Troubles musculosquelettiques

1 908 souris et 297 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection de vecteur viral dans la veine de l'œil ou dans la veine de la queue, des prélèvements de sang hebdomadaires, des mesures répétées de force et de fatigue musculaires sous anesthésie, et des évaluations cardiaques précédées d'une épilation du thorax. Le projet sert à fixer la dose qui figurera dans le dossier réglementaire déposé pour obtenir l'autorisation d'essai clinique, après des cas de toxicité graves allant jusqu'au décès de patients traités à forte dose. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire la perte de locomotion ni les réactions immunitaires déclenchées par un vecteur d'origine virale.

Objectifs

Les dystrophies musculaires sont des maladies génétiques invalidantes affectant le muscle squelettique et sans traitement à l’heure actuelle. Elles sont dues à des mutations de gènes. Une option thérapeutique possible pour ces pathologies est la thérapie génique qui consiste à transférer une copie normale du gène déficient à l’aide d’un transporteur, un virus modifié capable d’amener le gène thérapeutique dans la cellule sans entrainer d’effets nocifs. Ces virus modifiés sont appelés des vecteurs. Le muscle squelettique représente environ 40% de la masse corporelle, ce qui nécessite d’utiliser des doses élevées de vecteur pour toucher l’ensemble de la musculature. Cependant, ces doses élevées de virus modifié peuvent entrainer des effets secondaires graves. Par conséquent, il y a un besoin de développer des produits efficaces à plus faible dose. Des études préliminaires ont permis d’obtenir des vecteurs efficaces à plus faible dose pour transférer un gène dans le muscle (jusqu’à 10 fois plus efficace). La meilleure dose efficace n’est pas connue. L’objectif de ce projet est donc de déterminer in vivo la meilleure dose efficace de ces nouveaux produits sur des modèles rongeurs de maladies musculaires. Les traitements seront administrés à 2 âges afin de mimer 2 stades différents des maladies humaines. Les analyses réalisées permettront de définir la dose conduisant à un effet thérapeutique, ce qui servira à déterminer la dose qui sera utilisée chez l’homme lors d’essais cliniques. Les études seront incluses dans le dossier réglementaire à déposer aux agences dans le but d’obtenir l’autorisation d’essai clinique.

Bénéfices attendus

Les produits de thérapie génique en cours de développement clinique utilisent des doses élevées de vecteurs, qui se sont parfois assorties d’effets toxiques importants, conduisant dans le pire des cas au décès du patient. Ce projet a pour but d’identifier des produits de thérapie génique de seconde génération efficace à plus faible dose, ce qui permettra de résoudre les problèmes de toxicité, tout en conservant une bonne efficacité thérapeutique.

Procédures

Le traitement par transfert de gène se fait par injection intraveineuse en une seule fois, soit sur animaux anesthésiés pour l’injection à la veine de l’œil soit sur animaux non anesthésiés pour l’injection dans la veine caudale. Les prélèvements de sang se font au maximum une fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse. Les prélèvements de sang ne se font pas le même jour que les injections afin de ne pas induire de douleur supplémentaire. Afin d’évaluer le bénéfice du traitement, des explorations de la fonction musculaire seront réalisées sur les animaux en début et au cours du protocole. Leur durée moyenne est de 10 minutes. La fatigue musculaire sera également évaluée plusieurs fois au cours du protocole avec un maximum de trois à cinq fois selon la durée post-injection. Les animaux sont anesthésiés, l’examen dure environ 20 minutes. Les animaux sont soumis à une évaluation de la fonction cardiaque au début et en fin de protocole. Les animaux sont anesthésiés et maintenus dans cet état tout au long de l’examen d’une durée de 20 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont les suivantes: → Les animaux seront maintenus en contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. → Certains actes mesurant la force du muscle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil. → Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment de l’injection intraveineuse du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique ou de dobutamine, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang. → Des lésions locales de type inflammatoire ou des irritations accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par l’épilation nécessaire pour pratiquer les mesures de la fonction cardiaque, par la pose d’électrodes au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé. Une sécheresse oculaire peut également être observée au cours des anesthésies. → Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte légère ou modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des organes et des muscles pour l’analyse des tissus et des niveaux de produits thérapeutiques reçus afin de vérifier l’efficacité thérapeutique et l’absence de toxicité.

Remplacement

Le projet consiste à déterminer l’effet thérapeutique de nouveaux produits de thérapie génique au niveau des muscles squelettiques et du coeur. Cette évaluation ne peut pas être réalisée dans des modèles cellulaires car 1) il est impossible de mimer les symptômes de la maladie dans ces modèles (type perte de la locomotion ou atteinte des paramètres cardiaques) ; 2) Il est impossible de cibler différents tissus simultanément dans ces modèles et d’étudier la répartition du produit thérapeutique entre les différents organes ; 3) Il est impossible de recréer en laboratoire les réactions immunitaires complexes qui peuvent se développer après l’injection de vecteurs d’origine virale.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe est optimisé pour obtenir des résultats significatifs sans utiliser d’animaux surnuméraires. Nous utiliserons les mêmes animaux témoins pour des expériences différentes chaque fois que possible. Un maximum d’analyses sera réalisé sur chaque organe prélevé. Un nombre plus important de doses sera testé sur les jeunes animaux, et selon les résultats obtenus, un nombre réduit de doses sera testé sur des animaux plus âgés, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en tout.

Raffinement

Pour les animaux non issus de l’élevage, une phase d’adaptation sera respectée avant la réalisation des procédures. L’ensemble des animaux est observé quotidiennement au niveau de la cage. Afin de limiter le stress et la douleur induite par les prélèvements de sang, ces derniers seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Dans le cas des prélèvements de sang réalisés sous anesthésie gazeuse, des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées telle l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus. Un point de compression est systématiquement réalisé pour favoriser la coagulation. La survenue de signes hémorragiques, gonflements ou rougeurs sera surveillée après le prélèvement. Un test de course sera réalisé : une phase d’entrainement sera réalisée pendant 4 à 7 jours avant le test. Lors des tests de mesure de la force des muscles, il y a un risque exceptionnel de blessure. Dans ce cas, un traitement à la bétadine sera prodigué jusqu’à la cicatrisation. La mesure de l’activité électrique du muscle sera réalisée après un traitement anti-douleur préalable réalisée 30 minutes avant le test. Le test sera réalisé sur une plaque chauffante sous anesthésie aérienne. Lors des mesures de l’activité du cœur, une épilation du thorax est réalisée : une application locale de crème anti-irritation sera réalisée à l’endroit de l’épilation. Lors des anesthésies, les animaux sont placés sur plaque chauffante.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons les espèces souris et rat car ces modèles reproduisent les caractéristiques principales des maladies étudiées. Dans le cas des modèles de la maladie de Duchenne, le modèle de rat présente des atteintes cardiaques plus représentatives de la pathologie humaine, tandis que le modèle de souris est un meilleur modèle de la pathologie du muscle. Dans certains modèles, le modèle de rats présente des cellules immunitaires spécifiques de la pathologie humaine, mais seule la souris présente une réduction de la force des muscles. L’utilisation de deux modèles de rats ou de souris est donc nécessaire, selon la question scientifique posée. D’autre part, les espèces de souris et de rats sont faciles à manipuler, héberger, et se reproduisent facilement et rapidement. Les approches de thérapie génique ont des efficacités variables selon l’état du muscle: elles sont généralement plus efficaces à des stades précoces, notamment parce que le tissu est en meilleur « état ». Pour cette raison, la dose efficace d’un même produit peut être différente selon l’état d’avancement de la pathologie Dans ce projet, dans le but de traiter des patients ayant des avancées différentes des maladies, il sera nécessaire d’utiliser des animaux adultes jeunes et des animaux plus âgés afin de reproduire les stades précoces et tardifs des pathologies.

Quarante souris atteintes d'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth reçoivent une injection quotidienne pendant quatorze jours, puis passent chaque semaine un test de suspension à une grille inversée et un test de suspension par la queue, avant un déplacement sur tapis roulant à six semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur affirme que ces souris ne présentent aucun signe de douleur, et prévoit dans le même temps que tout animal qui aurait mal soit mis à mort par anticipation, les antidouleurs risquant de perturber les résultats des tests. Les 40 souris sont tuées à six semaines pour prélever les nerfs sciatiques et les muscles de leurs deux pattes.

Objectifs

Ce projet vise à développer une thérapie pour une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). La CMT se manifeste dès l’enfance par une faiblesse musculaire, une perte de sensation et des problèmes de coordination, évoluant vers une difficulté motrice chez les adultes. Notre objectif est d’injecter quotidiennement un composé pharmacologique aux souris modèles de la maladie pour atténuer ces symptômes. Nous souhaitons évaluer le potentiel du composé Bis-T-23, car il a montré, dans le contexte de maladies rénales, son efficacité à augmenter l'activité de la protéine qui est déficiente dans notre forme de CMT. Bien que Bis-T-23 soit encore expérimental, il a déjà été utilisé dans d'autres études, et ses conditions pharmacocinétiques chez les rongeurs sont bien documentées. Repositionner ce composé pourrait réduire les coûts et accélérer le développement d’un traitement pour cette maladie qui en est dépourvue.

Bénéfices attendus

Le succès de ce projet fournira une stratégie thérapeutique pour certaines formes de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, et constitue une étape essentielle vers les essais cliniques. Il s’agit ici de tester un composé médicamenteux, cette approche pharmacologique est plus facilement transposable à l’Homme en cas de succès de l’étude. Ce travail pourrait être bénéfique pour le traitement d’autres formes génétiques de CMT si un lien moléculaire ou mécanistique entre les différentes formes est découvert.

Procédures

Les 40 animaux de l’étude seront injectés quotidiennement (durée d’injection de quelques secondes) pendant 14 jours consécutifs. Le lundi en semaine 3, 4, 5 et 6 les animaux seront pesés puis 2 tests comportementaux seront réalisés : -test de suspension à une grille inversée (durée 3x60secondes) pour évaluer la force musculaire – test de suspension par la queue (durée 5-10secondes) pour évaluer la neurodégénérescence. A 6 semaines, les animaux réaliseront également un déplacement sur tapis roulant (max 60secondes) pour évaluer leur coordination.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, nous utiliserons un modèle de la maladie de Charcot-Marie-Tooth dont les caractérisations ont déjà été effectuées. Le modèle utilisé dans cette étude présente une légère perte de poids, quelques tremblements et des défauts lors du test de hanging ainsi que des défauts histologiques au niveau du nerf à 24 jours. Les animaux ne présentent aucun signe de douleur et aucune incapacité locomotrice n’a été notée jusqu’à l’âge de 16 semaines. Les tests phénotypiques (de suspension, de déplacements) peuvent engendrer un stress physique chez l'animal. Les injections peuvent entrainer une réaction inflammatoire.

Devenir

Les animaux de cette étude seront mis à mort à 6 semaines après caractérisation comportementale, les tissus affectés seront prélevés pour étude histologique.

Remplacement

Le modèle souris étant physiologiquement et structurellement assez proche de l’Homme, il nous permettra d’étudier d’une part la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’autre part de mieux comprendre les voies de signalisation impliquées dans le développement de cette maladie. Une étude sur culture de cellules mutantes ne peut être envisagée car les symptômes décrits ne se développeraient pas et la caractérisation du modèle serait alors impossible. De plus, nous ne pourrions pas étudier les bénéfices apportés par le médicament sur l’ensemble de l’organisme, notamment sur la force musculaire et la coordination motrice.

Réduction

Les études histologiques et procédures expérimentales seront réalisées avec un nombre d’animaux qui sera réduit au maximum pour obtenir une puissance statistique suffisante. Les 2 pattes seront utilisées (2 nerfs sciatiques et 2 muscles) afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Nos connaissances sur les modèles murins et les études réalisées sur d’autres thérapies montrent que 10 souris par groupe pour l'étude comportementale seront nécessaires pour obtenir une étude concluante avec des tests statistiques adéquats.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage en zone élevage. Après sevrage ils seront hébergés à plusieurs par cage afin d'éviter l'isolement social. La qualité de l’air sera assurée par une ventilation et la température sera maintenue constante. Des nids seront disposés dans chaque cage, avec un accès illimité à la nourriture/boisson. De la nourriture en gel et enrichie sera placée dans les cages afin de faciliter la nutrition des animaux. La litière sera changée hebdomadairement afin de maintenir les animaux au propre et au sec. Les souris sont pesées une fois par semaine afin de surveiller leur état de santé et de s'assurer qu'il n'y a pas de perte de poids significative, qui pourrait entraîner, le cas échéant, l'arrêt du protocole. Le bien-être des animaux sera contrôlé quotidiennement afin de détecter au plus tôt les premiers signes de souffrance comme l’apathie, la prostration, l’abaissement des paupières et l’apparition d’une cyphose. La zone d’injection sera observée quotidiennement (couleur/gonflement) afin de prévenir l’apparition d’une infection. En cas de douleur au cours de l’étude, les antidouleurs risquant de réagir de manière imprévisible avec le médicament et perturber les résultats aux tests, l’animal sera mis à mort prématurément.

Choix des espèces

Afin de comprendre les mécanismes moléculaires aboutissant à la maladie de Charcot-Marie-Tooth et d’évaluer les effets d’une thérapie, nous avons besoin d’effectuer des expériences physiologiques in vivo. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d’autres espèces évolutivement plus éloignées de l’Homme car la structure des muscles et des nerfs, les deux tissus principalement touchés, est trop différente. D’une part, une étude sur des cellules ne pourrait pas se suffire à elle-même car les effets sur l’ensemble de l’organisme et l’évaluation des bénéfices sur la structure des fibres nerveuses et musculaires, sur la force générale et sur la coordination motrice seraient impossible à évaluer. D'autre part, une étude sur culture de cellules ne peut être envisagée car le phénotype pathologique ne se développe pas et les bénéfices sur les paramètres décrits ci-dessus ne peuvent être mesurés. Pour augmenter l’activité de la protéine déficiente, nous administrerons un composé pharmacologique pendant 14 jours consécutifs aux souris modèles de la maladie. Nous étudierons les effets de ces injections à 6 semaines, car à cet âge le phénotype de la maladie est exprimé (défauts histologiques des tissus et structurels), ainsi nous pourrons savoir assez tôt si le médicament est bénéfique.

Des souris porteuses de mutations qui leur causent des douleurs, des difficultés à se déplacer et parfois la mort avant terme sont élevées ici pour d'autres projets. 7 500 d'entre elles sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la seule intervention décrite étant une biopsie de quelques secondes pour le génotypage. Le porteur affirme que l'élevage de ces lignées ne peut pas être remplacé, ces animaux constituant selon lui "le cœur même" des projets des utilisateurs. Celles dont le génotype n'intéresse aucun projet sont transférées vers un autre établissement quand c'est possible, tuées sinon, tandis que les autres partent en expérimentation ailleurs ou servent de reproducteurs.

Objectifs

Dans le cadre de la production de modèles murins génétiquement modifiés, l'objectif du projet est de décrire la prise en charge des pathologies induites par les mutations de ces modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de raffiner la production de souris génétiquement modifiées et de gérer l'apparition de pathologies induites par ces modèles en anticipant leur prise en charge et en permettant ainsi une réaction immédiate et adaptée. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines.

Procédures

Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. La biopsie pour génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable induisent en général et à des degrés divers des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures epxérimentales dans d'autres établissements utilisateurs (utilisation continue) ou peuvent servir en tant que reproducteurs. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt pour les projets expérimentaux initiaux peuvent être soit utilisés pour d'autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs si c'est possible, soit euthanasiés s'l n'y a pas de possibilité de les utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur même des projets des utilisateurs.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des points limite attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (par exemple : batonnets de coton, maison en carton si besoin, frisottiss si besoin,mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions environnementales sont très élevées afin de protéger les animaux d'infections.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.

1 760 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun voyant ses pattes arrière immobilisées par un adhésif seize heures par jour, de la naissance au vingt-huitième jour. Les ratons sont séparés de leur mère cinq heures au douzième jour, certains sont ensuite soumis à une course forcée sur tapis roulant trente minutes par séance, trois jours par semaine pendant quatre semaines, d'autres à des vibrations du corps entier quinze jours de suite. Une injection de marqueur dans le muscle après ouverture de la peau, une étude électrophysiologique d'une heure trente et un prélèvement de sang par section du bout de la queue complètent le protocole, avant la mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur annonce des contremesures qui permettraient aux enfants alités ou atteints d'un trouble de la coordination un développement harmonieux, quand ce qui est acquis ici est l'immobilisation quotidienne de rats nouveau-nés.

Objectifs

Les premières années de la vie sont déterminantes pour le développement de l’enfant et de la santé de l’adulte qu’il deviendra, et elles programment sa santé future (cf. concept des « 1000 premiers jours » lancé par l’Unicef). La jeune enfance est donc une période critique du développement au cours de laquelle les individus vont développer les compétences motrices et cognitives essentielles pour leur existence. Or, certains enfants sont contraints à l’hypoactivité parce qu’ils sont alités (maladie, accident, paralysie cérébrale…). D’autres, qui souffrent d’un trouble développemental de la coordination, présentent des atypies sensorimotrices. L’hypoactivité ou les troubles moteurs précoces sont à l'origine d'un développement anormal et durable de l'organisation et des fonctions du système nerveux. Ils conduisent à des troubles cognitifs et à un risque accru d’émergence de maladies civilisationnelles à l’âge adulte (diabète, hypertension...). Les objectifs de ce projet sont 1/ de fournir des preuves d'une altération du dialogue muscle-cerveau dans les déficits neurodéveloppementaux induits par l'hypoactivité et 2/ dans une perspective translationnelle, de développer des stratégies innovantes pour restaurer un dialogue efficace et robuste entre le muscle et le cerveau afin de contrecarrer les déficits. L’étude sera réalisée sur un total de 1760 rats dans le respect du principe des « trois R » (remplacement, réduction, raffinement). L’une de nos priorités majeures sera de minimiser l'inconfort, le stress ou la douleur des animaux et de maintenir le nombre d'animaux utilisés dans les procédures expérimentales au minimum. Les interventions invasives seront menées dans les conditions appropriées d'anesthésie et toutes les mesures nécessaires seront prises pour minimiser la douleur pendant et après les interventions. Dans le cas où la vie d'un animal devra être interrompue, cela sera effectué rapidement pour minimiser la douleur et dans le respect des procédures éthiques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’avancer dans la compréhension des effets de l’hypoactivité au cours du développement (enfance) et de proposer des contremesures efficaces pour permettre un développement sensorimoteur et cognitif harmonieux.

Procédures

- La procédure de restriction sensorimotrice consiste à immobiliser les pattes postérieures pendant 16h chaque jour, de la naissance à P28. La pose de l'adhésif chaque soir dure env 1 min et le retrait chaque matin 1-2 min. - Prise alimentaire : les ratons sont isolés de la mère pendant une durée de 5 heures le 12e jour postnatal. - L'analyse IRM est réalisée une seule fois et dure env. 1 heure, depuis l’anesthésie jusqu’à l’euthanasie finale. - Les animaux du groupe "exercice" seront entrainés à marcher sur la tapis 10 minutes / jour, 5 jours consécutifs, puis seront soumis à une course sur tapis roulant pendant 30 min, 3 jours /semaine, 4 semaines consécutives. - Vibration corps entier : pendant 15 jours consécutifs, avec un maximum de 15 min / jour. - Avant l’euthanasie, une goutte de sang sera recueillie par section de la pointe de la queue pour mesures de paramètres sanguins au moyen de bandelettes. Cette procédure très rapide ne génère pas plus de douleur pour l’animal que, pour les personnes diabétiques, le fait de se piquer le bout du doigt pour obtenir une goutte de sang. En outre, une pommade anesthésique sera appliquée préalablement. - Injection de marqueur rétrograde dans le muscle : cette procédure, réalisée sous anesthésie, nécessite d'ouvrir la peau pour injecter une petite quantité de marqueur dans le muscle au moyen d'une aiguille très fine. L’animal recevra une injection d’analgésique. La durée totale de l’intervention n’excèdera pas 30 min. - Une étude électrophysiologique (réflexe H) et mécanique (propriétés contractiles) : le niveau d’anesthésie sera vérifié tout au long de la procédure, en veillant toujours à ce que l'animal ne présente aucun signe d'inconfort. La durée totale de l’ensemble de cette procédure est de l’ordre de 1h30. À la fin, les animaux seront mis à mort par euthanasiant chimique et différents tissus seront alors prélevés. - tests comportementaux : réalisés chaque semaine pendant 2 mois. Ils sont répartis sur 5 jours consécutifs, l'ensemble des tests réalisés les 3 premiers jours n'excède pas 30 minutes / jour. Le 4e jour, le test de fatigue dure jusqu'à ce que l'animal refuse de courir. La durée est de l'ordre de 30 min à 1h. Le 5e jour, le test dure toute la nuit mais l'animal est laissé dans sa cage d'hébergement.

Impact sur les animaux

Pour les animaux du groupe RSM (soumis à une restriction sensorimotrice), la peau des pattes postérieures peut se trouver sensibilisée par l’application quotidienne d’adhésif médical. En outre, l’immobilisation peut induire des contractures musculaires. Lors du retrait du système d’immobilisation chaque matin, la peau est soigneusement inspectée et les mouvements de flexion et extension des pattes postérieures sont réalisés délicatement. L’ensemble des tests réalisés pour l’évaluation de la fonction motrice peuvent générer un stress modéré dû à la manipulation et au changement d’environnement. La durée de cette étude est estimée à 1h au maximum. En outre, la course forcée sur tapis roulant peut générer un stress et de possibles douleurs musculaires. Les animaux seront habitués à la course sur tapis roulant à faible vitesse pendant au minimum trois séances préalablement à l’exercice proprement dit. L’étude des propriétés musculaires peut générer de la douleur mais cet effet indésirable sera prévenu par l’utilisation d’une anesthésie gazeuse et analgésie chimique.

Devenir

Les animaux des différents groupes expérimentaux seront mis à mort afin de prélever des tissus.

Remplacement

L'analyse comportementale nécessite d'être réalisée in vivo et ne peut être remplacée par des méthodes alternatives. L'analyse des propriétés musculaires pourrait être réalisée ex vivo. Cela nécessite un appareillage particulier, onéreux, et une longue période de tests. Des travaux préliminaires seront intégrés à cette étude, en parallèle de l’approche in vivo. Notre objectif est de privilégier cette alternative dans l'avenir.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux par groupe se base sur la nécessité d’avoir suffisamment d’animaux pour que l’analyse statistique soit possible entre les deux groupes. La plupart des interventions sont non invasives et peuvent être réalisées sur les mêmes animaux. Toutefois, lors de l’euthanasie, deux types de perfusion différentes seront nécessaires pour prélever les tissus, ce qui oblige à prévoir deux lots d’animaux. En outre, pour éviter un effet éventuel de la portée (dû par exemple au comportement maternel), il faut diversifier les portées d’origine au sein d’un même groupe (par exemple, 10 animaux seront obligatoirement issus de 5 portées différentes au minimum).

Raffinement

Les rats seront hébergés en cage collective dans des condition de température et d’hydrométrie contrôlée avec une alimentation et un apport en eau à volonté. Ils bénéficieront d’une surveillance quotidienne et de pesées bi-hebdomadaires. Les expérimentations et les prélèvements seront effectués dans des pièces réservées à cet effet et différentes des locaux d'hébergement. Des anesthésiques et antalgiques adaptés au protocole seront utilisés. Des points limites adaptés seront appliqués. Les animaux présentant au minimum un point limite seront immédiatement retirés de l’étude et euthanasiés.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles animaux les plus couramment utilisés en recherche fondamentale ou appliquée chez les mammifères, notamment pour l’étude de pathologies humaines. Le laboratoire dispose du savoir-faire et des dispositifs expérimentaux nécessaires à l'étude de la fonction sensorimotrice chez les rongeurs. Les rats seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 3 mois, ce qui permettra d'étudier les conséquences chez le jeune adulte d'une restriction sensorimotrice subie au cours de l'enfance.

Injections dans l'abdomen tous les deux jours de un à quatre mois, test de force trois fois par jour chaque mois, vingt-quatre heures d'enregistrement de l'activité locomotrice répétées jusqu'à quatre fois, prélèvement de sang mensuel : 660 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent l'une des deux mutations les plus fréquentes chez les patients atteints de myopathie à agrégats tubulaires, et présentent une faiblesse musculaire dès l'âge de deux mois. Le porteur signale aussi une douleur et un stress liés au poinçonnage de l'oreille et au tatouage de la queue. La mesure finale de la force musculaire dure jusqu'à trente minutes sous anesthésie, sans réveil, et les souris sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés.

Objectifs

La myopathie à agrégats tubulaires (TAM) est une maladie rare caractérisée par une faiblesse musculaire progressive, des crampes et des myalgies. La majorité des patients présentent également des anomalies de la peau, des os, des plaquettes, et de la rate. La présentation complète de ces signes multisystémiques est appelé syndrome de Stormorken (STRMK). TAM et STRMK forment un spectre de la même maladie. Nous avons précedemment généré et caractérisé deux modèles murins portant les deux mutations TAM/STRMK les plus communes chez les patients, localisées sur des gènes différents. Les souris présentent les principaux signes cliniques des patients. A ce jour, aucun traitement n’est disponible ni pour prévenir ni pour atténuer ces signes cliniques. A partir d'une librairie de médicaments approuvées pour le traitement médical chez l'homme, nous avons identifier deux médicaments capables d'inverser les défauts associés à la maladie in vitro. Une autre molécule est actuellement entrée en Phase II en essais cliniques pour la pancréatite aïgues mais cible la même voie dérégulée chez nos patients. Nous avons l'intention de traiter nos modèles souris TAM/STRMK avec les deux médicaments et la molécule en Phase II afin de tester la prévention mais également la réversion des symptômes observés chez les souris. Nous espérons ici trouver une nouvelle indication thérapeutique à des médicaments utilisés pour le traitement d'autres maladies. Cette méthode permet d'offrir une solution thérapeutique plus rapide aux patients et également peu toxique. Cette méthode est particulièrement intéressante pour les maladies rares comme TAM/STRMK où le nombre de patients diagnostiqués n'est pas suffisant pour réaliser des essais cliniques sur cette maladie.

Bénéfices attendus

Il est attendu que cette étude apportera une preuve de concept pharmacologique pour un traitement efficace de TAM/STRMK.

Procédures

Les animaux seront injectés par injection intrapéritonéale tous les deux jours entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention, et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. L'injection est réalisée en moins de 30 secondes. Le test de comportement permettant d’évaluer la force globale de l’animal sera réalisé 3 fois par jour toutes les mois entre 1 et 4 mois pour la stratégie de prévention et entre 4 et 6 mois pour la stratégie de réversion. Chaque test dure 60 secondes avec repos minimal de 5 minutes entre chaque test. Le test permettant de mesurer l’activité locomotrice spontanée dure 24h, et sera répété 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 2 fois pour la stratégie de réversion (1 fois par mois). Le prélèvement du sang sera répété 1 fois par mois, soit 4 fois dans la vie de la souris pour la stratégie de prévention et 3 fois pour la stratégie de réversion, et durera 1 minute. La mesure de la production de force du muscle est une procédure sans réveil, qui durera au maximum 30 minutes. A l’issue de cette procédure, l’animal anesthésié sera mis à mort. Des injections péritonéales seront réalisées pour administrer le traitement. La procédure prendra environ 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Les souris malades manifestent des problèmes dans le muscle, la rate, et les plaquettes, tout comme pour l'homme. Le modèle murin est un outil approprié pour étudier le développement de la maladie et l'effet thérapeutique attendu des traitements étudiés. Les tests de comportement peuvent induire du stress chez l'animal. Les injections du traitement peuvent causer douleur chez l'animal. Une douleur et un stress physique sont attendus suite au poiçonnage de l'oreille et au tatouage consécutif de la queue lors de l'identification de l'animal.

Devenir

Les animaux seront mis à morts à l’issu des tests pour prélever les muscles nécessaires aux analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation d’un modèle cellulaire ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme qui dans notre cas est crucial car nous étudions une maladie associée à un phénotype multisystémique.

Réduction

Pour la partie expérimentale, les tests phénotypiques réalisés de manière non invasive offrent la possibilité de réaliser un suivi longitudinal en répétant les expérimentations sur les mêmes animaux au cours du temps. D’autre part, les analyses moléculaires et histologiques seront réalisées uniquement à la fin du traitement, ce qui permet de s’affranchir de générer une nouvelle cohorte pour chaque point du suivi longitudinal. L’organisation de nos procédures vise à utiliser le plus possible de tissus différents provenant de la même souris afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs procédures expérimentales seront réalisées avec un maximum d’un test par jour. Le nombre d’animaux sera réduit au maximum en veillant à obtenir une puissance statistique suffisante. Ainsi, nos précédentes études montrent que 15 souris au maximum par groupe seront nécessaires pour obtenir une étude concluante.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu'au sevrage. La couleur de leur peau et la présence d'une poche de lait seront évaluées tous les 2 à 3 jours. Après le sevrage, les animaux seront hébergés en groupe dans des cages placées dans un environnement où la température sera maintenue constante, la qualité de l'air sera assurée par une ventilation et un cycle de lumière de 12 heures jour/nuit sera respecté. Les animaux auront accès à volonté à de l'eau et de la nourriture. La litière sera changée aussi souvent que nécessaire pour maintenir les animaux propres et au sec. Le milieu sera enrichi avec des nids et un tube. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. En cas de perte de poids, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, la nourriture sera placée dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l'aide de tests permettant une exploration totalement non invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo, ce qui limite le développement de la douleur. Afin de réduire le stress lié aux différents tests, une phase de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi longitudinal. Pour les mesures de force in situ, l'animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d'un mélange de produits anesthésiants et analgésiques permettant d'éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L'animal sera placé sur une plaque chauffante pendant toute la procédure afin de maintenir sa température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué. Des points limites pour nos souris incluent des signes de difficultés motrices majeurs tels que la perte de poids et une immobilité prononcée des membres postérieurs avec l’apparition d’une cyphose (dos arrondi). Si l'un des points limites est atteint, les souris seront euthanasiées. Les sites d'injections seront surveillés quotidiennement pour prévenir une infection.

Choix des espèces

Le modèle souris nous permet d’étudier la possible amélioration du phénotype musculaire et notamment du phénotype observé sur d’autres organes dans ce modèle murin d’une maladie multisystémique. Nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo chez la souris. Ces mesures ne peuvent pas être réalisées sur d'autres espèces évolutivement plus éloignées de l’homme car la structure du muscle est plus différente. C'est pourquoi nous proposons de réaliser ces techniques sur des lignées de souris disponibles dans nos laboratoires. Les tissus de la souris peuvent alors être utilisés pour effectuer d'autres analyses, maximisant ainsi les résultats obtenus par souris et minimisant le nombre total d'animaux utilisés. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Stim1R304W/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît au bout de 2 mois et s’accentue avec l’âge présentant un phénotype modéré à 9 mois. Le phénotype multisystémique de notre modèle animal Orai1V109M/+, caractérisé par de la faiblesse musculaire et des signes dystrophiques en histologie, apparaît également au bout de 2 mois. Les souris seront utilisées à l’âge adulte après 4 semaines (pour la prévention de la maladie) jusqu’à 4 mois, et des souris après 4 mois jusqu’à 6 mois (pour la réversion de la maladie), pour observer le développement des souris après le traitement.

600 rates vont être utilisées, toutes tuées et autopsiées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit l'ablation des ovaires sous anesthésie, opération de 30 à 40 minutes, puis des injections sous-cutanées quotidiennes sur animal éveillé sous contention, des prélèvements sanguins à la veine jugulaire jusqu'à une fois par semaine, et un hébergement individuel imposé par le suivi de la prise alimentaire. Le porteur reconnaît qu'un état de mal-être peut découler de cet isolement, et signale des cris ou de l'agitation pendant l'administration des traitements. Il conclut à l'absence de "méthode alternative" et au caractère "indispensable" de l'utilisation d'animaux pour évaluer des peptides censés limiter la perte osseuse après la ménopause.

Objectifs

La ménopause est une période clé pour la santé de la femme car s’accompagne de modifications physiologiques comprenant, notamment, une modification de la composition corporelle et un changement de la répartition des graisses corporelles conduisant notamment à un risque élevé pour la santé cardiaque, ostéo- articulaire et musculaire (perte de densité osseuse, fonte musculaire…). Des traitements thérapeutiques existent déjà pour réduire la perte osseuse, mais présentent des effets secondaires. Des conseils nutritionnels adaptés, associés à des conseils relatifs à l’activité physique, peuvent également s’opposer en partie aux effets de la ménopause d’autant plus que dans notre société l’activité physique est réduite, et la sédentarité croissante. Dans ce contexte, où des facteurs génétiques interviennent également expliquant les différences entre femmes, il devient fondamental de prendre en considération l’impact d’une balance énergétique déséquilibrée en faveur des apports et non des dépenses. L’objectif du projet est donc d’évaluer l'effet de thérapie sur le processus de formation et résorption de l’os dans un contexte combinant ostéoporose et contrôle alimentaire afin de proposer aux professionnels de la santé et aux patients des approches thérapeutiques plus appropriées. Les agents thérapeutiques testés sont des peptides agissant à différents niveaux, il est attendu un effet sur la masse graisseuse et sur le remodelage osseux. Il s’agira d’évaluer l’effet de ces agents thérapeutiques sur la perte osseuse induite par ovariectomie chez le rat (modèle décrit et reconnu par la communauté scientifique) dans un contexte de prise alimentaire monitorée. Ce modèle d’ostéoporose induite par ovariectomie a pour principaux avantages (i) de mimer le développement d’une ostéoporose post-menopausale, avec une reproductibilité élevée pour analyser de manière robuste et efficace les mécanismes mis en jeu dans le développement de la pathologie et dans la réponse induite par les agents thérapeutiques testés (ii) d’accéder à de plus amples informations indispensables au développement de nouvelles approches thérapeutiques (iii) d’être prédictif en clinique de l’activité des agents thérapeutiques testés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux. Ce projet permettra à court terme d’obtenir des informations sur (i) la tolérance ou la potentielle toxicité des agents thérapeutiques étudiés au niveau systémique et osseux (ii) l’influence d’une alimentation monitorée sur la prise de poids et indirectement sur le développement de l’ostéoporose (iii) les modifications induites par l’administration des agents thérapeutiques étudiés au niveau du corps entier et des os. A plus long terme, ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle des modifications physiologiques ayant lieu après ménopause, d’établir des diagnostics robustes et de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques alliant traitement médicamenteux et suivi alimentaire et limiter les effets secondaires.

Procédures

Les animaux seront soumis à une opération chirurgicale unique réalisée sous anesthésie générale et avec analgésie pré- et post-opératoire afin de réalisation l’ablation des ovaires. Cette opération dure 30 à 40 minutes par animal. Les traitements sont réalisés par injections sous-cutanées, réalisées quotidiennement, chaque injection dure 1 à 2 min, et est réalisée sur animal éveillé avec contention simple. Des injections sous-cutanées de produits permettant le suivi de la formation osseuse seront réalisées dans les 2 dernières semaine du protocole. Chaque animal recevra 2 injections à 1 semaine d’écart, chacune durant de 1 à 2 min. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine jugulaire pourront également être réalisés, ces prélèvement auront lieu sur animal éveillé, dureront moins de 5 min par animal, et pourront être répétés une fois par semaine tout au long du protocole.

Impact sur les animaux

La réalisation de la chirurgie peut s’accompagner d’une possible réaction inflammatoire transitoire au niveau du site de l’incision. Les effets indésirables attendus sur les animaux peuvent être un traumatisme exprimé par des cris ou une agitation pendant l’administration des traitements ou le prélèvement de sang, et une inflammation au niveau du site d’injection. Un état de mal-être pourrait également survenir lié à l’hébergement individuel.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes et tissus d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour doser les agents thérapeutiques, les paramètres et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les agents thérapeutiques que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais la perte osseuse induite par la déficience en œstrogène est un mécanisme complexe faisant intervenir différents types cellulaires du tissu osseux. Les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur des effets sur l’ensemble des organes d’un organisme. Ces mécanismes extrêmement complexes ne pouvant pas être mimés par des modèles simples de culture de cellules in vitro, il n'existe malheureusement pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’efficacité d’agents thérapeutiques sur la perte de densité osseuse. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au maximum afin d’obtenir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une étude complémentaire pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Nous utiliserons notamment des femelles adultes depuis plusieurs semaines ayant dépassé la majorité squelettique dont le squelette n'est plus en phase de croissance. Etant donné la variabilité probable en réponse aux agents thérapeutiques, 10 animaux au maximum par condition testée sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé grâce à nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif pourra être revu après analyse de résultats de protocoles préliminaires, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre.

Raffinement

Du fait du suivi alimentaire à réaliser, les animaux seront stabulés individuellement dans des conditions d’hébergement optimisé afin de limiter le stress (ajout d’un enrichissement augmenté tels que tunnel, bâton ou bille de bois). L'état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne et sera spécifiquement axée sur l’apparition (i) de signes de douleur occasionnée par l’acte chirurgical (exemple : inflammation locale, plaie…), (ii) de signes de stress dus aux prélèvements de sang ou liés à l’hébergement individuel, (iii) ou de signes d’inflammation liés aux injections des traitements. Cette observation quotidienne aura pour but de minimiser la douleur et tout facteur agissant sur le bien-être animal. Un protocole analgésique et/ou antalgique sera mis en place le jour dès le jour des chirurgies, avant et après l’opération. Outre la gestion de l'analgésie, l’ablation des ovaires sera pratiquée sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation. Enfin, tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible et à l’appui des grilles du bien-être animal) sera humainement euthanasié.

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment au niveau osseux, proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques. Les rats femelles et adultes auront dépassé la majorité squelettique (10 semaines). Autrement-dit leur squelette ne sera plus en phase de croissance.

Une perte de 25 % du poids, ou un score de douleur de huit à neuf sur la grille du laboratoire, déclenche la mise à mort. 313 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux de sang et d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome mitochondrial rare, elles sont suivies de la naissance jusqu'à deux ans, avec prélèvements sanguins et urinaires à un, deux, quatre et six mois, tests de force et d'endurance et séances d'IRM et d'échocardiographie sous anesthésie aux mêmes âges. Le porteur attend un déficit de poids d'environ 20 %, un défaut cardiaque et un défaut musculaire, et présente ce travail comme l'étape préalable au test de candidats médicaments déjà repérés sur des cellules de patients.

Objectifs

Le syndrome NARP (Neuropathie Ataxie Rétinite Pigmentaire) est une pathologie rare qui affecte majoritairement les fonctions cardiaques, musculaires, et neurologiques et pour laquelle il n'y a toujours pas de traitement. Au laboratoire nous avons identifié des candidats médicaments efficaces sur les cellules de patients atteints du syndrome NARP. Afin de pouvoir proposer le traitement à des patients il nous faut prouver leur efficité dans un animal entier (ici le modèle murin). Avant, il est nécessaire d'identifier des déficits clairs dans le modèle souris du syndrome de Barth. Ce projet vise donc à caractériser finement le modèle souris du Syndrome NARP d'un point de vue cardiaque, musculaire, comportementale etc.... Ceci permettra ensuite de tester si les candidats médicaments efficaces en cellules de patients sont capables de diminuer les défauts mis en évidence dans l'étape de caractérisation du modèle murin. Si tel est le cas, on aura la preuve de leur efficacité dans un animal entier. L'objectif ultime étant de proposer les candidats médicaments efficaces dans les cellules de patients et le modèle murin du syndrome NARP à des patients atteints du syndrome NARP.

Bénéfices attendus

Avant de tester des candidats médicaments, il est nécessaire de caractériser la lignée murine, modèle du syndrome NARP, dans nos animaleries afin d'identifier les meilleurs paramètres pour les futurs tests médicamenteux. Cela n'a jamais été fait auparavant de manière détaillée. Seront analysés, le comportement, le poids, la fertilité, les portées, les avortements spontanés, la mortalité périnatale, l'acidose, la force musculaire, l'endurance, la coordination, les fonctions cardiaques, les fonctions mitochondriales sur tissus et des dosages sanguins et urinaires.

Procédures

Prélèvements sanguins et urinaires aux âges de 1 mois, 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excédera pas 10 minutes. Tests comportementaux (force musculaire, motricité, équilibre et endurance) aux âges de 2 mois, 4 mois et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes. IRMs et echocardiographies aux âges de 2, 4 et 6 mois. Chaque intervention n'excèdera pas 30 minutes et les souris subiront des anesthésies.

Impact sur les animaux

Des nuisances liées aux souris présentant un phénotype dommageable peuvent être attendues. Comme d'autres modèles murins similaires (avec des déficits mitochondriaux) nous pouvons attendre, à l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents, un défaut cardiaque et un défaut musculaire. Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. L'analyse par IRM et échocardographie nécesite une anesthésie. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données IRM ou échocardiographiques. Le suivi des performances sur tapis de course, rotarod ou grip test teste les capacités motrices de l'animal vigile. Il n'y a pas de conséquence sur le bien être de l'animal au delà de la période entourant le recueil des données de la course.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement terminaux de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de caractériser à différents niveaux le modèle murin.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires eucaryotes pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome NARP, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également avant de procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaires a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8 animaux par groupe. Afin de palier une éventuelle mort prématurée des animaux (suite à une blessure par exemple), nous prévoyons 20-25 pourcents d’animaux en plus, soit 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la Structure chargée du Bien Etre des Animaux (SBEA), les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 1 fois par semaine. Si l'animal perd entre 10 et 15 pourcents par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 25 pourcents l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Nous raffinons nos expérimentations en utilisant les animaux de chaque groupe pour recueillir plusieurs types de données. Sur chaque animal, l’ensemble des organes et tissus pouvant être recueillis sont prélevés afin d’anticiper les expérimentations futures. Pour toutes les procédures, les animaux seront observés quotidiennement, et les points limites seront évalués en détail: Plaie/Traumatisme, Comportement/Mouvement, Aspect général, Evolution pondérale. Un score sera attribué, qui déterminera les traitements/observations à suivre: Score 0-2 = aucune douleur => pas de traitement. Score 3-5 = Observation plus importante et gel diet et croquettes humides au fond de la cage. Score 6-7=douleur légère à modérée=>Nettoyer d'éventuelles plaies et injection en sous cutanée d'un anti douleur et euthanasie si pas d'amélioration sous 24H. Score 8-9 = euthanasie de l'animal pour ne pas attendre et laisser souffrir l’animal. Les animaux seront transférés dans différentes animaleries selon les analyses. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquate et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des cages de transport adaptées contenant copeaux, cotons et nourritures. Les souris contrôles seront toujours séparées des souris modèle de la maladie. Les transferts seront effectués une semaine avant les analyses pour laisser un temps d'acclimatation dans la nouvelle animalerie.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99 pourcents d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - les symptômes de la maladie retrouvés dans le modèle murin sont équivalents à ceux retrouvés chez l'homme suggérant qu'un candidat médicament efficace dans le modèle murin le sera également chez l'homme Les animaux seront suivis de leur naissance (mortalités, suivi des portées, génotypage, avortements spontanés) à l'âge de 2 ans. Les animaux seront caractérisés dès l'âge de 10 jours pour un suivi de poids hebdomadaire, aux âges de 2, 4 et 6 mois pour des tests d'endurance, de force musculaire, de coordination et de fonction cardiaque et aux âges de 1, 2 ,4 et 6 mois pour des dosages sanguins et urinaires, et des prélèvements d'organes.

Tester si des cellules souches au métabolisme standardisé freinent la dégradation du cartilage suppose d'abord de détruire ce cartilage. 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses radiologiques et histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Deux injections de collagénase sont pratiquées dans le genou droit à deux jours d'intervalle sous anesthésie gazeuse, puis une injection de cellules une semaine plus tard. L'arthrose ainsi provoquée peut plonger les souris dans la prostration, les isoler de leurs congénères et leur faire cesser le toilettage social, un signe clinique déclenchant des croquettes humidifiées, deux un analgésique, trois la mise à mort.

Objectifs

L’arthrose (OA) est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50 % de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble des tissus de l’articulation et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’OA est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements palliatifs non spécifiques existent et ne permettent pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’OA. Dans ce contexte, les cellules souches adultes et leur potentiel thérapeutique ont été largement étudiés. Des études pré-cliniques et cliniques ont montré des résultats prometteurs. Cependant, des inconvénients majeurs ont été mis en évidence, la fuite des cellules du site d’injection, leur faible viabilité après l’injection et la variabilité de l’efficacité des cellules en fonction des donneurs. Les travaux de nos collaborateurs ont montré que le métabolisme des cellules joue un rôle primordial pour leurs propriétés thérapeutiques. L’un des objectifs du projet est de standardiser le métabolisme des cellules afin de maximiser leurs propriétés thérapeutiques et rendre plus reproductible les résultats obtenus avec différents donneurs de cellules. L’objectif de ce projet vise à montrer l’effet immunosuppresseur des cellules traitées quel que soit le donneur de cellules dans un contexte arthrosique et de suivre le devenir des cellules injectées. Les données recueillies permettront d’envisager une étude chez un plus gros animal que la souris. Selon les résultats obtenus, nous envisagerons ensuite d'encapsuler les cellules traitées dans un hydrogel afin de les protéger d’une fuite du site d’injection et de la mort cellulaire afin de prolonger leur effet thérapeutique.

Bénéfices attendus

La prise en charge des patients atteints d’arthrose (OA) est à ce jour peu efficace et, compte-tenu de l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le traitement de l’OA représente un enjeu économique et social majeur. Ce projet permettra de mettre en évidence l’importance du statut métabolique des cellules souches mésenchymateuses (MSC) in vivo pour le traitement de l’OA et de suivre le devenir des MSC injectées dans l’articulation. Ces travaux pourront, à long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques pour des essais cliniques chez le chien (animal présentant naturellement de l’OA comparable à l’Homme) puis chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections intra-articulaires de 5 µL de la molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage ou d'une solution saline pour les groupes « contrôle » dans le genou droit à deux jours d’intervalle. Puis, une semaine après, une partie des animaux recevront une injection de 8 µL de cellules dans ce même genou pour étudier leur effet thérapeutique. Ces injections dureront quelques secondes par animal et seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire. Les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Lors du développement de l’arthrose (OA), de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration (état dans lequel l’animal est inactif, immobile et en repli sur lui-même), s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Une infection pourrait intervenir au niveau du point d’injection de la collagénase puis des cellules. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué tel qu’un changement mineur, une boiterie, une mobilité réduite, …) seront attentivement observés afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.

Devenir

A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.

Remplacement

L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires ainsi que d’un liquide synovial. L’ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d’une pathologie comme dans le cas de l’arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour lesquelles il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences statistiquement significatives et reproductibles entre les groupes. De précédentes études ont été réalisées pour le suivi de cellules marquées notamment après injection sous la peau. Ainsi nous n’utiliserons pas d’animaux pour la mise au point technique de la détection des cellules marquées. De plus, des études in vitro ont permis d’optimiser le protocole de standardisation des cellules souches adultes afin de limiter le nombre de groupes de souris lors de la procédure d’expérimentation animale.

Raffinement

De façon générale, un suivi quotidien par un personnel impliqué dans la procédure pendant la première semaine post-injection puis hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. Si des signes cliniques sont observés, la gestion de la douleur se fera comme suit : 1 signe notable = visite 3 fois / semaine, mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage ; 2 signes notables = administration de analgésique ; 3 signes notables ou un signe sévère (point limite) = euthanasie. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux (une fois tous les 10 jours). Le reste du temps, les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec de l’enrichissement du type frisottis et d’un dôme. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Pour le cas particulier des injections, les souris sont anesthésiées par inhalation d’anesthésique durant toute la procédure et sont suivies quotidiennement pendant les 3 premiers jours post-injection.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose (OA), plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autre part, elle permet la constitution de groupes d’animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des calculs statistiques pertinents et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré la faisabilité du modèle et qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation permettant d’obtenir des résultants pertinents et reproductibles. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose (OA) est possible et documentée dans la littérature.

5 202 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce qu'elles auront été en contact avec une bactérie pathogène pour l'humain. Chacune subit une biopsie d'oreille par semaine pendant 42 jours, une prise de sang hebdomadaire pendant 42 à 92 jours, jusqu'à sept injections sous-cutanées et deux intramusculaires, et des piqûres de tiques dont les nymphes restent accrochées cinq jours. 216 souris sont utilisées uniquement pour produire des tiques infectées. L'infection par Borrelia peut provoquer des arthrites aiguës, une démarche anormale, une perte de tonicité et une paralysie des pattes, et le porteur écrit par ailleurs que les piqûres de tiques sont indolores pour l'animal.

Objectifs

La borréliose de Lyme (BL), maladie à transmission vectorielle prédominante en Europe, est causée par les spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato (sl). Cette maladie peut affecter divers tissus tels que la peau, le système nerveux, les articulations, le cœur, et occasionnellement, d'autres organes. La transmission des bactéries se fait par la morsure de tiques dures du genre Ixodes, parasites de nombreux hôtes, y compris petits et grands mammifères, oiseaux et reptiles. Les manifestations chroniques de la maladie incluent des complications neurologiques rares liées à l'infection par B. burgdorferi s.l. La pathogenèse de la maladie dépend de la génétique bactérienne, de la capacité de l'hôte à contrôler l'infection et des facteurs liés à la tique. 1. Objectifs Principaux du Projet : o Comprendre en détail les mécanismes de transmission de la maladie de Lyme par les tiques. o Identifier de nouveaux modèles murins d'infection à Borrelia reproduisant la gamme complète des symptômes humains en tirant parti de la diversité génétique de lignées murines pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. o Améliorer les connaissances pour une meilleure prise en charge des patients et des stratégies préventives. 2. Procédures Expérimentales : o Dans une première procédure, évaluer la sensibilité de 13 lignées murines après injection sous-cutanée de trois espèces de Borrelia burgdorferi européennes, choisies pour leur infectiosité élevée chez la souris de référence. o Dans une deuxième procédure, tester la réponse des souris à une infection naturelle par des tiques infectées par trois souches de la bactérie Borrelia. o Dans une troisième procédure, évaluer l'effet d'antibiotiques couramment utilisés dans le traitement de la borréliose de Lyme, ainsi qu'une combinaison de molécules agissant sur les formes persistantes de la bactérie. o Enfin, dans une quatrième procédure, évaluer l'effet protecteur de préparations vaccinales vis-à-vis de l'infection par des tiques infectées. Signification et Impact : • Contribuer à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie de Lyme. • Proposer de nouveaux modèles murins reflétant davantage la diversité des symptômes humains. • Tester l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à combler les lacunes dans la compréhension de la borréliose de Lyme, en mettant l'accent sur des approches novatrices pour les modèles murins, les traitements et les préventions, avec un objectif ultime d'amélioration des soins aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies d’oreille un fois par semaine pendant 42 jours. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Des prélèvements de sang au niveau du sinus retro mandibulaire seront réalisés toutes les semaines (durée 30 secondes) pendant une période pouvant varier de 42 à 92 jours. Des injections par voie sous-cutanée (1 à 7 fois) et intramusculaire seront réalisées (2 fois). Chaque injection ne dure que quelques secondes. Les souris seront également soumises à des piqures de tiques. Les nymphes restent attachées pendant 5 jours et les larves 3 jours. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Douleur, lésion, maladie : arthrites aiguës (gonflement des articulations), atteintes neurologiques aiguës (mouvements limités, démarche anormale, manque de tonicité, paralysie des pattes) lors de l’infection par les bactéries Borrelia. Environnement non adapté. Il y aura isolement des animaux pendant la durée du gorgement des tiques, pour une durée inférieure à une semaine On peut observer une perte de poids éventuelle durant le gorgement des tiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été en contact avec un agent pathogène pour l’homme.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler dans le cadre de l’expérience 1 sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées les plus sensibles aux trois souches de Borrelia. Les 8 individus seront répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de l’expérience 2, nous aurons 20 souris par groupe. Dans le cadre de la procédure 2, lors de l’expérience 1, le nombre de souris utilisées (216) pour l’obtention de tiques infectées est strictement lié à la biologie des tiques dont nous avons une excellente connaissance. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 10 individus par groupe pour pouvoir faire des mises à mort à différents temps et disposer de 2 individus dans le cadre des analyses que nous souhaitons mener. Dans le cadre de la troisième procédure, nous utiliserons 12 souris par groupe. Ces trois procédures nécessiteront lors de leur analyse d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. Dans le cadre de la quatrième procédure, nous avons choisi d’utiliser 20 souris par vaccins. Ce chiffre est issu d’expériences déjà menées et qui ont montré que la sensibilité des expériences qui seront menées afin de démontrer l’efficacité d’un vaccin nécessite ce nombre d’animaux. En supposant un effet cage d’un certain niveau, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, un risque à 5% et une puissance à 80% de détecter des effets marqués ou forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Les atteintes neurologiques seront évaluées plus précisément par l’utilisation de tests comportementaux. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Un renforcement de l’enrichissement sera effectué notamment dans le cadre de la procédure 1 afin que les animaux soient dans une ambiance confortable. Dans le cadre des procédures au cours de laquelle les animaux seront infectés par des piqûres de tique, les souris devront être isolées et nous ajouterons dans la cage des objets pour les distraire : bâtonnets, balles, coton. Les cages étant totalement transparentes et filtrantes, un contact olfactif, visuel et acoustique sera possible entre les animaux.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme une espèce qui développe au moins certains des symptômes de la maladie de Lyme. Nous avons mis au point chez la souris un modèle expérimental d'infection prenant en compte les différentes conditions qui seront testées ici (salive de tiques, infection par des tiques). C'est la seule espèce à posséder des lignées présentant une large diversité génétique telles que celles du Collaborative Cross. Les souris seront des femelles et des mâles âgés de 5 à 7 semaines. S’il s’avère que l’un des deux sexes est plus sensible que l’autre à l’infection, nous n’utiliserons alors qu’un sexe sur les deux. Nous souhaitons que le système immunitaire soit mature lors de l’infection. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 42j et nous souhaitons que les souris aient au maximum un âge de 12 semaines à la fin de l’expérience pour pouvoir les comparer avec les données déjà obtenues sur d’autres souris.