Troubles respiratoires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Rôle de l’épithélium alvéolaire dans le maintien de l’immunité entraînée pulmonaire, chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Pour étudier la cicatrice immunitaire que laisse une pneumonie dans le poumon, 420 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Une partie est irradiée puis reconstituée en moelle osseuse par injection dans le sinus de l'oeil, toutes reçoivent une administration intra-trachéale et certaines des cellules cancéreuses par voie veineuse. Le porteur décrit une perte de poids transitoire après l'infection et annonce un modèle de métastases pulmonaires "sans souffrance" jusqu'au jour de la mise à mort. Les retombées contre les infections et le cancer restent présentées comme potentielles.
Objectifs
Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Hydrogénothérapie et mesure de la biodistribution chez le rat
- Recherche appliquée
- Cancers
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
200 rats vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque rat subit une chirurgie unique pouvant durer jusqu'à trois heures, avec l'implantation de sondes destinées à mesurer la répartition du dihydrogène dans les organes, et le porteur signale des risques de détresse respiratoire et d'hémorragie. Le projet cherche à décrire la distribution et l'élimination du H2 selon la voie d'administration, présenté comme un candidat médicament. Le porteur affirme qu'aucun modèle sans animaux ne peut remplacer la complexité du corps et qualifie cette étape d'"incontournable".
Objectifs
Le dihydrogène (H2) est un candidat médicament très intéressant de par ses effets bénéfiques dans le traitement des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore du cancer. La petite taille de l'H2 lui permet de diffuser facilement dans les tissus et les organes. Lors de précédentes études, l'évolution de la concentration en H2 dans le coeur et dans le sang, pendant une administration par inhalation, a été explorée chez le rat. Au cours de ce projet, l'évolution de la concentration en H2 sera mesurée grâce à une sonde implantée dans différents tissus cibles. La présente étude permettra de déterminer la distribution et la vitesse d'élimination de l'H2 dans les différents organes suite à son administration par différentes voies et de qualifier chaque voie d'administration sur un plan qualitatif et quantitatif.
Bénéfices attendus
Ce projet est une étape incontournable pour la mise au point de nouvelles thérapies basées sur l'H2 qui permettront de soigner des maladies cardiovasculaires, maladies neurodégénératives, troubles métaboliques ou encore le cancer.
Procédures
Chaque animal subira une intervention chirurgicale unique d'une durée maximale de 3 heures. Un même animal sera soumis à une anesthésie complémentée avec une analgésie, suivie d'une administration d'H2 par différentes voies possibles. La quantité d'H2 distribuée dans différents tissus sera mesurée à l'aide d'une sonde. Au terme de la mesure ou des trois heures, l'animal sera mis à mort sans réveil préalable.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent présenter des signes de détresse respiratoire ou des hémorragies.
Devenir
La procédure proposée est en classe "sans réveil", la mise à mort des animaux est donc incluse dans cette procédure et inévitable du fait du caractère lésionnel des abords chirurgicaux et de l'utilisation des sondes de mesure.
Remplacement
La présente étude a pour objectif de caractériser précisemment la distribution de l'H2 dans les différents organes et son élimination suite à un traitement à l'H2. Actuellement, il n'est pas possible de remplacer la complexité du corps humain par des modèles n'utilisant pas d'animaux, d'où la nécessité de leur utilisation dans ce projet.
Réduction
Un maximum de 200 rats sera utilisé dans ce protocole. Afin de réduire le nombre d'animaux il est prévu d'effectuer les mesures d'H2 dans plusieurs organes par animal car nous disposons de plusieurs sondes. Il est envisagé qu'une dizaine de modes d'administration d'H2 seront testés, chaque groupe expérimental sera constitué de 20 animaux (10 contrôles et 10 traités ; prenant en compte une éventuelle mortalité due à l'opération d'environ 10%). Ce nombre d'animaux permettra de réaliser un test statistique afin de valider nos résultats. De plus, des animaux venant d'autres protocoles de contrainte légère à modérée pourront être utilisés.
Raffinement
Le projet est mis en oeuvre dans un établissement utilisateur agréé. L'ensemble des personnels impliqués est à jour des formations réglementaires exigibles pour les manipulations sur des animaux vivants. Le rat correspond à l'espèce animale la plus pertinente dans ce type d'étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement enrichi contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. L'intégralité des gestes sera réalisée sous anesthésie générale complémentée par une analgésie.
Choix des espèces
Les similitudes d'anatomie et de physiologie entre le rongeur et l'Homme permettront d'obtenir une comparaison fiable des données obtenues et une meilleure compréhension de la distribution de l'H2 dans l'organisme. De plus, le diamètre des sondes utilisées (1,1-1,6 mm) est compatible avec la dimension des organes cibles de l'étude. Nous utiliserons des rats adultes de minimum 7 semaines pour les mâles et 10 semaines pour les femelles (d'un poids corporel supérieur à 300g). Ce sont les animaux les plus couramment utilisés en pharmacologie de sécurité.
Impact d’une pneumonie à Influenza sur les fonctions des macrophages pulmonaires : mise au point et validation chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent le virus de la grippe par le nez ou par la trachée sous anesthésie, avec une perte de poids que le porteur décrit comme transitoire et inférieure à 10 %. Le projet vise à mettre au point ce modèle d'infection pulmonaire et à étudier la réponse des macrophages du poumon. Le porteur affirme que la complexité des interactions cellulaires rend le modèle animal "indispensable", sans détailler la justification de l'effectif de 3 900 animaux.
Objectifs
Notre projet vise à développer un modèle murin d’infection pulmonaire induit par le virus de la grippe, et à utiliser ce modèle pour explorer les conséquences d’une inflammation sévère sur la fonction des macrophages alvéolaires (Cellules retrouvées dans les alvéoles des poumons). Les objectifs de notre projet sont : 1-De mettre en place un modèle murin de pneumonie induit par un virus de la grippe 2-D’évaluer l’évolution temporelle des cellules immunitaires (macrophages, neutrophiles, cellules dendritiques) au cours de la phase inflammatoire et de sa résolution. 3-D’appréhender les conséquences de l’infection virale sur les fonctions des macrophages (phagocytose, activation, production de cytokines). 4-De définir le rôle du recrutement des macrophages inflammatoires dans la physiopathologie de la pneumonie et l’impact sur la cicatrice immunitaire post-inflammatoire.
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer le rôle d’une inflammation virale pulmonaire sur le rôle et la fonction des cellules myéloides, notamment les macrophages alvéolaires, première ligne de défense contre les pathogènes respiratoires.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une instillation nasale. Cette instillation sera réalisée sur animaux vigile. Une partie des animaux de ce projet sont soumis à une adminsitration intra-trachéale sous anesthésie générale. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles. Ces interventions sont de courte durée (1 min environ)
Impact sur les animaux
Modèles d’infection : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Les différentes interventions sont de courte durée et n'engendre pas de douleurs résiduelle ainsi que de stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indispensable. Les multiples interactions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites adapté aux modèles a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphinique seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage est préalablement enduite d'un antalgique afin d’anesthésier localement la trachée.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Le virus de la grippe provoque des altérations distinctes des macrophages alvéolaires humains et murins : une analyse comparative pour une perspective translationnelle
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
2880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On les infecte par le virus de la grippe puis, au septième jour, par le pneumocoque, une surinfection qui provoque troubles respiratoires, perte de poids et prostration et tue en deux à trois jours si elle n'est pas arrêtée, les instillations se faisant sous anesthésie parfois par incision de la trachée. Le porteur cherche à comprendre pourquoi les macrophages pulmonaires réagissent différemment chez la souris et chez l'humain, et à tester des molécules immunomodulatrices dont un brevet est en cours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la tolérance d'un "organisme entier", tout en décrivant des travaux sur tranches de poumon humain censés réduire le recours aux animaux.
Objectifs
Chaque année, la grippe saisonnière infecte plus d'un milliard de personnes (environ 20 % de la population mondiale). La versatilité de l’efficacité vaccinale, et l’absence d’antiviraux efficaces, peine à juguler les 500 000 décès annuels dus à la grippe. Cependant, lors d’une infection grippale, la morbi-mortalité n’est pas attribuée seulement au virus influenza, mais aussi à des co-infections bactériennes (40% dans notre service de réanimation). Streptococcus pneumoniae (ou pneumocoque) est le principal agent de ces co-infections, responsable de la sévérité de l’infection et de décès potentiels. Les macrophages alvéolaires (MAs) sont essentiels dans la défense contre les infections à pneumocoque. Une déplétion des MAs chez des souris avant une infection par le pneumocoque entraîne une multiplication bactérienne dans les poumons 100 fois plus élevée par rapport au groupe témoin. Pourtant, une infection grippale chez les souris diminue la population des MAs d’environ 80%. Nous avons mené une étude observationnelle chez l’homme pour confirmer et quantifier la déplétion des MAs après une infection grippale (étude multicentrique). Surprenamment, la quantité de MAs reste stable lors d’infections grippales chez l’homme, remettant en question nos connaissances actuelles sur le rôle des MAs. Notre objectif est de comprendre cette différence souris-homme. Nous souhaitons étudier des modèles de souris plus proches de la réalité humaine : dose virale faible, souris plus âgées, souris avec expérience d’infections antérieures. L’exposition à des composés microbiens façonne le développement et la fonctionnalité du système immunitaire, influant sur la réactivité des MAs aux défis ultérieurs par un phénomène appelé immunité entraînée. Nous avons récemment découvert qu'une reprogrammation métabolique des MAs pouvait altérer leurs propriétés immunitaires, et nous souhaitons étudier ce phénomène chez la souris (et chez l’homme) lors d’une surinfection grippale à pneumocoque. Enfin, nous avons démontré que certaines modifications métaboliques induites par le virus influenza pouvaient être inversées, notamment par l’ajout de succinate ou d’autres molécules immunomodulatrices (Demande de brevet en cours). Nous souhaitons évaluer si ces molécules pourraient représenter une nouvelle piste thérapeutique pour lutter contre les surinfections grippales à pneumocoque.
Bénéfices attendus
L’infection grippale est un problème de santé publique majeure ; chaque avancée dans notre compréhension est importante. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle préférentiel pour l’étude des pathologies respiratoires humaines. Nous avons récemment mis en évidence que l’une des faiblesses de ce modèle réside dans la différence entre les macrophages alvéolaires (MAs) murins et humains. Les MAs sont l’une des cellules les plus impliquées dans l’immunité pulmonaire, notamment dans les co-infections bactériennes, responsables de la gravité des présentations cliniques chez l’homme lors d’une infection grippale. Cette différence peut biaiser les recherches effectuées dans ce domaine et limiter la translation souris-homme des thérapies. Ainsi, nous proposons d’améliorer le modèle murin d’infection grippale et de surinfection bactérienne en nous rapprochant de la relevance humaine. Nous espérons que les résultats issus des expériences décrites ici vont faire rapidement progresser nos connaissances et fournir de nouvelles pistes de compréhension sur le rôle des MAs dans cette pathologie. Ce projet permettra d’améliorer la translationalité des recherches dans le contexte des pathologies respiratoires, et notamment des thérapies antigrippales. De plus, nous possédons déjà des molécules immunomodulatrices qui ont démontrées leur intérêt thérapeutique sur un modèle de cellules épithéliales infectées par le virus de la grippe, ainsi que sur un modèle murin d’infection in vivo. Certaines de ces molécules ont notamment un effet protecteur sur les MAs infectés par le virus de la grippe. Ces molécules proviennent d’un nouveau concept de défense immunitaire, l’immunometabolisme ; présentant plusieurs bénéfices attendus : Ces molécules naturelles et endogènes de l’homme (et non des drogues de synthèse), ont des propriétés antivirales à large spectre ainsi qu’un potentiel anti-inflammatoire puissant. Cette double action diminue le risque de résistance ; et permet de conserver un effet thérapeutique protecteur même dans le cas d’une instillation tardive, à l’inverse des molécules antivirales actuellement sur le marché. Pour l’ensemble de ces raisons, l’étude des MAs représente une avancée majeure pour lutter contre la grippe, pour laquelle il n’existe actuellement aucun traitement efficace.
Procédures
Toutes les souris seront anesthésiées, par injection intrapéritonéale, 3 ou 4 fois selon les groupes, pour une durée quelques minutes à chaque fois, durant lesquelles elles recevront soit une instillation intranasale soit une instillation intra-trachéale. Cette dernière nécessite une petite incision en haut de la trachée. Ces instillations ne durent que quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’anesthésie générale nécessite une contention pour l’injection intrapéritonéale ce qui peut engendrer du stress pour les animaux ainsi qu’une légère douleur au niveau du site d’injection. Cette anesthésie peut également entrainer un refroidissement de l’animal. Les instillations pulmonaires intranasales et intratrachéales provoquent un stress pulmonaire qui se caractérise par une respiration saccadée et accélérée pendant 1 ou 2 minutes. Le liquide est ensuite rapidement absorbé par les tissus et lors du réveil de la souris, la respiration est revenue à la normale. L’instillation intratrachéale nécessite une petite incision en haut de la trachée. Notre modèle d’infection grippale à faible dose virale entraîne des dégâts pulmonaires qui peuvent fragiliser l’animal à partir du 7ème jour post-infection. La surinfection bactérienne a lieu au 7ème jour chez la souris et provoque une infection qui, si elle n’est pas contrôlée, aboutie à la mort des animaux en 2 à 3 jours. Le cumul de ces infections va induire une altération modérée de longue durée, affectant le bien-être et l'état général des animaux (troubles respiratoires, une perte de poids et une réduction de l’activité, température corporelle abaissée, prostration, fermeture totale ou partielle des yeux).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que le modèle murin d’infection par le virus de la grippe est bien établi et maîtrisé par l’équipe. Par contre, un effort important est fait pour remplacer certaines explorations in vivo par la mise en place de différents modèles de macrophages alvéolaires in vitro et ex vivo (macrophages alvéolaires), pour étudier les altérations immunométaboliques induites par le virus de la grippe. Enfin, certaines explorations sont directement faites chez l’homme quand cela est possible (culture ex vivo de macrophage alvéolaire humain, coupe de poumon issue de pièce opératoire).
Réduction
Premièrement, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés pour chaque condition, nous allons utiliser une technique d’instillation par la trachée. Cette technique permet une instillation dans seulement l’un des deux lobes pulmonaires. De fait, la souris représente son propre contrôle, divisant ainsi par deux le nombre d’animaux requis. Cette technique a été apprise lors d’un séjour d’étude à l’étranger et nous souhaitons la mettre en place dans notre laboratoire pour limiter le nombre d’animaux et les variations interindividuelles. Secondairement, nous allons récupérer les macrophages alvéolaires issus des souris entraînées ou traitées par des métabolites pour les cultiver en laboratoire. Cela permet de réaliser plusieurs types de tests sur des MAs issue d’une seule souris, limitant ainsi l’utilisation des animaux. Ajouté à cela, nous développons actuellement des modèles de tranches de poumons humains et murins. Cette technique, permet de réaliser un grand nombre de tranches de poumons à partir d’un seul donneur (environ 20 tranches par poumon de souris). Ce modèle permet à la fois de conserver la structure pulmonaire et la diversité cellulaire. Ainsi, cela permet la réalisation d’un grand nombre de tests au plus proche de la physiologie pulmonaire, réduisant le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les expériences sont conçues pour utiliser un nombre minimum d’animaux, mais suffisant pour pouvoir réaliser les tests statistiques adaptés. Pour réduire le nombre de souris, un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge du pathogène, …).
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. A l’arrivée des souris dans l’établissement d’hébergement, une habituation de 7 jours sera réalisée avant toute manipulation. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Toutes procédures d’instillation intranasale ou intra-trachéale seront précédées d’une anesthésie des souris par voie intrapéritonéale ou gazeuse pour les animaux déjà infectés. L’état de sédation de l’animal suivant ces anesthésies sera de maximum 20 minutes. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les animaux ayant atteint le point limite seront euthanasiés.
Choix des espèces
Nous utiliserons la souris. Il existe de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris. Cette espèce est la mieux caractérisée pour les réponses immunitaires pulmonaires, réduisant le besoin d'animaux pour des études préliminaires. Les souris sont facilement infectables par des souches adaptées de virus de la grippe humaine et présentent des symptômes cliniques similaires à l'homme (anorexie, hyperinflammation pulmonaire, perte de poids et mortalité). Les souris sont les plus couramment utilisées dans les études de physiopathologie et mécanistiques, mais également pour le développement d’outils thérapeutiques. Cette souche est appropriée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires et est un modèle bien établi d’infection grippale. Les MAs de ces souris semblent plus résistants à l’infection grippale, se rapprochant de la réponse des MAs humains. Enfin, l’utilisation de souris consanguines permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats significativement interprétables. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour avoir un système immunitaire mature. Afin d’avoir des souris correspondant à l’âge moyen humain de notre étude (64 ans), des souris agées de 24 mois seront également utilisés.
Inhibition de la cathepsine C dans un modèle murin de la Dysplasie Bronchopulmonaire
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
120 souris, mères et souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont exposés dès la naissance à 75 % d'oxygène pendant quatorze jours pour reproduire une dysplasie bronchopulmonaire, puis reçoivent deux injections intrapéritonéales par jour, avant d'être mis à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que l'hyperoxygénation provoque une insuffisance respiratoire et peut léser les intestins, les yeux et le cerveau, et vise à tester l'inhibition d'une enzyme, la cathepsine C. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit une réponse immunitaire complète, les retombées pour les enfants prématurés restant formulées au conditionnel.
Objectifs
Les nouveaux nés atteints de la dysplasie bronchopulmonaire ont une inflammation chronique dans les poumons, liée à la présence d’enzymes qui sont délétères. Leur inhibition pourrait donc être bénéfique d’un point vue thérapeutique. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet de l’inhibition indirect de toutes ces enzymes, via l’inhibition de la cathepsine C, dans un modèle murin de la dysplasie bronchopulmonaire.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre l'identification d’un nouveau traitement préventif et/ou curatif pour les enfants prématurés sous ventilation mécanique. Un traitement préventif ou qui diminue les conséquences de la pathologie pourrait améliorer l’espérance et la qualité de vie à l’âge adulte de ces patients.
Procédures
Hyperoxygénation pour les mères et leurs souriceaux : 75% d'oxygène pendant 14 jours, ou 75% d'oxygène 1 heure par jour pendant 14 jours. Injection intrapéritonéale 2 fois par jours pendant 14 jours pour les souriceaux.
Impact sur les animaux
La première nuisance est l’exposition à l’oxygène qui entrainera la pathologie pulmonaire, qui chez les humains se traduit par une insuffisance respiratoire. L’exposition à l’O2 peut également entrainer des dommages au niveau des intestins, des yeux et du cerveau. Les autres nuisances seront les douleurs liées aux injections et le stress lié aux manipulations.
Devenir
Les mères et les souriceaux soumis à l'hyper-oxygénation seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses.
Remplacement
La dysplasie bronchopulmonaire est une pathologie inflammatoire qui fait intervenir le système immunitaire et notamment les neutrophiles. A ce jour il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de mettre en place une réponse immunitaire complète et l’effet qu’un traitement pourrait avoir dessus. Cette pathologie atteint la morphologie pulmonaire au niveau des alvéoles, et du système vasculaire notamment ; il n’existe pas de modèle pulmonaire in vitro permettant d’avoir une bonne représentation de la maladie. Ainsi l’efficacité du traitement ne pourra être réalisée que sur un modèle in vivo.
Réduction
D'après des expériences réalisées par d'autres laboratoires avec de la fumée de cigarette ou de l'ozone, les lots devront être constitués d'au moins 8 animaux pour atteindre des différences statistiques.
Raffinement
Pour le confort des souris les dispositions suivantes sont prévues : manipulation des animaux à l'aide d'un tube, présence de dôme, de papier pour nidation, de nourriture et eau ad libitum, de jeux type rouleaux en de carton et de récompense comme des fruits secs ou des graines après chaque manipulation. Les animaux seront observés quotidiennement. Leur poids sera contrôlé. Le comportement de la mère et des souriceaux sera observé, ainsi que leur aspect physique : poil, oreille. En ce qui concerne le raffinement pour les femelles gestantes : massage abdominal, réchauffement de la femelle sur couverture chauffante, tentative de sortie manuelle de l’embryon coincé.
Choix des espèces
Il y a deux raisons à l’utilisation du modèle murin pour ce projet. La première concerne la mise en place du modèle de dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. Cela permet d’utiliser les souriceaux à leur naissance, alors que l’on devrait pratiquer une césarienne sur d’autre modèle. La seconde raison est la disponibilité de souris déficiente en cathepsine C, qui nous permet de faire notre preuve de concept. Les souris adultes (8 semaines) seront utilisées pour la reproduction et pour le sevrage des souriceaux dans le cas de la mère. Les souriceaux seront utilisés dès leur naissance pour la mise en place du modèle de la dysplasie bronchopulmonaire. En effet, les enfants prématurés atteint de DBP ont un stade de développement pulmonaire au niveau fin caniculaire, début sacculaire, les souriceaux naissent au stade sacculaire. La mise en place du modèle dure 14 jours, les jeunes souris seront euthanasiées à ce moment-là pour la récupération des échantillons.
Tests de stratégies thérapeutiques pharmacologiques chez des modèles murins du syndrome d’Ondine, une maladie génétique rare.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
2 310 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 2 250 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux porteurs d'une mutation du syndrome d'Ondine, maladie qui interrompt la respiration pendant le sommeil, subissent des gavages, une injection intrathécale sur animal vigile et des mesures cardio-respiratoires répétées de la naissance à trois semaines. Le porteur signale une forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance et une vulnérabilité à l'anesthésie qui le conduit à injecter sans anesthésier. Le projet teste deux pistes pharmacologiques pour une maladie sans traitement, en s'appuyant sur une recommandation de l'Agence européenne du médicament de tester sur rongeurs juvéniles.
Objectifs
Le syndrome d'Ondine est une maladie génétique rare, constatée dès la naissance : le nouveau-né́ diminue sa respiration jusqu’à l'arrêter pendant le sommeil. Une caractéristique majeure est l'absence d'un réflexe respiratoire important : l'augmentation de la respiration lorsque l'on inhale du CO2 (sensibilité́ à l’hypercapnie). La maladie est provoquéé par une mutation hétérozygote d'un gène déterminant dans le développement embryonnaire du système nerveux autonome qui contrôle les grandes fonctions vitales comme la respiration. Actuellement, il n'existe aucun traitement pharmacologique et le recours à une ventilation mécanique à vie pendant le sommeil est nécessaire. Ce projet vise à étudier deux pistes de stratégies thérapeutiques pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un traitement pharmacologique réduirait le recours à la ventilation mécanique, l’unique prise en charge actuelle pour cette pathologie et ainsi réduirait les risques dus à un arrêt accidentel pendant le sommeil ou à une ventilation inadaptée. Les retombées de ce projet sont ainsi directement utiles en termes de prévention et d’implications thérapeutiques. De plus, pour des médicaments à visée pédiatrique, l’agence européenne du médicament recommande des tests sur des rongeurs juvéniles pour garantir l’innocuité et l’efficacité du produit sur la population cible.
Procédures
- Gavage en lait réalisé en moins de 2 minutes, fréquence : toutes les deux heures sur les souriceaux dont la poche de lait est vide entre 7h et 19h de la naissance à sept jours de vie (P7) puis 3 fois par jour jusqu'à P14- Gavage en molécule réalisé une fois - Injection intrathécale (injection sous la membrane protégeant le cerveau) de molécule sur animal vigile, réalisé une fois - Mesures cardio-respiratoires répétées 3 fois espacées de 4 heures puis une fois à 4 jours après la seule injection aigue pour une cinétique ventilatoire (évolution de la ventilation après l'injection unique de médicament). Les mesures cardio-respiratoires réalisées une fois par jour à 7, 14 et 21 jour. La durée d'une mesure cardio-respiratoire est d'une heure maximum. A chaque fin d'enregistrement, les souriceaux retournent dans la portée avec leur mère- A noter qu'aucun prélèvement d'organes ou de sang n'est effectué sur animaux vigiles. Le génotypage des reproducteurs s'effectue par prélèvemnt de follicule pileux, une méthode non invasive. Pour les souriceaux, le génotypage est réalisé par prélèvement tissulaire au niveau de la queue vers 4 jors de vie.
Impact sur les animaux
Les mesures cardio-respiratoires sur les souriceaux sont toutes non invasives et la séparation maternelle pour les réaliser n’excède l’heure. Les apnées et l’hypoventilation des mutants avec la mutation constitutive sont accompagnées pour certains mutants d’un défaut de succion/déglutition qui expliquerait en partie leur perte de poids. Ces effets indésirables attendus sont pris en charge par le gavage en lait. Le gavage peut tout de même représenter une gêne pour le souriceau mais nécessaire pour les maintenir en vie. Les modèles dont la mutation est restreinte dans des tissus spécifiques font des apnées et ne répondent pas à l’hypercapnie (hypercapnie : la pression partielle en CO2 dans le sang est augmentée) à la naissance mais leur phénotype respiratoire ne compromet pas leur survie. Leur croissance pondérale est similaire à leurs congénères sauvages. L’administration de traitement par injection sans anesthésie peut induire un stress sur l'animal qui sera de courte durée car le geste est précis et maîtrisé. De plus, les mutants ont une vulnérabilité à l'anesthésie. Le recours à l'anesthésie pourrait conduire à une mortalité précoce ne permettant pas de vérifier l'effet des molécules testées. La nuisance par le génotypage des souriceaux par prélèvement tissulaire au niveau de la queue engendre une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, des prélèvements de sang ou de tissus auront lieu en post-mortem.
Remplacement
L’étude préclinique sur des animaux en développement est un préalable recommandé par l’Agence européenne du médicament pour les stratégies thérapeutiques pharmacologiques notamment pédiatrique, l’utilisation de l’animal ne peut être évitée. Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. De plus, des modèles in vitro ne sont pas adaptés car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge thérapeutique.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et de la forte mortalité des souriceaux mutants à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental (génotype ; dose ; génotype*dose) de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions une étude longitudinale ce qui réduit l’utilisation d’animaux.
Raffinement
Surveillance journalière des cages de souris expérimentées : boissons et nourriture à volonté des mères, papier doux de quantité suffisante pour le nid, vérification du comportement de la mère envers les petits de sa portée (regroupement de la portée), état de la portée – Suivi clinique : présence de lait dans l’estomac les premiers jours de vie, prise de poids, température corporelle et vérification des points limites à l’aide de grilles d’évaluation adaptées à l’âge de l’animal (état du pelage de la souris, sa posture, sa mobilité, l’absence d’automutilation, croissance pondérale). Fréquence de suivi clinique : journalier la première semaine, une fois par jour et en jours de semaine de la deuxième semaine puis deux fois par semaine jusqu'à la fin de la procédure. Les points limites choisis sont suffisament prédictifs pour éviter toute souffrance animale. En cas de point limite atteint, les animaux concernés seront euthanasiés selon les méthodes réglementaires par un personnel compétent.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont largement utilisées dans l'étude des mécanismes physiopathologiques d'une maladie génétique. Nous travaillons sur les pistes thérapeutiques pharmacologiques d'une maladie génétique congénitale dont les manifestations cliniques sont précoces et la prise en charge pharmaceutique est encore inexistante. A ce jour, la seule prise en charge des patients est la ventilation mécanique. Nous avons à disposition des modèles murins sur lesquels nous pouvons prendre en charge dès la naissance et tester les stratégies thérapeutiques pharmacologiques. De plus, les études précliniques sur des animaux en développement constituent une recommandation de l'agence européenne du médicament comme préalable à la recherche des médicaments pédiatriques.
Évaluation de l’efficacité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, dans des modèles murins infectés par Pseudomonas aeruginosa ou par le virus de la grippe.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
960 souris au maximum vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal est infecté par le virus de la grippe ou par la bactérie Pseudomonas aeruginosa par voie intranasale sous anesthésie, puis traité ou non par une molécule, l'infection pouvant provoquer perte de poids, hypothermie et léthargie pendant plusieurs jours. Le projet évalue l'efficacité antivirale et antibactérienne de cette molécule déjà active in vitro. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de la tolérance d'un "organisme entier" et pourrait ramener le nombre de 960 à 384 souris si la première modalité fonctionne.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l’efficacité antivirale et antibactérienne d’une molécule que nous appelerons M, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées. Cette demande d’autorisation de projet est couplée avec une première demande qui évaluera au préalable la tolérance de la molécule M, in vivo, chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l’effet antiviral et antibactérien d’une nouvelle molécule prometteuse ayant une activité in vitro contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Avant d’être évaluées in vivo la molécule M a démontré son efficacité contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa in vitro à des doses non cytotoxiques. Au préalable, une étude de toxicité/tolérance sera réalisée (autre demande d'autorisation de projet). La dose la plus appropriée sera ensuite utilisée pour déterminer l’efficacité antivirale et antibactérienne, dans un modèle murin d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa, en traitement curatif. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre le virus de la grippe et contre P. aeruginosa.
Procédures
Les souris seront infectées par le virus de la grippe ou P. aeruginosa, par voie intranasale, sous anesthésie générale, puis traitées ou non par la molécule M, administrée 1 à 3 fois, par voie intranasle, également sous anesthésie générale.La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes par souris jsuqu’à son réveil.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces. Par ailleurs, pour étudier l’efficacité de la molécule M vis-à-vis du virus de la grippe ou de P. aeruginosa, les souris seront infectées et feront donc l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids de chaque souris. Ces deux modèles d’infection peuvent conduire aux effets secondaires suivants : perte de poids, température, perte d’appétit, inactivité ou encore létargie, sur une durée allant jusqu’à 6 ou 7 jours post-infection pour la grippe. Le modèle d'infection pour P. aeruginosa est beaucoup plus court (48h). Afin d’éviter d’infliger une douleur et une souffrance à l’animal, nous avons établi plusieurs critères d’évaluation afin de déterminer très rapidement les points limites.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance et d'efficacité.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier ou encore de mimer les réponses immunitaires ou de modéliser la complexité d’un organisme pour analyser cette dernière. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que les modèles murins d’infection par le virus de la grippe ou par P. aeruginosa sont bien établis et maîtrisés par l’équipe. De plus, nous tenons à souligner que dans notre étude, la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antivirale contre le virus de la grippe et antibactérienne vis-à-vis de P. aeruginosa, à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques. Ainsi, pour évaluer l’efficacité de la molécule M, vis-à-vis du virus de la grippe et de P. aeruginosa, un total de 960 souris au maximum sera nécessaire. Cependant, ce nombre sera réduit puisque 3 modalités de traitement sont envisagées, mais si la première modalité montre une efficacité antimicrobienne, les 2 autres modalités ne seront pas réalisés, réduisant le nombre de 960 à 384 souris.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.).
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons des souris parce qu’il s’agit d'une espèce animale appropriée pour étudier l’inflammation, les réponses immunitaires et qu’il s’agit d’un modèle bien établi pour l'infection par le virus de la grippe et pour l'infection par P. aeruginosa. D’autre part, le modèle d’infection grippale et le modèle d'infection par P. aeruginosa sont pleinement maîtrisés, chez la souris, au laboratoire et les pathogènes utilisés dans ce projet sont identiques à ceux infectant l’Homme. Il existe également de nombreux réactifs commerciaux adaptés à la souris pour décrire et comprendre les acteurs de sa réponse inflammatoire et immunologique. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, le choix de cette espèce limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant, et nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles pour rechercher un éventuel "effet sexe".
Prélèvements ponctuels sous anesthésie pour les mises au point, la calibration de techniques ou la réalisation de tests préliminaires in vitro chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
40 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres études après une période de repos. Sous anesthésie générale, chaque animal peut subir jusqu'à cinq fois sur deux ans des prélèvements de moelle osseuse, de liquide cérébrospinal, des lavages broncho-alvéolaires ou des prises de sang. L'objectif est de fournir du matériel biologique de primate pour mettre au point des techniques d'analyse. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de recourir à l'animal, la proximité des primates avec l'humain étant présentée comme sans équivalent.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre à disposition de la communauté scientifique du matériel biologique de primate (liquide cérébrospinal, échantillons pulmonaires ou de moelle osseuse, accompagnés ou non de prélèvement sanguin), qui ne peut être collecté que sous anesthésie générale des animaux. Ces prélèvements sont nécessaires à la mise au point de techniques d'analyses sur ces échantillons, à la sélection d'animaux sur certains critères physiologiques, ou encore à la réalisation de test in vitro afin d’appréhender la toxicité ou l'efficacité d’un produit, au lieu de ou avant de le tester chez l’animal. Ce projet vise donc à pouvoir prélever certains échantillons biologiques de primate sous anesthésie, dans le but de réaliser des tests préliminaires ou en remplacement d'études in vivo sur cette espèce.
Bénéfices attendus
Tout test de matériel biologique obtenu lors de protocoles expérimentaux utilisant l'animal nécessite au préalable d'être mis au point, affiné, voir validé selon un certain cadre réglementaire. Ces mises au point nécessitent elles-mêmes l'utilisation de matériel biologique, qui doit être obtenu sur la même espèce. Beaucoup de tests sont basés sur des produits sanguins, mais certains nécessitent d'autres matrices biologiques plus difficile d'accès, comme la moelle osseuse, le liquide cérébrospinal ou les lavages pulmonaires. La moelle osseuse pourrait par exemple être utilisée dans le cadre de la mise au point d'un test visant à caractériser les cellules progénitrices du sang, pour le développement d'une thérapie contre des maladies héréditaires. Le liquide cérébrospinal pourrait être utilisé pour mettre au point une méthode de mesure d'un produit injecté dans le sang d'un patient, pour évaluer sa capacité à passer dans le cerveau. Cela peut avoir des implications pour évaluer la potentielle neurotoxicité d'un produit, ou au contraire sa capacité à atteindre le cerveau pour lutter contre des maladies neurodégénératives. Finalement, les lavages pulmonaires permettent d'avoir accès à du liquide et à des cellules de poumons, sans pour autant sacrifier l'animal : cela permettrait d'étudier le microbiote pulmonaire d'animaux, ou encore d'utiliser ces échantillons pour mettre au point des méthodes d'investigation de virus pulmonaires comme le SARS-CoV-2 (ex: PCR). Ces prélèvements sous anesthésie de matrices biologiques spécifiques pourront potentiellement être accompagnés de prélèvements sanguins dans la limite des recommandations de volume et fréquence pour l'espèce. Ces prélèvements de sang pourront être réalisés seulement s'il est jugé scientifiquement ou éthiquement pertinent de les faire sur le même animal plutôt que sur une cohorte différente. Dans certains cas, ces échantillons pourraient être utilisés pour réaliser des tests in vitro remplaçant l'utilisation de l'animal, comme par exemple dans le cadre de tests de toxicité d'un produit sur les cellules progénitrices de la moelle. Dans ce contexte, les différents prélèvements réalisés sont nécessaires pour mettre au point ou améliorer des méthodes d'analyses existantes. Ce projet contribuera donc à réduire le nombre d’animaux utilisés en étude, en permettant le développement de méthodes d'analyses plus fines ou de test in vitro remplaçant l'animal lors de phases expérimentales précoces.
Procédures
Les animaux seront manipulés afin de réaliser une injection d’anesthésique. Les procédures se déroulent entièrement sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à une parmi les 4 procédures différentes, chacune nécessitant entre moins d’une minute et trois minutes . Les prélèvements possibles seront : prélèvement de moelle osseuse, prélèvement de liquide cérébrospinal, lavage broncho-alvéolaire et prélèvements sanguins. Le temps entre l’induction de l’anesthésie de l’animal et son réveil est d’environ 1h.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de liquide cérébro-spinal est réalisé sous anesthésie. Une légère gêne au lieu de ponction peut être ressentie au réveil par l’animal. Le lavage broncho-alvéolaire peut provoquer une gêne chez l'animal suite à l'administration de liquide dans les poumons. De plus, dans le cadre de ce protocole, les prélèvements seront par définition ponctuels et donc non répétés dans le temps. Le prélèvement de moelle osseuse peut quant à lui provoquer des douleurs au niveau de la zone de prélèvement. ire un hématome sur la zone de prélèvement.
Devenir
Après une période de repos adéquate, les animaux seront disponibles pour intégrer d'autres études, sur avis vétérinaire.
Remplacement
Il n'est pas possible de remplacer l'animal dans le cadre de ce projet. L'utilisation de celui-ci est indispensable afin d'obtenir le matériel biologique nécessaire à la mise au point, la calibration et la validation de méthodes d'analyses biologiques. Ces méthodes visent en effet directement les cellules de l'espèce animale concernée (cytométrie en flux, tests de stimulation de cellules immunitaires, caractérisation de l'expression de certains gènes…), ou peuvent être fortement influencées par le milieu biologique dans lequel elles sont réalisées (mesure de la quantité d'un anticorps ou d'une protéine exogène par ELISA ou spectroscopie de masse). Le raffinement de ces méthodes d'analyses sert d'une part à transférer des protocoles d'analyses d'une espèce à l'autre, et à améliorer leurs sensibilité et spécificité, réduisant ainsi potentiellement le nombre d'animaux nécessaires lors d'études subséquentes. De plus, la disponibilité de matériel biologique permet de la réalisation d'étude d'efficacité ou de toxicité in vivo, qui pourront potentiellement permettre de remplacer ou réduire le besoin d'études in vivo.
Réduction
Afin de ne pas surestimer le nombre d'animaux utilisés, le nombre d’animaux pour ce projet a été défini par une analyse rétrospective des prélèvements de liquide cérébrospinal et de prélèvements pulmonaires fait au sein de l’entreprise au cours des dernières années, modulée par la trajectoire de croissance de notre activité . Afin d’assurer un nombre minimum d’animaux, les animaux pourront être prélevé un maximum de 5 fois sur une période de 2 ans dans le cadre de cette DAP.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (mâles et femelles hébergés séparément) sur de la litière pour leur permettre de fourrager. Des jouets sont mis à leur disposition (rotation des jouets une fois par semaine). Des friandises sont distribuées quotidiennement aux animaux (après les manipulations et fin de journée) dans la litière et dans des dispositifs à friandises (tube, jouets...). Les fruits et légumes frais qui leurs seront fournis seront variés d'un jour à l'autre, tout comme la façon de les préparer, afin de stimuler les animaux. Un fond musical sera diffusé dans l'animalerie tout au long de la journée afin d'habitue les animaux à la voix humaine et de masquer les sons liés à l'utilisation quotidienne de l'animalerie. Toutes les procédures décrites dans ce protocole auront lieux sous anesthésie, accompagnées de mesures de soutien en fonction de la procédure en question. Par exemple, les prélèvements de moelle osseuse ou de liquide cérébrospinal seront précédés d'injection d'analgésique, les prélèvements pulmonaires seront accompagnés de monitoring dédié et de supplémentation en oxygène. Les animaux seront gardés sur coussin chauffant durant la procédure afin de ne pas occasionner d'hypothermie. Les volumes maximum de matrice biologique à prélever sont basés sur une analyse de la littérature disponible, ou sur les pratiques utilisées en clinique humaine le cas échéant. L'animal sera suivi par le personnel d’étude tout au long de l'anesthésie et surveillé au moment de son réveil ainsi que durant les heures suivantes. Un suivi clinique quotidien ainsi que la mise en place de points limites spécifique à chaque procédure permet d’évaluer quotidiennement le bien-être de l’animal. En fonction de la procédure réalisée, un score neurologique pourra aussi être réalisé, si nécessaire, les jours suivant les prélèvements afin d’assurer qu’il n’y ait pas de dommage neurologique.
Choix des espèces
Par leur origine phylogénétique, les primates non humains présentent une forte proximité avec les humains en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Cette proximité permet de les utiliser dans le cadre de développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou prophylactiques. Cette espèce est donc particulièrement utilisée pour tester l'efficacité ou la toxicité de drogues visant des processus biologiques spécifiques à l'homme ou aux espèces proches. Ces études peuvent couvrir les thérapies géniques ou cellulaires visant à corriger l'expression de gènes défectueux, les études infectieuses sur des virus n'infectant que l'homme ou certains primates, ou encore les thérapies visant le système nerveux central (la barrière hémato-encéphalique de l'humain étant très proche de celle du singe). Ce type d'étude nécessites la mise au point de méthodes d'analyses dédiées, pour lesquelles l'accès au matériel biologique de l'espèce cible est nécessaire. Ainsi, des études visant des maladies génétiques ou des leucémies auront besoin d'analyser la moelle osseuse des animaux, les études infectieuses de virus respiratoire (le singe étant le modèle de référence pour l'infection au SARS-CoV-2) auront besoin d'échantillons pulmonaires, et les études visant le système nerveux auront besoin d'échantillons de liquide cérébrospinal pour mettre au point leur méthode de dosage. Les mises au point et/ou test préliminaires de ce projet concerneront des candidats médicaments humains. Les animaux pourront être des juvéniles à mature, en fonction des besoins de l’étude. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou des matures en fonction des objectifs des études. Par exemple, des prélèvements de moelle osseuse peuvent chercher certaines populations de cellules précurseurs plus fréquentes chez le juvénile que chez l'animal mature.
Elevage d’animaux avec un phénotype dommageable.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
4 910 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour l'élevage de lignées au "phénotype dommageable", surtout des souris immunodéficientes ou issues de croisements transgéniques. Elles subissent une biopsie de l'oreille pour le génotypage et un hébergement stérile strict, une rupture de stérilité pouvant, selon le porteur, les contaminer jusqu'au décès du fait de leur immunodéficience. Les souris dont le génotype n'a pas d'intérêt sont tuées, les autres gardées pour la reproduction ou pour entrer dans d'autres procédures. Le porteur décrit ces lignées transgéniques comme des modèles "unanimement validés" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne recrée la complexité du système immunitaire.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élever des animaux au sein d’une plateforme animalière agrée, en particulier des souris, avec des phénotypes dommageables. Ces animaux sont, pour la majorité, des souris immunodéficientes qui sont utilisées dans nos projets de recherche. Ces souris sont dépourvues totalement ou partiellement de système immunitaire adaptatif. Ces animaux ayant un phénotype dommageable peuvent être aussi des souris issues du croisement de deux souches de Souris transgéniques. La surveillance du bien-être des lignées au cours de l’élevage exigera des contrôles quotidiens et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Ces animaux issus du croisement de deux souches de souris transgéniques seront utilisés dans des modèles communs : les modèles d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, d’arthrite, de maladies chroniques de l’intestin, d’inflammation cutanée et pulmonaire. Enfin, les modèles expérimentaux de cancérogénèse sont des modèles de greffe de tumeurs murines ou humaines comme les leucémies, différentes lignées de cancer du côlon ou du pancréas. Ces différents modèles permettent d’adresser un mécanisme d’action, ou des approches thérapeutiques avec des produits biologiques humains. Aujourd’hui, il n’y a pas de données scientifiques publiées sur ces croisements. Les données obtenues avec des nouvelles lignées permettront d’enrichir les données scientifiques dans les modèles étudiés. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable au cours de la génération de ces lignées transgéniques dans nos conditions d’hébergement. Ce n’est que lors de nos expérimentations suite à l’injection de tamoxifène qu’un caractère dommageable sera observable ou non. Si un phénotype dommageable apparait, nous définirons des points limites et une intention particulière sera porté au bien-être animal.
Bénéfices attendus
L’elevage de ces animaux au sein de notre animalerie est bénéfiques pour les animaux et donc nos expérimentations. Les animaux, lorsqu’ils seront utilisés dans nos expériences, seront déjà habitués aux conditions environnementales de l’animalerie, ainsi qu’aux soigneurs et aux expérimentateurs Ce qui pourra limiter très fortement le stress de ceux-ci.
Procédures
L’animal présentant un phénotype dommageable suite au croisement des 2 souches de souris transgéniques pourra ressentir, du fait de son statut génétique, une douleur, une souffrance, une angoisse ou un risque d’infection . La surveillance du bien-être de chaque animal au cours de l'expérience exigera des contrôles quotidiens de routine et une évaluation appropriée de tous les aspects du bien-être des animaux. Des conditions d’hébergement pour ces élevages seront strictes dans des portoirs ventilés avec de la litière autoclavée ainsi que des poches d’eau stérile. Tout ceci est mis en place afin de maintenir les animaux en bonne santé et de veiller au bien-être des animaux. Hormis le change des animaux, l’autre intervention sur ces animaux sera une biopsie d’oreille servant à vérifier le génotype des animaux et servant également à l’identification des animaux pour un bon suivi de l’élevage.
Impact sur les animaux
Concernant les animaux immunodéficients, les conditions d’hébergement strictes permettent de maintenir les animaux en bonne santé. Dans le cas où une rupture de la stérilité aurait lieu, les animaux pourraient être contaminés par des micro-organismes opportunistes qui seraient pathogènes pour ces animaux. Du fait de leur immunodéficience, ces animaux subiraient de graves effets indésirables qui se manifesteraient par une inactivité, une perte de poids pouvant aller jusqu’au décès. Pour les modèles CreLox inductible, les phénotypes dommageables des souris obtenus sont difficile à prévoir à l’avance Le bien-être animal sera évalué selon les principes suivants : Des données seront recueillies durant au moins 2 cycles de reproduction après la génération considérant la lignée stable (après 2 générations) avec un nombre d’animaux scientifiquement et statistiquement justifiés (jamais moins de 14 animaux issus d’au moins 2 portées/pontes différentes) en prenant en compte le sexe sur le phénotype : à défaut 7 mâles et 7 femelles. Les observations seront faites à un âge représentatif et un génotype pertinent. Les animaux contrôles seront de même fond génétique que les lignées générées.
Devenir
Les animaux dont le génotypage n’est pas d’intérêt, seront euthanasiés. A l’inverse, les animaux ayant un génotypage d’intérêt seront conservés, soit pour continuer les élevages, soit pour rentrer dans une procédure d’expérimentation.
Remplacement
Un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes lors de greffes ou de thérapies anti-cancéreuses. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste. L’élevage des animaux est réalisé à la demande des expérimentateurs. En fonction de la procédure concernée, le nombre d’animaux par groupe est défini de façon à obtenir une différence statistique (Tests paramétriques et non-paramétriques) en fin d’expérience en ayant pris en compte les animaux nécessaires (couples parents et portées non utilisées) et la toxicité associée à chaque modèle. A cause des variabilités inter‐animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et donc la nécessité de répéter inutilement l’expérience. Si un phénotype dommageable est observé avec ces souches, le nombre d’animaux utilisé dans nos expériences sera adapté en conséquence (dimunition du nombre d’animaux par groupe).
Raffinement
L’élevage des animaux au sein de l’animalerie est réalisé dans des conditions strictes de stérilité et de suivi. Les Souris sont hébergées dans des cages en portoirs ventilés, ce qui assure une non contamination par des pathogènes pouvant être présents dans l’air ambiant des pièces d’hébergement. Les cages contenant la litière sont autoclavées préalablement au change. L’eau de boisson est distribuée via des poches d’eau stériles à usage unique. Le change des animaux est réalisé sous hotte de change, le transfert des animaux de la cage sale à la nouvelle est réalisé à l’aide d’une paire de pince trempée dans l’alcool permettant au maximum de limiter les risques de contamination entre les cages. Entre chaque cage le soigneur désinfecte ses gants. Les animaux sont suivis quotidiennement par les soigneurs afin de prendre en charge les animaux pouvant montrer des signes de mal être et ainsi protéger ces congénères. Ce suivi accru limite aussi le risque de propagation potentielle de pathogènes.
Choix des espèces
La Souris présente un système immuno-physiologique très proche de celui de l’Homme, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques cellulaires. Les modèles transgéniques utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. Tous les animaux produits seront utilisés dans différentes procédures autorisées dans notre établissement. Ces animaux seront utilisés soit à partir de 8 semaines pour renouveler les couples reproducteurs, soit pour être utilisés dans les différentes procédures et cela à partir de 5 semaines. Cinq semaines est l’âge à partir duquel les animaux peuvent subir une greffe de cellules hématopoïétiques humaines ou de tumeurs sans alterer leur croissance et leur bien-être.
Caractérisation en modèle murin de la pathogénèse de virus respiratoires humains et évaluation de vaccins
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
1 150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des virus respiratoires humains administrés dans les narines sous anesthésie, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang répétés, jusqu'à un prélèvement terminal par ponction cardiaque, pour caractériser de nouveaux candidats vaccins. Le porteur indique une perte de poids, une accélération respiratoire et une perte d'activité après administration du virus. Il décrit le recours à l'animal comme "indispensable" et renvoie aux "guidelines" de l'Agence européenne du médicament pour justifier le modèle murin.
Objectifs
Les virus respiratoires provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’Homme et constituent la première cause de mortalité chez les jeunes enfants. Les possibilités de traitements ou de vaccinations contre ces virus restent limitées et/ou peu efficaces et le développement et l’approbation de nouveaux vaccins sont freinés par des efficacités de protection faibles et un manque de connaissances des réponses immunitaires induites. Pour les vaccins vivants atténués, la réponse immunitaire locale des muqueuses respiratoires (réponse mucosale) est encore peu décrite à ce jour mais elle contribuerait aussi à limiter la transmission des virus respiratoires. Aussi, de nouveaux candidats vaccins vivants atténués modifiés génétiquement sont en développement et permettraient d’avoir une couverture vaccinale plus large, protégeant contre plusieurs familles de virus respiratoires, à partir d’un seul vaccin. Sur la base de ces constats, ce projet vise à caractériser et valider l’efficacité de nouveaux candidats vaccins vivants atténués pour protéger contre deux familles de virus respiratoires humains, à l’aide d'un modèle expérimental de pneumonie virale chez la souris. Ce projet vise aussi à étudier de manière plus approfondie l’impact de ces candidats vaccins sur l’immunité, avec un focus particulier sur la réponse immunitaire des muqueuses respiratoires.
Bénéfices attendus
Les résultats de ces études seront utiles pour approfondir la compréhension de l'infection par les virus respiratoires et des réponses immunitaires et inflammatoires induites par ces infections. Cette étude permettra aussi de participer au développement et à la caractérisation de nouveaux candidats vaccins innovants contre ces infections respiratoires, pour lesquelles il n’existe aujourd’hui que peu d’option efficace disponible sur le marché.
Procédures
(1) 80 animaux subiront des prélèvements de sang au niveau de la joue : prélèvement sur animal vigile, jusqu’à 3 prélèvements par animal, 3 semaines d’intervalle entre chaque prélèvement. Durée du geste (contention comprise) : 1 minute ; (2) Tous les animaux (soit 80) seront pesés tous les jours : pesée d’animaux vigiles, une fois par jour pendant 63 jours consécutifs. Durée du geste : 30 secondes ; (3) 80 animaux subiront une injection d’un mélange d’anesthésiques avant chaque administration de virus : injection sur animal vigile, jusqu’à 3 injections réalisées à 3 semaines d’intervalle par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes ; (4) 80 animaux subiront une administration de virus ou vaccin : administration sur animal anesthésié (anesthésie liquide), administration au goutte à goutte sur les narines de l'animal tenu en position dorsale, jusqu’à 3 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (5) 20 animaux subiront une injection intramusculaire (cuisse) de vaccin : injection sur animal anesthésié (anesthésie liquide), jusqu’à 2 administrations sur le même animal avec 3 semaines d’intervalle entre chaque administration. Durée du geste : 1 minute ; (6) 24 animaux subiront une injection sous-cutanée d’analgésiques 30 minutes avant anesthésie générale gazeuse et prélèvement de sang terminal (par ponction cardiaque). Analgésie + anesthésie + prélèvement de sang réalisé 1 fois en fin de procédure sur chaque animal. Durée du geste : 40 minutes ; (7) 32 animaux subiront une injection de pentobarbital : injection sur animal vigile, 1 injection par animal. Durée du geste (contention comprise) : 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoires : une perte de poids sur une durée de 1 à 10 jours après administration de virus (jusqu'à 3 administrations pendant une étude d’efficacité vaccinale) + une accélération du rythme respiratoire + une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration de virus. Les souris pourraient aussi subir des effets indésirables après la réalisation des gestes techniques de prélèvements sanguins ou d’injections éventuelles de vaccins, d’injection d’anesthésiques ou d’analgésiques. Ces effets indésirables seraient des douleurs locales et de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales pour le prelevement de sang total et organes (évaluation de la réponse immunitaire et protection vaccinale).
Remplacement
Toutes les étapes du présent projet et la caractérisation des nouveaux candidats vaccins en modèle murin font suite à des études effectuées et validées auparavant en laboratoire. Malgré le progrès des dernières années dans le développement de modèles d’études alternatifs, l’interaction entre les virus et le système immunitaire d’un individu est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal. A cet égard, le recours indispensable à l'animal de laboratoire pour la caractérisation de la pathogénèse des souches virales, de la réponse immunitaire globale face à l’infection, ainsi que le niveau de protection induit par un vaccin, figure dans les "guidelines" édictées par l'Agence Européenne du Médicament.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés par groupe expérimental tiendra compte du nombre minimal d'animaux pour atteindre une relevance expérimentale, réaliser des tests statistiques et maintenir des groupes sociaux au sein de chaque cagée, en tenant compte des animaux consacrés aux prélevements terminaux. Dans la mesure du possible, les groupes contrôle d'animaux seront mutualisés pour réduire le nombre total d'animaux.
Raffinement
Après anesthésie générale, un suivi accru sera fait jusqu’à réveil et reprise d’activité de chaque animal. Après chaque administration de virus ou de vaccin, chaque animal fera l'objet d'une surveillance pendant 14 jours au rythme de 1 fois par jour, accrue à 2 fois par jour au besoin, pour réaliser un suivi de poids et de signes cliniques. Pour limiter les effets indésirables dûs aux prélevements de sang au niveau de la joue, le volume de sang prélevé sera limité pour faciliter la compensation de la perte de sang en quelques heures. Pour réduire la douleur provoquée par le prélevement de sang par ponction cardiaque, l’administration d’analgésiques sera réalisée 30 min avant anesthésie gazeuse. Les potentielles nuisances identifiées lors de la réalisation des procédures seront prises en compte pour le raffinement des prochains protocoles incluant d’éventuelles analgésies et anesthésies supplémentaires pour des prélevements douloureux.
Choix des espèces
Bien que les modèles expérimentaux animaux pour l’étude des infections respiratoires se soient diversifiés ces dernières décennies (furets, rat des cotonniers, hamsters, bovins, primates non humains), aucun de ces modèles ne réflètent complètement la pathologie et la réponse immunitaire chez l’humain. La souris reste cependant le modèle sur petits animaux le mieux caractérisé pour l’étude des infections respiratoires virales. A ce stade de notre projet, il n’y a pas de justification à l’utilisation d’un autre modèle animal sans une validation au préalable chez la souris. Nos précédentes expérimentations ainsi que celles d’autres équipes ont montrés que des souris sevrées âgées de 4 à 8 semaines au début du protocole sont bien adaptées aux besoins de ce projet, puisque ce modèle permet non seulement l’observation de signes cliniques liés à l’évolution de la pathologie respiratoire mais aussi de réaliser aisément diverses analyses. De plus, le modèle murin est parfaitement maitrisé depuis plusieurs années par les responsables et manipulateurs.
Étude du niveau d’hypoxie dans le syndrome d’apnées obstructives du sommeil de l’enfant dans un modèle murin.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système respiratoire
540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux sont séparés de leur mère puis exposés de façon répétée à une baisse d'oxygène (hypoxie intermittente), avec imagerie du cerveau sous anesthésie et tests d'exploration, pour étudier les conséquences de l'apnée du sommeil de l'enfant. Le porteur indique que la séparation maternelle peut générer de l'angoisse et que le protocole ralentit la croissance, et que toutes les souris sont tuées entre 30 et 35 jours pour prélever leur cerveau. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent répondre à la complexité d'un "organisme entier" et juge le modèle animal "indispensable".
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) de l’enfant est une maladie fréquente (4% des enfants) responsable à moyen terme de difficultés scolaires, de troubles du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité et à long terme potentiellement de complications cardiovasculaires. Le SAOS est caractérisé par une alternance de périodes d’apnées et de périodes de respiration sans apnées. Durant les phases d’apnées, les patients présentent une diminution du taux d’oxygène (hypoxie) dans le sang pouvant être plus ou moins sévère. Le modèle de SAOS le plus utilisé est l'hypoxie intermittente caractérisée par des épisodes de diminution du taux d’oxygène dans le sang. Pour ce faire, nous faisons alors varier la quantité inspirée en oxygène et sa durée et mesurer les conséquences. Ce modèle permet donc d’étudier de façon spécifique les conséquences d’une hypoxie intermittente sur le plan cognitif et physiologique dans un modèle murin juvénile.
Bénéfices attendus
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez l’enfant est très peu étudié pourtant cela concerne beaucoup d’enfants (4% de la population). Ce projet permetterait de mieux comprendre les déterminants du pronostic de ce syndrome en terme de fonction cognitive (mémoire) et de fonction cardio-vasculaire. Une meilleure compréhension permet une meilleure prise en charge.
Procédures
Séparation maternelle de 2 fois 3h pour les souris âgées de 15 à 27 jours. Entre 30 et 35 jours de vie : ces souris seront soumises une fois à une courte anesthésie (30 minutes maximum) afin de réaliser une imagerie ultrasonore fonctionnelle à temps réel du cerveau . C'est une imagerie éveillée sur boîte cranienne et peau intactes (sans cranioctomie) ) qui mesure les variations du flux sanguin cérébral et renseigne ainsi l’activité cérébrale. Gestes techniques : prise de poids et de température, tests de comportements par exposition des animaux dans une arène vide puis dans une arène munie de deux objets, préhension des animaux pour la lecture du tatouage d'identification sur les pattes, pour le déplacement dans les chambres d'exposition et pour l’administration une fois d’anesthésiant et le rasage au niveau de la tête pour l'imagerie fonctionnelle
Impact sur les animaux
- séparation maternelle limitant le contact maternel pouvant générer de l'angoisse - troubles cardio-vasculaires selon le protocole d'hypoxie intermittente (hypoxie intermittente = épisode de diminution de la fraction inspirée en oxygène réalisée de manière intermittente et non continue) - croissance pondérale ralentit selon le protocole.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort avant prélèvement du cerveau pour des études histologiques entre 30 et 35 jours de vie.
Remplacement
Dans le SAOS, les études épidémiologiques enrichissent déjà les connaissances de la maladie mais sont limitées par la possibilité d’étudier plus finement les paramètres connus et ceux potentiellement contributifs pour des raisons éthiques évidentes des tests chez l’humain. Bien que des méthodes non-animales jouent un rôle important dans la recherche scientifique pour comprendre isolément des mécanismes, elles ne peuvent pas répondre à la complexité d’un système intégré d’un organisme entier. De plus, les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. Pour étudier les maladies humaines et répondre aux exigences de sécurité pour la santé humaine, l’utilisation de modèle animal est indispensable.
Réduction
Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions au maximum une étude longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous effectuerons le bilan physiologique (ventilation, fréquence cardiaque, croissance pondérale,....), cognitif (mémoire) et cérébro-vasculaire (activité neuronal, fluctuatio du débit sanguin cérébral) sur les mêmes portées. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle dans les paramètres physiologiques, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Si toutefois, par des analyses intermédiaires, nous obtenons une puissance statistique suffisante dans le test de nos hypothèses, nous n’augmenterons pas le nombre d’animaux pour respecter le lot de 30 animaux.
Raffinement
Mesures pour minimiser une possible angoisse des animaux : durée de mesure courte, regroupement des souris lors de l’exposition à l’hypoxie intermittente, fourniture d’une quantité de sciure maternelle dans les chambres d’exposition (boîtes dans lesquelles les souris sont exposées à l'hypoxie intermittente), remise à la mère d’une heure entre les 2 sessions journalière d’hypoxie intermittente afin de maintenir le contact maternel. Fréquence de la surveillance : pesée journalière pendant l’exposition à l’hypoxie intermittente (15 à 27 jours) et à chaque point de mesure (tests comportementaux, mesures physiologiques), vérification journalière pour les besoins en eau et nourriture de la mère et de sa portée, vérification journalière des points limites (état du pelage, du comportement de la souris dans sa portée et comportement de la mère envers sa portée). Une dose letale d'aneshésiant est administrée à l'animal avant le prélèvement de cerveau pour des études histologiques.
Choix des espèces
Les souris, étant des mammifères, elles sont suffisamment proches de l’Homme. Nous partageons 95% de nos gènes avec la souris. La souris est de petite taille, la reproduction est rapide car la durée de gestation est courte, la manipulation est facile ce qui en fait un modèle efficace pour la recherche. La période choisie pour l’exposition à l’hypoxie intermittente correspond à la petite enfance jusqu'au début de l’adolescence, période de manifestation du syndrome d’apnées obstructives du sommeil de l’enfant.
Évaluation de l’innocuité d’une nouvelle molécule, administrée par voie intranasale, chez la souris saine
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
160 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent une à trois administrations intranasales d'une molécule sous anesthésie, pour évaluer sa tolérance avant des essais d'activité contre une bactérie et le virus de la grippe. Le porteur indique n'attendre aucun effet secondaire, la molécule s'étant montrée non toxique en culture cellulaire, mais prévoit un suivi du poids et de la température. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne renseigne sur la tolérance d'un "organisme entier", d'où le recours aux souris pour cette étape préalable.
Objectifs
Chaque année, dans le monde, le nombre de cas de grippe est d’environ 1 milliard et le nombre de décès liés à la grippe est estimé entre 290 000 et 600 000. L’émergence d’une pandémie, comme celle de COVID-19, met fortement en évidence l’impact sanitaire, social et économique d’une infection virale incontrôlée. Ainsi, chaque pays est également confronté à des défis de sécurité. Même si la vaccination est la stratégie la plus efficace contre les virus, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin, associée à la dérive antigénique intrinsèque des virus, affecte négativement cette protection. En parallèle, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) alerte aussi sur les maladies résistantes aux médicaments, qui pourraient être responsables de 10 millions de décès chaque année d’ici à 2050. Parmi ces maladies, celles ayant pour origine des bactéries multi-résistantes aux antibiotiques présentent un risque critique, avec une menace particulière dans les hôpitaux, les maisons de retraite, etc. Une liste de bactéries a été publiée et comporte notamment Pseudomonas aeruginosa dont certaines souches sont devenues multi-résistantes aux antibiotiques. Ces souches peuvent entraîner des infections sévères, telles que des pneumonies qui peuvent conduire au décès des patients. De nouvelles molécules antivirales et antibactériennes sont donc à développer de toute urgence. Le projet actuel a pour objectif d’évaluer in vivo l'innocuité d’une molécule que nous appelerons M, pour déterminer les doses auxquelles elle pourra être utilisée ensuite dans une autre demande d'autorisation de projet pour évaluer ses activités antibactérienne et antivirale, dans le contexte d’une infection par P. aeruginosa ou par le virus de la grippe, chez la souris. En effet, cette molécule a déjà montré une activité antivirale et antibactérienne in vitro, sans toxicité aux doses utilisées.
Bénéfices attendus
Notre projet consiste à évaluer l'innocuité d’une nouvelle molécule M prometteuse chez la souris saine. Cette molécule M possède une activité in vitro contre P. aeruginosa et contre le virus de la grippe, à des doses non cytotoxiques. Les expériences montrent que cette molécule ne semble pas favoriser la résistance et propose une solution de traitement avec une administration par voie nasale, ce qui permet d’interagir directement avec la muqueuse nasale et pulmonaire. Les expériences permettront de déterminer la dose la plus appropriée à utiliser pour démontrer son activité antivirale et antibactérienne in vivo. Ceci concernera une autre demande puisque les expériences devront être réalisées dans une animalerie A2 qui permet d'utiliser des micro-organismes de classe de risque 2, c'est-à-dire des pathogènes pouvant provoquer une maladie chez l'homme et pour lesquels une prophylaxie ou/et des traitements sont efficaces. Cette nouvelle molécule permettrait ainsi d’apporter une nouvelle stratégie pour lutter contre Pseudomonas aeruginosa et contre le virus de la grippe.
Procédures
Dans une première expérience, les souris recevront 1 seule administration intranasale de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie intrapéritonéale. Dans une seconde expérience, les souris recevront 2 ou 3 administrations intranasales de la molécule M ou de solution contrôle, sous anesthésie générale induite par voie gazeuse. La durée d’une administration intranasale, anesthésie comprise, dure environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les contentions engendrent du stress pour l'animal et l'injection intrapéritonéale pour l'anesthésie générale peut entraîner une légère douleur au niveau du site de l'injection. L’administration de la molécule M ne devrait pas provoquer d’effets secondaires car les tests en culture cellulaire ne montrent pas de cytotoxicité aux doses efficaces, mais les souris feront l’objet d’un suivi bi-quotidien et nous mesurerons notamment la température corporelle et le poids et nous observerons attentivement leur comportement.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque plan expérimental afin de prélever des organes et d’analyser les différents paramètres de la tolérance.
Remplacement
Dans notre étude, les expériences que nous souhaitons réaliser sur les souris ne peuvent pas être remplacées par des méthodes alternatives car actuellement, aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de connaître la tolérance d’un organisme entier. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires à notre étude. Nous souhaitons rajouter que la molécule a déjà démontré in vitro son efficacité antibactérienne et antivirale à des doses non cytotoxiques en culture cellulaire.
Réduction
Chaque procédure a été conçue pour utiliser le minimum de souris, en utilisant les tests statistiques adaptés. De plus, les expérimentations sont également conduites en recherchant un éventuel « effet sexe ». Ainsi, un total de 160 souris est donc nécessaire pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec du sopalin, des fragments de boîtes d’œufs et des jouets en plastique. Toutes les manipulations sur les souris ne seront effectuées que par du personnel qualifié ayant suffisamment d’expérience avec les procédures décrites pour minimiser toute douleur et inconfort possible pour les animaux. Tout au long du déroulement des expériences, une observation systématique de leur état clinique sera réalisée de façon pluriquotidienne par les animaliers et les expérimentateurs, afin de détecter au plus tôt une éventuelle souffrance animale. Les souris seront habituées aux manipulations les jours précédant l’expérimentation, en les sortant de la cage et en associant la manipulation à un renforcement positif en donnant une récompense alimentaire (bout de biscuit, pomme, etc.). De plus, l'administration intranasale sera effectuée sous anesthésie générale suivie d’une analgésie éventuelle (paracétamol 200 mg/kg). Afin d’identifier la souffrance et la douleur, nous avons établi une grille permettant d’évaluer différents paramètres et de prendre en considération différents points limites.
Choix des espèces
Lors de ce projet, nous utiliserons la même souche de souris qui sera ensuite utilisée pour étudier l’inflammation et les réponses immunitaires. De plus, la souris, de par sa petite taille, permet une logistique aisée, et constitue un bon support pour tester les nouvelles approches thérapeutiques dans les modèles précliniques. Ainsi, cette souche de souris limite de ce fait le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (entre 8 semaines et 12 semaines) pour avoir un système immunitaire mature mais non vieillissant en vue des doses à utiliser dans un contexte infectieux pour tester l'activité antivirale et antibactérienne de la molécule M. De plus, les expériences seront conduites en utilisant des souris mâles et de femelles afin de rechercher un éventuel « effet sexe ».