Troubles nerveux

Chaque souris subit une chirurgie du cerveau d'une trentaine de minutes, pour y injecter un virus ou y implanter des canules et des sondes de microdialyse. 630 souris mâles adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si le prucalopride, un médicament contre la constipation, réduit rapidement l'anxiété, en comparaison avec la fluoxétine et le diazépam. Le porteur affirme que "Les nuisances pour ces animaux sont faibles" et que l'implantation n'est qu'une "gène légère", au motif que le cerveau est dépourvu de fibres de la douleur, et il ne nomme pas le test comportemental que passe chaque souris. Toutes sont tuées à l'issue par perfusion d'un fixateur sous anesthésie, qui vide leur corps de leur sang, pour étudier leur cerveau.

Objectifs

Les troubles anxieux sont parmi les maladies psychiatriques les plus fréquentes dans le monde. Ils impactent de façon important la qualité de vie des personnes atteintes ainsi que leur capacité à travailler et à mener une vie normale. Aujourd’hui, les traitements disponibles ne sont pas efficaces pour tout le monde : environ 40 % des patients ne répondent pas suffisamment. Les médicaments les plus utilisés, appelés antidépresseurs, mettent plusieurs semaines avant d’agir. Pour soulager plus rapidement les symptômes, d’autres médicaments comme les benzodiazépines sont souvent prescrits, mais ils peuvent entraîner des effets secondaires importants comme une dépendance, une somnolence ou des troubles de la mémoire. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer de nouvelles approches thérapeutiques, à la fois plus rapides et mieux tolérées. Une piste prometteuse serait de cibler des récepteurs à la sérotonine présent dans les régions du cerveau impliquées dans la régulation de l’humeur. Un médicament déjà utilisé chez l’Homme pourrait agir sur ces récepteurs et produire des effets bénéfiques sur l’anxiété et l’humeur. Des études chez l’animal ont déjà montré des résultats encourageants, notamment après des traitements prolongés. L’objectif de ce projet est d’évaluer si ce médicament peut également agir rapidement après une seule administration, et de comparer ses effets à ceux des traitements actuellement utilisés pour soulager rapidement les troubles anxieux. Le projet vise aussi à mieux comprendre les mécanismes dans le cerveau qui expliquent ces effets, en s’intéressant à des régions cérébrales impliquées dans les réponses au stress. Ces travaux pourraient contribuer à l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques pour une prise en charge plus rapide et plus sûre des troubles anxieux

Bénéfices attendus

Cette étude sera la première à examiner les effets anxiolytiques rapides après une administration unique du prucalopride, utilisé chez l’homme dans la prise en charge symptomatique de la constipation chronique idiopathique, dans le modèle de souris adultes mâles, comparé à un antidépresseur de référence, la fluoxétine et à une benzodiazépine de référence, le diazépam. Les résultats de cette étude fourniront des informations sur l’intérêt de repositionner le prucalopride en tant que nouvelle approche thérapeutique pour la prise en charge des troubles anxieux. Cette approche permettra de diminuer le recours aux benzodiazépines et donc d’offrir une alternative thérapeutique plus sécurisée pour les patients. Vu que le prucalopride est actuellement approuvé pour l’utilisation chez l’Homme il est réaliste d’envisager une future inclusion du prucalopride au sein de l’arsenal thérapeutique actuel pour la prise en charge des troubles anxieux. De plus nous serons les premiers à mettre en évidence les effets prosociaux du prucalopride, ce qui représente un intérêt certain dans la prise en charge du troubles anxieux et fournira également un point de départ pour des recherches concernant d’autres troubles impliquant une altération de la sociabilité. Enfin, cette étude s’inscrit dans la continuation des travaux explorant simultanément les dimensions comportementales et les circuits neuronaux, en lien avec la modulation des comportements de type anxieux. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes qui sous-tendent l'activité des anxiolytiques et pourraient conduire au développement de nouveaux traitements pour les troubles anxieux d’une façon plus ciblées.

Procédures

Les chirurgies d'administration de virus et d'implantation des canules au niveau du cerveau seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques, une seul fois par animal, et durent environ 30 minutes par opération. Chaque animal ne subira qu’un seul test comportemental lors des procédures et ceux-ci durent moins de 30 minutes et n'impliquent pas de douleur. Après les expériences, les animaux seront perfusés sous anesthésie (sans réveil) par une solution de fixation pour permettre de préserver les cerveaux en vue de les étudier.

Impact sur les animaux

Les nuisances pour ces animaux sont faibles. Pour l'axe comportemental, les administrations intracérébrales seront réalisées par du personnel qualifié à ces techniques et les tests comportementaux n'impliquent pas de douleur ou de durée d'expérimentation déraisonnable, la dialyse a lieu pendant 3 à 4 heures sans manipulation de l'animal et les tests comportementaux effectués 30 minutes après administration locale ne durent que 5 minutes. Les implantations intracérébrales constituent une gène légère pour l'animal. En effet, le cerveau est dépourvu de fibres sensibles à la douleur, à titre d'exemple des chirurgies similaires sont réalisées chez l'humains sous simple anesthésie locale. La perfusion des animaux par la solution de fixation tissulaire implique d’extraire le sang de l’animal inconscient, sous anesthésie et antidouleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales car nous souhaitons explorer différents paramètres neuronaux à partir de tissus cérébraux prélevés après euthanasie.

Remplacement

L'utilisation de souris est indispensable pour ce projet. L'évaluation de processus complexes qui induisent une réponse neurochimique ou comportementale n'est à ce jour pas modélisable. Ainsi seul un animal entier vivant et vigile permet d'appréhender ces éléments.

Réduction

Une étude statistique préalable nous a permis de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour pouvoir mener cette étude. Cela a été fait grâce à un calcul de puissance effectué pour nos tests comportementaux dont les données présentent la plus grande variance.

Raffinement

Un anesthésique est utilisé pour effectuer l'implantation des sondes de microdialyse. Le cerveau est un organe dépourvu de fibres nerveuses libres dédiées à la nociception, bien qu'invasive cette chirurgie se révèle mineure pour les animaux. Par ailleurs un anti inflammatoire est utilise le jour de la chirurgie. Si l'animal présente un état physiologique anormal (immobilité, prostration, signes de souffrances, perte de poids supérieur à 20% par rapport au poids à 8-10 semaines), l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

À ce jour, les mécanismes impliqués dans les effets anxiolytiques restent mal compris et ne peuvent être reproduits ni simulés par des modèles in vitro. Des animaux adultes seront utilisés car nous nous intéressons à l’étude de l’effet anxiolytique chez l’adulte. De plus, l’espèce choisie permet de faire les modifications génétiques nécessaire pour étudier l’activités des circuits de neurones impliqués.

Isolées socialement de façon chronique ou nourries d'un régime hyperlipidique, des souris reçoivent une fibre optique implantée dans le cerveau par une chirurgie stéréotaxique d'une heure trente, parfois une pompe sous la peau, et des injections abdominales de tamoxifène cinq jours de suite. 1 040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses histologiques. Le projet teste si des métabolites bactériens, moins abondants chez des personnes atteintes de troubles psychiatriques, atténuent les effets de l'isolement et de l'obésité sur la neurotransmission dopaminergique. Hormis un conditionnement opérant, qui maintient les souris à 90 % de leur poids par restriction alimentaire, les tests comportementaux ne sont pas nommés, alors que le porteur indique que certains provoquent un stress.

Objectifs

Les maladies psychiatriques sont un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, la prise en charge de ces pathologies demeure incomplète puisqu’entre 30 et 50 % des patients souffrant de depression sont résistants aux traitements existants. Dès lors, la recherche de nouvelle piste thérapeutique est essentielle et urgente. La neuroinflammation est une composante essentielle des pathologies psychiatriques. Notamment l’activation des cellules microgliales, qui controle l'inflammation dans le cerveau, a été observé dans des pathologies comme la dépression. Notre projet a débuté par une partie clinique qui a permis d’identifier différents métabolites d’intérêt dans la circulation sanguine chez des sujets atteints de troubles psychiatriques. Notre objectif est donc de tester si l’administration de ces métabolites a des effets sur le fonctionnement cérébral, la neuroinflammation et le comportement. L’objectif final du projet sera de mettre en évidence les mécanismes par lesquels les métabolites influencent le cerveau afin de pouvoir proposer de nouvelles stratégies dans la prise en charge des pathologies psychiatriques. Parmi les facteurs de risques des maladies psychiatriques l'isolation sociale chronique AINSI QUE L’OBESITE ONT été démontréS comme délétère pour la santé mentale que soit dans des études chez l'animal ou l'humain. L'objectif est donc de tester si les métabolites bactériens sélectionnés pourraient diminuer les effets délétères de l'isolation sociale ET DE L’OBESITE sur la neurotransmission dopaminergique et le comportement chez la souris.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de comprendre comment les métabolites bactériens qui sont diminués chez les sujets atteints de maladies psychiatriques pourraient protéger des altérations comportementales et de neurotransmission dans un modèle validé de pathologies psychiatriques chez la souris.

Procédures

Les animaux subiront des interventions chirurgicales visant à implanter des fibres optiques dans le cerveau et potentiellement des pompes sous cutanées. La chirurgie stéréotaxique dure 1h30 avec une phase de réveil de 2 heures. L'implantation de pompes sous cutanée quant à elle dure au maximum 15 minutes. Cette dernière sera réalisée en même temps que l'implantation pour les souris concernées. MODIFICATION 2: "DES INJECTIONS ABDOMINALES SERONT REALISEES SUR ANIMAL VIGILES UNE FOIS PAR JOUR PENDANT 5 JOURS POUR L'ADMINISTRATION DU TAMOXIFENE."

Impact sur les animaux

Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère (maintien à 90% du poids ad libitum). Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période entourant l'opération. Le modèle de pathologie psychiatrique reposant sur l'isolation sociale qui induira, d'après la littérature scientifique un phénotype anxieux chez les souris. LA CONSOMMATION DU REGIME HYPERLIPIDIQUE INDUIRA UN GAIN DE POIDS QUI PEUT ETRE ASSOCIE A DES TROUBLES METABOLIQUES (DIABETE) ET UN PHENOTYPE ANXIEUX CHEZ LES SOURIS. Pour les injections ou les tests comportementaux, les animaux subiront des préhensions et contentions. Les souris de la procédure 1 réaliserons des tests comportementaux dont certains induisent un stress de courte durée. Enfin dans le cas ou les métabolites ne pourraient être administrés par l'eau de boisson ou la nourriture (pour des raisons organoleptiques conduisant à la non consommation par la souris), une chirurgie visant à implanter des pompes osmotiques sous-cutanées sera réalisée. MODIFICATION 2: L'INJECTION ABDOMINALES DE TAMOXIFENE INDUIT AUSSI DES EFFETS DE DOULEURS LEGERES A MODEREES CHEZ L'ANIMAL. LA DUREE DANS LE TEMPS SERA LIMITEE A QUELQUES MINUTES APRES CHAQUE INJECTION A RAISON D'UNE PAR JOUR PENDANT 5 JOURS.

Devenir

Tous les animaux expérimentaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour procéder à des analyses histologiques (1040).

Remplacement

Ce projet ne peut être réalisé sans l'utilisation de modèles animaux puisqu'il s'intéresse à des dimensions comportementales, non modélisables sur des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux utilisés. En particulier, nous utiliserons des mâles et des femelles. Le nombre d'animaux (1040) nécessaires est basé sur des expériences précédemment effectuées au laboratoire permettant de révéler des différences statistiques entre groupes ayant subis un stress chronique.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement ultra-enrichi (carré de coton, maison en carton, pièce en plastique pour se cacher et jouer) même en cas d'isolation sociale. Ce stress chronique a été sélectioné par rapport au stress chronique de défaite sociale, modèle de référence en psychiatrie, car il induit des altérations comportementales similaires sans induire de potentielles blessures à l'animal. Du fait de la déprivation alimentaire durant les expériences de conditionnement opérant, les animaux seront observés et pesés tous les jours de la semaine. Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille basée sur des scores de 0 à 3 et seront consignés sur une fiche de scorage (en annexe): - Perte de poids anormale (10-20% score 1, score 3 si supérieur à 20%) - état du pelage - site de chirurgie - Comportements anormaux (poil hérissé, prostration,...). Si le score est supérieur ou égal à 3 une mise à mort immédiate aura lieu. Un suivi du bien être animal sera effectué sur tous les animaux de manière quotidienne pendant le protocole de stress et l'étude comportementale en utilisant une fiche de suivi du bien être (en annexe). Le poids, le comportement général, l'apparence et les signes neurologiques seront scorés. Si un animal présente un score supérieur à 3 dans une des 4 rubriques il sera mis a mort. Sinon si un mal être est détecté il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera mis à mort dans les 48h. Dans tous les cas, si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées (Dakin) et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Concernant l’administration des métabolites d’intérêt, nous priviligérons l’utilisation de l’eau de boisson, la nourriture ou l'implantation d'une mini pompe sous cutanée par rapport à des méthodes plus traumatisantes comme les injections intrapéritonéales répétées ou le gavage. Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

Ce modèle d'étude chez la souris âgée de 8 semaines (jeune adulte) est la référence dans les pathologies psychiatriques et les métabolites d'intérêt dans ce projet sont naturellement présent chez la souris.

Toutes tuées en fin de procédure pour des prélèvements de tissus et de sang, 2 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sans anesthésie, chacune reçoit jusqu'à quatre injections intraveineuses ou sous-cutanées, jusqu'à quatre prises de sang et dix à quinze prises de température rectale sur trois à cinq heures, avec une hypothermie induite qui peut descendre à 32 °C. Il s'agit de tester des vecteurs-médicaments conçus comme un "cheval de Troie" pour franchir la barrière du cerveau, sur des lignées de souris génétiquement modifiées porteuses de cibles humaines. Le porteur affirme que la souris reste le "seul système physiologique" capable d'intégrer ces paramètres, et renvoie les "avancées majeures" pour les patients au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments sur des modèles murins humanisés pour des récepteurs et ou transporteurs d’intérêt.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : - L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). - Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. - La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). - La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). - Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. - Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). - Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50μl/semaine, ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu à une dose de 5.5ml/Kg ou 10ml/Kg respectivement) ou intrapéritonéale (dose unique de 0.1 ml de mélange d’anesthésiques/10g de souris), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements (≤50µl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in silico et in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L'optimisation de nos molécules permet d'améliorer leur efficacité tout en réduisant les doses administrées. Cette approche contribue à limiter les effets indésirables potentiels pour les animaux (raffinement) et à réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats fiables (réduction). Les animaux seront répartis en groupes de 6 (3 mâles et 3 femelles), correspondant au plus faible effectif permettant d'obtenir des résultats scientifiquement valides et robustes. Au total, jusqu'à 2160 souris pourraient être utilisées sur la durée de l'autorisation (5 ans). Ce nombre correspond au scénario maximal envisagé et tient compte de l'évaluation de plusieurs molécules dans différentes lignées de souris génétiquement modifiées nécessaires pour répondre aux objectifs du projet. Les tissus prélevés en fin d'étude seront sélectionnés de manière à maximiser les informations obtenues à partir de chaque animal et à éviter l'utilisation d'animaux supplémentaires. De plus, de très petits prélèvements sanguins réalisés au cours de l'étude permettront de suivre la présence des molécules dans l'organisme sans nécessiter de nouveaux animaux. Plusieurs analyses pourront ainsi être réalisées à partir d'un même animal. Cette stratégie contribue à réduire le nombre total d'animaux utilisés tout en garantissant la qualité scientifique des résultats.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées.

Choix des espèces

Des études in silico et in vitro sont réalisées en amont afin de sélectionner les candidats les plus prometteurs. Toutefois, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité du fonctionnement d'un organisme vivant, indispensable pour évaluer le devenir et l'efficacité d'un candidat thérapeutique. À ce jour, aucun modèle alternatif ne permet de reproduire l'ensemble de ces mécanismes. La souris est un modèle de référence pour l'étude des mécanismes physiologiques in vivo. Elle permet d'évaluer les interactions complexes entre les différents systèmes de l'organisme, indispensables à l'étude de l'efficacité d'un candidat thérapeutique. L'utilisation de souris humanisées est particulièrement pertinente dans ce projet, car elles permettent d'étudier des mécanismes impliquant des protéines humaines et d'obtenir des résultats plus représentatifs de la physiologie humaine. Les lignées utilisées seront constituées de souris jeunes adultes âgées de 8 à 12 semaines (27 à 30 g). Ce stade de développement correspond à une maturité physiologique permettant de limiter la variabilité entre les animaux et d'obtenir des résultats plus homogènes.

Six à huit essais de nage d'une minute par jour, pendant dix à douze jours, attendent une partie des 724 souris de ce projet dans la piscine de Morris, en plus de l'open-field, du labyrinthe en croix et d'un test de reconnaissance d'objets. Toutes reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen pendant cinq jours à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis sont tuées pour l'analyse de leur cerveau. Ces souris, privées par invalidation génétique du gène en cause dans le syndrome de Coffin-Lowry, sont utilisées pour tester un traitement des déficits cognitifs, dès 14 jours de vie pour les plus jeunes. Le porteur précise que ce traitement est déjà administré en recherche clinique à des adultes et à des enfants.

Objectifs

Nous étudions une souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Cette pathologie est due à des mutations d'un gène et conduit à une déficience intellectuelle modérée à sévère chez l’Homme. Il n’existe à ce jour aucun traitement. Pour ce projet, nous utilisons des souris invalidées pour le gène responsable. Notre projet a pour premier objectif de mettre au point un traitement pharmacologique pour corriger les altérations comportementales et cognitives de la souris modèle du syndrome de Coffin Lowry. Notre second objectif sera de tester si ce traitement pharmacologique délivré au plus tôt au cours de la période postnatale, permet d’éviter le retard de développement cérébral et de prévenir l’apparition des altérations cognitives. Enfin, nous combinerons le traitement pharmacologique à un enrichissement environnemental dans le but de corriger les altérations à plus long terme.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe pas de traitement pour les patients atteints syndrome de Coffin-Lowry. Compte tenu de la sévérité des altérations cognitives, la qualité de vie pour ces patients et leurs familles est profondément impacté. Au niveau expérimental chez la souris modèle, la description des altérations moléculaires nous permet aujourd’hui d’envisager de développer des stratégies thérapeutiques basées sur la délivrance d’agents pharmacologiques. Les traitements proposés ont déjà été testés chez d'autres souris modèles et s’avèrent bénéfiques sur certains comportements. Pour information, le traitement proposé est déjà utilisé dans la recherche clinique chez des patients, adultes et enfants, c’est pourquoi nous souhaitons commencer nos expérimentations avec ce candidat médicament. Dans ce contexte, notre projet testera pour la 1ère fois si ce traitement permet aussi de réduire, voire restaurer les altérations cognitives chez la souris modèle du Syndrome de Coffin Lowry.

Procédures

Pour le projet, tous les animaux recevront des injections quotidiennes du traitement ou de solution saline en intrapéritonéale. Après différents délais, ces souris seront mises à mort afin d'analyser leurs cerveaux. Une partie des animaux effectuera en plus des tâches comportementales. La locomotion et l’exploration sera évaluée dans une boite appelée open-field (durée 10 minutes) ou dans un labyrinthe en croix ((durée 10 minutes), ce qui ne génère aucune nuisance. La mémoire de reconnaissance s’effectue dans l’openfield préalablement exploré dans lequel on ajoute des objets à explorer. Pour ce test, les souris sont placées dans cet openfield pendant 10 minutes, 1 à 2 fois par jour pendant 5 jours maximum. La mémoire spatiale sera évaluée avec le test de la piscine de Morris qui génère un léger stress en début de protocole. Le protocole a une durée de 10-12 jours, à raison de 6-8 essais par jour (2 blocs de 3-4 essais successifs). Chaque essai comprend 1 minute de nage et 1 minute de repos sur une plateforme.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéale pendant 5 jours à 6 semaines, selon les procédures expérimentales. Les tests comportementaux pourraient générer une légère réactivité émotionnelle chez les animaux en tout début de test.

Devenir

à l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin d'étudier leur cerveau.

Remplacement

Notre projet de recherche consiste à évaluer les bénéfices d’un traitement visant à réduire / compenser les altérations comportementales et cognitives associées à la déficience intellectuelle (retard d’apprentissage, déficits de mémoire). Bien que certaines cascades moléculaires peuvent être décrites sur des cultures neuronales en conditions basales, il est ensuite absolument nécessaire de valider les bénéfices du traitement sur les processus cognitifs chez un animal vivant qui se comporte dans différentes tâches comportementales.

Réduction

Le nombre d’animaux correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. Sur la base des études publiées et de notre expérience, 4-8 souris par groupe expérimental pour les analyses biochimiques et analyses cérébrales, et 8-15 souris par groupe pour les études de comportement sont nécessaires. Des tests de puissance de nos analyses statistiques seront effectués au cours de nos analyses (à partir de n=4), afin de détecter si des comparaisons suffisamment fiables sont dejà atteintes sans avoir à aller, pour chaque expérience, jusqu'à l'effectif maximum envisagé. Si cette valeur est atteinte, il ne sera pas nécessaire d’augmenter les effectifs jusqu'a à 8 pour les analyses cérébrales ou jusqu'à 15 pour les analyses comportementales. De plus, afin de réduire encore le nombre d’animaux nécessaires, les mêmes souris seront réutilisées dans plusieurs tests successifs, les premiers tests d’exploration ne durant que 10 minutes par jour et par souris.

Raffinement

Limiter la souffrance des animaux, s’assurer de leur bien-être et de leur santé, fait partie de nos préoccupations majeures et conditionne véritablement le bon déroulement de nos études, et la fiabilité de nos résultats. En effet, nos études comportementales doivent, pour les animaux, impérativement s’effectuer en l’absence de stress, anxiété et douleur afin d’être viables. Ainsi, avant de les soumettre aux premières injections ou aux tâches comportementales, l’expérimentateur manipule les souris pour limiter stress et anxiété et les habituer à sa présence. Afin de s’assurer que l’administration du traitement n’altère en rien la santé et le bien-être des souris, la mise en place de points limites permettra de réduire de potentielles souffrances. Pour cela, une grille d’évaluation sera utilisée.

Choix des espèces

Il n’y a pas d’autre modèle animal présentant des mutations équivalentes dans le gène ciblé pour ce projet. Le modèle murin inclus dans notre projet est déjà élevé au laboratoire et permettra de mener de manière rigoureuse notre étude. Les études passées ont montré que ces souris sont des modèles reproduisant des déficits cognitifs associés à la pathologie humaine (retard d’apprentissage, déficit de mémoire). Dans notre projet, une partie des expérimentations seront effectuées à l’âge adulte (>56 jours) afin de montrer les effets potentiellement bénéfiques de notre traitement sur des fonctions cognitives altérées. L’autre partie des expérimentations sera effectuée chez des souris juvéniles (de 14 à 35 jours). En agissant au cours de cette période de développement, nous souhaitons corriger au plus tôt le retard de développement cérébral et éventuellement éviter les altérations cognitives à plus long terme.

Ouvertes par laparotomie pendant une heure pour atteindre les embryons, les femelles gestantes servent de voie d'accès à une greffe d'interneurones humains injectés in utero. D'autres souris sont greffées à deux ou quatre jours de vie, brièvement séparées de leur mère, d'autres encore à l'âge adulte par une chirurgie de trois heures qui ouvre le crâne et y scelle une fenêtre permanente. Suivent des séances d'imagerie répétées, tête immobilisée, sur des souris parfois éveillées, à un, trois et sept mois après la greffe. 998 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, le prélèvement du cerveau interdisant, écrit le porteur, toute réutilisation, replacement ou adoption.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment un gène propre à l’être humain, influence la formation et le fonctionnement des réseaux cérébraux. L’objectif général est de déterminer comment ce gène modifie la survie, la migration, la maturation, l’intégration synaptique et l’activité d’interneurones humains greffés dans un cerveau vivant. Ces cellules jouent un rôle de « frein » et limitent les excès d’activité. Deux contextes pathologiques seront étudiés séparément : la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer. Dans l’axe « Schizophrénie », le projet s’appuie sur les associations génétiques rapportées entre le gène et cette pathologie. La schizophrénie est associée à des anomalies de maturation des circuits corticaux inhibiteurs. Le projet testera si la présence, l’absence ou le dosage de ce gène modifie le développement d’interneurones humains greffés avant ou juste après la naissance, en étudiant leur migration, leur maturation, leur capacité à établir des connexions et l’organisation de leur activité. Dans l’axe « Maladie d’Alzheimer », les effets de ce gène seront étudiés dans un cerveau adulte présentant un environnement amyloïde. Le projet déterminera si le gène augmente ou réduit la vulnérabilité fonctionnelle et moléculaire de ces cellules. Le projet n’a pas d’objectif comportemental, car le nombre de cellules humaines greffées est insuffisant pour modifier le comportement de la souris. Les conclusions reposeront sur des analyses cellulaires, histologiques, transcriptomiques et sur des mesures répétées de l’activité calcique, complétées par des analyses du cerveau en fin d’étude. Les bénéfices attendus sont l’identification de mécanismes reliant le gène à la fragilité ou à la résistance des circuits, ainsi que de signatures pouvant orienter les stratégies ciblant les réseaux impliqués dans la schizophrénie et la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

À l’échelle du projet, les bénéfices attendus sont d’abord mécanistiques. Dans l’axe « Schizophrénie », les expériences permettront de déterminer si le gène étudié modifie la migration, la maturation, l’identité et l’activité d’interneurones humains pendant des fenêtres précoces du développement cérébral. Elles permettront de distinguer un effet sur la survie d’un effet sur la vitesse ou la qualité de maturation. Dans l’axe « Alzheimer », le plan déterminera si le gène étudié modifie spécifiquement la réponse des interneurones humains à un environnement amyloïde, notamment les programmes de stress, de maturation synaptique et l’activité calcique. La combinaison de l’histologie, de la transcriptomique et de l’imagerie longitudinale doit produire des résultats interprétables à plusieurs niveaux : localisation et maturation des cellules, mécanismes moléculaires et fonctionnement au cours du temps. Les résultats pourront identifier des signatures de vulnérabilité ou de résilience dépendantes de ce gène et améliorer la pertinence des modèles précliniques portant sur le récepteur α7, puisque les souris ne possèdent pas naturellement de ce gène. Aucun bénéfice thérapeutique immédiat ni effet comportemental n’est attendu. À plus long terme, les mécanismes identifiés pourront orienter des études pharmacologiques ciblant l’axe étudié et aider à sélectionner des marqueurs cellulaires ou fonctionnels pour de futurs projets. L’utilisation des animaux imagés pour les analyses terminales maximise les informations obtenues et pourra réduire les effectifs de travaux ultérieurs.

Procédures

- Chirurgie abdominale chez la souris gestante. Chaque chirurgie dure environ 60 min, en excluant les temps de préparation de l’animal et les temps post-opératoires. - Greffe de cellules chez l’embryon de souris au dernier tiers de gestation : injection 30 secondes au total. - Greffe de cellules chez la souris nouveau-né au dernier tiers de gestation : injection 45 secondes au total par hémisphère. - Greffe de cellules chez la souris adulte par injection dans le cerveau : injection 60 min /souris. - Pour les animaux inclus dans le suivi d’imagerie longitudinale, une fenêtre crânienne chronique est implantée au moment de l’intervention adulte; la chirurgie complète (craniotomie, injection éventuelle, pose de fenêtre et fixation) dure au maximum 3 heures, hors préparation et réveil.

Impact sur les animaux

Chez les nouveau-nés, les effets indésirables attendus sont liés à la manipulation et au geste d’injection d’une durée courte (quelques minutes) : stress transitoire associé à une courte séparation d’avec la mère (et réciproquement, stress de la mère vis-à-vis de la portée), ainsi qu’une douleur modérée (de quelques jours, lié à la chirurgie). Chez les femelles gestantes subissant une chirurgie abdominale (laparotomie pour accès in utero), les nuisances attendues comprennent une douleur post-opératoire modérée et une gêne transitoire liées à la cicatrisation. Chez les adultes subissant une chirurgie stéréotaxique, les effets indésirables attendus correspondent principalement à une douleur post-opératoire modérée, une baisse transitoire d’activité et, plus rarement, une perte de poids modérée immédiatement après l’intervention. Pour les animaux qui sont inclus dans la procédure d’imagerie avec fenêtre crânienne, des nuisances additionnelles sont attendues. Dans les jours suivant la craniotomie et la pose de la fenêtre, certains animaux peuvent présenter un inconfort local et un grattage autour de la zone opérée ou du matériau de scellement ; ce comportement est généralement transitoire et diminue au cours de la première semaine. Enfin, l’imagerie in vivo nécessite une phase d’habituation (manipulations répétées, installation sur le dispositif et, lorsque l’enregistrement est réalisé chez l’animal éveillé, contention légère et immobilisation de la tête). Ces étapes peuvent entraîner un stress et un inconfort léger, surtout lors des premières séances, parfois suivis d’une irritabilité transitoire.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Les objectifs du projet reposent sur l’analyse détaillée du cerveau ce qui nécessite le prélèvement des tissus cérébraux et donc ne permet pas de conserver l’animal en vie. En conséquence, les animaux ne peuvent pas être réutilisés, replacés ni proposés à l’adoption, car le prélèvement du cerveau est indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet.

Remplacement

L’objectif central du projet est de recréer un contexte cérébral in vivo pour analyser le développement, l'intégration et le fonctionnement de neurones d'origine humaine au sein de réseaux nerveux intacts, et leur modulation dans des contextes pathologiques pertinents pour la maladie d'Alzheimer et la Schizophrénie. Ce niveau d'organisation (architecture tridimensionnelle, vascularisation, interactions cellulaires, connectivité à longue distance, activité des circuits) n'est pas accessible in vitro. Les protocoles nécessitent des méthodes standardisées chez les rongeurs, avec des outils robustes. La souris est un modèle de choix : élevage maîtrisé, lignées génétiques, suivi longitudinal. La xénogreffe de neurones humains permet d'étudier des gènes humains dans un cerveau vivant, indispensable pour relier mécanismes cellulaires et phénotypes de réseau. Les organoïdes cérébraux et les systèmes microphysiologiques sont des avancées majeures, mais ne reproduisent pas un cerveau fonctionnel intact. Ils modélisent certaines étapes du développement et des interactions locales, mais sans vascularisation perfusée, système immunitaire, innervation périphérique ou interactions systémiques. Ces limites restreignent leur maturation et empêchent d'étudier la connectivité à longue distance, la régulation neurovasculaire, les réponses métaboliques/hormonales et les propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques. Outils complémentaires in vitro, ils demeurent insuffisants pour la dynamique fonctionnelle, la plasticité et les interactions de réseaux dans un cerveau vivant. Les approches in vivo restent indispensables pour comprendre l'intégration de cellules humaines dans un environnement cérébral complet, en conditions physiopathologiques réalistes.

Réduction

Le projet combine des approches transversales (prélèvements terminaux à des temps définis pour différents analyses) et longitudinales (suivi répété des mêmes animaux, notamment par imagerie fonctionnelle), afin de maximiser l’information obtenue par animal. Une partie des animaux suivis longitudinalement est ensuite utilisée pour les analyses terminales, ce qui permet de relier des phénotypes fonctionnels à des mesures tissulaires et moléculaires sans augmenter les effectifs. Les tissus non immédiatement analysés peuvent être conservés dans des conditions adaptées afin d’éviter de nouveaux prélèvements. Les analyses sur cellule ou noyau unique reposent sur des protocoles déjà établis, capables de générer une grande quantité d’information à partir d’un nombre limité d’échantillons, ce qui contribue directement à la réduction du nombre d’animaux. Pour les greffes in utero, la taille des portées permet de limiter le nombre de femelles gestantes nécessaires. Le stade d’injection retenu a été optimisé lors d’études précédentes et assure une bonne survie de la progéniture. Les mâles et les femelles sont inclus avec une répartition aussi équilibrée que possible. Les animaux sont mis à mort en fin de protocole car les objectifs nécessitent le prélèvement du cerveau ; ils ne peuvent donc pas être réutilisés.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées dans un laboratoire dédié exclusivement à la chirurgie. L’élevage sera en cage individuelle par portée et des mesures seront prises pour éviter tout animal isolé au-delà d’une période de 24h. Les animaux seront placés sur dispositif chauffant pour maintenir une bonne température corporelle avant, pendant et après l’expérience et seront étroitement surveillés après chirurgie sous anesthésie et analgésie multimodale. Les points limites spécifiques et précoces pour chaque étape du projet serons appliqués. Dans les procédures expérimentales, les souris feront l’objet d’une surveillance renforcée, de soins pré- et post-opératoires adaptés, des mesures de gestion de la douleur seront entreprises pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des souris. De façon générale et pour l’ensemble des protocoles de chirurgies sous anesthésie, nous rechercherons à minimiser la douleur par antalgiques, ajout de gel hydrique, par un réchauffement continu des animaux, et par des solutions de réhydratation maintenues à la température corporelle. Un renforcement des mesures de bien-être animal sera systématiquement appliqué à chaque étape. Il inclut une surveillance accrue durant la période critique post-opératoire, une évaluation plus fréquente de la douleur et de l’état général des animaux, et l’intervention rapide en cas de signes de gêne ou de souffrance. Le renforcement de l’enrichissement des cages sera intensifié par l’ajout de matériaux de nidification, de dômes en carton et d’éléments favorisant le comportement naturel. L’utilisation et l’état des cotons et nids seront surveillés pour s’assurer du confort thermique et comportemental des animaux.

Choix des espèces

L’évaluation du rôle du système nicotinique et d’un récepteur particulier chez l’homme dans les processus associés à la maladie d’Alzheimer et la Schizophrénie ne peut être réalisée autrement que sur animaux vivants, présentant des niveaux de développement cognitif et de capacités mnésiques suffisants pour représenter un modèle d’étude pertinent. Les protocoles décrits ne peuvent s’effectuer que chez les rongeurs (rat ou souris) du fait des outils disponibles (taille des appareillages), et de la manipulation plus aisée. La souris représente un des meilleurs modèles, jusqu’à présent, sur lesquels on peut étudier les comportements liés à la psychiatrie, dont l’élevage et le maintien en bonnes conditions reste pratique à réaliser en laboratoire, et dont on sait également analyser et manipuler le génome (pour étudier notamment le rôle des sous-unités nicotiniques dans le cadre de ce projet). La Procédure 1 utilise des femelles adultes en fin de gestation. Cette intervention permet l’accès aux embryons à E17.5 et la réalisation des greffes in utero décrites dans la Procédure 2. Les descendants sont ensuite analysés à 1, 3 et 7 mois post-greffe. Ces temps correspondent respectivement à la prise de greffe et à la migration initiale, à une phase intermédiaire de différenciation et de maturation, puis à une maturation plus avancée et à l’intégration fonctionnelle. La Procédure 3 utilise des souriceaux à P2-P4. Ce stade postnatal précoce reste compatible avec une forte plasticité cérébrale, tout en permettant d’étudier la survie, la maturation et l’intégration d’interneurones humains dans un hôte immunodéficient permissif. Les analyses sont réalisées aux mêmes temps, à 1, 3 et 7 mois post-greffe. La Procédure 4 utilise des souris adultes âgées d’au moins 2 mois, dont les circuits cérébraux sont établis. Les analyses à 3, 4 et 7 mois post-greffe permettent d’évaluer successivement l’intégration initiale, les réponses précoces, puis les effets plus tardifs sur la maturation et l’activité des cellules greffées. Les modèles embryonnaire, néonatal et adulte répondent ainsi à des questions complémentaires et ne seront pas interprétés comme une comparaison reposant uniquement sur l’âge de greffe.

Mises à mort par exsanguination après un unique prélèvement sanguin, pour que leurs organes soient prélevés un à un, 640 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection sous anesthésie gazeuse ou une administration orale sur animal vigile, d'une molécule radiomarquée dont la répartition dans le corps est suivie par imagerie. L'objet est de choisir la dose et la voie d'administration avant une future étude d'efficacité contre les tauopathies, dont la maladie d'Alzheimer. Le porteur écrit compter cinq rongeurs par type d'analyse et dix souris par groupe d'imagerie, sans que ces chiffres rendent compte des 640 prévus.

Objectifs

Il s’agit d’un projet de recherche fondamentale en vue d’une application en santé humaine. Les objectifs du projet sont de compléter un programme initial de développement de nouvelles thérapies pour le traitement des tauopathies telles que la maladie d’Alzheimer. Un nouvel agent a en effet permis de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle de souris malades. En utilisant maintenant une version de la molécule associée à un traceur radioactif (molécule radiomarquée), nous souhaitons évaluer les paramètres pharmacocinétiques de cette molécule et déterminer sa biodistribution dans l’organisme de la souris par imagerie. L’ensemble de ses informations sont nécessaires afin de sélectionner la dose et la voie d’administration pour mener par la suite une étude d’efficacité thérapeutique de la molécule.

Bénéfices attendus

Aucun traitement curatif n'existe actuellement pour le traitement des tauopathies, ensemble de maladies neurodégénératives caractérisées par l’accumulation dans les neurones d’agrégats toxiques de la protéine Tau, et dont la plus connue est la maladie d'Alzheimer. Cette étude intervient dans le développement de nouvelles thérapies pour ces pathologies n'ayant montré que peu d'effet lors des essais cliniques. Ce projet permettra de définir l’action d’une nouvelle classe de composés à visée thérapeutique sur les tauopathies en étudiant leurs paramètres pharmacocinétiques et de biodistribution dans un organisme entier afin de pouvoir initier la mise en place d’un premier dossier clinique pour démarrer des essais cliniques chez l’humain.

Procédures

Un opérateur spécialisé réalisera une injection (30 secondes) sur animal sous anesthésie gazeuse ou une administration orale (30 secondes) sur un animal vigil. Un seul prélèvement de sang (1 minute) sera réalisé par animal sous analgésie et anesthésie chimique générale puis les animaux seront mis à mort par exsanguination afin de prélever les différents organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs à la manipulation sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection ou un stress lié à la contention des animaux lors de l’administration orale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à l’issue de la procédure car l’étude de la biodistribution de la molécule nécessite de prélever les organes.

Remplacement

De premières manipulations réalisées en laboratoire sur des cellules de neurones ont permis de diminuer les taux des protéines impliquées dans le développement la maladie d’Alzheirmer. Cependant, la maladie d’Alzheirmer est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qu’il est possible de modifier génétiquement pour qu’elle exprime cette maladie, il est donc indispensable d’utiliser ces animaux pour développer des médicaments utilisables chez l’homme par la suite.

Réduction

Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse. Pour l’étude des tissus par imagerie, nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux par groupe (n=10 : 5 mâles et 5 femellesDe plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux, seule la dose de la molécule et la voie d’administration optimales sélectionnées à l’issu des expériences sur les souris saines seront testées sur les souris développant la maladie d’alzheimer.

Raffinement

La douleur engendrée lors des administrations est de courte durée et limitée par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse lorsque cela est possible. Les prélèvements présentent une douleur potentiellement plus importante, ils seront donc réalisés sous analgésie et anesthésie chimique générale. Bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, souffrance et angoisse associées à l’administration des composés, les animaux seront sous surveillance accrue durant les 24H de la manipulation et donc au moment même de l’apparition du moindre problème.

Choix des espèces

La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère qui peut être modifiée génétiquement pour modéliser la maladie d’alzheimer. (Ce modèle est disponible chez les éleveurs agréset est reconnu par la communauté scientifique, il a déjà été utilisé dans de nombreux projets scientifiques et est bien caractérisé. Les études de pharmacocinétique seront réalisées chez la souris, portant un fond génétique proche des souris porteuses de la maladie. Nous utiliserons des souris adultes car dans ce modèle la phase précoce de la tauopathie, apparaît entre 2,5 à 4 mois. Le projet prévoit l'utilisation des 2 sexes (même nombre d'animaux dans les deux sexes), la tauopathie étant décrite pour se développer de manière légèrement différente chez les mâles et les femelles dans le modèle.