Troubles nerveux

544 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de dépression obtenu par corticostérone dans l'eau de boisson pendant cinq semaines, suivi d'injections de kétamine, de chirurgies stéréotaxiques cérébrales et de la pose de canules intracérébrales. Il indique que les animaux subissent une "batterie de tests comportementaux" dont il ne précise pas le détail, avant la mise à mort pour analyser les marqueurs cérébraux. Sur le remplacement, il affirme que la dépression ne peut être reproduite sur des lignées cellulaires et que la souris en offre un modèle proche de l'humain.

Objectifs

La découverte de propriété antidépresseur de la (±)-kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et a suscité l’espoir de nouvelles avancées thérapeutiques. En effet, alors que les antidépresseurs classiques ciblant les systèmes monoaminergiques mettent des semaines à agir et sont souvent inefficaces - 30 % des patients ne répondent pas au traitement - l'administration d'une dose subanesthésique unique de (±)-kétamine provoque des actions antidépresseurs rapides et robustes chez les patients souffrant de dépression pharmaco-résistante. Si ce pouvoir antidépresseur est fermement établi, plusieurs aspects du mode d'action de la (±)-kétamine restent mal caractérisés ou controversés, et son utilisation clinique est limitée par des effets psychomimétiques indésirables sévères. Il est donc essentiel de mieux comprendre les mécanismes qui sous-tendent son efficacité antidépresseur rapide et ses caractéristiques psychomimétiques afin d’identifier de nouvelles cibles pour une intervention thérapeutique sûre dans les troubles dépressifs. Nous proposons qu'en remodelant l’organisation synaptique des récepteurs NMDA du glutamate (récepteurs majeurs de la neurotransmission excitatrice), la (±)-kétamine modulerait les réseaux neuronaux soutenant la récompense et l'humeur, et soulagerait ainsi les symptômes de la dépression.

Bénéfices attendus

En utilisant une combinaison de techniques d’imagerie de super-résolution, électrophysiologie, de biochimie et de comportement, nous évaluerons l'impact de la (±)-kétamine sur la dynamique, la stabilisation et l’organisation synaptique des récepteurs NMDA dans les réseaux corticaux et hippocampiques. Nous étudierons ensuite comment les redistributions des récepteurs NMDA induites par la (±)-kétamine peuvent soutenir les changements de connectivité au sein des réseaux cortico-mésolimbiques et mettrons en œuvre des tests comportementaux pour établir si moduler l’organisation des récepteurs NMDA aux synapses contrebalance ou imite les actions antidépresseur ou psychotomimétique de la (±)-kétamine.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions: -remplacement de l'eau de boisson par une eau de boisson supplémentée avec de la corticosterone pour generer un stress chronique chimique visant à créer un modéle de depression (5 semaines), qui sera reversé par l'injection intraperitonéale de Kétamine (1 min). -Les animaux subiront une batterie de tests comportementaux pour evaluer la depression et l'impact de la ketamine ou des anticorps bloquant la mobilité des récepteurs sur la depression. (12 jours). -Des injections intracerebrales de virus par chirurgie stéréotaxique (30 min) permettant d'identifier des changements de connections entre les réseaux neuronaux de la depression. -Installations par chirurgie des guides cannules intracérébrales (1h) et injection intracerebrale de molécules visant à manipuler les réseaux neuronaux de la depression (15 min) Avec l'euthanasie, notre saisine contient 6 procedures, mais tous les animaux ne subiront pas les 6 procédures.

Impact sur les animaux

Notre modèle de dépression chez la souris repose sur l’administration chronique de corticostérone dans l’eau de boisson pendant une période de 5 semaines. Ce traitement va donc générer un comportement anxieux et dépressif. Nous mettrons en œuvre également des approches chirurgicales, soit pour injecter des préparations d'ADN, soit pour poser des systèmes médicaux à demeure (canules d’injection) permettant l’injection intracérébrale locale. Ces approches chirurgicales pourront occasionner une gêne associée à la cicatrisation et la récupération post- chirugicale. Toutes ces nuisances sont suivies et pris en charge médicalement quand cela est possible

Devenir

A l'issu de chaque procédure, les animaux sont maintenus en vie pour participer à une autre procédure ou soient euthanasiés pour réaliser l'analyse des marqueurs moléculres de la depression

Remplacement

La dépression est une pathologie complexe, faisant intervenir plusieurs régions cérébrales et plusieurs systémes de neurotransmetteur. Il est impossible de mimer les changements cérébraux sur des modèles alternatives types lignées céllulaires. Les modèles murins offrent une opportunité unique d'étudier au plus prés de la pathologie humaine la depression

Réduction

Une planification précise des expériences a également été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides (réduction).

Raffinement

Toutes les chirurgies s'accompagnent de l'injection de substances pharmacologiques permettant de réduire durablement la douleur et les souffrances pendant la chirurgie et les jours suivants, pendant la phase de récupération. Le stress des injections intracérébrales (IC) est réduit par une manipulation quotidienne des souris pour l'entretien des guides canules. Les effets secondaires potentiels seront évalués par un suivi des prises alimentaires. Des changements dans l’interaction des animaux avec les expérimentateurs seront contrôlés quotidiennement, 3 jours avant et pendant toute la période des injections. Si ces paramètres varient, ils seront consignés et provoqueront l'arrêt des injections. Les animaux seront maintenus par 4 afin de maintenir le comportement social, pour une cabane transparente rouge et un carré de coton seront ajoutés dans la cage pour enrichir l’environnement. Si nous observons un ou plusieurs des signes cliniques tels que la perte de poids, l'absence d'appétit, l'agressivité anormale à la manipulation, poils hérissé et dos vouté, indifférence par rapport au milieu extérieur). Une fiche de suivi quotidien est initiée pour un suivi sur au moins 5 jours (cf suivi chirurgie). Si les solutions de raffinement telles que le réchauffement de l'animal, l'apport de nourriture ramollie/en gel enrichi en glucose ne changent pas durablement l'état de santé de l'animal durant les 5 jours de suivi, nous procéderons à la mise à mort de l'animal. Le responsable de l'étude est le seul à pouvoir prendre la décision de mise à mort à ce stade.

Choix des espèces

Notre projet utilise des souris C57BL/6J principalement en raison de la forte homologie dans les mécanismes de base de la depression entre l'homme et la souris. Les réseaux neuronaux et les systémes de neurotransmetteurs mis en jeu sont similaire entre la souris et l'homme. De plus, les nombreuses stratégies thérapeutiques actuelles chez l'homme ont été développé ce qui permet d'illustrer la pertinence de ce modèle La depression est une pathologie qui touche tous les ages, sans réelle prépondérence en fonction de l'âge, c'est pourquoi nos études se feront sur les souris adultes (2-4 mois)

1 472 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections chroniques de cocaïne ou de morphine, et une partie subit un test de peur conditionnée par chocs électriques (864 souris) ou une lésion pharmacologique du cortex frontal (608 souris) pour modéliser un stress post-traumatique ou un traumatisme crânien. Le porteur affirme que le conditionnement de peur n'induit "ni stéréotypies ni modification du comportement" durable. La mise à mort se fait par exsanguination sous anesthésie, présentée comme la seule façon de prélever assez de sang.

Objectifs

L’objectif du projet est de rechercher des biomarqueurs des comorbidités addictions / traumas psychologique (stress traumatique) ou physique (trauma cérébral). Pour cela, nous modéliserons chez la souris la prédisposition au développement de comportements de type état de stress post-traumatique (ESPT) suite à l’addiction à différentes drogues telles que la cocaïne et la morphine, et inversement d’établir un modèle de prédisposition à l’addiction à ces drogues dans le contexte de l’ESPT ou de trauma cérébral léger cortico-frontal. Ces modèles seront utilisés afin de rechercher des biomarqueurs de co-morbidités à la fois au niveau central (cerveau) et périphérique (sang). Le but à long terme est de proposer des stratégies diagnostiques et thérapeutiques communes à l’addiction et aux traumas psychologiques et/ou physiques.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront d'identifier des biomarqueurs des comorbidités addictions et traumas, et de mieux comprendre les mécanismes communs à ces pathologies afin de développer de futures thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies comorbides.

Procédures

Afin de modéliser l'addiction un test de préférence de place conditionnée est effectué sur l'ensemble des souris (n=1472) et permet de mesurer l'effet récompensant d'une drogue (administration chronique, 8 injections, morphine ou cocaine). Afin de modéliser les comorbidités, des animaux subiront également, soit une modélisation de l'ESPT, soit du trauma crânien léger. La modélisation du stress traumatique est effectuée sur n=864 souris, grâce au test de la peur conditionnée, qui permet que l'animal associe un choc electrique léger (x6, 2sec) avec un environnement durant 15 minutes totale du test. Une remise ultérieure dans cet environnement sans choc electrique constituera un "rappel de la peur" afin de mimer les flashbacks, reviviscence du souvenir traumatique, symptôme retrouvé chez les patients atteints d'ESPT. La modélisation du traumatisme crânien léger, sera effectuée sur n=608 souris, par lésion pharmacologique du cortex cérébral frontal, et necessite un chirurgie sous anesthésie générale ainsi que la prise en charge de l'éventuelle douleur résultante par un antalgique.

Impact sur les animaux

Même si le conditionnement de peur, consiste à modéliser un stress traumatique, dans nos conditions, il n'induit, ni stéréotypies, ni modification du comportement de type émotionnel (aux tests de comportement de type anxieux effectués le lendemain). Le stress ressenti par l'animal lors de cette procédure est donc de très courte durée. La lésion cortico-frontale peut entrainer une perte de poids et une mobilité réduite légère durant les 24h suivant la chirurgie, mais les animaux, pour la plupart (sauf atteinte des points limites dans 10% des cas au maximum), recouvrent leurs capacités locomotrices et leur poids au maximum 3 jours plus tard. Les traitements avec les drogues peuvent entrainer une perte de poids. Par contre, l’interruption du traitement durant 2 jours le samedi et le dimanche empêche généralement une perte supérieur à 15%.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie. L'exsanguination est en effet la seule méthode permettant de prélever suffisamment de sang chez la souris pour la recherche de biomarqueurs au niveau périphérique.

Remplacement

Les analyses in silico ou in vitro ne permettent pas à ce jour de modéliser ni la complexité du cerveau, ni celle du comportement aux cours des pathologies telles que l’addiction aux drogues et le trauma cérébral. Le modèle animal permet de réaliser des expériences comportementales complexes.

Réduction

Pour réduire le nombre de souris utilisées, nous avons estimé la taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace (ANOVA et tests post-hoc) grâce aux données collectées au cours d’expériences précédentes. Dans chaque expérience, le nombre minimum d’animaux pour avoir une étude statistique satisfaisante a été choisi. L’existence de variabilités interindividuelles ne permet pas d’aller en dessous d’une population de 14 animaux par groupe.

Raffinement

L’angoisse des animaux sera minimisée par au moins une semaine d’habituation aux conditions d’hébergement avant le début des expériences. Les animaux seront hébergés dans des conditions normales (4 souris / cage) avec enrichissement du milieu (nids végétaux). Tous les groupes auront accès libre à l’eau et à la nourriture. Les animaux opérés bénéficeront d'anesthésie (kétamine/xylazine) et de traitement d'un traitement anagésique per-opératoire (méloxicam). Toute atteinte de point limite entrainera la mise à mort de l'animal par dislocation cervicale. Les points-limites sont les suivants : - Toute perte de poids supérieure à 15% (aucune perte de poids : score = 0, perte de poids 15% : score = 2). - Toute modification majeure de l’état général : comportement (très agité, immobilité, automutilation) ; apparence physique (présence de pus sur la plaie, poil très ébouriffé, posture anormale). Aucune modification : score = 0, comportement ou apparence physique : score = 1, comportement et apparence physique : score =2.

Choix des espèces

Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles d’addiction, de trauma cérébral, et le conditonnement de la peur. De plus, cette espèce offre la possibilité de travailler ultérieurement sur des animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons seront de jeunes adultes. Ils arriveront au laboratoire à l’âge de 7 semaines environ et ne seront pas testés avant leur 8ème semaine, ce qui correspond à une phase où ils sont sexuellement mâtures. Il est important que nous réalisions ces expériences chez l’animal adulte pour éviter l’effet de l’âge sur les performances comportementales.

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.