Troubles nerveux

Deux heures de chirurgie cérébrale, douze heures d'isolement pour récupérer, puis jusqu'à quatre heures d'isolement à chaque test comportemental, aucun de ces tests n'étant nommé : 872 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélever leur tissu cérébral, les reproducteurs compris. Un vecteur viral est injecté dans le striatum de souris R6/1 et zQ140, deux lignées reproduisant la maladie de Huntington, afin de tester si l'activation d'un gène de rajeunissement cellulaire ralentit la dégénérescence des neurones. Le porteur indique que les R6/1 seront utilisées avant quinze semaines, donc avant l'apparition de leur phénotype dommageable, altération motrice progressive et parfois crises d'épilepsie. Il place cependant les tests comportementaux et biochimiques entre dix et douze semaines, "moment où les premiers signes de la maladie commencent à apparaître".

Objectifs

La maladie de Huntington est une maladie génétique rare qui cause une dégénérescence progressive de neurones, principalement dans une région du cerveau appelée le striatum. Cette dégénérescence affecte les fonctions motrices, cognitives et psychiatriques. Trouver un traitement capable de ralentir ou stopper l’évolution de cette maladie est un objectif clé de la recherche. Les recherches récentes suggèrent que les neurones touchés par cette maladie vieillissent prématurément. L'objectif de ce projet est de tester si l'activation de certains mécanismes moléculaires dans le striatum, grâce à des injections virales, peut ralentir la progression de la maladie. Pour cela, nous utiliserons deux modèles murins bien caractérisés, qui reproduisent les principaux aspects de la maladie. Ces modèles seront utilisés de manière complémentaire pour valider les résultats obtenus à travers différentes approches expérimentales.

Bénéfices attendus

Les maladies neurodégénératives représentent un fardeau social et économique majeur. Les maladies neurodégénératives, étant liées à l'âge, touchent une proportion croissante de la population, en particulier dans les pays européens. Il y a donc un besoin urgent de découvrir des thérapies. Comprendre les mécanismes de la maladie d’Huntington et moduler son impact serait une avancée thérapeutique majeure. Ce projet fournira des données utiles à la communauté scientifique et pourrait bénéficier à d’autres recherches thérapeutiques et fondamentales, tout en améliorant notre compréhension des maladies neurodégénératives chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront mis en accouplement et les descendants seront utilisés dans le cadre de l’étude. Les animaux seront soumis à une chirurgie (2h). Suite à cette chirurgie, ils seront isolés pendant 12h maximum. Les animaux de seront isolés pendant les taches comportementales pour un délai maximal de 4h.

Impact sur les animaux

Les souris R6/1 seront utilisés avant l'age de 15 semaines, soit avant l'apparition de leur phénotype dommageable (à partir de 20 semaines). Ce phénotype s'exprime par une altération motrice progressive et dans certains cas par des crises d'épilepsie. Des nuisances potentielles peuvent survenir après les chirurgies, telles que du stress ou des douleurs modérées, avec un risque très rare d'inflammation ou d'infection. Un isolement de 12 heures, bien qu'il génère un stress lié à la solitude, est nécessaire après la chirurgie pour permettre aux animaux de récupérer. Un autre isolement de 4 heures maximum sera nécessaire pour la réalisation des tests comportementaux, bien que cela puisse également induire du stress. Concernant l'injection d'un vecteur viral, peu de nuisances sont attendues pour les souris, et le délai après injection est court (4 semaines), ce qui représente une période faible par rapport à leur durée de vie. Les changements moléculaires attendus ne devraient pas entraîner de modifications importantes de leur comportement ou de leur état. Les tests comportementaux peuvent générer un stress.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu cérébral, y compris les animaux reproducteurs.

Remplacement

Cette étude vise à explorer un traitement potentiel pour la maladie de Huntington, une maladie neurodégénérative incurable qui entraîne un vieillissement prématuré de neurones chez l’adulte. A cette fin, un gène permettant de rajeunir les cellules sera exprimé dans les neurones. Dans un premier temps, nous étudierons l'effet de la surexpression de ce gène dans des neurones en culture. Cependant, les neurones en culture sont imparfaitement différenciés et ne reproduisent pas de manière satisfaisante la complexité des interactions cellulaires dans un cerveau et le mécanisme de vieillissement cérébral. L'objectif du projet étant de tester une approche pour rajeunir le cerveau Huntington, le recours à des modèles mammifères de la maladie permettant d'étudier le mécanisme pathogénique à un stade mature/adulte du cerveau est un aspect essentiel du projet. Les souris R6/1 et zQ140 sont des modèles de référence qui reproduisent des phénotypes clés de la pathologie humaine, dont le vieillissement prématuré de neurones. Ces modèles permettront d’évaluer si le traitement proposé ralentit ou stoppe la progression de la maladie.

Réduction

Les études comportementales incluent plusieurs tests moteurs et cognitifs pour mesurer des paramètres spécifiques. Étant donné la variabilité naturelle entre les individus, des groupes d'animaux plus grands sont nécessaires pour détecter des différences significatives entre les groupes. Pour les analyses histologiques et biochimiques, la variabilité étant plus faible, des groupes plus petits suffisent pour observer les différences.

Raffinement

Les animaux seront génotypés de manière non invasive grâce à une pincée de poils. Ils seront utilisés avant l’apparition des symptômes liés à leur génotype. La chirurgie se déroulera sous anesthésie gazeuse, avec une injection d’analgésique local pour réduire la douleur au niveau de l’incision. Une pommade anesthésique sera appliquée pour éviter les douleurs liées aux barres d’oreilles, et une pommade à base de vitamine A protégera les yeux du dessèchement. Un anti-inflammatoire sera administré pour soulager la douleur après l’opération. De plus, une solution saline (NaCl) tiède sera injectée pour compenser les pertes hydriques, et un tapis chauffant permettra de maintenir la température corporelle. Après la chirurgie, les animaux seront isolés pour faciliter leur récupération tout en préservant la dynamique sociale dans leur groupe. Pendant toute la durée de l’étude, leur état de santé sera étroitement surveillé par du personnel qualifié. Avant les tests, les animaux seront habitués à la manipulation pour limiter leur stress. Lors des tests comportementaux, ils seront temporairement isolés dans des cages enrichies avec des tunnels, des matériaux pour faire un nid, et de la nourriture déposée au sol pour faciliter leur alimentation. En cas de problème de santé grave, les animaux seront rapidement mis à mort, sans douleur par dislocation cervicale.

Choix des espèces

L’animal choisi pour cette étude est la souris, car son cerveau présente des structures similaires à celles du cerveau humain. En particulier, des zones comme celles responsables des mouvements et de la coordination sont touchées dans la maladie d’Huntington. Ces zones sont présentes chez la souris, mais pas chez des animaux plus simples comme le vers C. elegans, la mouche drosophile ou le poisson-zèbre. Les modèles de souris utilisés sont bien établis pour étudier la maladie d’Huntington et tester des traitements potentiels. Ces modèles sont utilisés ensemble pour valider les résultats de manière croisée. Les souris seront utilisées lorsqu’elles sont jeunes adultes, avec des procédures chirurgicales commencées entre 6 et 8 semaines d’âge, car à cet âge, leur système nerveux est entièrement développé. Les tests comportementaux et biochimiques auront lieu entre 10 et 12 semaines, moment où les premiers signes de la maladie commencent à apparaître.

Des injections répétées de streptozotocine provoquent chez treize macaques à longue queue des symptômes de maladie d'Alzheimer, après une ou deux chirurgies d'implantation sous anesthésie générale. Ces treize primates vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et tués à l'issue, pour que soient analysés biochimiquement et anatomiquement les effets d'une illumination du crâne par casque infrarouge. Le porteur liste parmi les nuisances attendues douleurs postopératoires, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection et hallucination temporaire, puis écrit n'attendre "pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d'illumination ou l'induction des symptômes". Il annonce neuf prélèvements de sang et de liquide céphalo-rachidien ainsi que "des tests comportementaux", sans préciser lesquels.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative, c’est-à-dire que la MA perturbe et endommage le bon fonctionnement des neurones jusqu’à entraîner la mort de ces cellules qui conduit à une perte progressive de la mémoire. Cette maladie touche de plus en plus de personnes et devient donc un problème de santé publique majeur au sein des pays développés. Dans les cerveaux des personnes atteintes de la MA, ils existent deux marqueurs neuro-pathologiques cérébrales, qui sont : les dépôts extracellulaires de petites protéines appelées amyloïde-β et les dépôts intracellulaires de protéines nommées Tau. Actuellement, il n’existe pas de traitement médicamenteux permettant de guérir de la maladie d’Alzheimer. Les traitements actuels ont une efficacité faible, inconstante et limitée dans le temps. Ils comportent un risque d’effets indésirables graves, augmentant avec la durée du traitement et n’enrayent pas la progression de la maladie. Une thérapeutique innovante par la lumière, la photobiomodulation, pourrait être une solution thérapeutique pour ralentir le développement de la maladie. Les effets de l’illumination proche infrarouge ont notamment été étudiés pour la maladie de Parkinson sur le plan préclinique (modèles primates et rongeurs), et ont donné des résultats très prometteurs de neuroprotection par la lumière. Ces résultats ont permis de démarrer un essai clinique en 2021 sur des patients parkinsoniens afin d’essayer de ralentir le développement de leur pathologie. Les mécanismes d’actions de la photobiomodulation semblent assez génériques (action sur un composé de la cellule, appelé mitochondrie), et pourrait être bénéfique pour d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie d’Alzheimer. Les régions cérébrales ciblées (cortex) étant plus en surface que pour la maladie de Parkinson (substance noire), la photobiomodulation sera administrée via un casque et les photons traverseront la boite crânienne pour atteindre le cortex. Notre projet nécessite l’utilisation de 13 primates non humains (PNH) et sera réalisé dans le plus strict respect de la règle des 3 R.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce nouveau projet sont une évaluation sur un modèle de primate non humain présentant des symptômes de la maladie d’Alzheimer, du bénéfice possible grâce à un traitement par photobiomodulation pour ralentir le développement de la maladie.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une voir 2 procédures chirurgicales et des injections sous anesthésie générale- de la photobiomodulation extracranienne - 9 prélèvements sanguins et de liquide céphalo-rachidien - des tests comportementaux

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par l’animal sont liées : -à la chirurgie d’implantation et aux suites post opératoire avec des risques de douleurs post opératoire, perte de poids, œdème, hémiparésie éphémère, infection. Une attention particulière sera apportée dans les premiers jours suivant l’intervention chirurgicale et sera maintenu durant quelques semaines. - aux injections répétées de streptozotocine avec des risques d’infection, œdème, inflammation, hallucination temporaire. Ces injections sont réalisées sous anesthésie générale et leur effet sur le comportement de l’animal sera suivi dans les heures et jours suivants. Afin de réduire le stress lié aux différents actes pratiqués, il y aura une phase de conditionnement positifs sur les actes post-opératoires afin d’assurer leur coopération sur notamment le retrait des points ou les soins de la plaie en vigile. En cas de détection de signe de douleur, de perte de poids ou de signes d’infection, une évaluation conjointe par les membres de l’équipe projet, le vétérinaire et les membres de la SBEA sera mise en œuvre de façon à décider du traitement à adapter ; une euthanasie précoce pourra être envisagée si nécessaire.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Des études ont déjà été réalisées sur des modèles murins présentant des données très encourageantes et il est impossible de réaliser de telles expériences in vitro ou in silico. Le modèle primate non humain est maintenant indispensable avant de pouvoir passer à un essai clinique chez l’Homme. Une seule espèce de PNH sera utilisé pendant l’étude mais vu les difficultés d’approvisionnements, nous avons décidé de mettre deux espèces afin de voir quel PNH est le plus facilement disponible pour effectuer l’étude dans les temps.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au maximum tout en permettant une validité statistique des résultats. Si les tests préalables de mise en place sont probants, le nombre d’animaux prévus pour la phase de test sera réduit. Les animaux pilotes seront donc inclus dans l’étude des effets neuro-protecteurs et considérés comme contrôle.

Raffinement

Afin de limiter au maximum le stress infligé aux animaux, ils seront préalablement habitués aux manipulations. Ils bénéficieront également d’une surveillance quotidienne, d’une médication adéquate lors de la chirurgie (anesthésique, anti-douleur et anti-inflammatoire) et tout signe anormal fera l’objet d’un signalement au chef de projet et au vétérinaire, afin que les animaux bénéficient aussitôt de soins adaptés. Une euthanasie précoce pourra être décidée en concertation avec l’équipe de recherche, la Structure Chargée du Bien Etre Animal et le vétérinaire si besoin. Les conditions d’hébergement des animaux respecteront strictement toutes les normes relatives au bien- être animal en vigueur. De plus, un enrichissement du milieu de vie des animaux utilisés pour les procédures de ce projet sera utilisé. D’après la littérature, nous n’attendons pas de gêne ou de douleur induite par le protocole d’illumination ou l’induction des symptômes.

Choix des espèces

Le modèle primate non-humain (PNH) est le modèle le plus proche de l’humain pour la pathologie étudiée. Les résultats obtenus permettront un transfert rapide à l’humain s’ils sont positifs. Ce projet nécessite de travailler avec des animaux adultes, voir âgés, afin que les résultats obtenus ne soient pas biaisés par d’éventuels processus développementaux non impliqués dans la pathologie et pour que nous soyons le plus en adéquation avec la temporalité de la Maladie d’Alzheimer présente chez l’Homme.

Une lésion nerveuse, un défaut tissulaire ou une ligature de vaisseaux sont créés chirurgicalement chez une partie des animaux avant qu'un dispositif ne leur soit implanté, l'intervention pouvant durer plusieurs heures. 150 cochons, 150 moutons et 75 chèvres vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec des prises de sang pouvant aller jusqu'à une par semaine. Le porteur écrit que l'anesthésie générale évite "tous stress et douleur", tout en annonçant une douleur postopératoire pouvant durer plusieurs jours selon l'invasivité de la technique. Il précise que l'effectif n'a fait l'objet d'aucune approche statistique, et que tous les animaux sont tués pour une nécropsie et un examen histologique destinés à établir la tolérance et la durabilité des implants.

Objectifs

Le système nerveux périphérique (SNP) est constitué des nerfs et des ganglions périphériques, il prolonge jusqu’aux organes le système nerveux central (SNC = cerveau et moelle épinière). Le SNP comprend le système nerveux somatique qui transmet des informations sensorielles de la peau, des muscles et des articulations et des informations motrices et participe à l’équilibre et la motricité. Les pathologies du système nerveux somatique se traduisent par des troubles moteurs et de l’équilibre, des manifestations sensitives anormales, des douleurs, elles peuvent avoir des origines traumatiques, métaboliques, inflammatoires ou génétiques. Lorsqu’elles atteignent la jonction avec les muscles sont qualifiées de neuromusculaires. Il comprend aussi le système nerveux autonome (SNA ou végétatif) qui assure de façon involontaire le maintien des fonctions organiques internes. Le SNA est constitué des systèmes nerveux sympathique et parasympathique aux fonctions de régulation réciproques sur l’homéostasie. Il assure la régulation de fonctions physiologiques comme la pression artérielle, la fréquence cardiaque, la température corporelle et la sudation, contrôle les équilibres hydrique et électrolytique ainsi que la miction, il contrôle les secrétions, la digestion, la défécation, la fonction érectile chez l’homme. L’objectif de ce projet de recherche est l’évaluation et le développement de nouveaux dispositifs médicaux, techniques chirurgicales et stratégies innovantes pour traiter les pathologies et les affections du système nerveux périphérique somatique, ou pour traiter les pathologies et les affections par une modulation du SNA. L’évaluation et le développement de ces dispositifs et techniques nécessitent une phase de recherche et de développement.

Bénéfices attendus

L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation qui handicapent les patients, et réduire le traumatisme tissulaire, corollaire de ces interventions ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif neuropériphérique avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif neuropériphérique associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 24 heures pour les ovins/caprins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion nerveuse, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour réduire au maximum ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).

Devenir

Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.

Remplacement

La validation des dispositifs médicaux implantables dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.

Réduction

Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.

Raffinement

Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, une analgésie est mise en place et des protocoles de prise en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (Anti-Inflammatoires Non Stéroidiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques détaillés dans la procédure ANIM-WI-015 sont appliqués tout au long du projet. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.

Choix des espèces

Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Le modèle porcin (n=150) est largement utilisé dans l’étude des implants neurologiques, le volume du crâne est adapté pour l’étude des dispositifs en développement pour une application chez l’Homme. Le modèle ovin (n=150) et le modèle caprin (n=75) présentent une longue région cervicale facilitant les abords chirurgicaux de l'emergence du système nerveux autonome et des ganglions nerveux. Pour toutes ces espèces, la distribution, la longueur et le diamètre des nerfs périphérique sont comparables à ceux de l'Homme. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme. Les animaux pourront être des mâles ou des femelles.

Onze macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir jusqu'à quarante séances sous anesthésie générale de une à six heures. Deux d'entre eux reçoivent en plus une chirurgie de quatre à huit heures pour l'implantation permanente d'électrodes intracrâniennes, avec les risques d'hémorragie et d'infection que le porteur décrit. Trois autres sont entraînés à rester éveillés, la tête fixée, dans un scanner IRM. Aucun n'est tué à l'issue, le porteur indiquant que les onze pourront être réutilisés dans d'autres projets selon la décision du vétérinaire, et justifiant le macaque comme "le meilleur compromis" entre proximité avec l'humain et adaptabilité aux conditions de laboratoire.

Objectifs

Peut-on rétablir la conscience suite à un coma par une stimulation du cerveau ? Un traumatisme crânien ou un accident vasculaire cérébral peuvent causer une perte de conscience. De nombreux patients ne recouvrent jamais un niveau de conscience normal. Ils restent dans un état chronique de troubles de la conscience, qui peut perdurer plusieurs années. Il s’agit de conditions dévastatrices, où les patients, tout en conservant les fonctions vitales comme la respiration, la digestion etc., perdent le cœur de leur identité : la conscience. Ces conditions ont un impact personnel, social et économique très lourd, et pourtant à ce jour nous ne disposons pas de traitement efficace prouvé. Des études récentes montrent que la stimulation cérébrale profonde du thalamus peut restaurer la conscience chez un primate anesthésié. Cependant cette technique nécessite une intervention chirurgicale invasive avec des risques tels que l'hémorragie cérébrale ou l’infection. En outre, le taux de réussite des études cliniques préliminaires reste modeste. Il est donc nécessaire de développer une nouvelle approche thérapeutique non invasive. Nous allons explorer l’usage de nouvelles technologies non invasives de stimulation cérébrale afin de restaurer l’état de conscience. Récemment les ultrasons focalisés de faible intensité sont apparus comme une technologie prometteuse. Il s’agit d’envoyer des vibrations non audibles (ultrasons, US) qui affectent les tissus. Combinés à une injection dans le sang, les US permettent la livraison de médicaments à des cibles spécifiques dans le cerveau, pour une thérapie plus efficace. Une deuxième technique est la TIS (stimulation électrique par interférence temporelle) qui produit un effet par l’intersection de deux courants électriques très faibles traversant le cerveau. Nous proposons donc d’étudier la possibilité de réveiller des primates anesthésiés avec une stimulation par ultrasons focalisés, associée ou non à l’injection de médicaments d’intérêt, ou par interférence temporelle. Pour suivre au cours du temps les effets de la stimulation, nous étudierons les signatures neuronales de la conscience par IRM fonctionnelle et électroencéphalogramme. Cela constituerait une première étape dans le développement d’une thérapie non invasive pour les patients dans un état de perte ou désordre de la conscience.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu de ce projet est le développement d’un nouveau traitement de la perte de la conscience aiguë (coma) et chronique (état végétatif, état de conscience minimale) par stimulation cérébrale non invasive. La validation préclinique est une étape importante vers la réalisation d’essais cliniques chez les patients comateux ou atteints de désordres chroniques de la conscience. Ainsi, en cas de succès, nous allons ensuite travailler pour la translation de ces techniques chez l’humain. Un deuxième bénéfice est d’ordre de la connaissance scientifique. Les ultrasons focalisés ont été développé récemment et ouvrent des voies nouvelles, impossibles avec d’autres techniques de stimulation plus traditionnelles. L’utilisation de l’imagerie cérébrale (IRM fonctionnelle) nous permettra de mieux comprendre les mécanismes cérébraux précis de ces nouvelles technologies de stimulation cérébrale non invasive. Très récentes et prometteuses, elles sont encore peu étudiées, alors que leurs effets sur le cerveau sont très complexes. Notre projet permettra de mieux comprendre les mécanismes d’action de ces techniques, leur utilité clinique, leurs similarités et différences avec la technique plus vieille et invasive appelée DBS (deep brain stimulation, stimulation cérébrale profonde). Tout cela sera fait avec un focus sur les troubles de la conscience, mais les informations récoltées auront un impact beaucoup plus général, parce que ces deux nouvelles techniques de stimulation cérébrale pourront potentiellement être utilisées dans de très nombreuses applications médicales. À titre d’exemple, ce type de stimulation peut être bénéfique pour des troubles neurologiques comme la maladie de Parkinson, ou psychiatriques comme la dépression.

Procédures

Nous aurons trois groupes d’animaux. Un premier groupe recevra des stimulations du cerveau sous anesthésie, pour voir si l’intervention peut restaurer la conscience. Les sessions sous anesthésie prévues seront jusqu’à 40 par animal et auront une durée comprise entre 1h et 6h. Le nombre exact de sessions dépendra du succès de la manipulation. La stimulation pourra être effectuée par ultrasons ou par des courants à basse intensité (1h max). Les mesures des effets seront effectuées par électroencéphalogramme (EEG) ou résonance magnétique (IRM). Les sessions de stimulation impliquent l’application d’un ou plusieurs dispositifs au contact de la peau de l’animal. Dans certains cas, la stimulation sera associée à l’injection de médicaments et de microbulles gazeuses dans le sang. Un deuxième groupe recevra ces mêmes stimulations, mais aussi une stimulation plus traditionnelle et invasive appelée stimulation cérébrale profonde (DBS, pour comparaison, toujours sous anesthésie. Les sessions prévues auront même durée (1h à 6h) et seront au plus 40 par animal. Les mesures des effets seront également obtenues par EEG et IRM. Les animaux de ce groupe subiront une chirurgie (4 à 8 h) pour installer l’équipement intracrânien. Un troisième groupe recevra les mêmes stimulations non invasives du premier groupe (au plus 20 sessions de 1h à 6h par sujet), mais réalisera aussi des sessions à l’état éveillé, et sans stimulation, comme contrôle. Ces animaux devront être entraînés par des sessions quotidiennes à rester calmes et le plus immobiles possible pendant ces sessions, à l’aide de récompenses alimentaires ; à la fin de cet entrainement les sessions de test seront acquises (jusqu’à 80 sessions de 1h à 2h, entrainement et test confondus). Les animaux de ce groupe devront avoir une chirurgie (3 à 6 h) pour recevoir un équipement extracrânien qui permet de garder leur tête immobile dans le scanner IRM.

Impact sur les animaux

● L’anesthésie peut causer des effets indésirables bien connus , Les nausées/vomissements , les lésions de la gorge/trachée dues à l’intubation , le maintien prolongé dans la même position peut causer des douleurs musculaires. Les effets indésirables graves et la mortalité restent extrêmement rares dans une anesthésie contrôlée de ce type. ● L’usage de l’agent de contraste utilisé peut causer une accumulation de fer dans les tissus, mais cela n’a pas d’impact appréciable sur la santé des animaux. ● Des stimulations trop intenses par FUS peuvent produire des lésions, donc nous en allons contrôler attentivement l’intensité. ● La DBS ne cause pas d’effets négatifs au moment de la stimulation, mais elle requiert la pose chirurgicale d’un implant permanent intracrânien. Cela entraîne des risques d’infection et d’hémorragie. Un suivi adapté est spécifiquement mis en place en post-opératoire. La chirurgie peut causer de la douleur post-opératoire. Sur le long terme, la présence de l’implant cause un inconfort minimal chez l’animal. ● L’implant extracrânien implique des effets différents. La chirurgie est moins invasive, donc le risque d’hémorragie est moindre. il peut occasionnellement produire une infection.. Si le singe exerce trop de force quand il est fixé, cela peut fragiliser l’implant et conduire à son détachement ou le casser. ● L’entraînement et l’IRM vigiles peuvent causer de l’inconfort voire du stress à l’animal à cause de la fixation de la tête, du bruit et des protections auditives, de l’espace restreint.

Devenir

Les animaux sont gardés en vie en fin de procédure, car il n’y a pas d’éléments scientifiques dans ce projet qui nécessitent une mise à mort. Les animaux pourront être réutilisés pour d’autres projets selon la décision du vétérinaire.

Remplacement

Une procédure médicale comme la neuromodulation pour la restauration de la conscience doit être testée sur des organismes vivants avant d’être appliquée à l’homme. Il existe des modèles informatiques de la conscience, mais ces modèles ne sont absolument pas réalistes au point de pouvoir remplacer des études biologiques, parce que le cerveau est extrêmement complexe, et la conscience est une des facultés les plus sophistiquées du cerveau et encore très mal comprise. Au contraire, les mesures expérimentales que nous recueillerons dans ce projet pourront être utilisées pour perfectionner ces modèles informatiques. Il ne serait par ailleurs pas admissible d’appliquer directement sur des patients des techniques non testées, d’autant plus que cette population avec des troubles de conscience ne peut pas exprimer un consentement informé à la participation à une étude expérimentale. L’usage d’animaux pour cette recherche à visée médicale reste donc le choix privilégié.

Réduction

Le nombre d’animaux choisi est basé sur la littérature scientifique et nos propres expériences précédentes. Il n'y a donc pas eu d'approche statistique necessaire. Nous testerons les trois types d’interventions sur un premier groupe de 6 sujets. Cette recherche demande de nombreuses sessions sous anesthésie, nous avons donc choisi 6 sujets pour trouver un équilibre entre le nombre d’animaux, le plus petit possible, et le fait que le nombre total et la fréquence des anesthésies par animal ne soient pas trop importants. Le groupe 2, recevant une intervention chirurgicale invasive est réduit au strict minimum de 2 sujets. Le groupe 3, utilisé comme contrôle pour effectuer des sessions « éveillées » comprend 3 sujets. Ce nombre a été choisi pour être également le plus petit possible, mais à cause des contraintes dues à l’entraînement, il devra être légèrement plus large que le groupe 2. Chaque session IRM sera analysée avant d’être répétée, afin d’estimer la qualité des données et la force des résultats, pour limiter le nombre d’examens par animal au minimum nécessaire.

Raffinement

Toute mesure sera prise pour améliorer le bien-être des animaux et réduire leur souffrance. La plus grande partie des étapes de ce projet sera réalisée sous anesthésie générale. Néanmoins il est nécessaire d’avoir des sessions de contrôle dans un état éveillé, pour juger de l’efficacité des interventions expérimentales. Anesthésie - Médicament pour protéger les oreilles en cas d’utilisation d’un support de la tête incluant des barres d’oreilles. - Anesthésie locale de la glotte avant intubation de l'animal. - Surveillance en continu des paramètres physiologiques pendant toute la durée de l’anesthésie. Couverture chauffante pour le maintien de la température corporelle. Hydratation intraveineuse. - Surveillance au moment du réveil jusqu’à que l’animal se lève et isolement des partenaires jusqu’à la reprise des forces, nécessaire pour éviter des combats pour la hiérarchie. Traitement anti-douleur - Lors des chirurgies, la douleur est prise en charge par un traitement pré-, per- et post-opératoire adapté. Comportement - Différents types d’enrichissement sont utilisés - L’entraînement à tolérer des sessions dans un état éveillé dans le scanner IRM est graduel et minimise le stress. - L’entraînement se fera sur la base du renforcement positif, donc avec des récompenses alimentaires (par exemple jus de fruit ou compote) et sans punitions. IRM - Usage de protections auditives. - La durée des sessions IRM vigiles sera réduite au minimum (on vise 1h et sans jamais dépasser les 2h). Neurostimulation - Les paramètres de stimulation seront calculés de manière à éviter tout effet indésirable Surveillance L’état général de chaque animal est évalué au quotidien dans sa propre cage par les expérimentateurs ou techniciens. Sont alors vérifiés l’apparence physique, la réactivité, le comportement (changement de l’attitude). Les courbes de poids des primates sont informatisées et surveillés de prêt afin de détecter des variations du poids. Mise en place de points limite adaptés.

Choix des espèces

Le macaque est le meilleur compromis pour avoir une espèce suffisamment proche de l’être humain, adaptable aux conditions de laboratoire, sans devoir travailler directement chez l’humain. Dans ce projet nous étudions les bases neurales de la conscience et la possibilité de la restaurer en cas de perte de conscience. Or des animaux évolutivement plus éloignés de nous, comme les souris ou les non-mammifères, ont une structure cérébrale considérablement différente, en particulier en ce qui concerne la conscience, car la conscience humaine dépend des parties évolutivement plus récentes du cerveau. Pour cette raison, une technique qui affecte l’état d’éveil chez un animal qui n’est pas un primate, ne va pas forcément être efficace pour restaurer la conscience d’un être humain. Le macaque est actuellement le modèle primate non-humain le plus utilisé au monde dans le domaine des neurosciences, précisément parce qu’il correspond au mieux à tous ces critères, et il est particulièrement approprié pour une étude préclinique sur la conscience. Nous allons utiliser des primates adultes pour que le développement du cerveau soit complet avec pour but ultime de traiter les troubles de la conscience chez les patients humains adultes. Nous n’aborderons pas ici des thématiques pédiatriques.

Comparer les concentrations sanguines d'un candidat médicament selon qu'il est injecté dans la veine, avalé, glissé sous la peau ou envoyé dans la cavité abdominale : 3 600 rats vont être utilisés pour cela, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique puis jusqu'à huit prélèvements de sang sous anesthésie, sur une période allant de quinze minutes à un mois. Le porteur liste parmi les effets possibles des signes de douleur sur la face, des constrictions abdominales, du sang dans les urines, une perte de poids et une hypothermie, et annonce un arbre décisionnel fondé sur des points limites qu'il ne détaille pas. La mise à mort tient à l'âge : les rats ayant entre 6 et 12 semaines, il écrit qu'une seconde procédure ne peut pas être envisagée.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer la biodisponibilité de composés par comparaison des concentrations sanguines après administration par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine), qui est la voie de référence, versus une administration par voie autre qu’intra veineuse : orale (administration dans l’estomac), sous cutanée (injection sous la peau) ou intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale). L’étude de la biodisponibilité a pour objectif de sélectionner le meilleur candidat médicament, de définir les doses à administrer chez l’homme et la forme galénique optimale. Il fait suite à une première sélection de candidats médicament qui ont montrés leur efficacité sur des modèles vitro ou vivo

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’étudier la biodisponibilité des candidats médicaments dans l’organisme vivant. Les données ainsi recueillies dans un contexte pré-clinique permettent de sélectionner les molécules candidates les plus prometteuses (selon leur profil pharmacocinétique et leur biodisponibilité) et d’identifier la forme galénique optimale avant de poursuivre vers les études cliniques. Les molécules étudiées sont à visée thérapeutique humaine ou vétérinaire (maladie d’Alzheimer, maladies cardiaques, diabète, ...).

Procédures

Les animaux sont administrés par voie intra veineuse (injection dans la circulation sanguine sur animaux anesthésiés), par voie orale (administration dans l’estomac sur animaux vigiles), voie sous cutanée (injection sous la peau sur animaux anesthésiés) ou voie intra péritonéale (injection dans la cavité abdominale sur animaux vigiles) Les administrations sont réalisées en bolus (administration en une seule fois et inférieure à 30 secondes). Les animaux sont également soumis à des prélèvements sanguins répétés après application d’un analgésique et sous anesthésie. 8 prélèvements maximum sont réalisés par animal (la durée totale de l’intervention pour chaque prélèvement est d’environ 5 min : anesthésie + prélèvement) et sur un période allant de15 min à généralement 24h mais pouvant s’étendre jusqu’à 1 mois maximum.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables généralement observés sont principalement dus aux gestes expérimentaux, c’est à dire à l’administration du composé ou aux prélèvements sanguins. - Pour les administrations on peut observer de l’inconfort ou une douleur locale au point d’injection. Pour les prélèvements répétés on peut observer un stress lié à la manipulation répétée des animaux, un inconfort, une douleur locale ou un hématome au point de prélèvement. Les nuisances en lien avec les effets possibles des molécules testées sont rares. Néanmoins on pourrait observer les effets suivants : Signes de douleur sur la face, constrictions abdominales, posture modifiée, présence de sang dans les urines, modification de la consistance des selles, perte de poids, hypothermie, modification de la respiration.

Devenir

Les animaux utilisés étant des jeunes adultes entre 6 et 12 semaines, l’application d’une seconde procédure expérimentale ne peut pas être envisagée. A la suite du dernier prélèvement, l’animal est donc mis à mort.

Remplacement

L’étude de la biodisponibilité d’un candidat médicament est une étape importante et nécessaire dans le développement d’un médicament et il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour ce type d’étude. Des méthodologies de modélisation in silico sont en cours de recherche mais ne sont pas encore abouties et fiables pour apporter le même niveau d’information.

Réduction

Afin d’obtenir des données expérimentales robustes et des faire des statistiques, un minimum de 3 animaux pas lot sera utilisé (molécule, voie d’administration, dose, formulation) avec 2 lots nécessaires pour calculer les paramètres pharmacocinétiques (comparaison de l’administration directement dans le sang à celle hors circulation sanguine), soit un minimum de 6 animaux. L’expérimentation est définie pour prélever sur un même animal le volume minimum de sang nécessaire aux analyses tout en respectant les volumes de sang définis dans les textes règlementaires et les recommandations (décret officiel et FC3R (société francaise des 3R : Remplacer, Réduire, Raffiner)) . Le nombre de prélèvement par animal est ainsi optimisé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux

Raffinement

Tout au long des expériences une observation de l’état clinique des rats est assurée. Les mesures de raffinement suivantes sont prises. Les animaux sont maintenus en groupe stable durant toute la période d’acclimatation et si possible pendant la procédure expérimentale. Afin de réduire le stress et la souffrance animale les administrations sont réalisées sous anesthésie gazeuse lorsque le geste technique ou le type d’administration le nécessite et les prélèvements sont réalisés sous analgésie et anesthésie gazeuse. Les rats à euthanasier sont placés dans une salle isolée du reste des animaux. Pour ce projet les études sont réalisées sur animaux sains. Aucune toxicité particulière n'est attendue sur les molécules testées. Des points limites adaptés sont définis et un arbre décisionnel basé sur ces points limites est établi. Des critères de diminution ou d’arrêt des souffrances sont mis en place.

Choix des espèces

Le modèle (rongeur) dans les études pré-cliniques précoces est le même modèle qui sera ensuite utilisé et requis dans le cadre d’études réglementaires de toxicocinétique. Le choix du rat dépendra des données déjà disponibles dans la littérature et du modèle qui a été utilisé dans les précédentes études pré-cliniques et/ou qui sera requis selon les études réglementaires visées. Les animaux utilisés sont des jeunes adultes d’environ 6-12 semaines basé sur les recommandations des textes règlementaires et leur robustesse par rapport à des animaux plus âgés ou juvéniles. De plus l'utilisation d'animaux spécifiquement de cette tranche d'âges permet la comparaison d'études différentes mais avec des molécules chimiquement proches.

Opérées pendant environ quarante minutes pour se voir implanter une fibre optique dans le cerveau, puis soumises à quatre injections quotidiennes de tamoxifène sans anesthésie, 100 souris subissent une lésion du nerf sciatique ou une injection d'adjuvant de Freund destinée à provoquer une douleur chronique. Elles passent quatre à onze semaines en enregistrement par photométrie, à raison de séances d'environ trois heures, et subissent deux jours de tests comportementaux par semaine, dont le porteur ne précise pas la nature. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, la lésion nerveuse entraînant selon lui une douleur et des comorbidités anxiodépressives pendant environ six semaines. Toutes sont tuées à la fin du projet pour prélever leur cerveau, une mise à mort qu'il présente comme un moyen de leur éviter toute souffrance inutile.

Objectifs

Avenant : nos résultats préliminaires montrent que la douleur est encodée différement au niveau du cortex cingulaire antérieur (ACC) en fonction du stimulus douloureux appliqué (mécanique ou thermique) mais également en fonction de l'évolution de la pathologie dans le temps. Afin de rafiner notre analyse, nous souhaitons enregistrer sélectivement les neurones pyramidaux de ce cortex, notamment ceux exprimant l'isoforme gamma de la protéine kinase C.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre comment les neurones pyramidaux du cortex cingulaire antérieur (ACC) sont impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoires selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux (n=100) subieront une procédure chirgicale afin d'implanter dans le cerveau une fibre optique. Cet acte dure environ 40 minutes. Ils recevront également tous 4 injections consécutives de tamoxifen, 1 fois par jour. Cet acte maîtrisé par le laboratoire est réalisé sans anesthésie et dure moins d'une minute. Les animaux seront ensuites analysés par photométrie pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 4 à 11 semaines, chaque séance durant environ 3h. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie Spared Nerve Injury (SNI) consiste à réaliser une lésion nerveuse du nerf sciatique et entraine une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 6 semaines. L'injection d'Adjuvant Complet de Freund (CFA) entraine une inflammation cutanée et une douleur modérée et des comorbidités anxiodépressives durant environ 1 semaine. L'implantation des canules induit une douleur modérée pendant environ 24h. L'injection intrapéritonéale de tamoxifen entraine une douleur légère de courte durée.

Devenir

Les souris douloureuses chroniques seront euthanasiées à la fin de la procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux génétiquement modifiés permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par photométrie.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement, en accord avec le décret n° 2011-1177 du 23 septembre 2011 relatif à l'utilisation confinée d'organismes génétiquement modifiés. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

Limplantation de fibres optiques permettant de mesurer l'activité du cerveau est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modéle souris en lien avec les données préliminaire obtenue au laboratoire. Adultes (P21-100) pour comparaison avec les autres données de la littérature