Troubles gastrointestinaux
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
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- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
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- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Essai d’efficacité et de sécurité de nouveaux dispositifs chirurgicaux en chirurgie mini-invasive
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles urogénitaux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Une trentaine de dispositifs médicaux, instruments, implants ou logiciels, vont être testés sur des cochons en prestation de service, pour des équipes internes ou extérieures à l'établissement. 380 cochons vont être utilisés, tous mis à mort à l'issue pour une autopsie, les uns opérés sous anesthésie et tués sans réveil, les autres réveillés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les interventions durent jusqu'à quatre heures sous anesthésie générale, et la survie des porcs charcutiers est plafonnée à six mois, pour limiter les contraintes liées à des cochons qui peuvent dépasser 100 kg. Le porteur écrit avoir réduit leur nombre "afin d'obtenir des résultats statistiquement exploitables", puis qu'il ne fait "pas de tests statistiques".
Objectifs
Ce projet de recherche et de développement vise à répondre à différentes demandes de validation préclinique de dispositifs médicaux (DM) innovants sur modèle porcin. Selon la réglementation, on entend par DM, tout instrument, implant, appareil, équipement, logiciel ou réactif utilisé, seul ou en association, à des fins médicales chez l’Homme. Ce projet détaille les procédures pouvant être utilisées chez les porcs pour évaluer des DM, en assurant leur prise en charge médicale selon les niveaux de complexité des interventions. La mise en œuvre du projet s’appuie sur l’expertise de nos équipes dans les approches chirurgicales mini-invasives, pour tester l'efficacité et la sécurité de DM en recourant à des méthodes et des équipements à la pointe de la technologie et de l’innovation. Dans le but de répondre à la demande de prestation de service aussi bien en recherche et développement que pour la réalisation d’études conformes aux BPL (Bonnes Pratiques de Laboratoire), ce projet vise à couvrir de façon générale plusieurs DM dont la pertinence scientifique et la licéité de mise en œuvre chez l’animal auront été préalablement évaluées par le comité scientifique de l’établissement. Dans le cadre de ces tests réalisés pour des équipes internes ou externes, deux types d’événements sont explorés : ceux liés directement au DM testé et ceux qui sont en rapport avec la technique d’implantation ou opératoire. L’objectif est d’évaluer les principales complications pouvant apparaitre pour établir le rapport bénéfice/risque du dispositif médical testé.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus lors de ce projet concernent l’effiacité thérapeutique et la sécurité (éviter les effets secondaires) de dispositifs médicaux utilisables chez des patients humains principalement dans le domaine chirurgical.
Procédures
La plupart des actes se dérouleront sous anesthésie générale. Ainsi, les cochons vont recevoir une injection de sédatif en intramusculaire (durée d'une minute environ). Lorsqu’une intervention sous anesthésie est prévue, sous sédation, un cathéter intraveineux sera posé sur une veine de l’oreille, l’animal étant profondément sédaté, il n’y a que peu de réaction à cet acte qui dure environ une minute. La suite de l’intervention se déroule sous anesthésie générale maintenue par un respirateur permettant de nous assurer de l’absence de toute réaction ni souffrance pendant la durée de l'intervention pouvant aller jusqu'à 4h maximum. Pour les injections intramusculaires de traitement post-opératoire (antidouleurs notamment), là aussi, nous prenons nos dispositions pour que l’injection soit la moins stressante, la moins douloureuse et la plus courte possible (durée d'une minute environ). La prise de médicaments par voie orale ne présente pas de contrainte pour les animaux grâce au mélange dans un aliment ou une boisson appétente (durée d'une minute environ).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pour les animaux sont liés aux actes suivants : - Anesthésie : injection intra-musculaire (douleur transitoire au site d'injection), pose de cathéter à la veine auriculaire (douleur locale au site d'insertion du cathéter, risque d'hématome), risque d’hyperthermie maligne liée aux anesthésiques, risque de défaillance cardiorespiratoire - Pose du dispositif ou test d’un instrument/équipement/réactif/logiciel : douleur et/ou infection au site de pose/test, réaction inflammatoire locale, saignement transitoire - injections : * intra-veineuses: elles sont faites dans le cathéter limitant ainsi la douleur locale (on ne pique qu'une fois) et le risque d'hématome. * sous-cutanées ou intra-musculaire : douleur locale. * Les susbtances injectées sont toutes médicamenteuses, un des rares effets indésirables potentiels serait une réaction allergique
Devenir
L’ensemble des animaux est mis à mort en fin de projet car une autopsie doit être réalisée afin de prélever des organes et ainsi d’étudier l’effet du dispositif médical.
Remplacement
Toute évaluation d’un dispositif médical doit apporter des preuves suffisantes de son efficacité et de sa sécurité pour autoriser son utilisation sur des patients avec un taux de réussite optimal (durée d’intervention, efficacité du geste). L’étude initiale du DM sur simulateurs et modèles ex vivo permet d’en tester le concept et la faisabilité technique. Elle doit être souvent complétée par des études de compatibilité, d’efficacité et de sécurité qui nécessitent une phase d’expérimentation sur organisme entier vivant. Les procédures innovantes sont ainsi reproduites dans des conditions proches de la clinique, précliniques, qui incluent également les situations parfois difficiles liées aux voies d’abord, repères anatomiques, complications. Il n’existe pas de modèle ex-vivo ou d’autres possibilités de remplacement suffisantes pour valider intégralement l’efficacité et la sécurité de certains DM avant leur utilisation chez l’Homme, en particulier dans les contextes d’indications chirurgicales effectuées par des approches mini-invasives innovantes. A un stade de développement avancé, il devient nécessaire d’intervenir sur organisme entier vivant pour reproduire des situations cliniques, parfois complexes, de façon réaliste, en prenant en compte les complications éventuelles (voies d’abord, repères anatomiques, hémorragie, nécrose, viabilité des organes, compatibilité…). Les résultats des expérimentations animales permettront de rejeter des DM /procédures inefficaces et/ou dangereux en conditions « réelles », d’élaborer de manière optimale les protocoles de recherche cliniques en cas de résultats positifs et, à terme, de valider de nouveaux DM/ procédures cliniques innovantes utilisables chez les patients humains.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant d’envisager une application chez l’Homme. Les interventions sont réalisées par des chirurgiens experts, ce qui limite le nombre d’animaux nécessaires en optimisant le taux de succès. Chaque DM sera testé préalablement sur un faible effectif d’animaux (2 à 6) avant d’engager une étude plus complète après avis d’experts et d’éventuelles améliorations du dispositif et/ou de la procédure. 380 porcs sont prévus. Ceci est une estimation a priori pour tester une trentaine de DM innovants sur la durée de ce projet. Le nombre requis précisément dépendra des caractéristiques de chaque DM, de son caractère innovant, de la complexité de la procédure, de l’expérience du chirurgien et des risques estimés. Nous ne faisons pas de tests statistiques car il s’agit de preuves de concept sur un très faible nombre d’animaux. Les usages sur le marché du DM et notre expérience montrent que 6 porcs sont généralement nécessaires pour les études de faisabilité et preuves de concept (principalement sans réveil, mais pouvant parfois être réalisées en survie sur un faible effectif), puis en moyenne 10 pour l’évaluation préclinique (sans réveil ou en survie). Nous estimons que sur les 30 DM testés en faisabilité, 70% pourraient passer en phase d’évaluation préclinique : les procédures seront d’abord soumises à un expert pour validation, puis réalisées étape par étape avec évaluations intermédiaires et propositions d’amélioration.
Raffinement
Le protocole prévoit des procédures mini-invasives réalisées sous anesthésie générale. Dans les études de faisabilité, de nombreux DM peuvent être évalués sans nécessité de réveiller l’animal en fin d’expérimentation. Dans les études de compatibilité, d’efficacité et de sécurité du DM, les animaux seront réveillés après l’intervention et seront soumis à un suivi clinique quotidien par du personnel qualifié, sous couverture antalgique dès que nécessaire, et hébergés dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie) et enrichi : Les porcs sont des animaux sociaux, propres, avec un instinct de fouissement et d’exploration des matériaux. L’enrichissement apporté pour favoriser leurs comportements naturels comprend une stabulation en groupe social lorsque possible, la mise à disposition de jouets à mâchouiller, à manipuler (balles, jouets, chainettes...), l’accès à des zones de repos distinctes des zones de défécation. L’environnement sonore en animalerie est aussi apaisé par la diffusion de musique. Toute altération de leur état général sera reportée au vétérinaire et au responsable de l’intervention médicale qui mettront en œuvre des traitements adaptés. Des critères d’arrêt anticipé en cas de survenue de complications sont définis et validés par la structure en charge du bien-être animal. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale avec monitoring et gestion de la douleur. Une surveillance rapprochée des animaux permettra d’adapter le traitement à leur état clinique sur avis vétérinaire. Les modalités d’hébergement (paramètres environnementaux, alimentation, enrichissement, socialisation) sont contrôlées quotidiennement par des animaliers habilités. Si certains animaux présentaient des signes de souffrance ou de mal-être avant la fin de la période de survie, ils seraient euthanasiés et les données exploitables collectées. Le protocole sera alors revu avec les experts et affiné avant de recommencer une nouvelle série d’animaux. La SBEA (Structure du Bien-Etre Animal) est associée aux décisions relevant du bien-être des animaux en cours d’étude. A la fin du protocole, une étude rétrospective sera réalisée afin d’améliorer de façon continue nos protocoles et nos modèles.
Choix des espèces
Le Porc est un modèle de choix de par sa taille et son anatomie comparables à l’Homme, il permet l’utilisation d’instruments et équipements de chirurgie, endoscopie notamment, conçus pour l’Homme, et ainsi de reproduire de façon pertinente les procédures en clinique. Notre laboratoire dispose d’une forte expertise sur ce modèle avec de nombreuses données scientifiques disponibles (anatomie, chirurgie…). Des porcs, jeunes adultes entre 25 et 60 Kg, seront utilisés. La taille des organes des porcs à ce stade de croissance correspond déjà à ce qui peut être observé en clinique chez l’Homme, il offre les repères anatomiques recherchés par le praticien et permet d’utiliser les mêmes équipements et matériels chirurgicaux que chez le patient. Dans certains cas, en particulier pour les survies supérieures à 3 mois, le modèle « miniporc » (15-30 kg) pourra être retenu pour ses caractéristiques de croissance plus faible. Ce modèle de cochon « miniature » permet en effet de suivre sur du long terme un dispositif in situ sans qu’il soit trop impacté par la croissance rapide de certains organes (le porc charcutier « standard » peut prendre jusqu’à 800g par jour). Pour les porcs charcutiers, la durée de survie maximale a été fixée à 6 mois afin de limiter les contraintes zootechniques liées à la manipulation d’animaux pouvant dépasser les 100kg.
Evaluation de l’efficacité et du mode d’action d’un composé d’intérêt thérapeutique chez un modèle souris d’inflammation colique
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent 21 gavages, dont 8 de placebo pendant une phase d'habituation, et boivent pendant huit jours une eau additionnée d'un agent chimique qui déclenche une colite, avec diarrhées, sang dans les selles et douleurs abdominales. Hébergées seules alors que le porteur reconnaît que ce sont des animaux sociaux, elles sont utilisées pour évaluer deux candidats médicaments d'une "société cliente" contre la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Il écrit que le recours à "l'animal entier" reste une étape "nécessaire" à la constitution du dossier d'autorisation des essais cliniques.
Objectifs
Le présent projet vise à tester l'efficacité de deux composés d'intérêt thérapeutique (administrés seuls ou en combinaison) en développement préclinique et visant à traiter les inflammations chroniques de l'intestin (maladie de Crohn ou rectocolite hémorragique). Les données obtenues devraient permettre à la société cliente de détailler l’efficacité et les mécanismes d’action de leur composé et de permettre, dans l'hypothèse d'effets bénéfiques, de poursuivre le développement de ces composés en clinique humaine.
Bénéfices attendus
La présente étude devrait permettre de mettre en évidence une efficacité de deux candidats médicaments en développement à diminuer la colite, et apporter une confirmation de leur mode d'action. Dans ce cadre, les composés X et Y seront testés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourrait, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché.
Procédures
Les souris recevront 21 administrations par gavage (8 administrations de placébo pendant la phase d'habituation au traitement puis 13 administrations dans la phase de traitement elle-même; Durée < 1 minute). Hormis pour les 10 souris du groupe expérimental contrôle du modèle de colite, les animaux seront exposés à un composé chimique induisant une inflammation du colon via leur eau de boisson pendant 8 jours. Les souris seront pesées deux fois par semaine avant traitement et quotidiennement pendant les 13 jours de traitement (durée des pesées < 1 minute). Enfin, à l'issue de l'étude, les souris seront anesthésiées et mises à mort après anesthésie (Durée: 5 min).
Impact sur les animaux
Le modèle employé est un modèle de colite induite par l'administration par l’eau de boisson d'un agent chimique irritant dosé de façon à induire une colite modérée chez la souris. Dans ce cadre, les souris présentent des épisodes de diarrhée, avec une possible présence de sang dans les selles et des douleurs abdominales. L'ensemble des administrations par voie orales (8 administrations de véhicule suivies de 13 administrations de véhicule, ou des candidats médicaments administrés seuls ou combinés) et les pesées quotidiennes à l'état vigile peuvent être source de stress ou de douleurs. Par ailleurs, l'hébergement individuel représente également une nuisance pour les souris qui sont des animaux sociaux.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des analyses biochimiques et histologiques sur les colons qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur l’inflammation colique. En effet, les inflammations chroniques de l'intestin possèdent une étiologie complexe, impliquant des mécanismes inflammatoires et immunologiques. Bien que des modèles in vitro aient été utilisés afin de réaliser les premières preuves de concept de l’efficacité du composé X, le recours à l’animal entier reste une étape nécessaire à la constitution d'une demande d'autorisation afin de réaliser les études cliniques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de résultats obtenus lors de nombreuses études antérieures menées par le laboratoire. Le nombre de 15 animaux par groupe a été défini comme le nombre minimum d’animaux à utiliser pour pouvoir mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés et compte tenu de l'hétérogénéité du modèle employé. Un total de 70 souris sera utilisé, divisé en 1 groupe de 10 souris (groupe contrôle du modèle) et 4 autres groupes de 15 animaux chacun. Le groupe contrôle du modèle a été réduit à 10 animaux puisqu'il ne présente pas de colite, réduisant la variabilité des mesures réalisées. Une analyse statistique sera réalisée.
Raffinement
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est un modèle particulièrement bien caractérisé dans la littérature. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress induit aux animaux (périodes d’acclimatation et d’habituation des animaux aux procédures d’administration) et à établir des points limites appropriés. En cas d'atteinte de scores de souffrance animale spécifiques, une administration d'analgésique sera employée pour s'affranchir de toute douleur induite aux animaux. Les animaux seront hébergés individuellement mais conserveront des contacts visuels et olfactifs entre congénères et une enrichissement renforcé de leur environnement sera mis en place sous forme de briquette de bois spéciales pour rongeurs, de dômes en cartons et de papier de nidification.
Choix des espèces
Le modèle animal utilisé est un modèle d’inflammation colique induite par administration d'un agent irritant chez la souris qui est très bien caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans le cadre d'études précliniques. Les animaux seront réceptionnés à 7 semaines d'âge et les traitements débuterons à 9 semaine d'âge. Cela correspond à un stade de jeune adulte mimant la population cible majoritaire des inflammations chroniques de l'intestin chez l'humain.
Réponse au traitement et nouvelles thérapies contre l’infection par le VHD (EU1/3)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Une greffe de cellules de foie humain injectées dans la rate, puis huit prélèvements de sang étalés sur seize semaines : 98 souris au foie humanisé vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont infectées par les virus des hépatites B et D, puis reçoivent des traitements quotidiens par injection sous-cutanée ou par gavage. Le porteur indique qu'environ 10 % des souris développeront une insuffisance hépatique aiguë faute de prise de greffe, et que le gavage peut provoquer des saignements ou une perforation de l'œsophage ou de l'estomac. Le choix de l'espèce tient à une exclusion : seul le chimpanzé s'infecte naturellement comme l'humain, son utilisation est interdite depuis la directive européenne, restent donc les souris chimériques.
Objectifs
Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération de la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le cancer du foie. Si certains traitements permettent aujourd’hui le contrôle de l’infection par le VHB, les traitements disponibles contre le VHD sont non satisfaisants, malgré le développement récent de nouvelles molécules. Notamment, le bulevirtide, inhibiteur d’entrée du virus dans les cellules, bénéficie d’une autorisation conditionnelle d’utilisation en Europe depuis 2020. Cependant, tous les patients ne répondent pas au traitement bulevirtide et les causes de cette variation entre patients est inconnue. De nouvelles stratégies de traitements contre le VHD et la compréhension de la réponse au traitement par bulevirtide sont indispensables. Dans ce contexte, nous avons récemment caractérisé l’activité anivirale d’une molécule utilisée dans le traitement contre l’arthrite rhumatoïde, l’upadacitinib, contre le VHD. Ce projet combine à la fois une analyse de la réponse au traitement par bulevirtide chez les souris co-infectées par le VHD et le VHB, à la recherche de marqueurs de la réponse au traitement, et le test in vivo de l’upadacitinib. Il s'agit d'un projet multisites.
Bénéfices attendus
La thérapie antivirale de dernière génération pour l'infection par le VHD est le bulevirtide, qui conduit à une diminution significative de la charge virale dans les études cliniques chez 70% des patients. Cependant, aucun marqueur de réponse au traitement n'est disponible et des antiviraux plus efficaces sont nécessaires pour améliorer la durée de vie et la qualité de vie des patients infectés par le VHD. Cette étude vise à identifier des marqueurs pour la réponse au traitement par le bulevirtide et le risque de cancer. De plus, l'étude fournira une preuve de concept préclinique en utilisant une nouvelle molécule antivirale comme candidat médicament.
Procédures
Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux après anesthésie générale et analgésie. Cette chirurgie est réalisée en moins de 10 minutes. Un prélèvement de sang sous anesthésie générale et analgésie locale sera réalisé 3 mois après la greffe afin de nous assurer de la prise de greffe. Ce prélèvement prend moins d’une minute à être réalisé. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigils après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Cette injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les traitements seront administrés de façon quotidienne par injection sous-cutanée après désinfection à l’alcool, ou par gavage oral sur animaux vigils. Injections et gavages oraux sont réalisés en moins d’une minute. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 16 semaines, soit un total de 8 prélèvements. Ces prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés ayant reçu une analgésie locale et prennent moins d’une minute à être réalisés. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole sous anesthésie générale, réalisé en 1 à 2 minutes. Les animaux seront transportés d'un site à l'autre.
Impact sur les animaux
Les souris chez lesquelles la prise de greffe sera infructueuse (environ 10% des animaux) vont développer une insuffisance hépatique aigüe en 2-3 semaines du fait de la mort des cellules du foie murin, qui se traduit par une perte de poids rapide. Les prélèvements sanguins peuvent entrainer inflammation et cécité. Les injections sous-cutanées peuvent entrainer l’apparition d’une inflammation et/ou d’une induration. Le gavage oral peut également entrainer une inflammation et des saignements/perforation de l’œsophage ou de l’estomac. Les traitements peuvent entrainer une augmentation temporaire de la concentration en acides biliaires dans le sang, qui est asymptomatique et sans conséquence sur la santé. Les traitements peuvent également être associés à une élévation de niveau des enzymes du foie dans le sang ainsi qu’à une augmentation des lipidiques et cholestérol dans le sang. Le transport d'un site à un autre peut générer du stress.
Devenir
Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenue depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et D ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.
Remplacement
Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont sur des lignées cellulaires et sur des cellules du foie humain afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses et présentent de nombreuses modifications de leur ADN par rapport à des cellules normales du foie. De plus l’utilisation de cellules du foie issues de patients nécessiteraient un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation et la quantité de tissu n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser les modifications de l’ADN. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce aux données d’une étude précédente sur des souris humanisées. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire et des résultats statistiquement fiables. Pour réduire le stress engendrer par le transport des animaux, les cages de transport seront enrichies avec un baton et du coton ou de la frisure pour que les animaux puissent faire un nid. La température sera maintenue suffisamment élevée pour que les souris puissent maintenir leur température corporelle. Les cages seront équipées de couvercles filtrants afin de garantir leur protection des pathogènes extérieurs. A leur arrivée, une période d'acclimatation de 2 semaines serra respectée afin de permettre aux animaux de s'habituer au nouvel environnement.
Choix des espèces
Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies du foie et virales sur les cellules du foie humain et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe, afin de faciliter l’intervention, et à un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus, la prise de greffe optimale étant à 3 mois post-greffe.
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin au TNBS chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Cinquante études sur cinq ans, commandées par des laboratoires académiques, des biotechs et des industriels du médicament : 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour faire tourner un modèle de maladie inflammatoire de l'intestin. L'inflammation est déclenchée par une administration intra-rectale de TNBS dilué dans l'éthanol sous anesthésie, suivie de gavages, de prélèvements de sang et d'endoscopies par sonde caméra. Une partie des souris est immunodéficiente et porte un système immunitaire humanisé. Le porteur classe l'ensemble en souffrance modérée tout en décrivant une diarrhée pouvant être sévère, une déshydratation, une anémie, une prostration et une perforation de l'intestin.
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie caractérisée par une inflammation de la paroi du tube digestif entrainant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de molécules issues de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration intra-rectale sous anesthésie générale, durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Administration des composés à visées thérapeutiques par voie enterale (gavage ou incorporation dans l'eau de boisson) ou parentérale (intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée). Leur nombre est à déterminer, leurs durées seront de 10 à 15 secondes chacune. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements selon un schéma établis par le vétérinaire et le comité de bien-être. Chaque prélèvement aura une durée de 15 à 30 secondes, environ. Insertion de sonde caméra intrarectale sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de TNBS solubilisé dans l'éthanol ainsi que par les prélèvements sanguins, l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie. Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 1500 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet sur une durée de 5 ans, permettant de réaliser 50 études afin de mettre en place le modèle et de réaliser les premières études précliniques. Chaque étude comprendra un minimum de 4 groupes (contrôle négatif, contrôlé positif, plusieurs doses ou traitements à comparer) avec 5 à 10 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats fiables malgré la variabilité intrinsèque liée au modèle. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, le volume maximal est de 200µL pour un prélèvement unique, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue pour tout prélèvement unique à partir de 8mL/kg. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction des scores cliniques et de la perte de poids. Les administrations intra-rectales seront réalisées sous anesthésie générale à l'isoflurane et le volume d'injection ne pourra dépasser 200 μL. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie.
Choix des espèces
Le séquençage complet du génome de la souris a démontré la proximité phylogénétique des souris et des hommes : 90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes orthologues produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement dans le génome du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Ainsi, les souris SCID (Severe Combined ImmunoDeficiency), leurs dérivées et leurs analogues, toutes immunodéficientes, ont permis le développement des modèles humanisés. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.
ACCES-II : Modèle préclinique de rétablissement de continuité colique par anastomose colorectale écho-endoscopique : résultats à long terme sur la perméabilité des anastomoses
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Mis à jeun et purgés aux laxatifs, des cochons nains subissent une première chirurgie qui interrompt leur côlon et crée une stomie, puis, deux semaines plus tard, une intervention endoscopique pour reconnecter le côlon au rectum. 15 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec ensuite une à trois sédations pour retirer la prothèse et contrôler le rectum, et tous sont tués à la fin du projet pour analyser les tissus. L'objectif est de rendre moins invasif le rétablissement de la continuité digestive après une intervention de Hartmann, et le porteur ajoute que des internes en chirurgie s'y formeront pendant la première phase. Le titre annonce des résultats "à long terme", sans que le texte précise combien de temps les cochons vivent entre la dernière intervention et leur mise à mort.
Objectifs
Environ 4000 patients sont opérés annuellement en France d’une intervention de Hartmann, dont 80% par chirurgie ouverte (laparotomie), souvent dans le cadre de l’urgence, pour diverses pathologies entraînant une lésion du côlon . Cette intervention consiste à reséquer la partie du côlon gauche lésée. Le rectum est ensuite refermé (et reste en place dans l’abdomen), et le côlon en partie haute est extériorisée en extracorporel via une stomie permettant l’évacuation des selles. Cette intervention est généralement réalisée dans le cas où les risques de complications sont trop importants pour réaliser dès la première chirurgie la connexion entre le côlon et le rectum (anastomose). La stomie ainsi réalisée est théoriquement temporaire et le rétablissement de la continuité digestive se fait dans un second temps qui va néanmoins nécessiter une nouvelle opération en chirurgie ouverte le plus souvent. Cependant, compte tenu de la fragilité des patients, et des risques propres à une deuxième chirurgie pour le rétablissement de continuité, moins d’un patient sur deux sera à terme candidat à cette nouvelle chirurgie, avec des risques supplémentaires. L'objectif de notre étude est de développer une méthode non invasive de rétablissement de la continuité colorectale à l'aide d'une procédure endoscopique innovante.
Bénéfices attendus
Il s’agit d’une étude pilote in vivo sur modèle expérimental animal portant sur la faisabilité́ d’une nouvelle technique mini-invasive. Les perspectives sont l’établissement d’un protocole standardisé de la réalisation endoscopique d'anastomose colorectale, et l’évaluation du devenir des anastomoses colorectales confectionnées endoscopiquement après retrait de la prothèse d’apposition luminale. Les impacts attendus et les perspectives sont multiples : il s’agit en priorité de pouvoir proposer, après réalisation d’une expérimentation prospective chez l’homme en cas de succès, à des patients contre-indiqués au rétablissement de continuité chirurgicale, une prise en charge moins invasive, et de limiter le risque de réintervention pour sténose ou fistule anastomotique. Une évaluation du devenir des anastomoses après retrait des prothèses d’apposition luminale paraît indispensable, l’objectif à terme étant de proposer un rétablissement mini-invasif à des patients opérés d’une intervention de Hartmann, y compris en dehors de toute situation carcinologique ou palliative. La participation d’internes dans la première phase, permettra également d’améliorer leur formation et leur préparation aux situations réelles.
Procédures
Les animaux auront tous 2 anesthésies générales avec préparation dans les heures qui précèdent (mise à jeun et préparation colique – laxatifs) : une première procédure chirurgicale destinée à interrompre la continuité digestive et à créer la stomie (durée environ 1 heure). La seconde intervention, deux semaines après la première, est le traitement par voie endoscopique, d’une durée de 40 minutes environ. Les animaux auront ensuite de une à 3 interventions supplémentaires non invasives, sous sédation simple, d’une durée inférieure à 30 minutes, pour l’ablation de la prothèse et rectoscopie. La mise à mort sera réalisée en fin de projet, sous anesthésie générales préalable.
Impact sur les animaux
Du stress et de l’angoisse peuvent être présents en amont des deux interventions chirurgicales (J0 et J14), faites sous anesthésie générale : ces deux interventions sont considérées comme des procédures à degré de sévérité modérée car de la douleur peut être ressentie par les animaux à l’issue des procédures. Les procédures de contrôle endoscopique sont considérées comme des procédures à degré de sévérité légère. Une mise à jeun des solides au matin de la procédure est nécessaire pour les deux interventions de J0 et J14. De la faim peut donc être ressentie avant les interventions chirurgicales (J0 et J14) mais la boisson est autorisée ad libitum. La reprise de l’alimentation est autorisée le jour-même en l’absence d’élément évocateur de complication. Aucune mise à jeun n’est nécessaire pour les contrôles endoscopiques sous sédation simple.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure à des fins d'analyses des tissus traités pour rétablir la continuité digestive.
Remplacement
Il s’agit d’une nouvelle procédure au stade de recherche pré-clinique, n’ayant pas été réalisée chez l’Homme et ne pouvant être envisagée en l’absence d’étude de faisabilité sur modèle animal. Les simulateurs virtuels et mécaniques (Phantômes) ont démontré leur efficacité pour réduire l’utilisation du modèle animal dans l’apprentissage de l’écho-endoscopie diagnostique et de la ponction sous écho-endoscopie. Les modèles ex-vivo ont démontré leur utilité pour l’apprentissage du drainage des collections pancréatiques en suturant sur les faces postérieure et antérieure de l’estomac des morceaux d’intestin de porc remplies de gel d’échographie. Des modèles de simulation (virtuel, mécanique ou sur organe isolé) existent pour apprendre la technique de pose des prothèses utilisées dans ce projet. Néanmois, à l’heure actuelle, aucun modèle existant permet de remplacer le modèle animal vivant anesthésié. Effectivement, aucun modèle ex-vivo ne permet de reproduire le péristaltisme digestif, ni les conditions post opératoires après intervention de Hartmann. S’agissant d’une étude de faisabilité d’anastomoses, du tissu vivant est indispensable pour permettre une cicatrisation et évaluer la survenue de sténoses anastomotiques. L’objectif étant l’étude de la faisabilité de cette procédure, cela nécessite un suivi dans le temps, et ainsi l’utilisation d’un modèle animal est indispensable.
Réduction
Le nombre d’animaux maximum étudié a été fixé à 15 pour notre étude, s’agissant du nombre d’animaux nécessaire pour explorer les différents délais avant retrait des prothèses d’apposition luminale, tout en évitant les biais liés à la variabilité individuelle. Cet effectif est suffisant pour apporter des conclusions et permettre de détecter d’éventuelles complications associées à la réalisation des procédures et au suivi à long terme des effets de la procédure. Ces 15 animaux sont répartis en 3 lots stables, permettant un étalement des procédures et une adaptation progressive en cas de difficultés techniques ou de complications. Il n’existe à ce jour pas d’étude dans la littérature s’intéressant à notre sujet de recherche, ce qui ne permet pas de réaliser un calcul d’effectif ou de nombre de sujets nécessaires. La participation d’internes de chirurgie en fin de cursus sous la surveillance d’un chirurgien sénior, pendant la première phase chirurgicale, permettra la formation chirurgicale aux techniques précédemment évoquées sur un modèle vivant utilisé en formation, et ce, sans utilisation d’animaux supplémentaires. Le projet d’étude présenté prévoit également l’utilisation de dispositifs innovants visant à améliorer l’efficacité de l’intervention par le rapprochement du colon et du rectum. Apporter la preuve de l’efficacité de ces dispositifs lors de cette étude dispenserait également de la réalisation d’une nouvelle étude animale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d’acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie et leur première entrée en procédure. Ils seront suivis quotidiennement et leur état de santé sera évalué tout au long du protocole expérimental. Leur environnement sera enrichi (ballon, jouets divers) pour leur permettre d’exprimer un spectre plus large de comportements normaux. Dans la mesure du possible, les animaux seront hébergés par groupes stables afin de favoriser les interactions. Les protocoles chirurgicaux se feront sous anesthésie générale et analgésie. L’analgésie pourra accompagner l’animal en post-opératoire pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
L’anatomie du tube digestif du porc est connue pour être particulièrement proche de celle de l’anatomie humaine et constitue le modèle de référence pour la formation et la recherche en endoscopie digestive depuis de nombreuses années. La taille de l’animal permet d’utiliser les mêmes dispositifs (endoscopes, prothèses) que ceux disponibles en pratique clinique humaine. Nous projetons d’utiliser des mini-pigs pour limiter l’impact de la croissance post-opératoire, et faciliter le suivi au long cours ainsi que les diverses manipulations (retrait de la prothèse, scanner, contrôle endoscopique) Les animaux doivent être sevrés et peser plus de 15 kg permettant l’utilisation du même matériel que chez l’humain adulte (qui est utilisé chez l’enfant de plus de 15 kg).
Impact des maladies hépatiques sur la fonction de barriere de la muqueuse intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 pour cent, une posture prostrée, un léchage anormal ou des poils hérissés déclenchent l'arrêt immédiat de l'expérience et la mise à mort de la souris concernée. 3 264 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux modèles de colite provoquent douleurs abdominales, sang dans les selles, diarrhées et perte d'appétit, tandis que la cholestase hépatique est induite par un composé mêlé aux croquettes ou par deux injections intrapéritonéales par semaine pendant huit semaines. Le porteur écrit renoncer aux analgésiques et aux anti-inflammatoires, qui "risquent d'interférer" avec le cours de l'expérimentation, et s'en remet aux seuls critères d'arrêt.
Objectifs
La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie chronique du foie dans laquelle des fibroses et une inflammation chronique prennent place suite à la formation de sténoses biliaires multifocales. 70% des patients atteints de CSP souffrent également de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) dont notamment la rectocolite hémorragique (RCH). Cette coexistence chez le patient de ces maladies pouvant mener à un cholangiocarcinome (CCA) ou à un cancer colorectal pour lesquels les taux de survies sont faibles. Notre projet se concentre sur la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de la CSP et des MICI. Laquelle de ces deux pathologies se développent en 1er ? et est-ce que l'apparition de l'une favorise le développement de l’autre ? Ainsi, les objectifs du projet visent à étudier l'impact de la mise en place d'une CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et la susceptibilité de cette dernière à développer une inflammation. Réciproquement, l'utilisation de modèles murins de MICI favorise-t-il le développement de la CSP. En fonction des résultats obtenus, nous focaliseront l'étude des mécanismes impliqués sur le microbiote la perméabilité et les acides biliaires.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de comprendre comment la CSP et les MICI se développent. Dans un premier temps, ce projet permettra de définir l'impact de la CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à l'inflammation. Il permettra également de définir l'impact d'un contexte de susceptibilité génétique aux MICI dans le développement de la CSP (sévérité) ainsi que les conséquences de cette CSP sur la fonction de barrière de la muqueuse intestinale et sur la susceptibilité de la muqueuse intestinale à l'inflammation. Dans un deuxième temps, ce projet permettra de définir l'impact d'une inflammation intestinale sur le développement de la CSP. Ce projet permettra donc de définir les liens de causalités entre le développement de la CSP et des MICI ainsi qu'une meilleure compréhension des mécanismes impliqués. Une meilleure compréhension de ces maladies permettra alors une meilleure prise en charge thérapeutique.
Procédures
Pour le 1er modèle de CSP, aucune intervention sur les souris est prévue puisque le composé chimique est inclus dans les croquettes. Pour le 2-ème modèle de CSP, 2 injections (1 minute par injection et par souris) intra-péritonéales par semaine pendant 8 semaines seront nécessaire. Pour le 1er modèle d'inflammation colique, aucune intervention sur les souris est prévue puisque le composé chimique est inclu l'eau de boisson. Pour le 2ème modèle inflammatoire, 1 injection sous-cutanée (2 minutes) et une injection intra-rectale (2 minutes par souris). Pour les 2 procédures de CSP (procédures 1 et 2), les prélévements suivants sont prévus: - prélevements de selles une fois par semaine pendant la duré de la procédure; -1 prélèvement sanguin sera réalisé une fois par semaine, les deux dernières semaines de la procédure (1 minute par souris). En post-mortem, des prélèvements de foie, de contenu luminal, de duodénum, d'iléon et de colon post-mortem seront réalisés. Pour les 2 procédures d'inflammation coliques (procédures 3 et 4), la sévérité de l'inflammation sera determinée chaque jour en mesurant la perte de poids et les scores d'activité de la maladie (1 minute/ souris). En post-mortem, les scores macroscopiques inflammatoires seront déterminés (longueur et épaisseur du colon, taille de l'oedeme et des adhérences mésentériques) et des prélèvements tissulaires seront réalisés
Impact sur les animaux
Avec le régime supplémenté ou avec le modèle d'injection, l'induction du processus de cholestase hépatique est asymptomatique et sans douleur. Seuls les animaux traités par injection intrapéritonéale ressentiront potentiellement une douleur légère et de courte durée. Par contre, pour les deux modèles de colites, des douleurs inflammatoires transitoires seront ressenties par les animaux. Les nuisances liées aux modèles DSS ou Oxazolone sont les suivantes : pertes de poids, douleurs abdominales, sang dans les selles, diarrhées, perte d’appétit et souris prostrées.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Les organes seront prélevés et utilisés pour des analyses ultérieures en laboratoire
Remplacement
Le développement de la cholangite sclérosante primaire (CSP) et des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) chez l’Homme est un processus long et complexe mettant en jeu de nombreux facteurs génétiques et environnementaux. Les modèles murins génétiquement modifiés miment les pathologies humaines et sont la seule solution actuelle pour obtenir des données avec une relevance physiologique correcte. Pour atteindre les objectifs de nos études, il est nécessaire d'utiliser des modèles in vivo capables de tenir compte de nombreuses voies physiologiques intégrées. Actuellement, il n'existe pas de méthodes alternatives à ces études in vivo. L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (CSP et MICI). De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce d'animaux n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, primers) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués.
Réduction
Le nombre de souris utilisé dans chaque expérience a été calculé à minima en tenant compte de la variance biologique des résultats obtenus. Les données obtenues dans les différents groupes seront comparées à l'aide d'un test statistique approprié. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tous les échantillons prélevés sont stockés à - 80°C et dans une banque de données. Ils peuvent être réutilisés ou servir de témoins dans des expériences ultérieures.
Raffinement
Les souris sont hébergées par 5 dans des cages de portoirs ventilés d’une surface au sol de 500 cm2, à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Elles ont une maison en plastique et des fibres de carton comme enrichissement. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Des analgésiques, des antalgiques ou des anti-inflammatoires risquent d'interférer avec le cours de notre expérimentation. Néanmoins, nous avons mis en place des critères d'arrêt par rapport à la souffrance potentielle des souris durant l'expérimentation. Les souris sont contrôlées tous les jours, voire deux fois par jour. Les critères suivants sont pris en compte : - perte de poids est supérieure à 20% du poids initial - activité extrême (grattage ou léchage anormal) - posture prostrée - aspect (amaigrissement, déshydratation, poils hérissés, salissures et écoulements) - absence de toilettage et diminution de l'appétit - anomalies de la respiration (rythme et mouvements) - hypo ou hyperthermie. Si l'un de ces critères est atteint, l'expérimentation est immédiatement arrêtée et les souris sont euthanasiées. Un suivi quotidien est assuré par les membres de la SBEA (Structure en Charge du Bien-Etre Animal).
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant plusieurs pathologies humaines comme en témoignent les nombreuses références bibliographiques (Cholangite sclérosante primaire (CSP et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)). Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l'utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l'utilisation des animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce animale n'est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d'outils précieux (anticorps, primers..) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Enfin, les procédures de CSP et de MICI utilisées dans ce projet ont été validées que chez la souris. Souris jeunes et adultes (de 4 et 8 semaines). A cet âge, aucune des lignées étudiées ne présentent de phénotype. Pour les procédures (impact des modèles de CSP sur la fonction de barrière intestinale et la susceptibilité à l'inflammation) nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines. Ces souris seront traitées avec les deux procédures expérimentales permettant d'induire une CSP. Puis, certains lots de souris seront traités ou non avec l'une des deux procédures expérimentales permettant d'induire une inflammation intestinale. Pour les procédures (impact de la colite sur la sensibilité à la CSP) nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines. Ces lots de souris seront traités ou non avec les deux procédures expérimentales permettant d'induire une inflammation. Puis, certains lots de souris seront traités ou non avec l'une des deux procédures expérimentale permettant d'induire une CSP.
Évaluation du comportement PICA chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Détecter le potentiel nauséeux d'un candidat médicament avant son premier passage chez des volontaires humains : 1 500 rats vont être utilisés pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous seront tués à l'issue. Le comportement dit pica, la consommation d'une substance non nutritive, sert d'indicateur des nausées chez une espèce qui ne vomit pas. Chaque rat est hébergé seul sur grille, reçoit jusqu'à trois administrations par jour d'une substance émétisante ou du produit testé, jeûne jusqu'à seize heures en fin de procédure et peut subir jusqu'à douze prélèvements de sang. Le porteur justifie la mise à mort par la sévérité de la procédure et par le stress lié à l'hébergement, et conclut que les tests in vitro déjà réalisés ne reflètent pas la complexité du système digestif humain, ce qui rend selon lui les modèles animaux "indispensables".
Objectifs
Les nausées sont des sensations désagréables souvent accompagnées de vomissements (expulsion orale forcée du contenu du tractus gastro-intestinal supérieur), et sont couramment rencontrées dans la pratique clinique. Ces symptômes sont associés à diverses pathologies, notamment les troubles gastro-intestinaux, les infections virales ou bactériennes, les maladies métaboliques comme le diabète etc. D’autre part, les nausées sont l'un des effets secondaires les plus fréquemment signalés des médicaments prescrits et sont particulièrement redoutés des patients sous chimiothérapie. Ces symptômes sont également les plus rencontrés lorsqu’une nouvelle entité chimique est administrée pour la première fois à des volontaires sains. Une méthode de reconnaissance précoce des nausées et des vomissements est donc nécessaire avant qu'un nouveau médicament potentiel n'entre sur le marché et ne fasse l'objet d'essais chez l'homme. Enfin, l'identification des mécanismes et cibles impliqués nauséeux et émétique donneront également des indications importantes sur les nouvelles approches en matière de potentiel médicaments contre la nausée et les vomissements.
Bénéfices attendus
Ces études ont pour objectifs d’une part d’évaluer l’efficacité d’un traitement contre les nausées et les vomissements induit par une substance de référence ou d’autre part d’identifier les potentiels effets secondaires nauséeux causées par l’administration d’un candidat médicament.
Procédures
Les substances d'essais peuvent être administrées par bolus (durée de quelques secondes) ou par perfusion lente de quelques minutes. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours (le plus souvent, 1 administration par jour pendant la durée du test avec au maximum 3 adminsitration par jours), et cela en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux sont acclimatés aux conditions d’hébergement du test pendant 3 jours. Le comportement PICA des animaux est évalué sur en mesurant la consommation individuelle d'une substance non nutritive sur une période de 4 jours au maximum (soit uen durée maximale du test de 7 jours incluant la periode d'habituation). Par ailleurs, les animaux peuvent recevoir au préalable du test une substance réactive (administration unique ou répétée , 2 fois par jours maximum) pour évaluer l’effet l’efficacité anti-émétique des candidats médicament. Enfin, si nécessaire et selon l’objectif de l’étude des prélèvements sanguins (durée de quelques secondes, 6 maximum par jours avec un maxium de 12 prélévements au total) pourront être réalisés.
Impact sur les animaux
Un stress lié à l'hébergement individuel sur grille et à la répétition de cet hébergement tout au long de la procedure ( i.e. acclimatation et sessions test) ainsi qu'a une mise à jeun (n’excédant pas 16 h) en fin de procedure peut être ressenti. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou un inconfort liés à la sensation de nausée.
Devenir
La procédure est sévere, de plus les animaux sont soumis à un stress lié à la modification des condition d'hebergement durant la procédure ils seront donc euthanasiés à l'issue de la procédure.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments testés des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire pour ne retenir que les molécules présentant une certaine efficacité. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester (et donc du nombre d’animaux), ils ne reflètent pas la complexité du système gastro-intestinal humain qui est en constante interaction avec le système nerveux central chez l’Homme. Ainsi, les modèles d'animaux restent indispensables pour valider et optimiser de nouvelles thérapies pour leur utilisation en toute sécurité chez l'Homme.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif (substance de référence ou de comparaison) si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux en standard par groupe (nombre d'animaux et groupes variables, selon l’objectif de l’étude) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le comportement pica chez le rat est médié par les même mécanismes de vomissement chez l’Homme. Par ailleurs, le comportement pica est assimilable aux vomissements observables chez d’autres espèces. Tous les animaux seront utilisés après 4 semaines de développement (après sevrage) et jusqu'a 5 mois. En effet, les données de la littérature montrent qu'à partir de 5 mois d'age les animaux deviennent plus anxieux, ce qui peut interférer avce le test.
Impact d’une exposition alimentaire aux pesticides sur un modèle murin génétiquement prédisposé à la MASLD
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une perte de poids supérieure à 20 % vaut le score maximal sur la grille de suivi et retire la souris de l'expérimentation. 112 souris, dont le récepteur CAR a été rendu non fonctionnel, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées après un prélèvement de sang aux veines porte et cave. Elles mangent pendant soixante semaines une nourriture additionnée de glyphosate ou d'un mélange de boscalid et de lambda-cyhalothrine, subissent une glycémie à jeun tous les deux mois, deux prélèvements de sang à la joue, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept mesures sur deux heures chacun, un gavage qui peut irriter l'œsophage et 23 heures seules en cage à métabolisme. Le porteur revendique des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde, sur des paramètres que les études toxicologiques réglementaires explorent peu.
Objectifs
La maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique (MASLD) et les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin (MICI) sont en constante augmentation. Outre les facteurs génétiques et le mode de vie (sédentarité, alimentation), l’exposition aux pesticides peut être un facteur de risque au développement de ces pathologies. Des études montrent que le microbiote intestinal est aussi impliqué. Le glyphosate est l’herbicide le plus utilisé dans le monde et on le retrouve dans les aliments. Il agit sur une enzyme présente chez les champignons, les végétaux et certaines bactéries du microbiote intestinal avec comme conséquence un blocage de la synthèse des protéines. L’exposition au glyphosate change la composition du microbiote et modifie l’expression de gènes du foie parmi lesquels le récepteur nucléaire CAR (Constitutive Androstane Receptor). Le boscalid (fongicide) et le λ-cyhalothrine (insecticide) sont également retrouvés dans l’alimentation. Des résultats préliminaires obtenus sur une lignée de cellules de foie montrent qu’un mélange de boscalid et de λ-cyhalothrine agit sur le récepteur CAR. Par ailleurs, ce récepteur CAR est impliqué dans le développement des MASLD, associées à des perturbations du microbiote intestinal et à une inflammation intestinale. Dans ce projet nous voulons tester l’hypothèse que ces pesticides seuls ou en mélange, dans un contexte où les capacités de détoxification de l’organisme sont altérées via l’inactivation du récepteur CAR, favorisent le développement de la MASLD et des MICI. Nous étudierons donc l’impact d’une exposition alimentaire chronique au glyphosate et à un mélange boscalid/ lambda-cyhalothrine en utilisant des souris mâles et femelles dont le gène CAR a été inactivé.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous souhaitons approfondir les connaissances sur l’impact de l’exposition alimentaire au glyphosate et à un mélange de pesticides dans un contexte de prédisposition génétique à la maladie du foie associée à un dysfonctionnement métabolique et à l’inflammation intestinale. Le projet fournira des données indépendantes sur le pesticide le plus utilisé et le plus controversé au monde mais également sur l’effet d’un mélange de pesticides retrouvés dans l’alimentation. Il permettra d’étudier aussi certains paramètres peu explorés dans les études toxicologiques réglementaires, à savoir les effets sur le microbiote intestinal et l'inflammation intestinale.
Procédures
Ces souris seront nourries pendant 60 semaines (14 mois) avec un régime standard, et exposées via l’alimentation au glyphosate ou au mélange du Boscalid/Lambda-Cyhalothrine à des doses toxicologiques de référence (dose journalière admissible ou dose sans effet nocif observable). Tous les 2 mois, la glycémie à jeun sera réalisée par dosage du glucose dans une goutte de sang prélevée à la veine de la queue, ainsi qu’un dosage de lipocaline (marqueur de l’inflammation intestinale) en récupérant les fécès des animaux. Durant les 60 semaines, du sang sera prélevé à la joue (maximum 100 μl/prélèvement), à deux moments, afin de doser des marqueurs de dommages hépatiques. Les souris subiront également : - un test de tolérance au glucose, qui sera administré par gavage (moins d'1 minute par animal) et à la suite duquel la glycémie sera mesurée à intervalle régulier sur 2h (7 fois) comme décrit précédemment. - un test de tolérance à l’insuline par une injection intrapéritonéale avec une seringue adaptée (insuline), suivi d’une mesure de glycémie à intervalle régulier sur 2h (7fois), comme décrit précédemment. - un test de perméabilité intestinale qui nécessitera un gavage oral avec une sonde de gavage adaptée (moins d'1 minute par animal), suivi de deux prélèvement d’1 goutte de sang (10µl) à la queue - enfin, afin de récupérer les urines et fèces, les animaux seront placés en cages à métabolisme 1 fois au cours de l’expérimentation durant 23 h maximum. Selon les résultats obtenus, les animaux recevront un régime enrichi en gras et en sucre (Western Diet) pendant les 8 dernières semaines ou seront exposés au Dextran Sulfate Sodium dans l’eau de boisson destiné à provoquer une inflammation intestinale. A la fin de l’essai, un prélèvement de sang à la veine porte et la veine cave sous analgésie et anesthésie générale sera réalisé.
Impact sur les animaux
Le prélèvement sanguin à la veine maxillaire et le gavage oral de glucose et l’injection intrapéritonéale d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention, une douleur possible au point d’injection. De plus, le prélèvement à la joue peut induire un épanchement au niveau de la joue chez les individus et le gavage oral au glucose peut induire une irritation de l’œsophage. L’hébergement isolé (1 animal/cage) lors des récoltes d’urine en cages métaboliques peut entraîner un stress de l’animal. Le challenge au Dextran Sulfate Sodium, visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids et une colite plus importante chez les animaux exposés aux pesticides comparés aux animaux contrôles. Le régime Western Diet induit une obésité chez les animaux, ainsi que des perturbations métaboliques généralement associées à l'obésité : intolérance au glucose (diabète), accumulation de triglycérides dans le foie, augmentation de la perméabilité intestinale, sans souffrance visible des animaux, ni changement drastique de leur comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’expérimentation suite aux prélèvements de sang à la veine porte et cave (entrée et sortie du sang dans le foie), et différents organes seront récupérés pour réaliser les analyses et répondre à la question scientifique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux de laboratoire est nécessaire car le projet étudie des phénomènes biologiques (voies métaboliques) qui font intervenir différents tissus (foie, intestin, tissu adipeux) agissant en synergie via un dialogue inter-organe. De plus, afin d'étudier l'interaction entre l'alimentation et le microbiote intestinal, ainsi que les voies métaboliques impliquées dans l'axe intestin-foie, l'utilisation de souris de laboratoire est appropriée avec notamment la possibilité d'utiliser des animaux génétiquement modifiés. Enfin, actuellement, il est impossible de mimer ce dialogue complexe entre les différents compartiments et organes par l'utilisation de méthodes alternatives (modèles cellulaires).
Réduction
Nous avons soigneusement conçu les expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Un nombre suffisant de souris sera utilisé dans toutes les expériences afin d'observer des effets biologiquement pertinents et statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé par un test statistique et basé sur nos résultats préliminaires. Le nombre idéal d’animaux par lots est donc de 12.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages de 4 animaux dont le milieu d'élevage est enrichi d'un abri en inox permettant aux souris de s'isoler de leurs congénères si besoin. Afin de limiter le stress, les animaux sont manipulés régulièrement et habitués à la contention. Afin d'évaluer la souffrance, la détresse et l'inconfort des animaux, des points limites gradés seront mis en place basés sur l'évaluation de 4 aspects de l'état de l'animal : (i) variation du poids de l'animal (et variations connexes au niveau de l'ingestion d'aliment et d'eau) ; (ii) apparence physique externe ; (iii) changement dans les comportements non provoqués et (iv) réponses comportementales aux stimuli externes. Pour chaque catégorie, un système d'évaluation avec indices de 0 (normal ou léger) à 3 (changements importants par rapport à la normale) sera proposé. L'indice cumulatif obtenu en ajoutant les valeurs de chacun de ces aspects indiquera chez l'animal une déviation croissante par rapport à la normale qui peut être interprétée comme étant une indication de souffrance et/ou de détresse croissante. Ainsi, si un animal présente un score de 3 ou plus après évaluation de ces 5 critères, le critère d'arrêt sera atteint, l'animal sera retiré de l'expérimentation. Par exemple, une perte de poids supérieure à 20% entrainera un score de 3 pour cet aspect de l’état de l’animal, et constituera un critère d’arrêt. Ce score sera calculé sur chaque animal, de façon hebdomadaire. Lors du séjour en cage à métabolisme, les animaux bénéficieront d'un abri inox et les contacst olfactif et visuel avec leurs congénères seront maintenus.
Choix des espèces
Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche concernant le métabolisme. De plus, nous souhaitons étudier le rôle du récepteur CAR dans la toxicité des pesticides grâce à un modèle murin dont le gène CAR est non fonctionnel. Ce modèle existe uniquement chez la souris. Nous utiliserons des souris âgées de 4 semaines (au sevrage). En effet, c’est au moment du sevrage que le microbiote intestinal de l’animal se met en place avec le changement d’alimentation. Les animaux recevront donc les régimes expérimentaux dès le sevrage et jusqu’à l’âge de 64 semaines. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles car il existe chez l'homme des différences entre sexes dans le développement des maladies hépatiques mais également dans l'expression du récepteur CAR.
Physiopathologie et approches thérapeutiques de l’Ileus post-opératoire
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Toute souris dont le score clinique dépasse 8 est mise à mort. 3 348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent une manipulation de l'intestin de dix minutes sous anesthésie pour provoquer un iléus, l'insertion d'une bille dans le colon, des gavages au charbon, six heures d'isolement en cage individuelle et, pour certaines, l'administration pendant trois jours du microbiote fécal de patients opérés. Le porteur annonce en retour des durées d'hospitalisation raccourcies et la fin d'une mortalité liée à cette complication chirurgicale, pour laquelle aucun traitement médicamenteux n'est connu à ce jour.
Objectifs
L'ileus post opératoire est une complication survenant après une chirurgie abdominale induisant un ralentissement voire un arrêt du transit intestinal. L'objectif de ce projet est d'identifier de nouvelles voies physiopathologiques de l'ileus post-opératoire et d'évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques en utilisant un modèle murin.
Bénéfices attendus
Il n'existe pas de traitement médicamenteux connu à ce jour malgré l'incidence élevée de l'ileus post opératoire chez les patients. Le bénéfice de ce projet est d'identifier et de valider des molécules thérapeutiques permettant la résolution de l'iléus. Cela permettra de réduire la durée d’hospitalisation et éviter a mortalité des patients liés à cette complication chirurgicale.
Procédures
Une manipulation intestinale durant 10 minutes permettant d’induire l’ileus post opératoire chez la souris va être réalisée sous anesthésie générale et analgésie. Les molécules thérapeutiques candidates vont être administrées avant ou après la chirurgie. Afin d’évaluer l’efficacité de celles-ci, la vitesse de transit des différentes portions du tractus digestif (intestin grêle et colon) va être relevée ainsi que la vitesse du transit total grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui va permettre de relever le temps d’apparition d’une selle noire (entre 2 et 3 heures – temps limité à 6 heures pour l’animal). La vitesse du transit dans le colon sera mesurée grâce à l’insertion intra-colique d’une bille (dont la taille est équivalente à une fécès de souris) à l’aide de vaseline et sous anesthésie. Le temps d’expulsion de la bille sera le reflet de la vitesse du transit colique (autour de 2 minutes – temps limité à 15 minutes pour l’animal). La vitesse du transit de l’intestin grêle sera ensuite mesurée 24 heures après la chirurgie grâce à l’administration per os d’une solution de charbon qui permet de visualiser à l’œil nu l’avancement du charbon dans l’intestin grêle post mortem (20 minutes après le gavage). La perméabilité intestinale va être également étudiée grâce à l’administration d’une molécule fluorescente qui est retrouvée dans le sang en quantité proportionnelle à la perméabilité intestinale. Ainsi 4h après l’administration de la molécule, du sang va être prélevé sous anesthésie. L’influence du microbiote intestinal sur l’induction de l’ileus va être étudié en administrant le microbiote fécal pendant 3 jours provenant de patient ayant développé un ileus post opératoire avant de réaliser une manipulation intestinale de la souris.
Impact sur les animaux
inconfort abdominal (constipation, ballonements, gaz) induit par la manipulation intestinale stress induit par la mise à jeun, possibles douleurs post-chirurgicales, l’isolement pendant 6 h dans une cage individuelle lors de la mesure de la motricité colique et les administrations.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux sont euthanasiés dans le but de prelever les tissus en vue d'analyse histologique, moléculaire, contractile et microbiologique.
Remplacement
Les méthodes alternatives permettant l’étude de l'ileus post-opératoire et notamment de la motilité intestinale sont inexistantes. En effet les modèles in vitro actuels ne permettent pas de reconstituer l'environnement et les intéractions complexes entre les différents acteurs menant à l'ileus post opératoire. Ainsi, ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale afin de valider de nouvelles cibles thérapeutiques. Cependant les approches in vitro sont indispensables en amont pour valider l’efficacité des molécules candidates.
Réduction
Les datas générées grâce à l'apafis précédent nous ont permis d’utiliser l'application EDA développée par le NC3R afin de déterminer le nombre d'animaux par groupe requis pour obtenir une analyse stastique fiable et appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins et du même âge pour obtenir des résultats robustes. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours sont conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible à l’équipe ou aux collaborateurs, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Une recherche bibliographique approfondie a été réalisée en amont pour sélectionner des procédures à degré de sévérité légère réalisables après la chirugie ne nécessitant pas l’euthanasie de l’animal. Cela nous permet de réaliser une cinétique du transit intestinal sans euthanasie d’un groupe d’animaux à chaque temps.
Raffinement
Les souris seront mises par groupe afin d’établir une hierarchie et des contacts visuels, olfactifs, auditifs et tactiles. La surface au sol nécessaire par animal sera respectée. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. L’environnement des souris est enrichi avec a minima un igloo et du materiel de nidification tel que des serpentins et du sopalin. Le change de la litière est réalisé 1 fois tous les 15 jours. Les animaux ont au minimum une semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. L’état des animaux vérifié quotidiennement, deux fois après la chirurgie. La fréquence de surveillance est augmenté si le score total >2. Lors de la chirurgie, un tapis chauffant est systématiquement utilisé, les animaux sont sous anesthésie profonde surveillée et un agent analgésique est administré en période pré et post opératoire. En complément du tapis chauffant, des chaufferettes sont disposées de part et d'autre de l'animal afin d'éviter l'hypothermie. Lorsque les animaux sont réveillés ils sont remis dans leur cage avec du coton pour améliorer leur confort. Les expérimentateurs réalisant les procédures sont tous dotés du diplôme de chirurgie et appliquent les bonnes pratiques pour le suivi des compétences. L’application stricte des points limites définis au préalable sera réalisée. Tout animal présentant un aspect inhabituel : prostration, hypothermie, perte de poids (proportionelle au temps post chirurgie) fera l'objet d'une attention accrue et bénéficiera de soins appropriés. Une grille de scoring a été générée et adaptée aux types de procédures. Si le score total >8 alors l'animal sera euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris présente certains intérêts décisifs justifiant leur utilisation comme modèle dans ce type de projet : la physiologie digestive de la souris est très proche de celle de l'Homme et la manipulation intestinale qui a lieu lors d’une chirurgie de patient humain peut être reproduite à l’identique chez la souris.
Modèle préclinique d’insuffisance hépatique modérée ou sévère pour tester l’effet thérapeutique des molécules candidates
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
L'état des souris est suivi de près pour les tuer avant une mort certaine: 4 680 souris vont être utilisées dans ce modèle d'insuffisance hépatique aiguë, 4 080 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 600 un niveau modéré, toutes tuées à l'issue. Après seize heures de jeûne, elles reçoivent par gavage une surdose de paracétamol ou de thioacétamide qui détériore leur foie dans les heures qui suivent, avec douleurs abdominales, baisse de mobilité et arrêt du toilettage. Le porteur prévoit quinze souris par groupe pour le modèle sévère parce que la mortalité doit être intégrée au calcul, et précise qu'une souris morte spontanément devient inexploitable puisque son foie se dégrade. Un antidote existe déjà et se montre efficace dans les huit heures, le projet visant à élargir cette fenêtre.
Objectifs
L’acétaminophène (ou paracétamol ou APAP) est amplement utilisé comme médicament analgésique et pour faire baisser la fièvre, il ne présente pas de risque au patient en dose thérapeutique. Cependant, il peut induire des lésions sévères du foie, voir même une insuffisance hépatique aigüe en cas de surdose. Nombreux cas de surdoses de l’acétaminophène intentionnelle ou non sont comptabilisés spécialement dans les pays occidentaux avec un taux élevé d’insuffisance hépatique. En France, cette surdose représente la cause la plus fréquente d’insuffisance hépatique aigüe sévère avec un taux de mortalité de 22 %, c’est donc un grave problème de santé publique. A ce jour, un seul antidote est cliniquement prouvé mais bien qu’il se soit révélé très efficace pour prévenir les lésions hépatiques après un surdosage d'acétaminophène, l'efficacité thérapeutique est la plus élevée lorsqu'elle est administrée dans les 8 heures suivant l'accident. La recherche d'une thérapie ou d’un médicament permettant d'élargir la fenêtre thérapeutique a conduit à des études approfondies sur les mécanismes de mort cellulaire et sur les lésions hépatiques après une surdose d’acétaminophène. Les modèles d’insuffisance hépatique aigüe par intoxication de la souris avec surdose d’acétaminophène ou de thioacétamide qui est développé dans ce projet ont pour but de fournir la possibilité de tester différentes cibles thérapeutiques (composée chimiques ou thérapie cellulaire) dans un contexte d’intoxication modérée à sévère.
Bénéfices attendus
La surdose de paracétamol est un problème de santé publique important et l’insuffisance hépatique la principale cause de mortalité ou qui nécessite de transplantation hépatique. Le modèle d’insuffisance hépatique aigüe chez la souris, causé soit par surdose d’acétaminophène soit par surdose de thioacétamide est un modèle court. Il permet ainsi de tester rapidement l’efficacité de différentes thérapies (action sur la production de métabolite toxique et de ce fait sur la nécrose hépatique). Par conséquence, après validation clinique, cela permettra d’avoir une alternative à la transplantation de foie.
Procédures
Pour induire une insuffisance hépatique aigue modérée ou sévère, les animaux seront mis à jeun pendant 16h. Ils recevront un gavage en surdose qui engendrera une détérioration de leur foie dans les heures suivant cette administration. L’état des animaux sera suivi de près pour intervenir rapidement et euthanasier un animal avant une mort certaine. Les prélèvements de sang (100µL) seront réalisés de préférence à la veine maxillaire sur animal vigile (le prélèvement dure moins d’une minute) avant intoxication puis 24h post intoxication. Lors de l'euthanasie, le prélèvement de sang terminal sera effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sous anesthésie et analgésie. Le prélèvement dure moins de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle développé a pour but d’induire une insuffisance hépatique, selon la surdose, elle peut être modérée ou sévère. Cette pathologie cause de la douleur au niveau abdominal, les animaux peuvent montrer des signes de mal être, réduire leur mobilité/exploration de la cage, ainsi que leur toilettage. En fonction de la dose, ces effets peuvent durer plus ou moins longtemps. Une observation sera réalisée à différents temps après intoxication, les symptomes observés serviront à grader l’évolution de la maladie. Les effets secondaires des candidats médicaments ne sont pas toujours connus. Tout effet secondaire est répertorié et si cela impacte le bien être de l’animal, cela serait un point limite qui entrainerait l’arrêt du traitement, voir l’euthanasie de l’animal/du groupe de traitement.
Devenir
En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).
Remplacement
Des modèles in vitro pour comprendre la mécanistique du paracétamol et des composées à tester existent et peuvent être réalisés avec des cultures de cellules hépatiques primaires de souris ou humaines. Cela permet de sélectionner des molécules ou thérapies qui présentent un effet sur les points clés de la pathologie étudiée. Les cellules primaires présentent une limite entre leur viabilité et le temps en culture. En effet, elles ne sont pas viables après 24h en culture. Une autre limite est l’absence de cellules immunitaires, présentent dans l'organisme et qui jouent un rôle dans la régénération du foie. La relevance clinique des modèles cellulaires n’est pas très claire et peut ne pas être applicable à la réalité clinique.
Réduction
L’objectif de cette étude est d’avoir différents niveaux d’insuffisance hépatique causée par l'intoxication afin de pouvoir tester différentes interventions thérapeutiques. Les animaux auront un suivi accru qui permettra de minimiser la souffrance et en même temps qui garantit le phénotype pathologique. Comme ce modèle va varier entre une intoxication modérée et sévère, la mortalité doit être prise en compte bien qu’elle sera accompagnée et suivie afin d’éviter la mort spontanée et la souffrance extrême de l’animal. En conséquence, un nombre plus élevé de souris n=15 par groupe sera envisagé pour le modèle d’insuffisance hépatique sévère afin de garantir la puissance statistique du projet. Il est important de mentionner, qu’une souris morte spontanément ne pourra pas rentrer dans les analyses car son foie se dégénère et n’est plus exploitable.
Raffinement
Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et plusieurs types d’enrichissement seront mis dans les cages (tunnel, Aspen brick, coton, igloo et Sizzelnest). L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être. Après intoxication, les animaux vont montrer des signes de mal-être (baisse de l'activité dans la cage, un pelage moins brillant, baisse de la température corporelle, perte de poids), ces symptomes seront gradés. Dans le cas d'atteintes sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements de sang seront effectués de préférence à la veine maxillaire sur animal vigile ou à défaut au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie gazeuse et avec un anesthésique local.
Choix des espèces
L’overdose de paracétamol chez la souris présente des nombreuses caractéristiques pathophysiologique similaire à l’humain. A partir de la maturité sexuelle (8 semaines d’âge). Les jeunes souris avant 8 semaines d’âge métabolisent différemment l’acétaminophène et cela ne correspond pas à la pathologie humaine.
Détermination des rôles de ALK1 dans l’angiogenèse et la quiescence vasculaire en utilisant des modèles murins.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Comprendre pourquoi une maladie génétique rare abîme surtout les vaisseaux du foie et des poumons: 620 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit trois à dix injections en état vigile, et environ un tiers subit une chirurgie avec perfusion menée sous anesthésie, sans réveil. Le porteur indique que les injections provoquent une douleur passagère, un risque d'infection et d'hématome, et que l'invalidation du gène étudié peut entraîner une perte de poids ou une baisse d'activité, l'état des nouveau-nés étant noté sur une grille qui suit la prise de nourriture, la croissance et la respiration. Les souris portent la modification génétique des patients, et le porteur juge "indispensable" d'en étudier à la fois de jeunes et des adultes.
Objectifs
Nous étudions une une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Le diagnostic est souvent tardif car les symptômes se manifestent autour de 40 ans avec une grande variété de symptômes. Il s’agit d’une maladie génétique rare (1 cas sur 6000 naissances) dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le développement de traitements pour des patients atteints de cette maladie.
Bénéfices attendus
Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins principalement dans le foie et les poumons. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique. Les patients atteints de cette maladie ont des problèmes de malformations vasculaires hépatiques et pulmonaires. Aucun traitement à cette pathologie n’existe, nécessitant des recherches dans ce domaine.
Procédures
Des injections sur animaux vigiles sont effectuées sur l’ensemble des animaux, au nombre de 3 à 10 maximum et d’une durée inférieure à 30 secondes chacune. Une injection sur animaux anesthésiés est prévue sur moins d’un quart des animaux et d’une durée inférieure à 30 secondes. Une chirurgie avec perfusion est prévue sur environ un tiers des animaux, après administration d’analgésiques et d’anesthésiants, et d’une durée maximale de 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les injections sur animaux vigiles induisent une douleur passagère (quelques minutes maximum), un risque d’infection et d’hématome, ainsi qu’un stress suite à l’immobilisation (maximum 30 secondes). Lorsqu’une chirurgie est prévue, elle est sans réveil et d’une durée inférieure à 10 minutes. Une légère perte de poids ou une diminution d’activité sont possibles à la suite de l’invalidation du gène étudié.
Devenir
Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.
Remplacement
Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules des vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre pourquoi cette pathologie touche particulièrement les vaisseaux du foie et du poumon, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.
Réduction
Nous avons utilisé un logiciel statistique ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires pour garantir la validité des résultats avec un nombre d’animaux minimal.
Raffinement
Le bien-être des animaux est évalué quotidiennement par le personnel de l’animalerie. Dans chaque procédure induisant une douleur, des anesthésiants et des analgésiques sont utilisés. Suite à l’anesthésie (après environ 10 minutes), la perte totale de réactivité est testée en exerçant une pression sur les pattes avant d’effectuer tout geste technique invasif. Chez les nouveau-nés, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue la prise de nourriture du nouveau-né, la croissance et la respiration. Chez l’adulte, un examen attentif permet d’évaluer les animaux sur les différents points de la grille de scoring mise en place qui évalue le changement de poids corporel, l’apparence physique et le comportement.
Choix des espèces
Les souris utilisées ont une modification génétique équivalente à celles des patients atteints de la maladie que nous étudions. Ce modèle murin est le seul existant actuellement permettant d’analyser le développement des malformations vasculaires de cette maladie. Les animaux seront soit des jeunes pour l’étude des vaisseaux en cours de développement, soit des adultes pour l’étude des vaisseaux stabilisés. Certains symptômes de la maladie sont de naissance, tandis que d’autres apparaissent à l’âge adulte. Il nous apparaît donc indispensable d’étudier les 2 âges.
Validation préclinique chez le modèle porcin d’un dispositif électronique ingestible permettant de moduler l’activité vagale et cérébrale de manière non invasive
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
22 porcs juvéniles de 30 à 40 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant des anesthésies générales plafonnées à six heures. Un dispositif filaire de stimulation est inséré dans le duodénum, par chirurgie ou par canule, puis les animaux passent un scanner et un électrocardiogramme, parfois deux scintigraphies gastriques à une semaine d'intervalle ou une imagerie cérébrale de deux heures trente. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'il n'est pas possible de les remettre dans le circuit d'élevage pour la consommation humaine. Le bénéfice décrit reste une étape intermédiaire : valider un prototype filaire, pour envisager plus tard un dispositif ingestible autonome, lui-même préalable à un éventuel usage chez l'humain.
Objectifs
De nombreuses pathologies d’origine nutritionnelle ou digestive font état d’anomalies de communication au niveau de l’axe intestin-cerveau, comme en contexte d’obésité, de gastroparésie ou de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Le nerf vague joue un rôle majeur dans cette communication entre organes et différentes approches thérapeutiques invasives ont déjà été envisagées pour stimuler le nerf vague, comme la stimulation électrique avec implantation d’électrodes et de stimulateur par voie chirurgicale. L’objectif de cette étude préclinique est de tester un dispositif électronique ingestible qui serait capable de parvenir au niveau de l’intestin et de s’y déployer pour stimuler les neurites (terminaisons nerveuses) des villosités intestinales, modulant ainsi l’activité du nerf vague, par voie de conséquence la vitesse de vidange gastrique (la stimulation du nerf vague permettant de détendre le sphincter pylorique et d’accélérer la vidange gastrique) et in fine les réponses cérébrales, notamment à une stimulation alimentaire gustative sucrée. Dans la présente étude pilote, un prototype filaire du dispositif sera testé chez le modèle porcin afin de valider les effets de la stimulation opérée par ce dispositif au niveau de l’activité du nerf vague, de ses effets au niveau gastrique et cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité d’un premier prototype filaire capable de moduler l’activité vagale, la vidange gastrique et les réponses cérébrales par stimulation des neurites au niveau de l’intestin. Une fois cette preuve de concept obtenue, permettant de disposer de paramètres de stimulation efficaces, un futur projet pourra être envisagé cette fois avec un dispositif ingestible capable de se déployer de manière autonome dans l’intestin grêle, donc sans nécessité d’implantation chirurgicale. Cette solution représenterait une alternative non invasive en comparaison des autres techniques de stimulation vagale existantes, facilement implémentable et modulable en fonction des patients. En fin de vie ou d’action, le dispositif ingestible final sera excrété par voie naturelle via les fèces.
Procédures
Quatre animaux permettront de déterminer la meilleure stratégie pour implanter le dispositif de stimulation filaire : 1) la stratégie la moins invasive, privilégiée, correspond à l’insertion préalable du dispositif filaire sous anesthésie générale ; 2) la stratégie alternative, choisie si le dispositif ne peut pas rester longtemps en place, nécessite l’implantation d’une canule duodénale permettant l’insertion du dispositif le jour des mesures. Une fois le mode d’insertion choisi, 4 à 6 nouveaux animaux seront implantés avant d’être soumis à une imagerie anatomique CT-Scan (rayons X) et un enregistrement électrocardiographique (ECG) sous anesthésie générale pour repérer le dispositif dans le duodénum et évaluer l’effet de la stimulation sur l’activité vagale (intervention unique de 1h30 à 2h). Si aucun effet n’est observé durant l’ECG, les animaux seront soumis à 2 scintigraphies gastriques à une semaine d’intervalle, afin d’évaluer indirectement l’effet de la stimulation sur l’activité vagale en évaluant le temps de vidange gastrique après un repas test radiomarqué (interventions de 2h à 2h30). Sur 9 à 12 animaux différents, une imagerie par résonance magnétique fonctionnelle cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale une semaine après l’intervention chirurgicale, afin d’évaluer l’effet de la stimulation sur l’activité cérébrale et les réponses cérébrales à une stimulation gustative sucrée (intervention de 2h à 2h30).
Impact sur les animaux
Douleur, lésion physique ou gêne après intervention chirurgicale. Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement en cages individuelles, même si les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères. Stress psychosocial léger au début de l’habituation au hamac de contention, si l’option de réaliser des scintigraphies gastriques est retenue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des étapes du projet. Il n'est en effet pas possible de conserver ces animaux ni de les remettre dans le circuit d'élevage pour une consommation humaine ultérieure. Par ailleurs, des prélèvements intestinaux sont susceptibles d'être réalisés après la mise à mort afin de vérifier l'absence d'inflammation au niveau du site de fixation du dispositif de stimulation.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont de valider les effets d’un prototype de dispositif médical capable de stimuler le nerf vague via les terminaisons nerveuses intestinales et de moduler l’activité cérébrale, notamment en réponse à des stimuli alimentaires comme une stimulation sucrée. Ce dispositif doit impérativement être testé sur un modèle in vivo pertinent avant de l’optimiser et de l’appliquer à une étude clinique chez l’humain. Le porc est un animal de référence pour l’expérimentation médicale en chirurgie, gastroentérologie, nutrition et neurosciences. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. De plus, de très nombreuses études ont été publiées sur ce modèle dans le domaine de l’imagerie cérébrale, notamment par notre équipe qui est un des leaders sur le sujet.
Réduction
Quatre animaux sont un strict minimum nécessaire pour tester les deux stratégies d'insertion du dispositif de stimulation, chaque animal représentant son propre contrôle lors des mesures ECG et de vidange gastrique. Comme précédemment validé et publié, un effectif d’environ 8-9 animaux représente le minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre groupes ou traitements expérimentaux dans le domaine de l’imagerie cérébrale par IRMf, mais nous avons décidé d’inclure 12 animaux afin de garantir une puissance statistique satisfaisante tout en palliant d’éventuels imprévus.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par un chirurgien spécialiste de la chirurgie gastrointestinale chez l’humain et de la chirurgie expérimentale sur modèle porcin, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Les scintigraphies gastriques ne seront réalisées qu’en l’absence d’effet au niveau de la variabilité du rythme cardiaque enregistrée via ECG. Cette mesure est non invasive, réalisée sur animaux vigiles préalablement habitués au hamac de contention avec des récompenses alimentaires. Des points limites et critères d’arrêt des souffrances et de l’expérimentation ont été précisément définis, prenant en compte des indicateurs de bien-être général et d’éventuelle souffrance physique post-opératoire non résolue par l’usage d’analgésique, notamment grâce à l’utilisation quotidienne d’une grille de notation dédiée à l’espèce porcine.
Choix des espèces
Le porc est le modèle gros animal de référence pour l’expérimentation médicale. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. Par ailleurs, son cerveau est gyrencéphale, c’est-à-dire qu’il est doté de circonvolutions comme chez les primates, et est d’une taille relativement importante, ce qui permet la réalisation d’imagerie cérébrale fonctionnelle avec les mêmes machines (e.g. IRMf) que chez l’humain. Enfin, le porc est omnivore et présente une préférence spontanée pour la saveur sucrée, qui sera notamment étudiée en imagerie cérébrale dans le cadre de ce protocole de recherche. Porcs juvéniles de 30 à 40 kg, de race Large White x (Piétrain x Landrace) pour les tests sur l'implantation du dispositif (N=4). Miniporc Yucatan jeunes adultes (12 mois) pour les étapes 1 et 2 d'exploration des effets de la stimulation sur l'activité vagale et cérébrale (N=18).