Troubles respiratoires
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Etude de la fibrose pulmonaire: évaluation par imagerie et évaluation de nouveaux traitements chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Pour mettre au point des traceurs d'imagerie de la fibrose pulmonaire et tester des traitements, 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La fibrose est induite à la bléomycine, suivie d'injections de traceurs radioactifs, de jusqu'à cinq séances d'imagerie de quarante minutes sous anesthésie, d'un gavage quotidien de J8 à J28 ou d'injections intrapéritonéales quotidiennes, puis d'une ponction dans le cœur. Pendant la phase d'inflammation, les souris peuvent perdre du poids, se déshydrater, respirer difficilement et rester prostrées, sans analgésie, le porteur indiquant que les antidouleurs interféreraient avec le développement de la fibrose. Le nombre de souris par groupe a été fixé d'après l'expérience de l'équipe, le porteur précisant qu'aucune approche statistique n'a été utilisée.
Objectifs
Ce projet porte sur l’étude de la fibrose pulmonaire qui se caractérise par une modification de la structure du tissu pulmonaire qui devient plus rigide. Elle résulte de l’accumulation excessive de protéines comme le collagène et mène à des défauts de fonctionnement des poumons. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode permettant un diagnostic précoce et le suivi de la progression de la maladie. Peu de traitements sont disponibles car les mécanismes menant à la fibrose sont peu connus. Ces traitements permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie mais ne permettent pas de la stopper. De plus, il n’existe, à l’heure actuelle, aucun moyen de suivre l’efficacité de ces thérapies chez les patients. Ce projet est donc construit avec un triple objectif: 1/ Mettre en place de nouveaux traceurs d’imagerie pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression non-invasif de la fibrose pulmonaire, 2/ évaluer l’action de ces traceurs pour le suivi de l’efficacité de traitements anti-fibrose et enfin 3/ évaluer les effets de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
La découverte de biomarqueurs pour la FPI en est encore à ses débuts et il n'existe pas de consensus dans ce domaine, en particulier pour l'imagerie moléculaire. L'imagerie actuelle de la FPI repose uniquement sur le scanner haute résolution et n'a que peu d'impact sur le diagnostic précoce et la survie. En outre, l'efficacité des thérapies actuellement approuvées pour la FPI dans l'ensemble de la population atteinte de FPI reste incertaine et les outils permettant de contrôler l'efficacité des thérapies font cruellement défaut. Ce projet permettra donc de développer et d’évaluer des traceurs d’imagerie qui pourraient être des biomarqueurs d'imagerie pour la FPI. Un nombre important de patients atteints de FPI doivent subir une biopsie pulmonaire pour obtenir un diagnostic définitif. Cependant, l'hétérogénéité spatiale des lésions fibrotiques dans le poumon de la FPI rend difficile l'échantillonnage précis de la zone pulmonaire malade afin d'obtenir une décision de diagnostic fiable. Le développement de sondes radiomarquées spécifiques des zones pulmonaires affectées par la FPI, telles que les sondes développées dans notre projet, pourrait aider les cliniciens à prendre des décisions thérapeutiques. En outre, ce projet fournira des outils innovants pour la détection de voies biologiques spécifiques impliquées dans la fibrose pulmonaire. Dans ce contexte, les sondes développées dans le cadre de ce projet constitueront une première étape dans le développement de thérapies personnalisées pour les patients atteints de FPI, ce qui n'est pas le cas actuellement, en identifiant les répondeurs potentiels ou les non-répondeurs aux thérapies évaluées dans ce projet. Notre projet ambitieux favorisera donc le développement de thérapies ciblées qui sont inexistantes pour le traitement de la FPI.
Procédures
Intervention subies par les animaux : - Injection de traceur radioactifs par voie IV sous anesthésie (100µl, 2 minutes, 1 à 4 injection par animal) - Prélèvement sanguins sous anesthésie (2 minutes, 4 par animal, n=30 (procédure 1 seulement)) - Imagerie in vivo sous anesthésie (40 minutes maximum, 1 à 5 imagerie par animal) - Traitement par gavage sur souris vigile (procédure 3 uniquement, 200µl, gavage quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Traitement par injection IP sur souris vigile (procédure 4 uniquement, 100µl, quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Prélèvement de sang terminal sans réveil par ponction intracardiaque sans thoracotomie sur animal anesthésié (1 minutes).
Impact sur les animaux
Durant la phase d’inflammation de J0 à J7 les animaux peuvent subir une perte de poids importante et présenter des signes cliniques caractéristiques tels que la déshydratation, l’augmentation de la fréquence respiratoire (associé à une difficulté respiratoire) et un comportement de prostration et d’isolement. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures.
Devenir
A l’issue de chaque procédure la totalité des animaux seront mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéine) et les comparer avec nos techniques d’imagerie in vivo.
Remplacement
L’étude de la fibrose pulmonaire ainsi que l’effet d’un traitement sur celles-ci ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement complexe et pluricellulaire présent physiologiquement, ni la fonction pulmonaire (rigidité, stress mécanique dû à la respiration…) dans son ensemble. Néanmoins, les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.
Réduction
Dans le cadre de cette étude, les traceurs/composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum. De plus l’imagerie in vivo permet d’évaluer les traceurs/composés à plusieurs stades de fibrose sur les mêmes animaux limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminée suivant notre experience de ce type de manipulation et aucune approche statistique n'a été utilisée. De plus, le nombre d’animaux utilisé pourra être revu à la baisse pour certaines procédures en fonction des résultats obtenus lors des procédures précédentes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages, en groupe (10 maximum par cage), suivant un cycle jour/nuit inversé avec accès illimité à l’eau et la nourriture. Les litières des cages seront supplémentées par un enrichissement de type « SIZZLE PAD ». Les gestes de ce projet (injection, imagerie, mise à mort) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux recevant de la bléomycine seront observés une fois par jour pendant la phase aigüe d’inflammation (de J0 à J7) puis trois fois par semaine de J8 à J28 pendant la phase de progression de la fibrose. Le développement de la fibrose reposant sur l'induction d'une phase d'inflammation, il n'est pas possible d'utiliser des analgésiques qui pourraient interfèrer avec le bon développement de la fibrose. En dehors des effets induits par le modèle, aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance excédent les points limites sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de la mise à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les modèles de choix pour l’étude de la fibrose pulmonaire. La souris est l’espèce la plus utilisée et la plus connue notamment pour le modèle à la bléomycine, permettant ainsi une extrapolation à l’homme et une comparaison à de résultats antérieurs. Les souris débuteront les études à un âge de 8 semaines, déterminé en fonction de résultats déjà publiés. Cet âge correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.
Développement de médicaments antiviraux innovants contre les infections respiratoires induites par le virus de la grippe et le SARS-CoV-2.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
581 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus léger. Chacune reçoit sous anesthésie générale une administration de médicament directement dans la trachée ou dans une veine, puis un prélèvement de sang, avant d'être tuée pour que ses organes soient dosés. Aucun animal n'est infecté, le projet mesurant seulement où se dépose la poudre inhalée et à quelle concentration, les retombées annoncées contre la grippe et la Covid-19 restant à distance de cette étape. Le porteur indique avoir déjà évalué les formulations sur un impacteur multi-étages qui reproduit approximativement l'appareil pulmonaire, mais juge le passage chez l'animal "incontournable" faute d'y retrouver le mucus et les échanges gazeux.
Objectifs
Les infections virales respiratoires telles que la grippe ou la Covid-19 restent l’une des principales causes de décès dans le monde et l’émergence de nouvelles souches virales continue d’être une préoccupation majeure. Il n’existe actuellement aucun médicament efficace contre les coronavirus et le virus de la grippe A. La vaccination constitue pour l’instant la stratégie préventive la plus efficace. Cependant, la courte durée de l’immunité induite par le vaccin associée à la dérive génétique des virus et à la réticence actuelle des populations à l’égard des vaccins peut compromettre cette stratégie. Par conséquent, il est nécessaire de développer des médicaments antiviraux innovants pour traiter et soigner les personnes infectées. Les virus n’ont pas de métabolisme propre et ne sont pas capables de se reproduire sans l’aide d’une cellule étrangère qu’ils infectent et dont ils utilisent la machinerie pour se multiplier. Ces cellules deviennent des usines à virus et sont détruites lors de la libération des nouveaux virus. L’objectif global du projet est d’explorer une nouvelle stratégie qui au lieu de cibler le virus lui-même, s’appuie sur les médicaments modulant le métabolisme cellulaire des cellules hébergeant le virus pour renforcer la réponse immunitaire innée et empêcher la croissance virale. Des liens essentiels entre le métabolisme et l’immunité ont été découvert récemment. Donc interférer avec les voies métaboliques en utilisant des médicaments pour empêcher la croissance virale est une stratégie intéressante pour développer des antiviraux dirigés contre l’hôte. L’équipe a montré que certains métabolites des cellules inhibent fortement l’infection par le virus de la grippe A et du SARS-CoV-2 in vitro et in vivo. Sur la base de cette découverte, une série d’analogues sélectifs et plus puissants que les molécules naturelles ont été conçus et synthétisés. Des poudres sèches pour inhalation pour administrer ces composés (molécules naturelles et analogues) directement dans les voies respiratoires ont été développées. La voie pulmonaire est hautement souhaitable car elle permet de délivrer des doses plus élevées au site même de l’action du médicament et de réduire les potentiels effets indésirables systémiques. L’objectif de ce projet est maintenant d’évaleur la pharmacocinétique et la biodistribution de ces poudres in vivo sur un modèle animal sain.
Bénéfices attendus
La crise du Covid-19 a mis en évidence l’importance des maladies virales émergentes dans un contexte de mondialisation des flux, notamment des personnes. Cette crise sanitaire a souligné l’absence de traitement efficace contre les infections virales aiguës transmises par l’air, responsable de la majorité des infections virales mortelles. Nous parvenons actuellement à contrôler le SRAS-CoV-2 et la grippe A grâce à la vaccination mais des épidémies avec de nouveaux variants ou de nouveaux virus se produiront certainement dans les années à venir. L’impact humain, social et économique de médicaments antiviraux innovants est donc considérable. Le développement de formulations sous forme de poudre sèche pour délivrer localement par inhalation les antiviraux dans les poumons permettrait une administration aisée et ciblée des tissus respiratoires, lieu de l’infection et de diminuer les effets secondaires systémiques potentiels.
Procédures
Chaque souris subira sous anesthésie générale une administration de médicament soit par voie intratrachéale (dans les poumons) soit par voie intraveineuse et un prélèvement de sang sous anesthésie générale à la fin de la procédure. La durée de ces gestes n’excèdera pas une minute chacun.
Impact sur les animaux
Les souris peuvent subir un inconfort modéré et transitoire pendant et après l’administration des formulations. Un léger stress peut être induit au moment de l’anesthésie gazeuse.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure afin de prélever les organes et le sang pour des dosages des médicaments.
Remplacement
La performance aérodynamique des formulations a été évaluée in vitro à l’aide d’un impacteur multi-étages qui permet une modélisation approximative de l’appareil pulmonaire. Cette technique permet de répondre à des exigences réglementaires et de déterminer la quantité de poudre qui atteint les différents segments du poumon, notamment d’évaluer la fraction respirable d’un médicament inhalé qui correspond aux particules les plus suceptibles de se déposer dans les alvéoles pulmonaires (particules
Réduction
Une étude pilote sur un petit nombre d’animaux permettra d’affiner les différents paramètres de la pharmacocinétique et de valider le modèle. Le nombre de formulations testés in vivo dans ce projet a été limité à trois grâce à des études préliminaires in vitro pour réduire le nombre d’animaux. Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide du logiciel GPower qui est un outil permettant de calculer des analyses de puissance statistiques et de définir le juste nombre d’animaux à inclure dans une étude afin de pouvoir exploiter les résultats de façon statistiquement fiable. Les animaux seront alloués aux groupes expérimentaux par randomisation. Les données obtenues à partir de chaque animal seront maximisées. Les organes seront prélevés et congelés pour des études ultérieures.
Raffinement
L’ administration de poudre dans les poumons ou l’injection de la substance active sous sa forme soluble ainsi que les prélèvements de sang s’effectueront sous anesthésie générale afin de réduire au maximum la douleur et le stress que pourraient subir les animaux lors des gestes techniques. Les volumes d’air administrés ne dépasseront pas le volume courant des poumons. Les souris seront surveillées pendant toute la durée de la procédure qui dure 24h et des points limites adaptés seront strictement appliqués en cas de souffrance avérée déterminée à partir de signes cliniques précis. Les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi de tubes en cartons et de matériaux de nidification (type sizzle nest ou cocon) afin de favoriser les comportements naturels tels que l’activité et la fabrication d’un nid.
Choix des espèces
La pharmacocinétique se fera sur des souris afin de pouvoir comparer nos résultats avec des études déjà effectuées sur cette souche par les équipes partenaires du projet. Nous utiliserons des souris entre 7 et 15 semaines car leur appareil respiratoire aura atteint sa taille adulte et leur système immunitaire dont les cellules peuvent interférer avec les composés administrés sera mature.
Etude des effets biologiques d’un faisceau d’électrons à haute énergie
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
Les souris dont le poids passe sous un seuil de référence, qui présentent des difficultés respiratoires ou une fibrose avancée au scanner sont mises à mort. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Une partie reçoit une irradiation du thorax à 13 ou 15 grays, qui provoque une inflammation pulmonaire pendant un à trois mois puis, en cas de forte toxicité, une fibrose des poumons à quatre ou cinq mois. Les autres reçoivent des cellules tumorales sous la peau de la patte, avec des risques de dermite, d'ulcération et de nécrose cutanée, pour comparer un nouveau faisceau d'électrons de haute énergie à un faisceau témoin en vue de son intégration dans de futures machines de radiothérapie.
Objectifs
La radiothérapie induit des effets secondaires qui affectent la qualité de vie des patients atteints de cancers. Pour améliorer les traitements de la radiothérapie et limiter ses effets secondaires, nous explorons de nouvelles méthodes d’irradiation comme la radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. Afin de pouvoir explorer son potentiel clinique, nous caractériserons dans ce projet les effets biologiques de cette nouvelle méthode de radiothérapie en étudiant d’une part, les toxicités qu’elle pourrait induire, et d’autre part, son pouvoir à éliminer les cellules tumorales.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons déterminé le potentiel clinique d’une nouvelle méthode de radiothérapie utilisant des particules de haute énergie. En cas de résultats positifs, cette nouvelle méthode pourrait être intégrée, aux futures machines de radiothérapie et permettre une amélioration des traitements par radiothérapie (i.e. moins d’effets secondaires) pour les patients atteints de cancer.
Procédures
Dans une première procédure, 3 lots d’animaux seront irradiés avec une nouvelle méthode de radiothérapie et ils seront ensuite suivis par scanner pour petit animal. Ils seront anesthésies pendant 5 à 10 minutes pendant l’irradiation et environ 5 minutes pour chaque scanner mensuel. Dans une seconde procédure, des cellules tumorales seront injectées par voie sous cutanée aux animaux vigiles constituant 3 lots d’animaux : - 1 premier lot ne subira aucun autre geste technique - 1 second lot sera anesthésié en vue d’être irradié avec le faisceau contrôle sur les tumeurs implantées en sous cutanées. La durée de l’anesthésie sera de 2 minutes par animal - 1 troisième lot sera irradié avec le faisceau d’intérêt sur les tumeurs implantées en sous cutanées. L’anesthésie durera entre 5 et 10 minutes.
Impact sur les animaux
Pour l’étude de la toxicité sur tissu sain, les animaux, ayant reçu une irradiation thoracique, développeront une phase d’inflammation pulmonaire(1 à 3 mois post-irradiation) qui évoluera après 4 ou 5 mois vers une fibrose pulmonaire en cas de forte toxicité radio-induite (dose de 13 et 15 Gy). Suite au développement de la fibrose, une perte de poids des animaux pourra être observée. Pour l’analyse de l’efficacité antitumorale, les animaux greffés avec des cellules tumorales par voie sous-cutanée au niveau de la patte développeront des tumeurs qui seront mesurées régulièrement. L’injection de cellules tumorales provoquera une douleur et gêne de courte durée. Les potentielles toxicités cutanées (dermites, ulcération, nécrose) à court terme induites par le traitement seront évaluées par une grille de score adaptée
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des modèles in vitro (i.e lignée de cellules en culture) existent et sont utilisés dans le cadre d’études préliminaires des effets radiobiologiques d’un faisceau d’irradiation. Des études préliminaires ont été réalisé avec certains de ces modèles au laboratoire et nos résultats préliminaires sont encourageants (lignée de cellules tumorales/modèle ex vivo de coupes d’organe mis en culture. Cependant, ces modèles restent simples et ne permettent pas de prendre en compte la complexité du développement des toxicités induites par la radiothérapie chez le patient, ce qui nécessite le recours à l’animal
Réduction
Plusieurs mesures ont été prises pour réduire le nombre d’animaux à utiliser tout au long du projet : 1-Des études pilotes ont été réalisées sur un autre faisceau d’irradiation (faisceau contrôle) au laboratoire afin de déterminer les doses optimales pour évaluer les effets radiobiologiques du nouveau faisceau. De la même manière, des études pilotes utilisant des tumeurs greffées sous la peau nous ont permis d’évaluer les temps optimaux d’irradiation post-greffe ainsi que les doses de traitements adaptées 2-Dans le cadre de l’étude des effets secondaires de la radiothérapie dans le poumon, le bras contrôle avec notre faisceau se base sur des données déjà acquises par le laboratoire ce qui nous permet de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés pour cette étude. 3-Du fait d’études pilotes antérieures, le nombre d’animaux par groupe est optimisé pour avoir une puissance statistique suffisante lors de la comparaison des différentes modalités de radiothérapie. 4-L’optimisation et l’utilisation d’un suivi du développement des complications pulmonaires par imagerie scanner permet de suivre les animaux tout en évitant de multiplier les prélèvements ainsi que le nombres d’animaux utilisés pour cette étude. Les tests statistiques adaptés seront utilisés pour étudier la « survie sans complication » des animaux dans le cadre de l’étude sur le tissu sain. Pour la partie tumorale, des tests seront réalisés pour l’étude de la survie avant qu’un point de limite éthique soit atteint.
Raffinement
Pour la procédure d’évaluation des effets secondaires de la radiothérapie, plusieurs critères seront pris en compte : 1-Le poids des animaux sera suivi de manière hebdomadaire dans la période de 1 à 4 mois post-irradiation (i.e. pendant la phase de pneumopathie). Ensuite, de 5 à 7 mois post-irradiation, le poids des animaux sera suivi de manière bi-hebdomadaire (en début et fin de semaine) afin de surveiller les potentielles pertes de poids. Les animaux pour lesquels le poids sera inférieur au poids limite de référence seront mis à mort pour éviter toutes souffrances. 2-Si des difficultés respiratoires et/ou un isolement sont observés, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. 3-Le suivi scanner sera également un point majeur de notre évaluation du développement de effets secondaires. Si un animal présente des signes de fibrose avancée sur les images scanner, l’animal sera mis à mort pour éviter toutes souffrances. Pour la procédure d’évaluation de la réponse antitumorale sur un modèle de tumeurs sous cutanée, plusieurs critères seront pris en compte : 1-La taille de la tumeur sera un élément important et déterminant pour assurer le bien-être de l’animal. Le poids des animaux et la taille de leurs tumeurs seront évalués de manière bi-hebdomadaire. 2-De potentielles lésions cutanées peuvent survenir dans la zone d’irradiation de la tumeur. Une grille de score spécifique mise en place lors d’études pilotes et antérieures permettront d’évaluer le grade de ces lésions et limiter les douleurs chez l’animal (mise en place de traitements antalgiques ou mise à mort de l’animal si stade trop avancé) Pour les deux procédures, une anesthésie générale ainsi qu’une contention physique sur un support adaptée sera réalisée au moment de l’irradiation pour éviter tout inconfort et douleurs des animaux. Aucune douleur n’est attendue au moment de l’irradiation dans ces conditions. Les animaux seront hébergés dans des conditions standards
Choix des espèces
La souris est le modèle classiquement utilisé dans les études de toxicité radio-induite car il présente plusieurs avantages : i) il s’agit d’un modèle préclinique pertinent pour la radiothérapie car les réponses moléculaires et cellulaires (e.g. fibrose radique) des tissus murins à l’irradiation sont comparables à celles observées chez l’Homme ii) la souris est un mammifère génétiquement proche de l’Homme iii) son usage en préclinique a permis de mettre au point un grand nombre de nouveaux traitements Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines à 10 semaines Les organes étudiés sont alors matures, limitant les potentiels biais expérimentaux induits par l’irradiation d’organes à des stades de maturation différents. De plus, les animaux adultes supportent également mieux l’anesthésie et l’irradiation.
Rôle et régulation de la thrombopoïèse pulmonaire lors d’une infection virale pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Une partie des souris est génétiquement modifiée pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2, ce qui les rend infectables par les variants humains du virus. 5 040 souris vont être utilisées, 4 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 240 opérées sous anesthésie sans réveil. Sept jours après inoculation, le porteur décrit chez ces souris une température corporelle tombée à 25 degrés et une perte de poids supérieure à 20 %, et prévoit par ailleurs des chirurgies pulmonaires de quatre à cinq heures, des interventions sur les os du crâne, jusqu'à cinq prélèvements de sang sous la mâchoire et des injections derrière l'œil. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et moelle osseuse, ce cumul de prélèvements sur un même animal étant présenté comme une mesure de réduction.
Objectifs
Les mégacaryocytes sont des cellules qui se développent dans la moelle osseuse et qui permettent la formation de plaquettes dans le sang, nécessaire notamment à la coagulation sanguine. Récemment, nous avons démontré que cette formation de plaquettes n’est pas restreinte à la moelle osseuse mais qu’elle peut aussi avoir lieu dans les poumons. Des études récentes et nos données préliminaires suggèrent que cette formation de plaquettes dans les poumons pourrait jouer un rôle clef lors d'une infection virale pulmonaire. Chez l’homme au cours des infections à Sars-CoV-2 une augmentation très importante de ces mégacaryocytes pulmonaires a été reportée chez les patients atteints de COVID-19 en comparaison à d’autres patients atteints d’autres causes de détresse respiratoire. Nous pensons que la formation de plaquettes au niveau des poumons augmente au cours des infections pulmonaires, et cette augmentation semble liée à une aggravation de la détresse respiratoire et à une inflammation aigüe. Les mécanismes y conduisant ne sont pas connus et ce sont donc ces mécanismes que nous proposons d’identifier en utilisant des modèles d’infections pulmonaires chez la souris et des techniques de microscopie intravitale. L’identification de ces mécanismes devrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques non seulement pour les infections pulmonaires comme la COVID-19 mais aussi pour d’autres pathologies inflammatoires pulmonaires comme l’asthme ou les fibroses pulmonaires où l'activation des plaquettes contribue au développement de la pathologie
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de : (i) déterminer l’implication bénéfique ou délétère de la production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales ; (ii) étudier la cinétique de production de plaquettes dans les poumons au cours des infections virales pulmonaires et de l’inflammation pulmonaire ; (iii) caractériser et identifier de nouveaux mécanismes de la biologie plaquettaire (production, modifications, rôles) ; (iv) identifier potentiellement des nouvelles cibles thérapeutiques dans les pathologies pulmonaires dans lesquelles les plaquettes sont impliquées.
Procédures
Dans ce projet, - Les souris sous anesthésie générale subiront une injection de virus. L’injection ne dépasse pas 1 minute. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront entre un et cinq prélèvement sanguin. Les prélèvements ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques jours plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie générale et locale subiront une injection de cellules ou de molécules puis une chirugie quelques heures ou minutes plus tard. Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une procédure de chirurgie pulmonaire sans réveil. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris sous anesthésie generale et locale subiront une injection de molécules puis une chirugie quelques heures ou quelques minutes plus tard. Les souris anesthésiées subiront une procédure de chirurgie sur les os du crane. Les injections ne dépassent pas 2 min, et la chirrugie dure 4h. - Les souris anesthésiées subiront une injection de virus, puis quelques jours plus tard une injection de cellules, et quelques heures après ils seront mis à mort par anesthésie. Les injections ne dépassent pas 2 min. - Les souris sous anesthésie generale subiront une injection de virus. Puis quelques jours plus tard une injection de cellules sous anesthésie generale et locale. Les injections ne dépassent pas 2 min.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous utiliserons un variant du SARS-CoV-2 adapté pour infecter les souris qui induit des pertes de poids inférieures à 10% sur toute la durée de l’infection ainsi qu’une faible baisse de la température corporelle
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront mises à mort pour des prélevements de tissus et de sang.
Remplacement
Notre projet a pour but de mieux comprendre la production de plaquettes sanguines au cours des infections virales pulmonaires. Afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire suffisamment proche de l’homme. Il est impossible de ne travailler sur des modèles in vitro strictement cellulaires car il n'est pas possible pour l'instant d'obtenir en dehors d'un organisme vivant la production de plaquettes pleinement fonctionnelles. En effet cette production est dépendante du flux sanguin et de nombreuses interactions cellulaires. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier, le plus adapté étant la souris.
Réduction
Des expériences préliminaires ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les analyses statistiques seront réalisées sur un logiciel d’analyse en combinant les résultats de n=4 expériences indépendantes avec 5 souris par lot (soit 20 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus lors de certaines étapes clés de notre projet, nous poursuivrons ou arrêterons certaines expériences. Après mise à mort de l’animal, des prélèvements seront réalisés, afin d’obtenir le plus d’informations possibles sans avoir à utiliser d’autres animaux. Nous prélèverons par exemple à la fois le sang, les poumons, la rate et la moelle osseuse, ce qui nous permettra de réaliser plusieurs tests à partir d'un seul animal.
Raffinement
Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. Les injections sont réalisées sous anesthésie générale. Pour la chirurgie qui est une procédure sans réveil nous utilisons aussi une anesthésie générale, combinés à des anesthésiques locaux et un analgésiant. La température corporelle et l’hydratation des animaux sont maintenues tout au long de la procédure grâce à une caisse chauffante et des injections régulières de solution saline. Un gel est appliqué sur les yeux afin de prévenir leur assèchement. Les souris infectées seront surveillées quotidiennement jusqu’à l’arrêt des procédures. La température, le poids, l’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront prises en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Pour notre projet visant à explorer la biologie des plaquettes sanguines dans les infections par des virus, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques ii) de l’utilisation de souris génétiquement modifiées déjà présentes dans l’équipe permettant de suivre les plaquettes et les mégacaryocytes, et iii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité et de la biologie plaquettaire chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. De plus, notre projet est basé sur l’étude de la dynamique de production de plaquettes par une technique de microscopie intravitale qui n’est applicable que chez la souris. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes majoritairement âgées entre 8 et 12 semaines, mais également certaines de plus de 40 semaines afin d’étudier notre modèle à différents âges chez la souris. A ces stades de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.
modèle porcin de syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) avec lésion alvéolaire épithéliale directe par instillation d’acide chlorhydrique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Transportés le matin même de l'expérience, sédatés dès leur arrivée, pesés puis installés sur la table d'opération, 30 porcelets de deux mois sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Un cathéter est placé dans l'artère fémorale droite, une voie centrale dans la veine jugulaire, puis 18 d'entre eux reçoivent une instillation d'acide chlorhydrique dans les poumons pour provoquer un syndrome de détresse respiratoire aiguë. Quatre heures de suivi sous anesthésie générale s'ensuivent, avant une injection létale de thiopental et le prélèvement des tissus pulmonaires. Le porteur retient le porcelet parce que la taille de ses poumons approche celle des poumons humains, ce qui permet un monitorage ventilatoire aussi précis que chez l'être humain.
Objectifs
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une affection fréquente en réanimation et responsable d’une mortalité élevée. Il se caractérise par des lésions alvéolaires et une diminution sévère de l'oxygénation dans le sang. Actuellement, seule une approche protectrice de la ventilation mécaniques a permis de réduire la mortalité associée au SDRA au cours des dernières années. Le récepteur RAGE ( Receptor for Advanced Glycation End-products) est un récepteur exprimé à la surface de nos cellules, largement retrouvé dans les cellules alvéolaires. Son activation entraine divers mécanismes de régulation intra cellulaire : mort cellulaire, inflammation ou prolifération. Nous avons participé à démontrer que RAGE joue un rôle dans la pathogénie du SDRA. Une stratégie d’inhibition de RAGE, par l’administration d’antagoniste tel que RAP (RAGE antagonist Peptide) serait une cible thérapeutique prometteuse au cours du SDRA. D’autre part, notre équipe a pu mettre en évidence les effets bénéfiques d’une sédation inhalée par sévoflurane chez des patients présentant un SDRA à travers un essai monocentrique, contrôlé et randomisé. En effet, le sévoflurane améliorait l’oxygénation, diminuerait les niveaux alvéolaires et plasmatiques de sRAGE, forme soluble de RAGE, par rapport à une sédation par agent intraveineux. Les effets de cet halogéné sur l’inflammation, la résorption de l’œdème pulmonaire ont été, par la suite, mis en évidence dans un modèle murin de SDRA. Nous avons, à travers ce projet, la volonté de conjuguer ces résultats obtenus chez la souris à un modèle expérimental de SDRA chez un plus gros animal, le cochon. En effet, le recours au modèle porcin, se rapprochant plus de la pratique clinique, nous semble nécessaire en termes de mécanique et de stratégie ventilatoire afin de mieux appréhender les effets d'une modulation de RAGE. L'utilisation du modèle porcin permettra aussi de confirmer les résultats obtenus chez le petit rongeur sur les effets bénéfiques d'une modulation de ce récepteur, au cours du SDRA expérimental et de confirmer les effets du sévoflurane inhalé dans ce modèle animal.
Bénéfices attendus
L'instillation d'acide chlorhydrique reproduit dans un modèle porcin, les symptômes majeurs retrouvés dans le SDRA humain: survenue aiguë de lésions alvéolaires menant à une diminution sévère de l'oxygénation dans le sang avec diminution de la clairance liquidienne alvéolaire; altération de la perméabilité alvéolo-capillaire et réponse inflammatoire. La clairance alvéolaire étant la capacité de réabsorption de fluides au sein des alvéoles. L'inhibition de la voie RAGE par l'injection intraveineuse de son antagoniste RAP permettra de mieux décrire l'implication de RAGE au cours du SDRA. Une stratégie visant à accélérer la réparation alvéolaire; la clairance alvéolaire pourrait être bénéfique au travers de l'utilisation de sévoflurane inhalé.
Procédures
L'expérimentation durera pour chaque cochon, 6h découpées comme tel: 1h pour la préparation préopératoire ( prémédication; pesée de l'animal); la ventilation et la préparation chirurgicale de l'animal. 5h pour l'instillation d'HCl; les 4 heures de suivi sous anesthésie générale et l'euthanasie de l'animal. Sous anesthésie générale, l'ensemble des animaux subiront une procédure chirurgicale (n=30). Un abord chirurgical fémoral droit permettra de placer un cathéter dans l’artère fémorale droite pour une surveillance en continu de la pression artérielle et du débit cardiaque, et prélèvements sanguins. De plus, une voie veineuse centrale sera mise en place dans la veine jugulaire interne droite pour l'administration des drogues d’anesthésie, des fluides de remplissage vasculaire et de la mesure de la pression veineuse centrale. Selon les groupes à l'étude, 18 animaux subiront une instillation d'HCl.
Impact sur les animaux
Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA)créé par l'intillation d'acide chlorhydrique va engendrer une détresse respiratoire aiguë chez l'animal dans les groupes "HCl" mais cette phase est résolutive grâce au maintien des animaux sous sédation et avec un apport en oxygène tout le long de l'expérimentation.
Devenir
L'ensemble des animaux sera euthanasié par injection intraveineuse de thiopental à une dose de 60 mg/kg afin de réaliser un prélèvement post-mortem de tissus pulmonaires.
Remplacement
Des méthodes alternatives sont disponibles au sein de notre équipe. L'axe de recherche translationnelle de notre équipe sur les implications de RAGE au cours du SDRA, comporte des investigations cliniques et des expérimentations sur modèles cellulaires. Pourtant, seule l'utilisation de modèles animaux nous permet d'envisager une vrai translation entre les données obtenues in vitro et les données cliniques.
Réduction
En accord avec les principes éthiques des 3Rs, il a été convenu de considérer un nombre minimal d’animaux par groupe pour réduire le nombre total d’animaux utilisés mais permettant d'établir la significativité statistique. Nous utiliserons aussi bien des mâles que des femelles pour nos expériences. En prenant en compte ces considérations, le nombre d'animaux nécessaires à ce projet sera de 30 porcelets.
Raffinement
Les animaux ne seront pas hébergés par l’établissement utilisateur mais transportés le jour-même de l’expérimentation dans un véhicule climatisé et adapté au transport d’animaux de rente. Chaque animal aura un accès à volonté à l’eau durant le transport. Les animaux seront restreints en nourriture depuis la veille de l’expérimentation afin d’éviter tout risque de vomissement et par conséquent d’étouffement pendant l’anesthésie générale. Les porcelets seront sédatés dès leur arrivée au sein de l'établissement utilisateur afin de les tranquilliser pour faciliter la pesée et leur installation sur la table d’opération. Les “points limites” (ou critères d’arrêt de l’expérimentation en cours) choisis sont: - Hypothermie si >ou = à 34°Cet signe de détresse respiratoire chez le porc sans support ventilatoire et sans anesthésie. Si au moins un des points limites est atteint, les animaux seront sédatés par un coktail d'anesthésiant.
Choix des espèces
Le modèle porcin permet de réaliser des études morphologiques de la cinétique des lésions induites au cours du SDRA expérimental et de leur résolution. La taille des poumons porcins est proche de celle des poumons humains, ce qui rend possible l’application de stratégie ventilatoires pouvant se rapprocher le plus possible de la clinique et un monitorage ventilatoire (compliance, élastance…) aussi fiable et précis que chez l’Homme. Des porcelets blancs de race Landrace de 10 à 15kg et âgés de 2 mois environ seront utilisés.
Relation entre les dysfonctionnements sérotoninergiques et les troubles respiratoires associés à l’épilepsie dans un modèle du syndrome de Dravet chez la souris (EU 2/2)
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Exposées chaque jour pendant dix jours à un gaz convulsivant, le flurothyl, 418 souris porteuses de la mutation du syndrome de Dravet vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent quarante d'entre elles subissent une chirurgie de quatre-vingt-dix minutes pour l'implantation d'électrodes cérébrales, d'un capteur nasal et d'électrodes musculaires, puis des enregistrements de six heures par jour un jour sur deux pendant quatre semaines. Le porteur écrit qu'en dehors de perturbations transitoires du comportement, "aucun autre effet nuisible n'a été rapporté", tout en précisant que chez 30 % des souris la crise se termine par un arrêt respiratoire fatal. Chaque animal subit de trois à quarante-cinq interventions entre sa naissance et sa mise à mort, au terme de laquelle le cerveau est prélevé.
Objectifs
La mort soudaine inattendue en épilepsie (SUDEP) est la cause majeure de mortalité précoce chez les patients souffrant d’un syndrome de Dravet (SD). La SUDEP est décrite comme faisant suite à la survenue d’une crise épileptique entrainant un arrêt respiratoire fatal. L’unique stratégie qui est proposée de nos jours pour prévenir la SUDEP consiste à contrôler la survenue des crises épileptiques chez le patient. Cette stratégie comporte certaines limites dès lors que l’on considère que le SD est une forme d’épilepsie qui répond mal aux médicaments anti-crises actuellement disponibles. Pour prévenir la SUDEP, il est essentiel de trouver une autre alternative thérapeutique en identifiant de nouveaux candidats pharmacologiques à cibler chez le patient souffrant de SD. La sérotonine cérébrale joue un rôle majeur dans la survenue des crises et dans le contrôle de la respiration. L’hypothèse sur laquelle repose ce projet est que l’arrêt respiratoire survenant à la suite d’une crise et à l’origine des SUDEP dans le SD est favorisé par l’installation progressive d’une vulnérabilité de la fonction respiratoire en lien avec la répétition des crises d’épilepsie. Les objectifs de ce projet sont ainsi : (1) de caractériser la chronologie d’installation de la vulnérabilité respiratoire dans le SD, (2) d’identifier le(s) marqueur(s) sérotoninergique(s) associés à la vulnérabilité respiratoire et au risque de SUDEP, (3) et de tester un candidat pharmacologique en lien avec la cible sérotoninergique identifiée pour prévenir cette vulnérabilité respiratoire. Pour répondre à ces objectifs, nous aurons recours à un modèle expérimental chez la souris R1648H, qui porte la mutation du gène SCN1A, à l’origine du SD chez l’humain.
Bénéfices attendus
Aujourd’hui, nous ne savons pas comment la répétition des crises chez les jeunes patients souffrant de SD peut aggraver la vulnérabilité cardio-respiratoire qui conduit à la SUDEP. La souris R1648H est un modèle qui mime la symptomatologie du SD décrite chez l’humain et l’utilisation de ce modèle dans ce projet devrait fournir des éléments précieux qui permettront une meilleure prise en charge des patients SD. En ciblant le système sérotoninergique qui est fortement impliqué dans le contrôle de la respiration et dans la genèse des crises, nous espérons mettre en évidence des éléments de ce système qui pourraient être (1) utilisés comme des marqueurs permettant l’identification des patients SD à risque de SUDEP, et (2) ciblés par des agents pharmacologiques visant à prévenir l’installation de la vulnérabilité ventilatoire et le décès qui lui est associé.
Procédures
Le génotypage et le tatouage de l’ensemble des souris de la portée sera effectué à P7 (durée
Impact sur les animaux
En dehors des perturbations transitoires sur le comportement de la souris lors de la survenue de la crise par le flurothyl, aucun autre effet nuisible n’a été rapporté chez les animaux qui seront utilisés dans ce projet. Comme décrit dans l’annexe 3, la sévérité de la crise durant l’exposition au flurothyl est progressive et s’intensifie au cours du protocole d’ICF. Cela comprend 7 stades avec le stade 1 décrit comme celui qui est de plus faible sévérité comprenant des clonies de la face et des membres postérieurs ou antérieurs. Les caractéristiques des crises de stades plus sévères se traduisent par la présence de clonies plus intenses, des rebonds et/ou course de l’animal dans la cage et la présence d’une phase de tonus musculaire. A noter que la durée de la crise des stades 1-6 est de 15 à 60 sec ; toutefois, chez 30% des souris R1648H, la crise conduira dans les secondes qui suivent à un arrêt respiratoire fatal défini comme le stade 7.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort et le cerveau sera prélevé pour des investigations ex-vivo.
Remplacement
Le caractère inattendu de la SUDEP chez le patient SD rend les expériences prévues dans ce projet non envisageables chez le sujet humain. L’étude des rythmes cérébraux et cardio-respiratoires au cours ou en dehors d’une crise épileptique nécessitent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur des modèles in vitro. La souris R1648H modèle du SD est aujourd’hui la seule espèce qui présente une physiopathologie similaire à celle observée chez l’humain.
Réduction
Pour mener ce projet, nous aurons besoin d’utiliser 418 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au maximum sans compromettre toutefois les objectifs scientifiques du projet, en nous basant sur les données bibliographiques antérieures et des outils statistiques.
Raffinement
Les conditions de stabulation sont conformes à la réglementation et prennent compte du bien-être animal. Le poids des animaux sera suivi hebdomadairement, et les animaux seront soumis à une surveillance attentive à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être (annexe 1), pour limiter au maximum stress et douleur, et apporter des soins adaptés, le cas échéant. Les animaux qui auront été isolés pour leur confort seront manipulés quotidiennement pendant 5 minutes. Pour évaluer la respiration de façon non-invasive, nous utiliserons la pléthysmographie à corps entier qui permet d’obtenir des enregistrements chez un animal vigile et libre de se mouvoir. Le temps d’enregistrement est limité à son minimum durant la période inter-ictale avec 40 min par animal. Les enregistrements en imagerie cérébrale seront effectués sur un animal anesthésié pour réduire le stress de la contention. Toutes les mesures seront prises pour limiter la souffrance et la douleur. L’utilisation d’analgésiques par voie i.p. sera systématique avant la chirurgie (buprénorphine) puis quotidiennement et durant les 3 jours qui suivent le jour de l’implantation chirurgicale (Carprofène). L’expérience sera stoppée si les points limites définis dans la grille de score sont atteints. A la fin de chaque procédure expérimentale, les souris seront mises à mort.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser trois aspects du SD : 1) la pathologie génétique sous-jacente (mutations SCN1A), 2) l'impact progressif de la répétition des crises observées chez les patients, et 3) un risque modéré de décès (environ 20-40%) qui permettrait facilement de dichotomiser un groupe de survivants et un groupe SUDEP. Le modèle que nous utiliserons sera la souche de souris Scn1aRH+ (R1648H) qui répond parfaitement à ces objectifs. Les animaux seront utilisés entre 7 jours et 72 jours. A l’âge de 7 jours, le génotypage et le tatouage des animaux sera réalisé durant un temps inférieur à 5min puis les souriceaux seront remis avec leur mère. Les crises d’épilepsie se manifestant dès le plus jeune âge dans le SD, nous avons choisi un modèle expérimental de SD permettant de contrôler le déclenchement des crises d’épilepsie aussi bien à 21 jours post-natal (sevrage), qu’à un stade plus avancé (P60).
Rôle de l’épithélium alvéolaire dans le maintien de l’immunité entraînée pulmonaire, chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
La moitié des souris reçoit une irradiation puis une greffe de moelle osseuse par injection rétro-orbitaire sous anesthésie, toutes subissent une administration intratrachéale, et une partie reçoit des cellules cancéreuses par voie intraveineuse alors qu'elles sont éveillées. 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le RNT qualifie les métastases pulmonaires de modèle "sans souffrance jusqu'à J21", jour de la mise à mort. Sur le remplacement, l'équipe affirme que les paramètres étudiés ne peuvent pas être reproduits in vitro et que le recours aux souris est "indispensable" pour saisir l'immunité entraînée dans sa globalité.
Objectifs
Nos travaux antérieurs montrent clairement que suite à une pneumonie aiguë, le poumon des souris ne revenait pas à l’état initial mais avait développé une cicatrice immunitaire. Cette cicatrice semble jouer un rôle majeur contre des infections secondaires et contre d’autres pathologies telles que le cancer. Les cellules immunitaires naviguent dans le poumon au sein de structures cellulaires particulières telles que les alvéoles pulmonaires et les bronchioles. Les objectifs de ce projet sont de caractériser : 1- l’impact de la cicatrice immunitaire pulmonaire sur les cellules de l’alvéole et 2- le rôle de ces cellules de l’alvéole dans la mise en place et le maintien de cette cicatrice immunitaire. L’utilisation des procédures mentionnées dans ce document nous permettra de répondre clairement à ces questions
Bénéfices attendus
Notre projet nous permettra d’évaluer l’impact de la cicatrice immunitaire sur les fonctions des cellules de l’alvéole et d’évaluer le rôle de cette paroi dans la mise en place de cette cicatrice en vue d’une potentielle valorisation et mise en place de traitement adapté pour lutter contre les infections bactériennes et le cancer.
Procédures
La moitié des animaux seront soumis à une irradiation (de quelques dizaines de secondes), suivie d’une reconstitution en moëlle osseuse par voie (IV) intraveineuse rétro-orbitaire sous anesthésie générale. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste. Tous les animaux de ce projet sont soumis à une administration intra-trachéale (IT) sous anesthésie générale. Une partie des animaux sont soumis à une administration de cellules cancéreuses par voie IV caudale en vigile. En fonction de l’état général des souris (grille de score d’évaluation des points limites) et si nécessaire, une ou plusieurs injections sous-cutanée (SC) de morphinique pourraient être réalisées sur animaux vigiles.. Tous les gestes IV, SC et IT sont très rapides et ne durent au maximum que quelques minutes.
Impact sur les animaux
Modèles d’infection bactérienne : Les modèles d’inflammation respiratoires aigues sont des modèles avec une récupération de l’état général des souris à partir de J2. Suite à l’infection, une perte de poids transitoire (2-3jours) et modérée (< 10%) est observée, sans perte de motricité. Après J2, les souris reprennent une courbe de poids normale. Les modèles cancéreux de métastases pulmonaires sont sans souffrance jusqu’à J21, temps d’euthanasie pour analyse. Le modèle d’irradiation avec recomplémentation de moëlle osseuse est un modèle expérimental modéré sans développement de pathologies. Les souris seront traitées avec des antibiotiques dans l’eau de boisson. Ce traitement est nécessaire pour compenser l’immunodéficience profonde mais transitoire résultant de la forte dose d’irradiation utilisée pour éliminer les cellules souches hématopoïétiques. Le traitement commencera le jour précedant l’irradiation, pour accomoder les souris au goût des antibiotiques, et se poursuivra pendant 2 semaines après l’irradiation.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d’organes et analyse des modifications immunologiques.
Remplacement
Les paramètres étudiés dans ce travail ne peuvent être aujourd’hui remplacés par des procédures in vitro et le recours à l’utilisation de modèles animaux est indipensable. Les muliples intéractions entre types cellulaires différents et la complexité de la mise en place de l’immunité entraînée nous oblige à utiliser les modèles animaux pour appréhender ces phénomènes dans leur globalité.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum (n=5) afin de permettre une analyse statistique fiable des résultats. Une valeur de p
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe sociaux harmonieux (n≤5) dans des cages enrichies avec des frisottis, de taille normalisée. Les animaux ont un accès libre à l’eau et à la nourriture. Sauf mention contraire, l’état général des souris est évalué quotidiennement. Un tableau d’évaluation des points limites a été mis en place. Les procédures n’entrainent pas de douleur résiduelle. En fonction des scores obtenus, une ou plusieurs injections de morphiniques seront réalisées. Afin de limiter la douleur consécutive à l’administration intratrachéale, la sonde de gavage de 24G est préalablement enduite d’analgésiques afin d’anesthésier localement la trachée. Afin d’éviter le stress et la potentielle gêne consécutive à l’injection intra veineuse en rétro orbitale, nous réaliserons une injection sous cutanée de morphinique juste avant le geste.
Choix des espèces
Les modèles murins d’infections bactériennes ainsi que les modèles tumoraux sont des modèles fiables et reproductibles. Les résultats issus de ces modèles peuvent être transposés à l’homme avec une très bonne correspondance des résultats trouvés à la fois en médecine humaine et en expérimentation animale pour les datas déjà générées dans ce projet de recherche. 7-14 semaines de vie. A ce stade le système immunitaire est mature
Evaluation d’un dispositif médical d’ablation par micro-ondes pour le traitement de tumeurs pulmonaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles respiratoires
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Soumis à une bronchoscopie de quatre à cinq heures sous anesthésie générale au cours de laquelle une zone de leur poumon est brûlée par micro-ondes, 25 cochons de 40 à 70 kg sont tués à l'issue pour analyse histologique, 17 d'entre eux sans reprise de conscience. Le porteur annonce comme complications possibles des saignements, une défaillance respiratoire, un pneumothorax, une pneumonie ou une pleurésie. L'objet du projet consiste à vérifier la performance et la sécurité d'un dispositif commercial d'ablation thermique avant son emploi sur des patients. Le porteur revendique l'intérêt de l'approche sans réveil parce qu'elle permet de multiplier les ablations sur peu d'individus, et invoque les attentes des autorités sanitaires pour écarter les essais sur tissus.
Objectifs
Le cancer du poumon est le 3ème cancer le plus fréquent et la 1ère cause de décès par cancer en France. Entre 2010 et 2023, si l'incidence de ce cancer diminue légèrement chez l’homme (-0,5 % par an), elle progresse fortement chez la femme (+4,3 % par an). Le taux de survie nette à 5 ans augmente mais reste mauvais, en effet au niveau mondial le nombre de décès est estimé en 2020 à 1 796 144 tous sexes et âges compris. Il existe différentes approches thérapeutiques face à ce cancer, incluant entre autres des approches chirurgicales permettant la destruction (l’ablation) des tumeurs en leur appliquant une source d’énergie ciblée, nécrosante. L’objectif du projet est d’évaluer la performance et la sécurité d’un nouveau dispositif médical, qui vise à traiter les tumeurs du poumon périphérique par ablation thermique, avant son application chez le patient.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à vérifier que ce dispositif d’ablation thermique peut être utilisé en sécurité pour traiter efficacement des zones pulmonaires localisées, en alternative aux approches qui nécessitent une thoracotomie, et ainsi apporter une solution thérapeutique mini-invasive supplémentaire contre le cancer du poumon.
Procédures
Un premier groupe d'animaux sera soumis à un examen d'imagerie scanner (rayons X) sous anesthésie d'une durée de 30 minutes, puis, 3 jours après, une chirurgie pulmonaire mini-invasive (accès par voie endobronchique) sera réalisée sous anesthésie générale, d'une durée de 4 à 5 heures. Un deuxième groupe sera soumis au même examen d'imagerie sous anesthésie de 30 minutes, puis, 3 jours après, à la chirurgie pulmonaire mini-invasive sous anesthésie générale de 2 à 3 heures, puis après 4 semaines, à un contrôle d'imagerie sous anesthésie de 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés à l’anesthésie (nausée, désorientation, hypothermie, irritation trachéale) et à l’intervention chirurgicale au niveau des voies respiratoires dont les complications peuvent être des saignements, une défaillance respiratoire (obstruction des voies bronchiques, désaturation en oxygène, pneumothorax) ou l’infection (pneumonie, pleurésie).
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de réaliser des analyses histologiques des organes traités.
Remplacement
Cette étude vise à évaluer la capacité du dispositif médical à effectuer une ablation tissulaire (coagulation) dans les poumons. De nombreux tests sur tissus synthétiques et organiques ont déjà été réalisés. Mais les études ex-vivo n'intègrent pas les effets du flux sanguin qui ont un impact considérable sur le transfert de chaleur et, par conséquent, sur l'étendue des dommages tissulaires induits par l’ablation thermique. En outre, les propriétés diélectriques des tissus peuvent également varier entre l'in-vivo et l'ex-vivo (en raison de la déshydratation), ce qui crée un environnement d'ablation inexact pour tester le dispositif. Selon les considérations générales des autorités sanitaires, les études sur les animaux sont nécessaires pour fournir des preuves initiales de la sécurité des dispositifs, de leur performance potentielle lorsqu'ils sont utilisés dans un système vivant, et de la réponse biologique qu'un système vivant peut avoir à l'égard du dispositif.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit eu mieux pour obtenir des résultats statistiquement significatifs et conclure sur la fiabilité et l’efficacité du dispositif. L’approche aigue permet de réaliser un grand nombre d’ablations et de démontrer la performance du dispositif : les animaux n’étant pas réveillés, il est possible d’obtenir de nombreuses données sur un faible effectif animal. L’approche chronique se limitera à l’évaluation de la sécurité sur la base d’une à 2 ablations par animal. Des tests de faisabilité sur quelques individus seront réalisés en amont, avant d’engager des lots d’animaux dans les tests règlementaires.
Raffinement
Les porcs sont hébergés en groupe social, dans des box enrichis de jouets, avec une période d’acclimatation avant l’opération. Les paramètres environnementaux sont contrôlés, des récompenses sont distribués pour familiariser les animaux aux manipulations (prise de température, auscultation, palpation). Toutes les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale, avec couverture antalgique et monitoring des fonctions vitales. Un expert pneumologue réalise les gestes spécifiques liés à la bronchoscopie, au déploiement et à l’utilisation du dispositif. Les animaux en survie sont étroitement surveillés jusqu’à leur réveil et durant les jours suivant l’intervention. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.
Choix des espèces
Des porcs charcutiers, mâles ou femelles de 4 à 6 mois sont retenus pour ce projet. A cet âge ils pèsent entre 40 et 70 Kg et leur anatomie pulmonaire est comparable à celle de l’homme. Cela permet de réaliser une bronchoscopie dans les mêmes conditions que chez le patient.
Evaluation de stratégies de prévention et de traitement de l’infection par SARS-CoV-2 chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Pour tester vaccins, anticorps et antiviraux contre le SARS-CoV-2, 5 660 souris porteuses du récepteur ACE2 humain sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. La majorité des études recourt au modèle dit sévère, dans lequel l'infection provoque une maladie mortelle, une perte de poids allant jusqu'à 30 % et une survie moyenne de cinq jours. Les souris reçoivent jusqu'à cinq inoculations et trois prélèvements sanguins, certaines subissant une chirurgie ou une mesure de fonction pulmonaire sans réveil. Le porteur présente ce modèle létal comme une "opportunité unique", faute d'équivalent chez d'autres espèces.
Objectifs
Depuis la fin de l'année 2019, la pandémie de COVID-19 s'est propagée dans le monde entier, causant plus de six millions de décès et affectant plusieurs centaines de millions de personnes. Cette maladie, causée par la transmission du virus SARS-CoV-2, se manifeste par différents symptômes. Les formes légères se caractérisent principalement par de la fièvre, de la toux, de la fatigue, des pertes de goût et d'odorat. Les formes les plus graves sont associées à un syndrome de détresse respiratoire aiguë, et une défaillance de plusieurs organes de très mauvais pronostic. Des recherches intensives ont permis des progrès importants dans la compréhension des mécanismes sous-tendant les manifestations cliniques. Cependant, il n’existe toujours pas de traitement totalement efficace contre la COVID-19. Le récepteur ACE2, nécessaire à l’entrée du virus SARS-CoV‑2 dans les cellules de l’hôte, est une protéine clé dans les mécanismes à l’origine de la maladie. Il est. Parmi les différents modèles d’étude précliniques utilisés dans la recherche de vaccins et molécules thérapeutiques, les modèles de souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain sont sensibles à l’infection par le virus SARS-CoV-2, et permettent une analyse expérimentale de la COVID-19. Certains de ces modèles dits ‘sévères’ développent après infection une forme létale de la maladie causée notamment par une réponse hyper-inflammatoire hors de contrôle. D’autres, dits ‘modérés’, développent une forme légère de la maladie. L’objectif de ce projet vise à la mise en place de modèles souris d’infection (sévère et modérée) au SARS-Cov-2 pour permettre d’étudier l’infection d’une part, et d’évaluer d’autre part une large gamme de stratégies de prévention et de traitements potentiels (vaccins, anticorps, anti-viraux, anti-inflammatoires) avant passage en phase clinique chez l’humain. Ce modèle, génétiquement modifié pour exprimer le récepteur ACE2 humain, permettra le suivi des paramètres immunologiques de l’infection, y compris avec des variants d’intérêt récents du virus. Du fait de sa petite taille de l’accessibilité facilitée à des modèles génétiquement modifiés, le modèle murin permet d’évaluer une large gamme de candidats médicaments pour traiter la cause (l’infection par le virus SARS-CoV-2) et les symptômes de la maladie induite après infection. Il permet donc en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre.
Bénéfices attendus
Dans le contexte actuel de la pandémie COVID-19, il est urgent de pouvoir procéder à l’évaluation de traitements contre le virus lui-même ou contre les atteintes conséquentes à l’infection (respiratoires, vasculaires, neurologiques, cardiaques, inflammatoires). En permettant d’accroitre la capacité d’accès à plusieurs modèles pertinents de la maladie induite par l’infection au SARS-CoV-2, ce projet permettra d’augmenter significativement les options d’évaluation de nouvelles stratégies de traitement variées et adaptées à des situations cliniques (modérées et sévères) diverses. Dans le cadre de ce projet, nous mèneront à bien les campagne d’évaluation de composés candidats, avec l’objectif de permettre l’identification rapide de nouveaux produits efficaces contre SARS-CoV-2. A plus long terme, et ce, dans le cadre du projet collaboratif entre les différents partenaires du projet, de nouvelles approches technologiques en imagerie seront établies, permettant d’accroitre nos connaissances sur la réponse immunitaire mise en œuvre chez la souris dans le cadre d’infections causées par des pathogènes aéroportés.
Procédures
Les animaux de chaque étude seront soumis à plusieurs inoculations de composés tests, d’inoculation (au maximum 5 injections durée des interventions inférieur à 2min par animal). De plus, des prélèvements sanguins pourront être effectués sur les animaux (au maximum 3 prélèvements; durée des interventions inférieur à 2min par animal). Des procédures chirurgicales pourront être effectuées sous anesthésie, d’une durée de 15 minutes maximum par animal avant euthanasie terminale. Des expériences permettant de mesurer la fonction pulmonaire seront également effectuées sous anesthésie (environ 10 minutes par animal, c'est une procédure sans réveil, effectuée sur une fraction minime des animaux).
Impact sur les animaux
Deux types de modèles murins de l’infection au SARS-CoV-2 (sévère et modéré) seront établis. La grande majorité des études fera appel à un modèle d’infection sévère. Dans les modèles sévères, l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie létale (aboutissant à la mort) qui s’accompagne d’une perte d’activité et de poids (jusqu’à 30%), avec une survie moyenne de 5 jours. Dans les modèle modérés (moins bien décris dans la littérature scientifique), l’infection au SARS-CoV-2 induit une pathologie limitée qui se résout d’elle-même en 1-2 semaines, sans signe clinique macroscopique particulier chez les jeunes animaux. Une perte de poids transitoire (de l’ordre de 10% à 3 jours post-infection) a été rapportée chez les animaux plus âgés (30 semaines). De plus, des effets indésirables peuvent être observés suite à des traitements (inflammation ou nécrose au site d’inoculation, intolérance et toxicité des traitements).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, afin de procéder à la collecte d’échantillons biologiques d’intérêt (notamment des tissues des voies aériennes).
Remplacement
L’utilisation des modèles de souris COVID-19, organismes vivant complexes à même de reproduire différents aspects de la maladie humaine, est indispensable pour faire progresser le programme d’évaluation de candidats thérapeutiques dans un contexte où la balance bénéfice/risque de nombreuses molécules peut se révéler négative in vivo malgré des résultats prometteurs obtenus in vitro. Le projet portant sur l’étude de la réponse immunitaire de l’organisme et l’évaluation de traitements, il est impossible de remplacer l’animal par un modèle ne représentant que partiellement un organisme. L’utilisation de ces modèles intervient en seconde ligne après l’évaluation des candidats médicaments in vitro dans plusieurs systèmes expérimentaux (biochimie, culture de lignées cellulaires, avec utilisation de plusieurs variants d’intérêt du SARS-CoV-2). En l’absence d’une efficacité auparavant démontrée in vitro, les candidats médicaments ne seront pas testés in vivo. La sélection préalable des candidats in vitro permet de réduire drastiquement le nombre de produits à tester in vivo.
Réduction
En nous basant sur des études antérieures sur le modèle hamster COVID d’une part, et sur les études effectuées sur un modèle murin sévère d’infection d’autre part, nous avons établi des effectifs de lots de 15 animaux pour pouvoir observer des différences statistiques entre groupes. Dans chaque lot, une fraction des animaux sera utilisée pour évaluer la charge virale pulmonaire et des paramètres de réponse immunitaire, et une autre fraction sera utilisé pour évaluer la survie à long terme (2 semaines) prodiguée par le traitement en cours d’évaluation. Les comparaisons des données des différents groupes d’animaux seront réalisées au travers d’analyses statistiques adéquates.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera réalisé dans des portoirs ventilés. Suivant nos observations, nous pourrons augmenter l’enrichissement des cages (deux cylindres au lieu d’un) ou diminuer le nombre d’animaux par cage (tout en évitant les individus seuls). . Un suivi clinique quotidien (a minima sur les 7 premiers jours de l’infection) des animaux avec pesée & évaluation des paramètres cliniques permet de s’assurer de l’évolution des signes cliniques de l’infection. Une grille de score clinique sera mise en œuvre, en nous basant sur les observations et pratiques déjà établies par d’autres collaborateurs académiques. Les critères suivis incluent l’apparence physique, la perte de poids, la mobilité et le comportement et permettent de déterminer un score clinique non dommageable, léger, modéré ou sévère. Une euthanasie préventive sera effectuée pour éviter des souffrances inutiles si les animaux présentent une forte perte poids ou un score clinique sévère. En cas de perte de poids intermédiaire, la nourriture et de l’eau gélifiée seront disposés en fond de cage ainsi qu’une réhydratation par injection sous-cutanée quotidienne. Prise en charge analgésique et anesthésique sur les gestes techniques le nécessitant.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées pour l’expression du récepteur ACE2 humain permettent d’accéder à une gamme de modèles expérimentaux reproduisant une pathologie soit sévère, soit modérée, après infection au SARS-CoV-2. Elles présentent l’avantage de pouvoir être explorées expérimentalement grâce à de très nombreux outils de biologie cellulaire et moléculaire, ce qui n’est pas le cas du modèle hamster syrien doré. Du fait de sa petite taille, et de l’accessibilité facilitée via des éleveurs agréés, le modèle permet, en première intention, d’éviter le recours à des modèles plus complexes à mettre en œuvre, comme les primates non-humains. Il est à noter que les modèles chez lesquels une pathologie sévère est obtenue n’ont pas d’équivalent dans d’autres espèces animales, et représentent donc une opportunité unique pour étudier une pathologie de type COVID. Les animaux utilisés pour ce projet seront âgés de 8 à 12 semaines (stade adulte), comme décrit jusqu’à maintenant dans la littérature scientifique disponible sur le sujet. Dans certains cas, il pourra être envisagé d’utiliser des animaux plus jeunes ou plus âgés, pour potentiellement reproduire des aspects de la maladie spécifiquement observés chez des individus humains jeunes ou âgés, respectivement.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Production de routine
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 25000
300 000 rongeurs vont être utilisés, 275 000 souris et 25 000 rats, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et jusqu'à quatre prélèvements sanguins par jour, en plus du tatouage d'identification, et les lignées entretenues peuvent porter un phénotype dommageable dont le porteur admet ne pas toujours connaître l'impact avant caractérisation. À l'issue, les animaux sont soit expédiés, soit tués, le porteur précisant qu'ils "appartiennent au scientifique" et ne peuvent être replacés. L'objet du projet est de fournir des rongeurs génétiquement modifiés à des laboratoires, activité présentée comme un bénéfice en soi puisqu'elle améliore la "qualité génétique, sanitaire et zootechnique" des animaux livrés.
Objectifs
Ce projet a pour objectif la caractérisation et/ou l’élevage de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des traits physiologiques spécifiques, et parfois pathologiques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes ou encore la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent, ou de queue) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée transgénique, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie de taille réduite peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Enfin, certaines lignées transgéniques sont induites par une hormone. Pour induire cette mutation d’intérêt, une injection de l’hormone pourra également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 300 000 animaux (ajout de 10% en prévision de la hausse d’activité) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux transgéniques (avec un statut génétique et sanitaire connu) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement altérées et une standardisation et raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production et de la qualité génétique, sanitaire et zootechnique des animaux génétiquement altérés à fournir aux scientifiques pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute, à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute. Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront être de phénotype dommageable.
Impact sur les animaux
Expression d’un phénotype dommageable et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques ou stress exprimé pendant l’évaluation Bien Etre Animal. Douleur et stress associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum, oreille ou queue) en plus d’une identification. Douleur et stress associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress et perte de poids dûs aux contentions. Douleur, stress et perte de poids dûs à l'injection du ligand.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit expédiés, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet (par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction), ou d’éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels).
Raffinement
Les observations par le personnel technique permettent d’évaluer le stress, la douleur et la souffrance et d’y répondre au plus vite en faisant appel aux techniciens qualifiés et compétents et au vétérinaire. Si un point d’intervention est atteint, le technicien met en place un enrichissement adapté, un isolement et/ou si besoin la mise à mort de l’animal. En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Les lignées connues pour pouvoir présenter un phénotype dommageable peuvent être observées et vérifiées de manière plus fréquente et plus spécifique avec des points limites et des raffinements précis. Ceci est évalué lors de la caractérisation du phénotype de la lignée ou en lien avec le scientifique en charge de cette lignée et le vétérinaire lorsque le phénotype attendu est connu. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal , l’animal est immédiatement mis à mort. Pour chaque phénotype dommageable, une mise en place de points limites non terminaux est adoptée afin de réaliser un suivi plus précis et plus optimum et la mise en place de soins adaptés (soutien nutritionnel, enrichissement spécifique, …). Si des animaux présentent des signes cliniques qui peuvent être atténués ou guéris à l’aide d’un traitement, avec accord du scientifique, ce traitement est mis en place. Les animaux déclarant un phénotype dommageable léger à modéré mais aptes à voyager seront expédiés avec une communication auprès de l’utilisateur final afin qu’il puisse gérer selon les normes éthiques et de bien-être animal leur réception et utilisation. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la « Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l’animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5j après la fécondation.
Évaluation de l’efficacité de contre-mesures médicales contre une toxine végétale chez le macaque et établissement du modèle par aérosolisation
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Exposés à une toxine végétale mortelle par aérosol ou par dépôt liquide dans les voies respiratoires, 197 macaques à longue queue subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, la plupart tués pour analyse du tissu pulmonaire et 48 réutilisés dans d'autres protocoles. Le porteur décrit une intoxication qui tue en 36 à 48 heures, avec accumulation de liquide dans les poumons, détresse respiratoire sévère et léthargie, et prévoit jusqu'à quinze prises de sang, sept prélèvements du nez et de la trachée et un hébergement individuel de trois semaines après exposition. Il justifie le choix du macaque par la proximité avec l'humain et le recours à un "organisme entier", et présente le projet comme devant remplacer un essai clinique humain. L'objet déclaré relève de la défense contre un usage malveillant de la toxine, les contre-mesures ayant déjà été testées sur des rongeurs.
Objectifs
Certaines toxines d’origine végétale sont particulièrement nocives. Pour certaines, il n’existe actuellement pas de traitement médical confirmé pour la prévention ou le traitement de l'intoxication. À ce jour, plusieurs attentats ou tentatives d’attentats ayant recours à ce type de toxine sont recensés. Le mode de dispersion visé dans leur utilisation malveillante est le plus souvent l’aérosol qui est la voie de propagation de la toxine la plus préoccupante en raison de sa nocivité lorsqu’elle est inhalée. Les données scientifiques obtenues jusqu’à présent sur une de ces toxines ont été générées via un modèle établi par dépôt liquide directement dans les voies respiratoires de la toxine. Il apparaît comme une priorité de valider ce modèle en le comparant à la méthode de référence à l’échelle internationale qui est la voie d’exposition la plus probable en cas d’attaque malveillante. Par ailleurs, il est crucial de disposer de solutions efficaces pour contrer les effets de ce type de toxine tout en assurant que l’Europe soit autonome et indépendante dans sa capacité de production. Dans ce projet, plusieurs traitements contre ce type de toxine seront testées, soit par administration par voie intraveineuse, soit par dispersion sous forme d’aérosol à l’aide d’un système commercial. La méthode par injection intraveineuse a déjà été utilisée précédemment et est donc bien caractérisée et validée à de nombreux niveaux. La méthode d’administration par aérosol présente également de nombreux avantages tels que le traitement directement dans le poumon et une administration facilitée y compris par du personnel non médical. Les objectifs de ce projet sont donc : • De comparer la distribution dans l’organisme et la tolérance de traitement par voie intraveineuse et/ou aérosol, • De réaliser la faisabilité et de l’efficacité de ces traitements au moyen d’études courte déterminantes, • De mettre en place le modèle d’aérosolisation de la toxine et de valider ce modèle contre le modèle historique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de disposer de traitements contre l’intoxication à avec une toxine végétale. Un traitement efficace et dont l’administration est facile, y compris pour du personnel non médical, est critique pour le traitement rapide et efficace des populations.
Procédures
*Prélèvement de sang, jusqu’à 5 fois par jour pendant la première journée, une fois par jour pendant la première semaine puis deux fois par semaine. Le suivi dure 3 semaines (max de prélèvements : 15). Un prélèvement de sang prend environ 2 minutes par animal. *Prélèvement de fluides dans le nez et la trachée, jusqu’à 1 fois par jour pendant la première semaine (max 7). Ces prélèvements prennent environ 5 minutes en tout. *Imagerie de type scanner des poumons seront réalisées (maximum 3/animal). Ceci prend environ 20 minutes. *Suivi quotidien des animaux (incluant un suivi sans anesthésie, un suivi anesthésié, une pesée, les contrôles des paramètres de santé de l’animal (respiration, fréquence cardiaque, oxygénation du sang etc…). Jusqu’à 5 fois par semaine. Ce nombre pourra être adapté si l’animal montre des signes de mauvaise santé. Ceci est réalisé sur animal anesthésié et prend environ 5 minutes. *Traitement/exposition des animaux par voie gazeuse: jusqu’à deux fois par animal. Ceci est réalisé sur un animal anesthésié. Ceci prend environ 20 minutes. *Exposition par dépôt liquide : une fois par animal. Ceci est réalisé sur animal anesthésié et prend environ 15 minutes par animal. *Traitement par injection : ceci sera réalisé jusqu’à deux fois par animal après anesthésie. Ceci prendra environ 8 minutes par animal. *Les animaux seront hébergés individuellement pour s’assurer qu’ils aient à manger et à boire à volonté. Cet hébergement se fera de manière contiguë de sorte que les animaux puissent se toucher. L’hébergement individuel durera pendant deux semaines d’acclimatation puis maximum 3 semaines après exposition.
Impact sur les animaux
Pour les animaux qui recevront les traitements seuls, aucun effet indésirable n’est anticipé dans la mesure où ils se reposeront sur des résultats préalables obtenus sur modèle rongeur. Cela sera tout de même vérifié. L’intoxication induit des symptômes mortels sans traitement. Le décès des animaux intervient en 36 à 48h après exposition. Les symptômes qui accompagnent cette intoxication débutent 24h après exposition et ressemblent à un rhume. Les animaux développent progressivement du liquide dans les poumons conduisant à une difficulté respiratoire sévère qui, si rien n’est fait, induit la mort de l’animal. Celle-ci s’accompagne d’un état globalement léthargique. Afin d’éviter au maximum la mortalité des animaux, une surveillance très rapprochée (3 visites ou plus par jour) s’accompagnera de l’utilisation de mesures spécifiques pour le suivi de l’état de santé des animaux a été mis en place et vérifié nous permettant d’anticiper la mortalité des animaux et procéder à une euthanasie si celui-ci est en souffrance. Par ailleurs, l’équipe d’imagerie est mobilisée afin de pouvoir réaliser des examens d’imagerie des poumons en urgence sur les animaux si un doute sur l’état clinique d’un animal existait. D’autre part, une télémétrie (puce sous-cutanée de suivi de la température) sera mise en place afin de suivre de façon rapprochée l’évolution des animaux. La nuisance est minimale car la puce est de petite taille, placée sous la peau du dos, avant le début de l’étude, sous anesthésie. Elle est laissée en place tout au long de l’étude et enregistre la température corporelle. A la fin de l’étude, la puce est récupérée et les données de température qui y sont enregistrée sont alors extraites. De plus, l’hébergement individuel des animaux, qui aura lieu uniquement après exposition à la toxine pourrait entrainer un stress qui sera compensé par un programme défini par la cellule « bien-être animal » de l’établissement par l’enrichissement de leur milieu de vie. Enfin, les anesthésies répétées peuvent induire dans une certaine mesure une légère déshydratation chez les animaux qui sera surveillée et compensée e injectant du lsérum physiologique sous la peau au besoin. Par ailleurs, les modalités de l’anesthésie seront adaptées afin de ne pas induire de diminution de la fréquence respiratoire chez les animaux après l’exposition à la toxine.
Devenir
Du fait de l’impossibilité de savoir précisément l’impact de la toxine et du traitement par des technique d’imagerie in vivo ou pas le biais de dosage sanguins, il est nécessaire de réaliser des études sur le tissu pulmonaire entre autre (donc mise à mort des animaux). Ces études sont cruciales afin de déterminer précisément l’efficacité du traitement et de pouvoir envisager un jour de l’utiliser pour l’homme. Les animaux n’ayant pas reçu la toxine et n’entrant pas dans une étude du tissu pourront être réutilisés dans d’autres protocoles après un avis vétérinaire favorable.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale pour réaliser ce projet. L’objectif est de mettre en place un modèle cliniquement cohérent d’exposition à la toxine pour évaluer la protection induite par un nouveau mode d’administration de contre-mesures déjà testées chez les rongeurs. Ce choix s’explique par la complexité des réponses du corps à la toxine qui nécessite l’utilisation d’un organisme entier. Par ailleurs, le modèle choisi doit également permettre d’étudier les différentes composantes des réponses immunitaires (humorale et cellulaire) à de nombreux niveaux. Enfin, la recherche d’effet secondaires indésirables consécutifs à l’administration de la contre-mesure seule demande un modèle suffisamment proche de l’homme pour espérer une bonne transversalité. A ce titre, et en l’état actuel des connaissances, ces différents éléments ne peuvent pas encore être étudiés in vitro ou via des modèles utilisant de plus petits animaux ou des animaux moins sensible car le système immunitaire de ces autres modèles est très différent de celui de l’homme. Toutefois, cette phase de test de la contre-mesure ainsi que l’établissement du modèle reposent sur une expérience scientifique solide fournie à la fois par des projets précédents et des études sur des modèles de souris qui précèderont l’étude sur le primate non humain. Enfin, ce projet a pour vocation de remplacer une étude clinique humaine, il est donc impératif d’avoir le modèle animal le plus proche de l’homme possible. Les animaux utilisés seront des macaques cynomolgus.
Réduction
Lors de la phase de test de distribution dans l’organisme des contre-mesures, le nombre d’animaux a été fixé au minimum possible, en prenant en considération l’investigation d’un possible effet-genre (1/sexe), requis pas l’ANSM (Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé). Cette restriction a été appliquée à toutes les étapes du projet tout en se limitant à l’effectif minimum possible. Si toutefois un effet-genre ou tout autre effet inattendu était visible avec une des contre-mesures citées projet, alors un groupe supplémentaire de 6 animaux (1/sexe/étape) a été envisagé mais ne sera potentiellement pas utilisé. Lors de l’exploration de l’efficacité des doses, les groupes choisis sont de 4 par groupe (2/dose/sexe) ce qui correspond au minimum nécessaire pour l’évaluation de l’efficacité thérapeutiques des traitements. Ce nombre d’animaux est réduit au minimum nécessaire à une analyse statistique des résultats par des tests statistiques adaptés aux petits nombres. Lors de la vérification de l’efficacité du traitement, le nombre d’animaux retenu par groupe (8/groupe (4 par sexe)) a été limité au minimum permettant une comparaison des résultats obtenus. Pour l‘établissement du modèle, une recherche de concordance de dose sera réalisée avec 9 animaux. L’utilisation de 3 animaux par dose correspond au minimum requis pour approcher la dose recherchée. Enfin, concernant la dernière étape, le besoin de 8 animaux à la dose retenue est lié à l’utilisation de l’adaptation d’une méthode statistique adaptée au modèle primate. Concernant les 4 animaux pour vérifier la dose létale calculée, il s’agit du minimum d’animaux pour une analyse statistique des résultats. Ces 4 animaux pourront ne pas être utilisés.
Raffinement
Les procédures seront effectuées sur des animaux anesthésiés. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et des mesures seront réalisées à chaque anesthésie. Un suivi de paramètres spécifiques (score clinique) déjà éprouvé a été validé en partenariat avec les vétérinaires de l’installation et le responsable de la cellule locale du Bien-être animal. Ce score permettra de suivre de près l’évolution de la santé des animaux et proposer une approche prédictive qui servira d’aide à la décision. Toutes les décisions concernant le bien-être des animaux seront prise en accord avec l’équipe vétérinaire.
Choix des espèces
Considérant toutes les contraintes énumérées ci-dessus, le primate non humain a été choisi comme modèle d’étude pour ce projet. Les macaques cynomolgus ont été sélectionnés pour plusieurs raisons : • Leur sensibilité à l’intoxication par la toxine. • Ils réunissent les éléments nécessaires à l’évaluation de contre-mesure : leurs réponses immunitaires moléculaire et cellulaire et leur anatomie respiratoire sont proches de l’homme et les techniques et outils d’exploration de la réponse immunitaire sont disponibles et maitrisés chez cette espèce, contrairement à d’autres modèles d’infections respiratoires régulièrement utilisées comme le rat ou la souris. • Le présent projet aura valeur d’essai clinique d’efficacité de la contre-mesure et requiert donc les animaux ayant la physiologie la plus proche de celle de l’homme. Les animaux devront être adultes car il est primordial que les animaux disposent d’un système immunitaire et d’un système respiratoire pleinement matures. Le système immunitaire et le volume des poumons évoluent en fonction du stade de développement et de l’âge des animaux. Nous utiliserons donc des animaux adultes d’âge et de poids semblables.
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement modifiés dans notre institut
- Conservation des espèces
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Gardés vivants à l'issue de la procédure, 20 000 rats vont subir une biopsie de l'oreille dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, leur devenir étant ensuite décidé par le chercheur en charge de la lignée. Chaque animal reçoit une bague à une oreille et un poinçon de 1,5 mm à l'autre, entre 12 et 15 jours de vie, avant le sevrage, pour permettre le génotypage. Le porteur justifie ce calendrier par l'organisation de l'animalerie, un gain "de temps, de place et de travail" et une capacité d'hébergement limitée. Ces 20 000 interventions accompagnent la gestion d'un élevage de lignées transgéniques créées sur commande, activité que l'établissement décrit comme une prestation.
Objectifs
Réaliser une biopsie d'oreille sur les rats génétiquement modifiés afin de pouvoir génotyper les animaux d'intérêt (Fondateurs, maintien de lignées, ou validation de cryoconservation des modèles).
Bénéfices attendus
Caracérisation génétique des lignées commandées pour les projets scientifiques des chercheurs et optimisation de la gestion des élevages. Il est important de réaliser le génotypage des animaux tôt, afin d'avoir les résultats si possible avant le sevrage, pour constituer les cagées directement. Cela permet un gain de temps, de place et de travail dans l'animalerie.
Procédures
Nous identifions les animaux par la pose d'une bague d'oreille et nous génotypons les animaux par une biopsie de 1.5mm de diamètre sur l'autre oreille à l'aide d'une pince spécialement dédiée. Cette procédure est réalisée une seule fois par animal. L'acte de biopsie et identification est très rapide (maximum 20 secondes pour les 2 actes d'identification et de biopsie). L'animal est donc contenu durant quelques secondes seulement et remis immédiatement à la mère.
Impact sur les animaux
Le poinçon peut entrainer douleur légère et de courte durée au site de prélèvement
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à la suite de cette procédure peu invasive. La biopsie permettra de déterminer le génotype de l'animal. Le chercheur en charge de la lignée déterminera son devenir en fonction des projets qu'il mène.
Remplacement
Pas d’autre possibilité que le recours à l’animal vivant pour le prélèvement de tissus.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés et leur bien-être est une préoccupation permanente. Le raffinement de nos techniques de transgénèse, de procréation médicalement assistée et de cryoconservation permet de générer de moins en moins d'animaux pour l'ensemble des prestations de l'institut, ce qui permet de réduire de manière importante la quantité d'animaux générés et donc biopsiés. De plus, nous utiliserons dès que possible, de schémas d’accouplement optimisés ne nécessitant pas ou peu de génotypage, afin de produire un maximum d’animaux « utiles »
Raffinement
La méthode de poinçon à l'oreille est éprouvée, précise, rapide et standardisée ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs sur les animaux. De plus, les animaux sont surveillés quotidiennement ce qui permet de faire un suivi de la cicatrisation dans le temps. Nos rats sont hébergés en cages ventilées, en groupe, avec de multiples enrichissements : bâton de bois à ronger, balles de bois à ronger, nids, croquettes de nourriture au fond de la cage.
Choix des espèces
Le rat, comme la souris , est un très bon modèle d'expérimentation animale car il est de petite taille, son génome est parfaitement connu et il a un taux de reproduction très rapide. Il est couramment utilisé par les chercheurs qui nous commandent des prestations de création de lignées transgéniques Les rats seront prélevés entre 12 et 15j de vie, avant le sevrage. Cet âge a été judicieusement choisi car avant 12j, l'oreille ne s'est pas assez développée et ce n'est qu'un bourgeon sur lequel il est difficile de réaliser une biopsie. et après 15j, nous n'aurions pas les résultats de génotypage avant le sevrage (3 semaines), ce qui ne nous permet pas de faire les cagées définitives. Notre capacité d'hébergement est limitée et il nous faut donc optimiser la place constamment. Ce fonctionnement nous permet d'économiser du temps, des ressources et de la manutention pour les animaliers.