveineuse unique de nanoparticules censées acheminer un médicament directement vers un caillot cérébral, puis sont mises à mort selon le délai assigné à leur groupe. Le porteur indique que l'injection peut être douloureuse et que les nanoparticules peuvent provoquer une inflammation du rein, de la rate, du foie ou du poumon. Des tests sur cellules et globules rouges humains n'ont révélé aucune toxicité, ce qui n'empêche pas le porteur de conclure qu'un "organisme vivant complexe" reste "nécessaire" pour observer la distribution du produit.

Objectifs

Cette étude est un projet fondamental dans le domaine de la santé publique. L’accident vasculaire cérébral (AVC) est la deuxième cause mondiale de mortalité. En particulier, 80% des cas d’AVC sont caractérisés par la formation d’un caillot (thrombose) dans une artère cérébrale provoquant une diminution voire une suppression du flux sanguin dans une région du cerveau. L’hétérogénéité des causes de ces thromboses, la complexité et la sensibilité du cerveau font encore de l’AVC une pathologie complexe à traiter et des règles standards de traitements sont difficiles à établir. La première action thérapeutique consiste à rétablir le flux sanguin le plus rapidement possible afin d’éviter des séquelles irréversibles. Le traitement de référence reste le même depuis les années 1980 ; l’injection d'un médicament qui entraine la destruction du caillot. Toutefois, les critères d’inclusion des patients restent très limités, notamment à cause des effets secondaires: saignements, toxicité cérébrale. Le but de ce projet est d'étudier des nanoparticules (particules de taille nanométrique) pour apporter des médicaments directement au caillot, et ainsi éviter ces effets secondaires et diminuer les doses employées. Ce projet expérimental regarde spécifiquement l'innocuité du traitement proposé avec les nanoparticules et leur devenir dans le corps après injection.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, l'absence de toxicité d'un nouveau traitement pour les AVC dus à des caillots sanguins pourra être évaluée, avec en particulier: la mise à disposition des médecins d'un traitement plus complet pour résorber les caillots à l'origine de l'accident, avec une minimisation des effets secondaires (saignement, toxicité cérébrale), une diminution des doses employées et donc une utilisation potentielle pour plus de patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection unique par voie intraveineuse de nanoparticules sous anesthésie de l'animal (durée inférieure à 10 min), puis après un temps fixé (1 h, 3 h ou 24 h), les animaux seront euthanasiés pour observer la biodistribution des nanoparticules (c'est-à-dire leur distribution dans leurs organes).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles sont une douleur liée à l'injection, une toxicité éventuelle des nanoparticules, ou une éventuelle inflammation dans les organes responsables de l'élimination des nanoparticules: rein, rate, foie, poumon.

Devenir

Afin de pouvoir observer la distribution des nanoparticules dans les différents organes des animaux, ceux-ci doivent être euthanasiés pour récupérer leurs organes et réaliser l'analyse des tissus biologiques.

Remplacement

Des expériences préliminaires visant à déterminer l'innocuité de ces nanoparticules ont été réalisées, incluant des tests sur cellules humaines ainsi que des sur des globules rouges humains, et ne permettant pas de déceler de toxicité. Ces expériences apportent donc une première réponse au regard de la toxicité sans utiliser d'expérimentation animale. Il n'existe cependant pas de moyen permettant de déterminer une toxicité dans un organisme vivant complexe ainsi que la distribution des nanoparticules dans les organes avec ces premières expériences. Ce projet nécessite donc l'utilisation de modèles animaux pour les étudier.

Réduction

Des études préliminaires ont permis de déterminer les doses de nanoparticules à injecter pour garantir un effet thérapeutique, et permettent donc de ne sélectionner que deux doses à tester dans ce projet, réduisant donc le nombre d'animaux à utiliser. Pour anticiper une éventuelle mortalité du traitement, un nombre maximum de 8 animaux par groupe est prévu comme le minimum nécessaire pour garantir au moins 5 animaux utilisables par groupe et donc garantir la représentation de la variabilité inter-individus.

Raffinement

Avant la procédure: le temps d'acclimatation des animaux sera d'une semaine. Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur état de bien-être et l'absence de signes de stress ou de détresse. Durant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie pour l'injection de nanoparticules. Après réveil, les animaux seront remis dans leur cage, et une vérification visuelle une heure après procédure du site d'injection sera effectuée (absence de lésion) et de l'état général de l'animal sera faite en accord avec une grille de score des points limites (critères objectifs pour déterminer le niveau de bien-être ou mal-être des animaux). Les animaux seront finalement sacrifiés sous anesthésie et le prélèvement sanguin réalisé post mortem pour minimiser les gestes sur l'animal vigile.

Choix des espèces

Les expériences de biodistribution chez la souris sont abondamment décrites dans la littérature scientifique pour des injections intraveineuses de nanoparticules, en particulier pour l'utilisation de nanoparticules à but thrombolytique (c'est-à-dire visant à détruire un caillot sanguin) dans le cadre de maladies cardiovasculaires. les animaux utilisés seront adultes (5-8 semaines), pour obtenir des résultats sur des animaux matures au regard de l'immunité et de la formation des organes, et pertinents vis-à-vis d'une pathologie qui affecte majoritairement des individus adultes.

Âgés de douze jours, les ratons reçoivent une injection analgésique puis, en cinq minutes de chirurgie, quatre disques de péricarde bovin implantés sous la peau. Ils les gardent deux à trois mois, le temps que le tissu se calcifie, et sont ramenés auprès de leur mère, surveillés deux fois par semaine. 216 ratons vont être utilisés sur trois ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour comparer des traitements censés retarder la calcification des valves cardiaques artificielles posées chez l'humain, l'âge de douze jours ayant été retenu parce que la calcification y est plus rapide et écourte l'expérimentation. Ils sont tués avant que les disques soient retirés.

Objectifs

Un cœur sain bat environ 100 000 fois par jour pour alimenter l’organisme avec un sang riche en oxygène. Le cœur se compose de quatre cavités : 2 oreillettes (droite et gauche) ; deux ventricules (droit et gauche) et de quatre valves. Lorsque les valves cardiaques fonctionnent normalement, elles assurent un écoulement efficace du sang entre les cavités du cœur. En revanche, les valves malades ne peuvent pas s’ouvrir ou se fermer correctement, et finissent par se rigidifier et se calcifier progressivement. Le traitement de choix pour les patients est le remplacement de la valve cardiaque par une valve artificielle mécanique ou par une bioprothèse valvulaire d’origine animale. Les bioprothèses valvulaires d’origine animale sont composées de péricarde bovin ou porcin. La mise au point des techniques pour leur préservation a révolutionné les indications de remplacement valvulaire en clinique humaine. De nombreuses études ont démontré les avantages significatifs des bioprothèses valvulaires par rapport aux prothèses mécaniques, en particulier la diminution du risque de maladie thromboembolique et donc l’absence d’utilisation d’anticoagulants avec une morbidité et une mortalité per-opératoire et postopératoire moindres. Néanmoins, l’une des limitations principales à l’utilisation des bioprothèses valvulaires, est la survenue plus ou moins tardive de calcifications, c’est l’inconvénient majeur nécessitant un nouveau remplacement valvulaire. L’objectif de ce projet est de modifier les traitements de la bioprothèse valvulaire, afin de diminuer les calcifications qui apparaissent après implantation chez l’homme et de prolonger la durée de leur fonctionnement. Ces nouveaux traitements seront testés et analysés après implantation de péricarde bovin en sous-cutanée chez les ratons âgés de 12 jours. Pour ce projet, 216 ratons seront nécessaires pour une durée de 3 ans. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce travail vont nous permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes de calcification et une meilleure sélection parmi les différents traitements chimiques proposés. A l'issue de ce projet, il sera possible de définir le traitement optimal contre la calcification et la dégénérescence des bioprothèses valvulaires.

Procédures

Les ratons sont soumis à : 1) Une procédure chirurgiale qui conssiste à implanter des disques de péricardes bovins en sous-cutané pendant 2 à 3 mois. La durée de l’intervention est de 5 minutes par raton. 2) Une injection sous cutanée pour analgésie avant la chirurgie d’implantationune. 3) Une injection intrapéritonéale pour la mise à mort sous anesthésie avant la chirurgie d’explantation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le stress et les douleurs associés aux injections et potentielles douleurs post-opératoire dans la zone lombaire après la chirurgie.

Devenir

Les rats seront mis à mort avant l’explantation de péricarde. C'est pour récupérer les disques afin d'effectuer des tests, dosages et immunohistochimie.

Remplacement

L’étude de la prévention de la calcification des bioprothèses valvulaire nécessite le recours aux animaux. Il n’existe pas de modèle in vitro capable de réunir tous les facteurs biologiques, immunologiques ou mécaniques responsables de la calcification des bioprothèses.

Réduction

La diversité des traitements et des tests nécessite un grand nombre de groupes tests et chaque groupe doit contenir un grand nombre d’échantillons nécessaires pour nos études statistiques. Dans l’intention de réduire le nombre d'animaux au maximum, chaque raton recevra 4 disques de tissu péricardique. Le nombre des ratons par groupe a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique adaptée. Cela permet de comparer les moyennes de calcification de chaque groupe, tout en prenant en compte le fait qu'un même animal puisse avoir plusieurs groupes.

Raffinement

Pour réduire la douleur, souffrance ou angoisse ressenties par les ratons notre étude sera effectuée sous anesthésie générale profonde et l'injection sous cutanée d'un analgésique. Les ratons sont ramenés auprès de leur mère. Les ratons sont hébergés dans des cages avec un accès à l’eau et à la nourriture en granulé sans restriction, et dans un milieu d'enrichissement adapté. Les ratons seront surveillés 2 fois/semaine afin de détecter tout comportement clinique anormal. Des points limites ont été définis et leur atteinte entrainera la mise à mort du raton.

Choix des espèces

Les calcifications observées chez le raton correspondent à celle observées chez l’homme, ainsi le raton est le modèle préférentiel pour cette étude. Pour l’implantation sous cutanée, nous utiliserons des ratons de 12 jours, à cet âge les processus de calcification sont plus rapides que chez l’animal adulte, ce qui permet d’écourter l’expérimentation.