Troubles musculosquelettiques

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections de protéine SSA avec adjuvant complet de Freund pour déclencher une maladie auto-immune, sept prélèvements de sang à la joue sous anesthésie générale, et cinq recueils de salive provoqués par la pilocarpine, au rythme d'une série par mois. Le traitement testé, un anticorps bispécifique censé détruire les seuls lymphocytes B auto-immuns, est injecté jusqu'à trois fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur justifie la mise à mort de toutes les souris par l'analyse histologique de leurs glandes salivaires, et ajoute que les exposer à vie à la sécheresse buccale provoquerait des pathologies dentaires rendant leur adoption inenvisageable.

Objectifs

Le syndrome de Sjögren (SS) est une maladie auto-immune chronique caractérisée par une inflammation des glandes salivaires et lacrymales, entraînant une sécheresse de la bouche et des yeux. Cette pathologie se complique de manifestation graves comme des atteintes d’organes sévères (poumon, muscle, nerfs). La maladie de Sjögren augmente de 20 fois le risque de faire un lymphome lié à la maladie. Il n’existe à ce jour aucun traitement approuvé pour cette maladie. Cette pathologie est caractérisée par la présence d’auto-anticorps dirigés contre la protéine SSA aussi appelée Ro60 qui sont produits par des lymphocytes B spécifiques. Les modèles murins utilisant la vaccination contre la protéine SSA reproduisent les caractéristiques de la pathologie humaine. Notre objectif est de développer un nouveau traitement de cette pathologie avec un anticorps bispécifique qui détruit spécifiquement les cellules B auto-immunes qui sont à l’origine des auto-anticorps anti-SSA. Cet anticorps bispécifique portera sur un bras l’antigène SSA et sur l’autre un anti-CD3 qui dirigera une réponse des lymphocytes T qui détruiront spécifiquement les cellules B autoimmunes dirigées contre SSA sans détruire les autres lymphocytes B qui sont utiles pour portéger des infections. Pour cela nous avons besoin du modèle animal préclinique de vaccination anti-SSA pour tester l’efficacité du traitement.

Bénéfices attendus

La maladie de Sjögren est due à une petite fraction de globules blancs( les lymphocytes B) qui détruisent les glandes produisant de la salive. Cependant les traitements actuellement disponibles pour détruire les lymphocytes B les détruisent en totalité. La destruction de tous les lymphocytes B entraine un risque important d’infection. L’objectif est d’aboutir à une guérison des patients grâce a une destruction ciblée des lymphocytes B qui détruisent les glandes salivaires. Ceci ne peut être obtenu qu’après démonstration de l’efficacité de cet anticorps bispécifique dans un modèle murin de la maladie. Après d’autres études chez l’animal le traitement pourra faire l’objet d’essais cliniques chez l’homme.

Procédures

-Injection : 5 fois. durée

Impact sur les animaux

1)Douleur liées aux injections de vaccination, de médicaments: légère de courte durée 2)Douleur et stress de courte durée liée aux prélèvements sanguins sur la joue 3) Stress lié à la contention pour le recueil de salive limitation par l’anesthésie générale. 4) L'adjuvant complet de Freund sera injecté en sous-cutané pour limiter les lésions cutanées au point d'injection. En cas de lésions nous appliquons un antiseptique et un antibiotique en crème si besoin.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car pour démontrer à la fois l’existence de la maladie de Sjögren et l’efficacité des traitements il est nécessaire de réaliser des analyses histologiques des tissus cibles de la maladie comme les glandes salivaires qui sont le siège de la maladie. Par ailleurs exposer tout le reste de leur vie de les animaux à la sècheresse buccale peut entrainer à long terme des pathologies dentaires qui pourraient entrainer des difficultés d’alimentation des animaux. Il n’est donc pas envisageable d’adopter ses animaux.

Remplacement

Le développement d’un nouveau médicament utilisant un système immunitaire complet et des organes cibles comme les glandes salivaires et reproduisant la pathologie ne peuvent être effectués que sur un modèle animal. En effet la réalisation sur des cellules humaines humains est rendu impossible par le fait qu'il nous faudrait reproduire plusieurs organes (rate, glandes salivaires, ganglions) reliées entre eux par des vaisseaux dans lesquels circulerait des cellules immunitaires. Ceci n'est pas réalisable à ce jour par les outils à notre disposition.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux par groupe a été calculé précisément à l'aide d'outils statistiques qui permettent d'être surs que le nombre d'animaux par groups (ici 15) est suffisant pour être sur de voir une différence significative d'augmentation du flux salivaire si le traitement fonctionne. Pour cela nous avons analysé les données disponibles de variations de la production de salive entre différentes souris malades et non malades.

Raffinement

Les souris bénéficieront d'un milieu enrichi avec du coton, des rouleaux de carton et des bâtonnets en bois. Ces animaux ne seront jamais hébergés seuls dans des cages séparées et feront l'objet d'une période d'adaptation d'une semaine après leur arrivée avant de débuter une procédure. Les animaux seront suivis quotidiennement et des points limites sont prévus pour veiller à ce bien-être . Les injections et les prelèvements seront faits sous anesthésie génrale et/ou locale.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car nous avons besoin d'un organisme entier avec un système immunitaire proche de celui de l'homme. Par ailleurs le modèle de maladie de Sjögren avec immunisation avec le peptide SSA a été developpé par une équipe américaine sur la souris il est donc logique pour le reproduire d'utiliser la même espèce. Nous utiliserons des animaux adultes entre 10 à 12 semaines ce qui est l’âge habituel auquel les protocoles d’immunisation commencent dans les protocoles de vaccination.

Comparer la qualité des sources de protéines végétales et animales passe ici par la privation alimentaire, et 720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat est isolé en cage individuelle pendant toute la période expérimentale, placé deux fois vingt-quatre heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, radiographié deux fois sous anesthésie gazeuse et soumis à deux prélèvements sanguins de 500 microlitres à la queue. Une injection de valine marquée précède la mise à mort de trente minutes, le temps de mesurer la synthèse protéique. Le porteur affirme que la mesure des effets d'un régime pauvre en acides aminés sur la croissance "empêche le remplacement" par des modèles cellulaires, et présente l'isolement comme atténué par le fait que les rats entendent et sentent leurs congénères.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

Quatre injections dans le sinus rétro-orbitaire et cinq prélèvements sanguins à la queue par animal, à raison d'une séance par semaine pendant quatre semaines : 165 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chaque intervention se déroule sous anesthésie profonde, et le porteur indique qu'une réaction pseudo-allergique peut suivre l'injection de l'enzyme, un antihistaminique étant administré 48 heures avant en cas de réaction lors de la première expérience. Le projet compare des formulations d'encapsulation d'une enzyme utilisée contre la maladie de Pompe, dont la majorité des patients traités développent des anticorps qui la dégradent. Le porteur annonce une meilleure prise en charge de ces patients, quand l'étape réellement engagée ici mesure l'immunisation de souris et la distribution du produit dans leur rate et leur foie, prélevés après mise à mort.

Objectifs

L’alpha-glucosidase, une enzyme, est responsable de la dégradation du glycogène en glucose, en particulier au niveau des muscles. Dans le cas de la maladie de Pompe, un déficit de l’enzyme alpha-glucosidase (GAA), entraîne une accumulation de glycogène dans les lysosomes. L'accumulation de glycogène entraîne des conséquences graves dans de nombreux organes, en particulier les muscles et le système nerveux avec l’apparition d’une faiblesse musculaire et des troubles respiratoires. Le principal traitement de la maladie de Pompe se base sur l'administration en intra-veineux de l’alpha-glucosidase, permettant alors la dégradation du glycogène en glucose. Pour autant, ce traitement n’est pas sans complications étant donné que la majorité des patients traités développent des anticorps contre cette enzyme, ce qui entrainent sa dégradation et donc une diminution de l’efficacité de la thérapie. Il existe aujourd’hui des systèmes d’administration de médicaments basés sur l’encapsulation dans une paroi de phospholipides permettant la protection d’un médicament encapsulé contre le système immunitaire, l'amélioration de sa persistance chez l’Homme et la réduction des effets indésirables. Il serait intéressant de développer un tel système d’administration dans le cadre de la maladie de Pompe afin de réduire la résistance au traitement des patients. Ce projet vise donc à évaluer l’activation du système immunitaire par l’enzyme encapsulée ainsi que sa persistance chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les patients qui nécessitent une thérapie basée sur l’injection de l’enzyme alpha-glucosidase dans le traitement de la maladie de Pompe, sont susceptibles de développer une réaction immunitaire face à ce traitement, ce qui le rend à terme moins efficace. Les bénéfices attendus de ce projet sont ; une diminution de l’activation du système immunitaire par le médicament encapsulé et une amélioration de la persistance et de la distribution du médicament chez l’Homme. In fine, ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients atteints de la maladie de Pompe.

Procédures

Les animaux seront soumis au total à quatre injections par voie rétro-orbitale ainsi qu'à quatre prélèvements sanguins au niveau de la queue. Ces interventions seront réalisées une fois par semaine sur quatre semaines sur des animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement à la queue suivi directement de l'injection en rétro-orbitale ne dépassera pas les 15 minutes. Un prélèvement de sang final sera également réalisé à la fin de la procédure sur animaux profondément anesthésiés. Le prélèvement final n'excédera pas les 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets prévus sur les animaux sont une immunisation des souris à l'enzyme alpha-glucosidase injectée et une diminution de cette immunisation ainsi qu'une meilleur absorption grâce à la nouvelle formulation de l'enzyme. Les effets indésirables attendus pour les deux procédures expérimentales sont : un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire, un saignement au niveau du point de prélèvement ou d’injection. Il peut également survenir un possible stress au moment de l’anesthésie gazeuse pour le prélèvement à la queue (durée de 30 secondes avant endormissement). Une réaction pseudo-allergique peut également être attendue suite à l’injection de l’enzyme.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux sont mis à mort, car le prélèvement sanguin est terminal et car les organes (rate et foie) doivent être récupérés afin d'analyser la distribution de la nouvelle formulation de l'enzyme.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’activation du système immunitaire par les différentes formulations d’encapsulation de l’enzyme alpha-glucosidase afin de diminuer la réponse immunitaire et d’améliorer l’efficacité du traitement. Ce processus fait intervenir de multiples types cellulaires et tissulaires (cellules immunitaires, cellules musculaires…) il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus complet.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 15 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des résultats obtenus pour chaque groupe d’animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 2 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Par l’application d’une goutte de collyre sur l’œil après les injections retro-orbitale pour réduire la douleur au réveil • Par traitement des animaux avec un antihistaminique, 48h avant l’injection de l’enzyme en cas de réaction allergique lors de la première expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

Puisque nous souhaitons observer les différences de réactions immunitaires en fonction de la formulation de l’enzyme alpha-glucosidase, le recours à l’animal est nécessaire, car l’activation du système immunitaire est un phénomène complexe qui implique plusieurs types cellulaires et tissulaires et faisant intervenir des intercommunications complexes entre les cellules circulantes, les cellules immunitaires, les cellules musculaires et les cellules résidantes des tissus environnants, qui ne peuvent pas être reproduites de façon complète in vitro. Les similarités connues entre le système immunitaire de la souris et de l’homme, et en particulier les cellules impliquées dans les procédés d’immunisation font de la souris un modèle de choix. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères présentant un système immunitaire mature et ne présentant pas encore de vieillissement.

Corriger la fonte musculaire que provoque le sémaglutide, médicament anti-obésité déjà commercialisé, pour permettre de le prescrire plus longtemps : 58 souris mâles rendues obèses par douze semaines de régime gras vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit treize injections intrapéritonéales et quarante-deux injections sous-cutanées, subit trois prélèvements sanguins précédés d'un jeûne de quatre heures, deux tests de force des pattes avant et une session de tapis roulant de trente à quarante-cinq minutes. Le porteur note que l'obésité induite réduit déjà leur capacité de mouvement. Il justifie le passage par l'animal en invoquant une "étape règlementaire incontournable" pour constituer le dossier des premiers essais chez l'humain.

Objectifs

Le sémaglutide est utilisé comme médicament antidiabétique et anti-obésité. Son efficacité s'avère excellente, et son emploi relativement sûr. Cependant, outre la perte de masse grasse qu'ils induisent, les traitements chroniques à la sémaglutide sont également associés à une importante fonte musculaire, qui est considérée comme un effet indésirable. Le composé X a été initialement développé comme un médicament visant le muscle dans le cadre de pathologies induisant une atrophie musculaire. Le présent projet vise à élargir les indications thérapeutiques potentielles du composé X et de tester notamment sa capacité a compenser les effets délétères de la sémaglutide sur la masse musculaire lors d'un traitement chronique chez la souris obèse.

Bénéfices attendus

La Sémaglutide est aujourd'hui autorisée et utilisée en tant que médicament anti-obésité et anti-diabétique. Néanmoins ce composé à pour inconvénient d'induire une perte de masse et de force musculaire lors de traitements prolongés, réduisant la possibilité de son utilisation sur des périodes prolongées. Le développement du composé X permettrait, en co-administration, de bloquer totalement ou partiellement cet effet délétère de la sémaglutide, autorisant son utilisation sur des périodes plus prolongées et ainsi, une meilleure prise en charge thérapeutique des troubles métaboliques chez l'humain.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (10 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Administration de composés par voie intrapéritonéale (13 administration; durée : 1 minute); 3) Administrations de composés par voie sous-cutanée (42 administrations; durée : 1 minute); 4) Analyse non invasive de composition corporelle (5 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements; durée du prélèvement : 5 minutes); 6) Test de la force des pattes avant (2 tests, durée du test : 10 min); 7) Test d'exercice sur tapis roulant (1 session, Durée de la session : 30 à 45 min); 8) Anesthésie générale avant euthanasie et prélèvement d'organes (durée: 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle et le placement en boite de contention lors des prélèvements sanguins pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les traitements intrapéritonéaux et sous-cutanés, ainsi que les prélèvements sanguins seront source de douleurs aiguës et de stress. La mise à jeun de 4h préalable aux prélèvements sanguins, bien que réalisée en phase diurne, pourra induire une sensation de faim. Les tests de la force des pattes avant et tests sur tapis roulant pourront également être source de stress et de fatigue pour les animaux. Enfin, le caractère obèse des souris sera source d'inconfort en réduisant légèrement leur capacité de mouvement.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés à l'issue de l'étude. Des prélèvements d'organes sont prévus après euthanasie pour analyses ultèrieures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la composition corporelle, la prise alimentaire et les autres paramètres altérés dans le cadre des troubles métaboliques. Par ailleurs, bien que le composé testé ait fait l'objet de plusieurs études réalisées in vitro dans les premières phases de son développement, l'étude in vivo reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur le modèle de souris obèse et l'analyse des paramètres d'intérêt de l’étude. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Le groupe témoins non obèse a été réduit à 10 animaux, contre 12 pour les groupes expérimentaux constitués de souris obèses, compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu du fait que l’étude se positionne à un stade précoce du développement du candidat médicament, cette dernière sera limitée au genre mâle. La grande hétérogénéité du paramètre étudiés (notamment le poids corporel, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques) entre mâle et femelle imposerait en effet de doubler les effectifs de chaque groupe pour étudier l’impact du composé sur les deux genres. Dans la suite du développement du candidat médicament, et uniquement dans le cas où une efficacité aura été observée chez le mâle, une seconde étude sera menée chez la souris femelle afin de s'assurer de son efficacité sur les deux genre.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements par voie intrapéritonéale et sous-cutané seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2-3 souris / cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les prélèvements sanguins prévus seront limités au volume minimum nécessaire aux dosages ultérieurs et une crème analgésique sera appliquée sur la queue 30 minutes avant les prélèvements sanguins. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée.

Choix des espèces

Le modèle de souris nourris avec une alimentation enrichie en graisses (45% de l'apport calorique provenant des graisses) est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Ce modèle est sensible aux effets anti-obésité de la sémaglutide et présente également les effets secondaires de fonte musculaire observée chez l'humain. Les animaux seront utilisés au stade adulte, âgés de 18 semaines à la réception (28 semaines à l'issue de l'étude). Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte et tient compte d'une pèriode de 12 semaines de régime enrichi en graisse chez le fournisseur afin d'induire le phénotype obèse.

792 souris vont être utilisées, toutes tuées au quatorzième jour pour examens histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sept injections intrapéritonéales d'anticorps humains, subit un test d'effort, deux microprélèvements sanguins sous anesthésie et une opération du mollet destinée à mesurer la perte de tonus musculaire. La maladie est provoquée par transfert d'autoanticorps prélevés chez des patients atteints de myopathie nécrosante auto-immune, et le porteur souligne que les souris malades ne montrent aucun signe visible, la faiblesse n'étant détectable qu'à l'appareil de mesure. Le compte de 792 découle du protocole retenu, 22 souris rendues malades et 22 témoins par modèle, appliqué aux neuf molécules candidates.

Objectifs

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux anticorps thérapeutiques permettant de soigner des pathologies autoimmunes du muscle. Celles-ci sont dues à un dérèglement du système de défense du corps impliquant des protéines . Il est donc important de neutraliser l'attaque du système immunitaire contre ces deux constituants pour relancer la fabrication de fibres musculaires solides et saines. Dans le cadre du remplacement, les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans cette maladie. Aujourd’hui, nous devons confirmer l’aspect préventif et/ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de la pathologie. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Bénéfices attendus

L'objectif de notre projet est de développer de nouveaux bio-médicaments permettant de soigner les pathologies autoimmunes du muscle.

Procédures

Chaque animal subira : 7 Injections intra-péritonéales d'anticorps humain d’une durée de 30 secondes chacune, 1 test d'effort d’une durée de 1 à 2 minutes et enfin 1 intervention chirurgicale pour l'évaluation de la perte du tonus musculaire au niveau du gastrocnémien d’une durée maximum de 10 minutes. Les animaux seront soumis à 2 microprélèvements de sang (J0 et J7), prélèvements sous anesthésie, durée de l'acte moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris présenteront une perte de force musculaire symptomatique de la maladie. Dans de rare cas une fonte musculaire et donc une perte de poids seront observées.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie jusqu'à j14 où ils seront mis à mort pour examens histologiques.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement les premiers tests ont été effectué sur des modèles in-vitro de fibres isolées, d’organoïdes ou de myoblastes en culture. Cette approche nous a permis de sélectionner 9 molécules présentant un intérêt thérapeutique dans les MNAI. Aujourd’hui nous devons confirmer l’aspect préventif et ou curatif de ces nouvelles biomolécules dans nos modèles murins de MNAI. Seul un organisme vivant "complet" permettant d'évaluer la bio-distribution, la pharmacocinétique et les interactions du système immunitaire est capable de répondre à nos questions et de montrer l'efficacité de nos traitements.

Réduction

Nos modèles de maladies du muscle expérimentales chez la souris ont été optimisés et calibrés. Par expérience nous savons qu’il faut utiliser 22 animaux induits et 22 animaux témoins pour obtenir un résultat significatif et fiable pour chaque modèle de maladies du muscle. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement . Dans le but de réduire au maximum les animaux utilisés pour chacune de nos 9 molécules d’intérêt thérapeutique nous commencerons le test par le pouvoir préventif dans l’induction de maladies du muscle. En cas d’échec la capacité curative ne sera pas testée. En effet, selon le principe de fonctionnement de nos molécules, notre expertise nous permet de prévoir qu'il n'y aura pas d'effet thérapeutique.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement, notre unité a développé deux modèles de maladies du muscle expérimentales modérées en utilisant des autoanticorps issus de patients . La maladie se développe en 7 jours et présente des atteintes modérées au niveau des muscles squelettiques. Les animaux malades ne présentent aucun signe visible de la maladie et nécessite l’utilisation d’appareils de mesure de force non invasif pour détecter la maladie . Pour étudier l’aspect préventif de nos molécules les animaux seront traités à J-1 avant l’induction et la perte de force musculaire sera évaluée à J7 et J14. Pour l’effet curatif les animaux seront traités à J7 post induction et la force sera évaluée à J7 post traitement. La durée de la pathologie ne sera donc que de 7 jours afin de limiter au maximum tout inconfort de l’animal. Les animaux seront hébergés par groupe de 4 dans des cages adaptées avec un enrichissement à base de nids cartonnés et de tampons de ouate. De la nourriture sous forme de bouillie sera distribuée en plus des granulés afin de soulager toute atteinte des muscles masticateurs. Une surveillance quotidienne basée sur le grimace scale sera effectuée du début à la fin de l’expérimentation. Le grimace scale est un système d’évaluation de l’état de stress d’inconfort et de la douleur ressentie pour chaque espèce animale. Il est basé sur l’observation de 5 critères : Contraction orbitaire, gonflement du nez, gonflement des joues, position des oreilles et position des moustaches. Pour chaque item un score de 0 à deux est appliqué en fonction de l’état. Il permet d’obtenir des scores cliniques chiffrés. Au delà de 4 les animaux concernés seront sortis de l'étude et mis à mort par dislocation cervicale sous anesthésie profonde. Un analgésique sera administré 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ (injection en sous-cutané).

Choix des espèces

La souris est un animal de choix pour l’étude des maladies auto-immunes. Les lignées établies en consanguinités permettent d’obtenir des modèles de pathologies calibrées et reproductibles. De plus un nombre important d’outils tel que les anticorps dirigés contre les différents marqueurs de populations hématopoïétiques nous permettent de « décortiquer » les phénomènes immunologiques qui interviennent dans la maladie. De plus nous avons développé depuis peu un modèle murin standardisé et optimisé de maladies du muscle par transfère d’autoanticorps issus de patients. Les souris seront agées de 8 à 10 semaines (en début de protocole) pour posséder un systême immunitaire complet et pleinement actif.