Troubles gastrointestinaux

1680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, 720 relevant de la gravité sévère. Des rates Wistar subissent l'implantation chirurgicale d'électrodes, une distension colorectale douloureuse sous contention de 45 minutes et un stress d'immobilisation de deux heures, pour tester cinq souches probiotiques contre la douleur du syndrome de l'intestin irritable. Le porteur indique qu'un saignement anal peut survenir pendant la distension, auquel cas la procédure est arrêtée. Il affirme que la complexité du syndrome ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.

Objectifs

Notre projet vise à évaluer l’efficacité de 5 souches probiotiques pour le traitement et/ou la prévention du syndrome de l’intestin irritable (SII). Nous évaluerons ainsi les effets d’un traitement de 5 ou 10 jours avec ces souches productrices d’un métabolite d’intérêt sur la douleur viscérale en condition de stress chez le rat et déterminerons la persistance de l’effet antidouleur de ces souches après un arrêt du traitement (période de « wash out ») de durée variable selon les souches testées. Nous comparerons les effets des souches à une souche non productrice ainsi qu’à un mutant de chacune de ces souches ne produisant plus le métabolite afin de démontrer l’importance de celui-ci et de comprendre les mécanismes mis en jeu dans la modulation de la douleur. De manière complémentaire, l’effet de l’ensemble de ces souches sera évalué après un seul jour de traitement. Outre l’évaluation de la sensibilité viscérale chez les animaux traités, des prélèvements seront effectués 5 jours ou 10 jours après gavage des animaux en conditions basales ou de stress aigu et avec ou non période de « wash out », afin d’identifier les molécules potentiellement actives et ainsi décrypter les mécanismes d’action mis en jeu

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la durée de traitement nécessaire et suffisante ainsi que la persistance de l’effet antidouleur après arrêt du traitement des souches d’intérêt, apportant de nouvelles réponses sur les mécanismes impliqués dans les effets observés. A terme, ces explorations permettront de proposer de nouvelles pistes de traitement des symptômes douloureux des patients SII associés à un profil anxieux et/ou stressé développant des manifestations digestives douloureuses.

Procédures

Tous les animaux de ce projet reçoivent un traitement par gavage. Les animaux pour l’évaluation de la sensibilité viscérale sont soumis à une procédure chirurgicale durant 20 min sous anesthésie générale (implantation d’électrodes intramusculaires). Après une période de convalescence et de repos puis de traitement, les crampes abdominales vont être enregistrées pendant une phase de distension colorectale durant 20 minutes. Cet enregistrement se fait en condition basale puis le lendemain en condition de stress aigu (maintien des pattes avant le long du corps de l’animal pendant 2 heures). Pendant les phases d’enregistrement, les animaux sont placés dans des tunnels de contention (45 min ). Pour l’étude de l’effet « wash out », une période de repos/ arrêt du traitement est appliquée. Puis un deuxième enregistrement de crampes abdominales pendant la distension colorectale avant et après un stress aigu est réalisé. Pour l’étude des mécanismes d’action mis en jeu dans les effets anti-douleur des souches testées, une prise de sang est réalisée à la queue au milieu du traitement. Un stress de contrainte est réalisé à la fin du traitement et après la période de « wash out ». Les animaux sont ensuite anesthésiés et euthanasiés pour effectuer les prélèvements nécessaires.

Impact sur les animaux

La douleur liée au gavage est évitée en utilisant une sonde à bout arrondi adaptée à la taille de l’animal et en réalisant un geste rapide et bien maitrisé. Pour la mesure de viscérosensibilité, les douleurs liées à la chirurgie sont prises en charge (analgésie pré et post-opératoire /anesthésie). La déshydratation et l’hypothermie sont prévenue par une injection post opératoire de sérum physiologique à chaque animal et par un maintien au chaud pendant les phases chirurgicales, de réveil et de convalescence. Le stress lié à la manipulation des animaux est évité en prévoyant de phases d’habituation aux différentes manipulations et de repos. La douleur ressentie pendant les phases d’enregistrement des crampes abdominales (indice de douleur) due à la distension colorectale est progressive et dure 20 minutes. La douleur n’est plus ressentie après l’arrêt de la procédure car les enregistrements reviennent à un niveau équivalent à celui de départ. Il n’y a pas de dommages observés sur les animaux mais un effet indésirable possible pendant ou après la distension est un saignement au niveau anal. Dans ce cas la procédure est arrêtée immédiatement.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure. La procédure 1 étant une procédure sévère, les animaux ne peuvent pas être gardés en vie à la fin de la procédure ou participer à une autre étude. Les animaux de la procédure 2 sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements

Remplacement

L’utilisation du modèle rat se justifie par le nombre important d’études bibliographiques et d’outils méthodologiques utilisant ce modèle pour étudier la pathologie du SII qui de par sa complexité ne peut être reproduite sur des modèles in vitro.

Réduction

Le nombre de souches bactériennes sélectionnées (5) a été fixé suite aux essais de criblage réalisés par les partenaires du projet sur un panel de 152 souches vis-à-vis de leur capacité de production de la molécule d’intérêt in vitro. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque groupe expérimental a été optimisé en tenant compte de la variabilité interindividuelle en se basant sur les études précédentes utilisant le même modèle. Ces effectifs, n=12 pour les études de viscérosensibilité et n=8 pour les prélèvements de sang et d’organes, sont suffisants pour atteindre une validité statistique. La possibilité d’utiliser les mêmes animaux a été étudiée mais n’a pas été retenue. En effet, les deux procédures décrites ici doivent-être menées de façon distincte pour permettre d’obtenir des résultats pertinents et robustes.

Raffinement

Les animaux utilisés seront des animaux sains provenant d’un élevage agréé. Ils seront hébergés dans des conditions normalisées et suivis quotidiennement pour leur apporter tous les soins nécessaires et assurer leur bien-être. Leur milieu sera enrichi en buchettes de peuplier pour satisfaire leur besoin de ronger. Toutes les mesures ont été prises pour réduire l’inconfort (période d’adaptation, habituation, récupération) et prévenir toute douleur ou anxiété susceptible d’être subie par les animaux (anesthésie/ analgésie, soins post opératoire, détection de toute anomalie ou apparition de mal être). Si malgré les mesures prises, une souffrance était constatée la procédure serait arrêtée.

Choix des espèces

Le modèle de stress aigu chez le rat est largement validé par la communauté scientifique pour étudier la physiopathologie du SII. Ce modèle permet de reproduire les caractéristiques décrites chez les patients SII : douleur viscérale, augmentation de la perméabilité intestinale, micro-inflammation intestinale. Les animaux seront des rats Wistar femelles adultes de 200g à 220g. L’utilisation d’animaux adultes est nécessaire pour évaluer les effets des souches probiotiques sur une barrière intestinale parfaitement mature, sachant qu’en condition périnatale la barrière intestinale présente des caractéristiques biologiques complètement différentes de celles observés chez l’animal adulte.