Troubles gastrointestinaux

363 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance légers à modérés. Une colite est provoquée chimiquement par injection intra-rectale de DNBS, puis les animaux reçoivent par gavage la bactérie testée, avec pour effets attendus une perte de poids, des diarrhées et des saignements anaux suivis sur trois jours. Le projet, mené par une entreprise, vise à évaluer une bactérie vivante comme futur médicament contre les maladies inflammatoires de l'intestin. Le porteur affirme que ces modèles d'inflammation induite sont les seuls à reproduire la maladie et qu'un modèle in vitro ne restitue pas la complexité du microbiote.

Objectifs

La maladie de Crohn (MC) touche plus de 2,3 millions de personnes dans le monde, avec une prévalence en constante augmentation, en particulier dans les pays nouvellement industrialisés. L'étiologie de la maladie est liée à de multiples facteurs, notamment des facteurs environnementaux, génétiques, immunitaire et un microbiome intestinal altéré. Les patients sont atteints d’anomalies du système immunitaire intestinal associées à un microbiote intestinal peu diversifié et à une perte de bactéries bénéfiques par rapport aux individus sains. La qualité de vie des patients atteints de MC est fortement altérée car ils souffrent de douleurs abdominales atroces, de diarrhées récurrentes, de douleurs articulaires, etc. Les traitements disponibles - à ce jour (par exemple, corticostéroïdes, molécules immunosuppressives et agents biologiques) ou en développement - ciblent les voies responsables de l'inflammation qui déclenche ces symptômes. Cependant, il existe un fort besoin médical de nouvelles thérapeutiques avec un mode d'action différent, car ces traitements ne guérissent pas la maladie et sont associés à de nombreux effets secondaires. Aujourd'hui, il n'y a pas de nouvelle solution pour guérir la maladie. L’objectif du projet est de proposer un nouveau schéma thérapeutique pour la gestion de maladies inflammatoires de l’intestin, pour ceci nous allons évaluer le potentiel thérapeutique, ainsi que de déterminer le profil toxicologique d’une bactérie vivante Christensenella minuta dans des modèles précliniques bien établie qui reprennent les principaux symptômes de l’inflammation au niveau du colon. Ce projet rentre dans le programme de recherche de l’entreprise qui s’inscrit dans sa lignée de développement de nouveau médicament à base de microbiote.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la détermination d’un nouveau traitement qui aura une activité bénéfique dans la gestion de l’inflammation, basée sur une bactérie vivante de l’intestin, ainsi qu’une amélioration de la composition bactérienne et de ce fait nous pourrons ainsi proposer un nouveau schéma thérapeutique pour les patients atteints de maladies inflammatoires de l’intestin, telle que la maladie de Crohn.

Procédures

Les interventions auxquelles seront soumis les animaux sont : injection intra-réctale de DNBS pour l’induction de la colite sous anésthésie. La durée du geste est de moins d’une minute. Un prélèvement sanguin sera également réalisé sur certains animaux. La durée du geste de prélèvement est évaluée à moins d’une minute. L'administration orale par gavage des traitements sur tous les animaux du projet sera également réalisé. La durée du geste de gavage est évaluée à moins d’une minute. Les différentes interventions sont réalisées par une personne formée et les animaux sont suivis quotidiennement selon les critères mis en place au sein de l'établissement.

Impact sur les animaux

La colite chez les souris sera induite chimiquement par le Dinitrobenzène acide sulfonique (DNBS), afin de créer l’inflammation au niveau du côlon, cette procédure a pour effet une perte de poids des animaux qui sera surveillée attentivement au cours des 3 jours qui suivent l’induction. Une grille d’évaluation associée aux mesures à prendre a été mise en place et sera suivie tout au long de la procédure. De plus, il est important de prendre en considération que l’absence ou une perte de poids moindre chez nos animaux traités est un paramètre important marquant l’efficacité de notre traitement. Des effets sur le transit intestinal peuvent être observés, tel que des diarrhées ou des saignements au niveau de l’anus, qui seront suveillés et scorés sur les 3 jours post-induction (jour du sacrifice).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation afin de réaliser des tests et analyses ex-vivo permettant de valider et compléter les données.

Remplacement

L’efficacité et de la tolérabilité d’un médicament en cours de développement doit fait l'objet d'études réglementaires d’évaluation avant toute mise sur le marché, celles-ci exigent l’utilisation de modèles précliniques, qui puissent répondre à des questions toxicologiques. L’ensemble des données générées par ces modèles animaux nous permettront de pouvoir envisager une application thérapeutique chez l’homme. Le recours à des modèles d’inflammation induite chez le rongeur est une étape nécessaire dans notre démarche. Il s’agit des seuls modèles mimant la physiopathologie et la symptomatologie de la colite observées chez les patients atteints de la maladie de Crohn. La réponse immunitaire exprimée suite à l’induction de l’inflammation chez ces modèles précliniques est égalament similaire à celle observée chez l’homme, ce qui nous permet d’évaluer l’impact de notre médicament non seulement d’un point de vue clinique mais également physiologique. Par ailleurs, afin de minimiser au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons réalisé au préalable des tests in vitro de criblage sur modèles cellulaires, qui ont permis d’identifier quelques bactéries pertinentes ayant des effets immunomodulateurs et anti-inflammatoires. Nous souhaitons donc tester ces bactéries sur ces modèles animaux et valider l’effet de C. minuta sur la colite induite et sur la modulation du microbiote intestinal, ce paramètre ne pouvant pas être obtenues par des modèles alternatifs ex vivo ou in vitro, car ils ne reconstituent pas de manière optimale la complexité et la diversité des interactions du microbiote intestinal.

Réduction

Le plus petit nombre d’animaux nécessaire par groupe a été défini tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables, en se basant sur la variabilité interindividuelle et de la sensibilité des marqueurs biochimiques, dont les cytokines. Ce nombre tient aussi compte du fait que les expériences seront réalisées trois fois de manière indépendante afin de s’assurer de la reproductibilité des résultats.

Raffinement

Afin de raffiner les procédures et de réduire tout stress, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal en garantissant un enrichissement de l’environnement et une habituation aux personnes travaillant avec les animaux . Après 7 jours d’acclimatation qui leur permet de s'adapter à leur environnement, ils seront hébergés entre 3 à 5 par cage pour le respect la cohésion sociale de l'espèce, et manipulés quotidiennement jusqu’au début des expériences. Cette période d’habituation permet de réduire leur niveau de stress lors des manipulations ultérieures. Les cages, transparentes, sont enrichies (tunnels de manipulation en carton, carrés de cellulose et bâtonnets) et sont rapprochées les unes des autres, afin que les animaux aient un contact visuel avec leurs congénères. Un suivi des points limites sera mis en place suivant une méthode de prise en charge adaptée au projet. Les expérimentations sont réalisées lorsque cela le nécessite, sous anesthésie générale avec l'utilisation d'analgésiques adaptés. Les animaux sont suivis quotidiennement par du personnel formé et expérimenté, soucieux du bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est une espèce de référence en toxicologie et immunologie ; disciplines au carrefour desquelles la thématique du laboratoire nous positionne. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies humaines et de leur impact sur le microbiome intestinal. La disponibilité de modèles animaux d’induction de colite murins pertinents pour nos questions de recherche et le besoin ponctuel de travailler en environnement axénique (complétement stérile) , principalement en isolateurs, compatibles avec la taille des animaux, constituent de plus des facteurs important qui en fait l’espèce animale de choix. Les animaux seront utilisés à partir de 6-8 semaines (adultes), afin que le système immunitaire et le microbiote instestinal soient installés, ainsi nous pourrons évaluer l’impact de notre bactérie sur la structure, la composition de l’intestin, ainsi que la gestion de l’inflammation associée à la colite induite, et ce dans l'objectif de proposer aux patients une solution thérapeutique adaptée et efficace.

5 100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Greffées avec des cellules humaines, elles subissent une irradiation sublétale, des prélèvements de sang, des chirurgies puis une infection par des virus comme le VIH ou les hépatites B et C, pour étudier ces infections et tester des traitements. Le porteur indique que certaines souris présentent un poids réduit lié à une déficience hépatique et peuvent développer une dermatite, avec mise à mort si le score de souffrance atteint le point limite. Il présente ce modèle comme le "seul" permettant ces infections et comme une alternative au recours aux primates non-humains.

Objectifs

Ce projet utilise le seul modèle murin expérimental qui permet de suivre la progression in vivo des infections par des virus à tropisme restreint aux humains et aux primates non-humains. Dans ce projet, nous souhaitons étudier la physiopathologie induite par l’infection des virus de l’immunodéficience humaine (VIH), d’Epstein-Barr (EBV), de l’hépatite B (VHB), et de l’hépatite C (VHC) en suivant les réponses immunitaires, et évaluer l’impact des nouvelles approches antivirales ou vaccinales. Ce type d’expérimentation ne peut pas être mené chez l’hôte naturel de ces virus pathogènes (l’homme) et s’avère de plus en plus difficile à mettre en place chez des primates non-humains. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces virus, des modèles de souris humanisés pour le système immunitaire (souris HIS), ou pour le foie avec l'ajout d'hépatocytes humains (souris HUHEP), ont été développés au cours des deux dernières décennies. Comme premier modèle, nous avons généré des souris immunodéficientes (BRGS), par l’invalidation fonctionnelle des gènes codant pour certaines protéines. Les principaux mécanismes de rejet de greffe sont absents chez ces souris ce qui permet l’établissement d’une xénogreffe hématopoïétique humaine après injection de cellules souches hématopoïétiques humaines (HSC). Des études précédentes ont montré que les souris HIS étaient susceptibles aux infections par les virus HIV ou EBV, et modélisaient les réponses immunitaires humaines. Un second modèle murin immunodéficient porte en plus un gène urokinase plasminogen activateur (uPA) qui est toxique pour les hépatocytes dans le foie, ce qui induit une déficience hépatique. Ces souris sont greffées avec des hépatocytes humains adultes sains qui participent à la régénération du foie et constituent le modèle HUHEP. Des études précédentes ont montré que les hépatocytes humains pouvaient être infectées par les virus VHB et VHC ainsi que par le parasite de la malaria (Plasmodium falciparum) chez ces souris HUHEP. La combinaison des deux modèles ci-dessus, dite HIS-HUHEP permet une étude approfondie des interactions entre le système immunitaire et le foie dans le cadre d’infections hépatiques (VHB, VHC, P. falciparum). Celui-ci permet de décortiquer les mécanismes d’infection et de mieux comprendre la pathogénèse complexe induite par ces microbes invasifs.

Bénéfices attendus

Ces modèles animaux permettront de mieux caractériser les mécanismes d'infection et de réplication des virus (VIH, EBV, VHB, VHC), le rôle du système immunitaire dans l'évolution des pathologies, ainsi que de tester des nouvelles stratégies thérapeutiques et vaccinales. Bien que des traitements thérapeutiques existent pour les patients atteints de VIH, un vaccin thérapeutique permettrait de contrôler les infections de manière pérenne. Il n’existe pas de vaccin préventif pour le VIH et le VHC, ainsi des millions de nouvelles infections surviennent par an, ne permettant pas d’éliminer ces virus de la population globale. Bien qu’un vaccin sûr et efficace existe pour le VHB, plus de 260 millions de personnes sont actuellement infectées et seul 1% de ces patients ont accès aux traitement thérapeutiques, le VHB induit des hépatocarcinomes à mauvais pronostique. Ces traitements, comme celui pour le VIH, doivent être pris à vie, induisant un coût élevé pour la société et un risque de survenu d’échappement virologique. Ainsi, les recherches se poursuivent pour développer des vaccins, ou des traitements curatifs, pour ces pathologies. L’interaction entre la réponse immunitaire et le virus est essentiel dans la progression de la pathologie, comprendre ces mécanismes d’action est une clé de voute pour développer des nouveaux concepts de traitements à visé thérapeutiques, ou des vaccins. Or, les modèles animaux qui permettent d’étudier ces interactions sont rares étant donné que ces virus n’infectent que des cellules humaines ou de chimpanzés. Afin de modéliser ces questions, nous avons développé des modèles de souris greffées avec des cellules humaines qui sont susceptibles à ces virus, permettant d’étudier les réponses immunitaires antivirales humaines. L’ensemble de ces études participe à comprendre la physiopathologie induite par ces virus chez l’humain, et à développer des nouveaux traitements thérapeutiques et des stratégies vaccinales afin d’éliminer ces maladies.

Procédures

Les procédures expérimentales décrites prévoient les interventions suivantes : irradiation avec des doses sous-létales (une fois par vie, 1-3 minutes), prélèvements sanguins en retro-mandibulaire (chaque prélèvement dure quelques secondes et est réalisé tous les 15 jours au maximum), anesthésie et procédures chirurgicales (une fois par vie, environ une heure et demi par animal), infection par des virus (une fois par vie, chaque infection dure quelques secondes).

Impact sur les animaux

Le degré de gravité des procédures est considéré comme léger (injections et prélèvements) ou modéré (conséquences potentielles à long terme de l’irradiation sous létale ou chirurgie). Les animaux portant le transgène uPA ont un poids réduit (autour de 10% en dessous du poids normal) du à leur déficience hépatique qui entraîne des défauts métaboliques. Ce poids diminué n’affecte pas le comportement des animaux, n’entraîne pas de souffrances, ni de stress, d’après nos observations sur plusieurs années d’expérimentation. Les animaux humanisés pour le système immunitaire et exprimant le transgène TSLP peuvent développer une dermatite. Afin de soulager la dermatite, les animaux seront traités avec une solution antiseptique (bétadine) avec un anesthésiant locale (lidocaine) et ils pourront être hébergés sur une litière de cellulose plus adaptée aux peaux sensibles. Leur phénotype est suivi toutes les semaines selon les critères et les points limites suivants : 1. Apparence global de l’animal score 0 : normal score 1: poils ébouriffés, rougeur de peau ou perte de poils sur moins de 50% du corps, expression faciale modérée, animal en mouvement score 2: dos voûté, perte de poils sur plus de 50% du corps, expression faciale sévère, absence de mouvement, prostration. 2. Conditions corporelles (cachexie) score 0: BCS (Body Condition Scoring) 3: L’animal est bien conditionné. La colonne vertébrale est continue. Vertèbres palpables seulement avec une pression ferme. score 1: BCS 2: L’animal est sous-conditionné. Segmentation de la colonne vertébrale évidente. Les os du bassin dorsal sont facilement palpables. score 2: BCS 1 : L’animal est amaigri. Structure squelettique extrêmement visible et peu ou pas couverte par la chair. Vertèbres distinctement segmentées 3. Poids score 1: perte de plus de 10% du poids score 2: perte de plus de 20% du poids Le point limite est défini par la détection d’un score =2 Si un score > 0 est observé, les animaux auront une surveillance renforcée. Si un score = 2 est observé, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale #1 les animaux seront mises en expériences suivant les procédures expérimentales # 2, 3, 4 et 6. A la fin de ces procédures expérimentales les animaux seront mis à mort pour être analysés afin de caractériser la physiopathologie et la réponse immunitaire induite par les virus VIH, VHB, VHC, EBV. A l’issu de la procédure expérimentale #5 les animaux seront mis en accouplement.

Remplacement

Ce projet nécessite un modèle expérimental soutenant l’ensemble des mécanismes de la physiopathologie induite par une/des infection(s) virale(s). Or, de nombreux exemples démontrent que les tests d’efficacité de thérapies antivirales in vitro ne se confirment pas systématiquement in vivo en phase clinique chez l’Homme du fait des dynamiques complexes mises en jeu dans l’organisme (cinétique de l’infection; distributions cellulaires ; bio-distribution des composés; réponse immunitaire). Historiquement, les modèles infectieux de choix restent le macaque pour le VIH (avec le virus simien apparenté VIS ou l’hybride SHIV) et le chimpanzé pour le VHC et le VHB. En proposant comme modèle alternatif la souris humanisée pour le système immunitaire et/ou le foie, nous appliquons de manière relative le principe de remplacement en écartant l’utilisation de primates non-humains, avec l’avantage supplémentaire d’utiliser un modèle expérimental directement adapté au pathogène humain natif. A ce titre, les souris HIS et HIS-HUHEP sont le seul modèle expérimental correspondant à ces critères (mis à part l’Homme lui-même, chez lequel il est éthiquement inacceptable de tester directement de nouvelles stratégies préventives ou thérapeutiques).

Réduction

Le plan d’étude bénéficie de nos connaissances antérieures obtenues avec des souris humanisées sur l’infection par le VIH et le VHB. De plus, nous utilisons un modèle de souris HIS qui est à la pointe du domaine, ce modèle est sans cesse optimisé pour une meilleure prise de la xénogreffe humaine, ce qui diminue la variabilité intrinsèque au modèle et réduit d’autant le nombre d’animaux requis par expérience. Il sera essentiel de compter un minimum de 10 animaux par groupe, du fait de cette variabilité intrinsèque, et d’inclure l’ensemble des groupes contrôles pour valider les conclusions de chaque étude. La planification des expériences en amont et la concertation entre les membres de l’équipe seront des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux.

Raffinement

Les cages d’hébergement sont enrichies avec un coton dentaire permettant une nidification, et avec des refuges en forme de dômes en cellulose dans les cages de croisements. Par ailleurs, le stress des animaux est largement diminué par l’utilisation d’analgésiques et d’antalgiques lors de la majorité des procédures. L’isoflurane par voie respiratoire présente l’avantage d’être un anesthésiant permettant des séquences d’endormissement courtes et répétées. Les soins post-opératoires tels que des pansements, du gel oculaire, une réhydratation par voie sous-cutanée, et une alimentation hydratante (DietGel) sont inclus dans nos protocoles expérimentaux.

Choix des espèces

La souris HIS est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale soutenant une infection productive par le VIH. La souris HUHEP greffée avec des hépatocytes humains est permissive aux infections hepatotropiques (VHB, VHC, P. falciparum). Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris humanisées pour le système immunitaire (HIS) sont générées par injection de cellules souches hématopoïétiques humaines CD34+ dans des souriceaux nouveau-nés (

750 animaux, 600 souris et 150 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Les rats subissent une laparotomie avec injection intraportale, les souris des injections et prélèvements intraveineux hebdomadaires pendant jusqu'à trois mois, pour mettre au point un traitement de thérapie génique du foie développé par une société commanditaire. Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour analyser le sang et les organes. Le porteur situe la demande dans le prolongement d'un programme antérieur mené d'abord sur cellules puis sur l'animal.

Objectifs

La présente demande fait suite à celle soumise le 22/07/2015 au Comité d’Ethique en Expérimentation Animale des Pays-de-la-Loire et approuvée le 29/09/2015 (EU0164 – SCAHU-Angers), ainsi que par le Ministère de la Recherche le 4/12/2015. La précédente étude a été réalisée au Service Commun d’Animalerie du CHU d’Angers (SCAHU) entre le 01/02/2016 et le 30/09/2019. Cette demande est relative à un traitement de thérapie génique synthétique, est un nouveau procédé thérapeutique non-viral non-intégratif qui est développé par la société Eukarÿs, le sponsor de cette étude. La thérapie génique repose sur l’administration par voie intravasculaire d'ADN synthétique produit in vitro, mais de structure chimique tout à fait conventionnelle. La structure de cet ADN synthétique est conçue pour prévenir son éventuelle intégration génomique et donc de modification du génome. Cet ADN synthétique permet l’expression sous contrôle du système C3P3, technologie développée par la société Eukarÿs, lequel permet la synthèse autonome d’ARN messager (ARNm) cible in vivo. La thérapie génique synthétique est donc un traitement non-viral et non-intégratif. Plusieurs étapes de ce protocole (procédures 1 à 3) sont d’ailleurs réalisées avec un gène rapporteur pour faciliter la mise au point de cette technologie. Le traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR qui fait l’objet de la présente demande est destiné à prévenir une insuffisance hépatique en cas de résection chirurgicale majeure du foie. Cette intervention chirurgicale est réalisée pour des indications tumorales (par exemple pour métastases hépatiques ou hépatocarcinome) ou non-tumorale (par exemple pour kyste hydatique) chez environ 10.000 malades/an en France. L’insuffisance hépatique qui fait suite à une hépatectomie majeure constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale invasive, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle. Les études antérieures ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique. Ce protocole décrit les études requises pour la poursuite développement d’EUK-LPR avec deux types d’études selon le mode d’administration par voie intraveineuse ou intraportale.

Bénéfices attendus

Cette demande est relative à aux études non-réglementaires requises pour le développement du traitement de thérapie génique synthétique EUK-LPR. Ce traitement est destiné à prévenir une insuffisance hépatique secondaire à une résection chirurgicale majeure du foie qui constitue le principal risque de cette intervention chirurgicale, puisqu’elle conduit au décès post-opératoire de 5%-20% des patients. EUK-LPR vise donc à réduire la mortalité de cette invention chirurgicale en induisant sélectivement la prolifération hépatocytaire avant la résection chirurgicale hépatique, de manière à en augmenter la masse fonctionnelle.

Procédures

Tous les animaux des procédures 1 à 7 seront soumis à des prélèvements intraveineux hebdomadaires (600 souris et 150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 1-2-3-6-7 seront soumis à des injections intraveineuses hebdomadaires (600 souris). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 3 mois. Les animaux des procédures 4-5 seront soumis à une injection intraportale unique après laparotomie (150 rats). La durée des études est variable et peut aller jusqu’à 28 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont les suivantes : 1°) maintien en captivité des animaux, les modalités de stabulation étant décrites plus loin dans le texte, 2°) prélèvements sanguins uniques ou répétés selon les procédures, 3°) pour les animaux testés aux procédures 1-3 et 6-7, injection intraveineuse périphérique unique ou répétées, 3°) pour les animaux testés aux procédures 4 et 5, laparotomie et injection intraportale, 4°) pour tous les animaux, mise à mort à la fin de l’ étude, dont les modalités sont décrites plus loin dans le texte.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chacunes des études de la présente demande, le sang/plasma, ainsi que les organes de ces animaux devant être analysés.

Remplacement

Les phases préliminaires de ce programme réalisées le cadre de la précédente demande APAFiS ont été effectuées successivement dans des cellules en culture, puis chez l’animal. Ces études ont permis de tester et d’optimiser un gène artificiel permettant la croissance hépatique qui, administré par injection intravasculaire intra-portale chez le rat, permet d’augmenter de 18% la masse hépatique en 4 jours. Ce gène sera utilisé pour les études décrites dans la présente demande (procédures 4 à 7). Les prochaines étapes portent sur la réalisation d’études précliniques non-réglementaires chez l’animal pour lequel il n’existe pas de solution de remplacement satisfaisante et sont requises pour les futures études cliniques chez l’homme.

Réduction

Ce protocole a été conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas de manière à éviter la mise à mort inutile d’animaux. Les phases exploratoires pourront être interrompues prématurément en cas d’efficacité insuffisante ou de mauvaise tolérance du traitement, dans le but de réduire le nombre d'animaux. De plus, selon l’effet observé, la taille des groupes sera si possible réduite. Les études de cette demande étant exploratoires, la taille des groupes (n=10) ne repose donc pas sur des hypothèses statistiques préalables, mais sur l’usage courant en recherche animale. Ce protocole est cependant conçu de manière séquentielle avec analyse des résultats pas-à-pas, ce qui permettra si possible de réduire la taille des groupes afin éviter la mise à mort inutile d’animaux. L’analyse statistique des principales variables à l’état basal et sous traitement seront décrites au moyen de méthodes descriptives standard (moyenne, SD, médiane). Pour les variables de distribution ordinale, les comparaisons entre groupes se feront par test du χ-2 (n>5) ou test exact de Fisher (n≤5). Pour les variables quantitatives continues de distribution normale, éventuellement après log-transformation, les comparaisons statistiques entre groupes seront réalisées par t-test de Student (comparaison de deux groupes) ou ANOVA éventuellement avec ajustement de Dunnett (comparaison de plus de deux groupes par rapport à un groupe contrôle). En cas de variable quantitative continue de distribution non-normale, la comparaison sera réalisée par des tests non-paramétriques : U de Mann-Whitney ou W Wilcoxon (comparaison de deux groupes entre eux) ou H de Kruskall-Wallis (comparaison de plus de 2 groupes).

Raffinement

La souffrance des animaux sera réduite par une prise en charge de la douleur appropriée. Les animaux seront examinés et pesés une fois par jour, ce qui permettra de déterminer d’évaluer précisément un score de douleur et d’angoisse de l’animal. Ce score permettra de statuer sur la continuité du protocole en cours et les actions à mener, jusqu’au stade éventuel d’atteinte du point limite entrainant la mise à mort immédiate de l’animal (cf. Annexe). Un calcul du score de la douleur sera réalisé comme suit pour décider de l’action à mener : 1 point si symptômes modérés (lésion sans effraction cutanée, agitation/agressivité, hypomotilité/hyporéactivité, incoordination modérée, stéréotypies, poil piqué, zone anogénitale souillée, persistance du pli cutané, coloration jaune ou bleue des muqueuses), 3 points si symptômes majeurs (difficulté/impossibilité de mobilisation, difficultés respiratoires, incoordination marquée, gonflement abdominal, voussure du dos/ dos cambré), 5 points si symptômes indiquant l’atteinte d’un point limite (lésion sévère (automutilation, plaie suintante, masse ulcérée…), tremblements généralisés, convulsions, perte de poids supérieure à 10% en 24 heures). Ce score permet de définir l’action à mener : Score=0 : aucune douleur ; score 1≤Score

Choix des espèces

EUK-LPR est conçu pour être injecté par deux voies vasculaires : intra-portale principalement pour les indications tumorales de résection hépatique, ou intraveineuse périphérique pour les indications non-tumorales. Ces deux modes d’administration seront étudiés chez des animaux de laboratoire dans le but de générer des résultats aussi fiables que possible. La souris est l’espèce privilégiée pour la réalisation des études de ce protocole en raison du plus faible espace requis pour leur élevage. Les études nécessitant une administration voie intra-veineuse, les études seront donc réalisées chez la souris de laboratoire. Cependant, les études réalisées par voie intra-portale ne peuvent être facilement réalisées chez la souris en raison de la taille réduite du tronc porte. Ces études seront donc réalisées chez les rats de laboratoire, le diamètre du tronc porte permettant un cathétérisme facile. Il est d’ailleurs à noter que les études antérieures réalisées par voie intra-portale l’ont été dans cette espèce. Les études seront réalisées chez des animaux adultes, le traitement EUK-LPR étant développé - au moins initialement - pour patients adultes. A noter qu'il est vraisemblable que des études complémentaires seront réalisées chez animaux plus jeunes, en vue d’études cliniques chez l’enfant ou l’adolescent.

76 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de foie humain, une inoculation des virus des hépatites B et Delta et des prélèvements sanguins répétés pendant douze semaines, pour identifier des voies de signalisation et des cibles antivirales. Le porteur indique que l'échec de la greffe peut faire perdre du poids aux souris ou entraîner leur mort par insuffisance hépatique. Il décrit la souris au foie humanisé comme une alternative "indispensable", le chimpanzé, seul autre modèle naturellement infectable, étant interdit.

Objectifs

Le virus de l’hépatite Delta (VHD) est un virus satellite qui repose sur la présence du virus de l’hépatite B (VHB) pour sa multiplication. Les co-infections VHD-VHB représentent la forme la plus sévère des hépatites virales entraînant une accélération la progression de la fibrose hépatique vers la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (CHC) ou cancer du foie. La progression de la maladie hépatique implique une dérégulation des voies de signalisation cellulaires avec des conséquences sur l’inflammation et sur l’environnement entrainant le développement du cancer. Le but de ce projet est d’identifier les voies de signalisation dérégulées par le VHD et le VHB dans les hépatocytes, ou cellules du foie, afin de découvrir de nouvelles protéines conduisant à la progression de la maladie et de mettre au point de nouvelles molécules antivirales permettant de prévenir la progression de la maladie hépatique et le développement du cancer du foie.

Bénéfices attendus

Afin d’identifier les voies cellulaires dérégulées lors de co-infections VHB-VHD, nous souhaitons établir un atlas des changements cellulaires induits lors des infection VHB et VHD au sein des hépatocytes, ce dans le but d’identifier les voies de signalisation pertinentes pour les virus et la maladie ainsi que leurs régulateurs. Nous pensons ainsi pouvoir découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques antivirales ainsi que des candidats-médicaments pour un futur développement préclinique de nouveaux antiviraux et concepts de chimio-prévention.

Procédures

Les animaux recevront tout d’abord une injection intraveineuse afin d’améliorer la prise de greffe. Cette injection est réalisée sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale. Les animaux seront ensuite soumis à une petite chirurgie permettant la greffe de cellules de foie humain susceptibles à l’infection par le VHB et le VHD. L’injection de cellules de foie humain est réalisée dans la rate des animaux. L’infection par le VHB et le VHD sera réalisée par inoculation des virus par une injection unique dans le péritoine sur animaux vigiles après désinfection à l’alcool de la zone à piquer. Les animaux seront également soumis à un prélèvement de sang une fois toutes les 2 semaines pendant 12 semaines, soit un prélèvement avant l’inoculation et 5 prélèvements après l’inoculation, soit un total de 6 prélèvements. Les prélèvements sont réalisés sur animaux anesthésiés et ayant reçu une analgésie locale.

Impact sur les animaux

Nous utilisons et maîtrisons ce modèle murin depuis plus de 6 ans et la procédure de greffe depuis plus de 10 ans. La greffe de cellules de foie humain est réalisée suite à une petite chirurgie nécessitant une exposition de la rate Cette chirurgie n’induit pas d’effets indésirables chez les animaux. Il est néanmoins possible que la greffe soit inefficace et que les cellules de foie humain transplantées ne repeuplent pas le foie des souris. Dans ce cas, les animaux vont perdre du poids et peuvent mourir d’hépatodéficience aigüe. Suite à la greffe, les animaux ont recouvré un état de santé et de bien-être compatible avec leur utilisation dans ce projet. Les infections par le VHB et le VHD n’entraînent pas de phénotype particulier ni de douleur ou souffrance chez l’animal. Les animaux infectés peuvent vivre plusieurs mois sans problème.

Devenir

Les animaux de la colonie de reproducteurs seront mis à mort lorsque la qualité de reproduction déclinera. Les 2 animaux d’un couple sont mis à mort si aucune portée n’est obtenues depuis plus de 3 mois. Les animaux greffés chez qui la prise de greffe n’est pas efficace seront mis à mort car ils ne pourront pas être utilisés pour d’autre procédures. Les animaux inoculés avec les virus de l’hépatite B et Delta ainsi que les animaux contrôles non infectés sont mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever le foie et le sang qui nous permettront de réaliser les différentes analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Afin de remplacer l’utilisation d’animaux, une majorité d’expériences sont menées en amont, in vitro sur des lignées cellulaires et sur des hépatocytes primaires humains afin de nous assurer de la réelle nécessité de poursuivre sur ces modèles animaux greffés avec des hépatocytes humains. Il est toutefois nécessaire d’utiliser des animaux pour ce projet car les lignées cellulaires sont dérivées de cellules cancéreuses avec un phosho-protéome fortement altéré par rapport à des cellules primaires. De plus l’utilisation d’hépatocytes primaire nécessiterait un nombre très élevé de cellules fraichement isolées, les cellules congelées étant très difficiles à infecter in vitro. L’utilisation de biopsies humaines n’est également pas envisageable car les patients diagnostiqués avec une infection VHD sont très rares, et leur condition de conservation n’est pas compatible avec nos besoins permettant d’analyser le phospho-protéome. Dès lors, notre modèle de souris au foie humanisé est une alternative indispensable à l’identification de nouvelles voies dérégulées par les virus et potentiellement cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seul le nombre requis de souris seront greffées pour ce projet. Nous avons déterminé au préalable le nombre d’animaux nécessaire à ce projet sur la base de 2 critères principaux à savoir le taux de repeuplement du foie par les hépatocytes humains greffés, déterminés par dosage de l’albumine humaine sérique, et les charges virales VHB et VHD qui peuvent être très variables. Nos études de corrélation charge virale/albumine humaine montrent une corrélation positive pour VBH, mais pas de corrélation pour VHD. De plus la co-infection VHB-VHD réduit significativement la charge virale VHB, le VHD interférant avec le cycle viral du VHB. Nous avons donc estimé qu’un nombre de 8 souris par groupe est le minimum requis afin d’obtenir des résultats intra et inter-groupes comparables et interprétables.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tube de coton pour nidifier et des briques de tremble pour ronger, les animaux sont maintenus en groupe de 3 minimum afin d’éviter tout stress de l’animal isolé, les souris greffées auront un suivi quotidien adapté et tous les moyens nécessaires seront mis en œuvre pour éviter tout stress ou douleurs des procédures expérimentales (anesthésie, analgésie), des points limites adaptés et précoces ont été établis afin de soustraire les animaux à toute forme de souffrance inutile.

Choix des espèces

Seul le chimpanzé peut-être naturellement infecté, comme l’homme, par les virus VHB et VHD. L’utilisation du chimpanzé étant interdite depuis la nouvelle directive européenne relative à l’utilisation d’animaux en expérimentation animale, l’étude de ces virus in vivo est donc restreinte. Seuls les modèles de souris chimériques au foie humanisé peuvent maintenant être utilisés. De plus ces souris au foie humanisé permettent d’étudier précisément l’impact des maladies hépatiques et virales sur les hépatocytes humains et de tester des approches thérapeutiques pertinentes pour les patients. Les animaux seront utilisés à un âge adulte d’environ 8 semaines pour la greffe d’hépatocytes et un âge d’environ 20 semaines au moment de l’inoculation des virus.

2 132 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de souffrance légère à modérée. Elles subissent une injection intrapéritonéale, une injection rétro-orbitale sous anesthésie et des prélèvements mensuels de sang à la queue pendant six à douze mois, pour étudier le cancer du foie et la maladie du foie gras. Le porteur reconnaît une prise de poids importante liée aux régimes imposés et une altération de l'état général due au développement tumoral attendu au foie. Il présente le modèle murin comme "indispensable", seul modèle permettant selon lui d'invalider des gènes de façon tissu-spécifique.

Objectifs

Le foie est un organe vital qui intervient dans le stockage du glucose, la fabrication de la bile et la détoxification. L'incidence du cancer du foie (CHC) est en forte augmentation depuis 20 ans et ce cancer représente la 3ème cause de mort par cancer dans le monde. Ce cancer grave dispose de très peu de traitements efficaces et l’apport de nouvelles stratégies thérapeutiques représente donc un enjeu majeur dans la prise en charge de cette maladie. Bien que des progrès aient été accomplis dans le déchiffrage des mécanismes moléculaires du CHC, la dissection des événements précoces de la carcinogenèse hépatique, notamment comprendre la transformation tumorale des hépatocytes, cellules majoritaires du foie, est centrale pour mieux comprendre le développement de ce cancer. Des études récentes ont montré que le développement du CHC était intimement lié à un contexte d’altérations au niveau génétique, métabolique et inflammatoire, qui favorise un remaniement du cycle de division de l’hépatocyte. Dans ce cadre, nos travaux visent notamment à décrypter les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le cycle de division des hépatocytes, pour assurer ainsi le maintien de l’intégrité du tissu hépatique. Ce projet nécessitera 2132 souris et sera mené pour une durée de 3 ans.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet nous permettront de définir le rôle de STING, RhoA, ATM, ATR, DNAM-1 et LECT2, dans le contrôle prolifératif des hépatocytes, mais aussi dans la compréhension des mécanismes sous-jacents assurant l'intégrité génomique dans le foie, mécanismes faisant défaut au cours de l'hépatocarcinogenèse humaine. Ces travaux devraient conduire à élaborer chez l’Homme de nouveaux outils diagnostic/pronostic et des stratégies thérapeutiques innovantes pour ce cancer grave sans traitement effectif.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, une injection intra-péritonéale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée 30 secondes ) sur animal vigile (756 animaux). Une injection rétro-orbitale sera réalisée (une fois, à 5 semaines de vie, durée : 1 minute) sur animal anesthésié (820 animaux). Un prélèvement au niveau de l'apex de la queue de l'animal sera réalisé pour une mesure de glycémie de manière mensuelle (6 répétitions, pendant 6 ou 12 mois suivant l’expérimentation, durée : 30 secondes - 1 minute) sur animal vigile (2132 animaux).

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet nous procéderons à une injection intrapéritonéale et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine) pourra être ressenti par les animaux. Par ailleurs, du fait des différents régimes alimentaires auxquels seront soumis les animaux, une prise de poids importante est attendue. Enfin, du fait d’un développement tumoral attendu au niveau du foie, les animaux pourraient être sujets à une altération de leur état général.

Devenir

Pour ce projet de recherche, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et cela implique donc l’euthanasie (par une méthode réglementaire) de l’ensemble des animaux (2132).

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence dans notre cas le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique qui permette d’invalider ou d’induire l’expression de gènes de manière tissu-spécifique pour caractériser l’implication de ces derniers dans les mécanismes moléculaires induisant la séquence NAFLD/NASH/CHC.

Réduction

Nous estimons que pour ce projet, 2132 animaux seront étudiés. Les groupes expérimentaux sont constitués du minimum d’animaux nécessaire et suffisant pour permettre une analyse statistique robuste des effets observés. La taille des groupes a été déterminée selon nos travaux préliminaires ou basée sur l’expérience de nos études antérieures. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si l’effet observé s’avère significatif au cours des premières expériences. L’étude sera arrêtée si l’expérience initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.

Raffinement

Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour-nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive (injection à l’œil) sera précédée d’une courte anesthésie générale. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur une plaque chauffante. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, la mise à mort anticipée de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.

Choix des espèces

Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour déterminer les mécanismes moléculaires conduisant au CHC. Nous avons choisi la souris, car en plus de partager plus de 90% de gènes communs avec l’homme, il existe pour cette espèce des modèles génétiquement altérés pertinents pour l'étude. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont de jeunes adultes (5 semaines de vie) afin de disposer d'un foie largement engagé dans un état de différenciation avec un système immunitaire en fin de maturation. A ce stade, le tissu hépatique garde une capacité de prolifération en réponse à différents stimuli environnementaux, capacité essentielle notamment dans la régulation des lésions hépatiques qui prennent place dans la séquence NAFL/NASH. Une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l'expérimentation.