Troubles musculosquelettiques

288 souris, 144 mâles et 144 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Une myosite est déclenchée par des injections sous anesthésie, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant sept jours et subissent un test de force musculaire au grip test, avant d'être tuées pour prélever muscles et organes, afin de tester des molécules candidates contre les myopathies inflammatoires. Le porteur indique que l'induction fait perdre environ 30 % de force musculaire sans, selon lui, provoquer de souffrance décrite dans la littérature. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système cellulaire ne reproduit les interactions en jeu dans la maladie.

Objectifs

Les myopathies inflammatoires (MI) sont des maladies caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et une capacité réduite d'exercice, ainsi qu’une baisse de la qualité de vie et une mortalité accrue. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des effets indésirables. Même si des médicaments sont disponibles, ils ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons démontré chez la souris atteinte de myosite que la prednisone, permet de récupérer la force musculaire après 7 jours de traitement. Cet effet thérapeutique passe par l’activation de la voie b adrénergique dans les cellules inflammatoires. De ce fait, l’activation de cette voie pourrait récapituler les effets thérapeutiques de la prednisone en l’absence de ses effets indésirables. Cette stratégie thérapeutique a été testée dans un modèle murin de Myasthénie grave et un essai clinique est actuellement en cours chez l’homme. Nous avons mis en évidence que les fibres musculaires des patients atteints de dermatomyosite (DM), un sous-type de myosite, présentent une augmentation de l’activité du protéasome. De plus, les inhibiteurs du protéasome ont montré une efficacité in vitro, parmi les inhibiteurs du protéasome déjà utilisés pour le traitement d’autres pathologies auto-immunes et du cancer, Ixazomib et KZR-616 sont les mieux tolérés

Bénéfices attendus

Les myopathies inflammatoires (MI) sont caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et capacité réduite d'exercice, et qui est associées à une baisse de la qualité de vie et à une mortalité accrue par rapport à la population générale et aux patients atteints d’autres maladies chroniques. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention dans cette maladie car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des évènements indésirables et les médicaments qui ciblent l’infiltrat inflammatoire ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons précédemment démontré que la fibre musculaire est un acteur à l’origine des MI ainsi qu’une cible thérapeutique des GC et potentiellement d’autres médicaments. Ces données obtenues par des études in vitro, in vivo et chez l’homme ont ouvert des nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de MI. Notamment, l’activation de la voie b adrénergique et l’inhibition du protéasome dans la fibre musculaire permettront spécifiquement de cibler les mécanismes à l’origine de la maladie. Cela permettra d’améliorer le pronostic d’un groupe de maladies handicapantes et associées à une surmortalité.

Procédures

La myosite expérimentale (ME) sera réalisée, sur chaque souris, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites sous anesthésie à l’isoflurane le même jour et une seule fois sera suffisante pour induire la maladie. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. Seront générées 288 souris ME (144 males, 144 femelles) afin de permettre l’évaluation des nouvelles molécules pour les deux sexes. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile. Les médicaments seront administrés par gavage afin de garantir l’administration de la même quantité dans tous les souris. Chaque gavage induit une contention de 15 secondes par souris, le gavage dure 5 secondes et sera répété pendant les 7 jours de traitement. Au jour 21, 100µL de sang sera prélevé au niveau de la veine faciale (10 secondes maximum), puis les animaux seront mis à mort lors de la même contention et les prélèvements suivants seront alors réalisés : - muscles quadriceps, tibialis antérieur, gastrocnémien : afin d’étudier l’efficacité du traitement ; - foie, rate, cœur : afin d’étudier la tolérance du traitement dans le cas où il y aura des signes de toxicité au bilan dans le sang. La force musculaire sera mesurée au jour 0, 14 et 21 après l’immunisation, en utilisant un test de résistance de la préhension (Grip test). Lors de la mise en place de l’expérimentation, les souris seront différenciées par un marquage au feutre au niveau de la queue afin d’éviter toutes contentions inutiles, la durée du grip-test est de 10 secondes par souris (3 prises de mesures).

Impact sur les animaux

La myosite expérimentale (ME) sera induite sur chaque souris, sous anesthésie à l’isoflurane, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites le même jour et une seule fois. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. L'Induction de la Myosite entraine une perte de force musculaire entre 14 et 21 jours après l’induction. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile.

Devenir

La myosite expérimentale (ME) est induite le jour 0. 14 jours après l'induction de la ME, le traitement est administré pendant 7 jours par gavage dans l’eau de boisson. 21 jours après l'induction de la maladie, les animaux sont mis à mort afin d’étudier l’efficacité des molécules candidates thérapeutiques et leur tolérance par le prélèvement des muscles, du foie, du cœur et de la rate.

Remplacement

Le modèle murin de myosite décrit dans ce projet n’est pas remplaçable et reste indispensable afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité des molécules ayant possiblement un effet thérapeutique dans les myosites. En effet, il n’est pas possible actuellement de modéliser au moyen d’un système cellulaire les interactions dynamiques et complexes entre les cellules musculaires, inflammatoires et l'environnement au cours des myopathies inflammatoires. De plus, chez l’homme, il n’est pas éthiquement possible de ne pas traiter les patients avec des glucocorticoïdes malgré leurs effets iatrogènes connus et de tester des autres molécules candidates en l’absence d’études sur des modèles animaux.

Réduction

Pour répondre à la question scientifique posée, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande une cohorte de 12 souris (6 mâles, 6 femelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs De ce fait, 12 souris seront nécessaires pour les analyses histologiques, 12 pour étudier l’expression des gènes et des protéines, 12 souris pour étudier l’activité mitochondriale, 12 souris pour la cytométrie en flux, au total 48 souris. Vu qu’on compare 6 conditions, au total il faut 288 souris. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions significatives. Les expériences sur les animaux seront stoppées lorsque le niveau de signification statistique est atteint pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisées. Sur la base de notre bibliographie, la question scientifique à laquelle répondra ce protocole n’a jamais été étudiée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées agrémentées de nid, en groupes sociaux. Pour minimiser le stress des souris, toutes les injections pour induire la maladie seront faites par des seringues insuliniques et dans le cadre de la même anesthésie. Dans notre projet précédent, nous avons montré que l’induction de la myosite, même en fin d’anesthésie, ne provoque pas de douleur ni de nécrose dans les sites des injections. Cependant, si les souris présentent des rougeurs au niveau des sites d'injection, ou des détresses respiratoires liées à l'anesthésie, ces dernières seront sorties de l'étude. A partir de l’induction de la myosite inflammatoire, une perte de force étant attendue, de la nourriture en gel sera mise à disposition dans la cage afin d’assurer l’alimentation des souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien adapté. Le poids, le comportement général, la posture, l’état du pelage, les blessures potentielles seront suivies pendant toute la vie des animaux. En cas de doute, un suivi de poids pourra être mis en place et toute baisse de poids sera notifiée au responsable de projet et au vétérinaire. Nous avons montré que l’induction de la myosite (ME) diminue la force musculaire des souris de 30%, mais n’affecte pas leurs capacités à se nourrir. Cependant, après l’induction de la maladie, de la nourriture gel sera placée tous les jours dans la cage pour assurer leur alimentation même dans des conditions de faible mobilité. La prednisone n’induit pas de signe de souffrance, au contraire, ce traitement ainsi que les molécules candidates, devraient réduire la sévérité des symptômes de la ME. La mise à mort sera faite par des méthodes appropriées et par personnes compétentes pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animal la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants car la composition en termes de type de fibre des muscles squelettiques chez la souris mime celle humaine. De façon concordante, la myosite chez la souris mime la maladie humaine pour la présence d’une diminution de force musculaire, d’inflammation et variabilité de taille des fibres au niveau histologique. Des souris adultes seront utilisées. L’âge adulte selon les répondants varie entre 6 et 20 semaines. L'âge auquel les modèles animaux sont couramment utilisés est de 8 à 12 semaines. De ce fait, l’âge des souris sera de 8 semaines car pour les modèles de maladies auto-immunes la puberté est préférable afin d’avoir un système immunitaire compétent. En effet, la plupart des modèles expérimentaux de myosite présents dans la littérature ont été décrits chez la souris adulte et dans ces modèles, aucune souffrance animale n'a jamais été décrite.

220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie génétique liée au gène Bin1, elles subissent des injections dans le muscle ou l'abdomen, des mesures répétées de force musculaire sous anesthésie et des tests de suspension, pour tester une thérapie génique. Le porteur affirme n'attendre aucune douleur liée au phénotype et décrit une atrophie musculaire légère, tout en précisant que les souris sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et que la maladie deviendrait sévère si elles étaient gardées vivantes. Il conclut que les cultures cellulaires ne reproduisent pas un "organisme entier" et juge le modèle murin "essentiel".

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires liées au gène Bin1. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine BIN1 ainsi que ses effets à différentes étapes du développement musculaire.

Procédures

Les 100 souris de la cohorte « Injections intra-musculaires » seront soumises aux procédures suivantes : - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 20min par animal. - Injections intra-musculaires sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 12 semaines d’âge. Les 120 souris de la cohorte « Injections Intra-péritonéale » seront soumises aux procédures suivantes : - Injection intra-péritonéale, animal vigile, unique au premier jour post-natal, 1min par animal. - Test de suspension, animal vigile, non-invasif, hebdomadaire de 3 à 10 semaines d’âge, 5min par animal. - Test d’actimétrie, animal vigile, non-invasif, unique à 10 semaine d’âge, 24h par animal. - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 10 semaines d’âge.

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement (poids normal). A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose des électrodes sous-cutanée et l’injection intra-musculaire peux causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures expérimentales pour plusieurs raisons : Notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire. La myopathie étudiée est progressive et deviendrait potentiellement sévère si les souris étaient maintenues en vie.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Afin de limiter le nombre d’animaux de la cohorte d’injections intra-musculaires nous injecterons les deux pattes (muscle tibial antérieur) de chaque animal, l’une avec la solution contrôle et l’autre avec un des traitements. L’utilisation d’un contrôle interne à chaque souris plutôt qu’un groupe de souris contrôles permet de renforcer la puissance statistique en s’affranchissant de la variation inter-groupes et de réduire le nombre d’animaux nécessaires. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus. La mesure de la force musculaire in vivo par la procédure non-invasive hebdomadaire nous permet de faire le suivi de chaque animal, ce qui renforce la puissance statistique et nous affranchit de créer une cohorte d’animaux pour chaque semaine d’âge analysée.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire hebdomadaire, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir tout stress causé par la procédure. Un gel protecteur oculaire sera appliqué pour prévenir tout inconfort d’assèchement oculaire lors du réveil. Les souris seront observées jusqu’à leur réveil (~5min) pour s’assurer qu’elles sont capables de se déplacer après le test. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale , les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. Nous utiliserons ces animaux à des stades très précoces pour étudier l’effet de notre traitement avant l’apparition des symptômes mais également des animaux adultes pour étudier cet effet après l’apparition des symptômes.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent 26 injections sur douze semaines et deux prélèvements de sang au sinus de l'œil sous anesthésie, et passent des mesures de force et de fonction cardiaque, pour tester un composé censé renforcer la membrane des fibres musculaires. Le porteur indique que la maladie provoque spontanément une perte de masse et un comportement de "freezing", une immobilité inhabituelle, et que tous les rats sont tués pour les analyses. Il affirme que cette question ne peut être tranchée que chez l'animal vivant, le rat reproduisant la maladie "beaucoup plus fidèlement" que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. La dystrophine connecte l’intérieur de la fibre musculaire à la matrice moléculaire à l’extérieur de la fibre. En l'absence de dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse, d’une fibrose et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité régénérative des cellules souches. Dans les muscles squelettiques et cardiaque, la liaison à la matrice se fait essentiellement via une protéine appelée intégrine. En condition DMD, les intégrines sont surexprimées par un mécanisme compensatoire. La présence massive d'intégrines à la surface de la fibre musculaire favorise le relarguage de molécule de l’inflammation, à l’origine d’une boucle vicieuse favorisant la fibrose. La stratégie pharmacologique proposée ici consiste à exploiter la présence des nombreuses molécules d'intégrines à la surface des fibres musculaires DMD. L'objectif du projet est d'activer les molécules d'intégrines par une modification de leur forme induite par la fixation spécifique du composé testé. On sait que l'activation des intégrines promeut leur fixation aux molécules de la matrice extracellulaire. Nous posons l'hypothèse que sur notre modèle de DMD, la fragilité de la membrane cellulaire des fibres musculaires initialement induite par la déficience en dystrophine sera compensée par une stabilité renforcée de la membrane, résultant de sa connexion avec la matrice qui agit comme une gaine externe protectrice, avec pour conséquence de réduire la mort des fibres musculaires et pour conséquence fonctionnelle d'accroître le nombre de fibres musculaires actives et ainsi, la force du muscle.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation d’un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Ce composé agit en facilitant la résistance de la membrane protectrice qui entoure les fibres musculaires, réduisant ainsi leur mort qui est toujours accompagnée d’une inflammation douloureuse. Le composé réduit aussi la fibrose du muscle, accélérant la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux vigiles sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie préalable au prélèvement sanguin (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure). Ils sont injectés par voie sous-cutanée pour recevoir le traitement ou le contrôle 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Au total, chaque rat recevra 26 injections, chacune d'une durée maximale de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Les animaux seront également prélevés deux fois au sinus rétro-orbitaire pour obtenir du sang permettant d'évaluer le bénéfice espéré de la thérapie (biomarqueurs), sous anesthésie générale et locale. La séquence de prélèvement dure au total 1 heure (jusqu'au réveil). Le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement ECG est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il a été montré que le produit administré à une dose 3 fois supérieure à celle que nous administrerons n’est pas toxique chez le rat. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. La procédure de ce projet inclut des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires. Tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus pour les analyses prévues.

Remplacement

L'efficacité du composé testé sur l’activation des intégrines a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé permet-elle de protéger suffisamment la membrane de la fibre musculaire pour que la masse des muscles des rats DMD traités augmente, que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle du cœur et des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable du remodelage délétère à l’échelle histologique ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Les muscles des animaux âgés d’un à 6 mois sont affectés par la maladie. Il est donc attendu que les différences entre animaux WT et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité du composé testé sera pertinente puisqu'intervenant à un moment où la déviation de la trajectoire fibrotique permettra une moindre myonécrose, facilement quantifiable.

Une chienne Border Collie va être utilisée, dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposée à l'adoption. Elle subit sous anesthésie générale une biopsie d'un muscle de la cuisse, acte que le porteur décrit comme douloureux pendant et après la chirurgie, avec un risque de complications au site opératoire. La biopsie doit fournir une lignée de cellules saines servant de contrôle face aux cellules de quatre chiens de la même portée atteints d'une myopathie génétique. Le porteur affirme qu'un prélèvement de tissu chez l'animal ne peut être évité, tout en revendiquant que cette lignée contribuera ensuite au remplacement de l'animal in vitro.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont un groupe de maladies génétiques humaines rares touchant le muscle, liées à des mutations dans différents gènes, ayant en commun des lésions du muscle typiques, une faiblesse et une fonte des masses musculaires. Parmi les gènes en cause, une mutation du gène codant pour la dynamine 2 (DNM2) qui entraîne une augmentation de l'activité de la protéine est responsable de formes autosomales dominantes (=mutation présente sur 1 chromosome suffisante pour entraîner la maladie). Récemment, il a été démontré sur des modèles in vitro et dans des modèles murins, que la répression du gène DNM2 permet d'apporter un bénéfice thérapeutique, non seulement dans le cas de la myopathie centronucléaire liée à DNM2, mais aussi dans d'autres formes de myopathies centronucléaires. Cette approche pourrait donc constituer une thérapie génique commune pour tout ce groupe de maladies, bien que liées à des mutations dans des gènes différents. Récemment, un cas de myopathie centronucléaire a été identifié chez un chien Border Collie de compagnie âgé de deux ans, présentant une atrophie musculaire et une faiblesse locomotrice. La mutation en cause a été identifiée et se trouve dans le gène DNM2. Elle est identique à la mutation la plus fréquemment diagnostiquée chez les patients humains. Une portée issue de ce chien a été obtenue, confirmant que cette mutation est bien responsable d'une myopathie centronucléaire peu invalidante, lentement évolutive, et similaire à la maladie humaine. Afin de développer une thérapie génique innovante permettant de réduire la quantité de DNM2, et avant d'envisager les essais précliniques in vivo, il est nécessaire de valider les candidats-médicaments in vitro. Pour ce faire, des biopsies musculaires ont été effectuées sur les 4 chiens porteurs de la mutation (descendance du border collie), mises en culture avec succès au cours d'un projet précédemment autorisé. Afin de disposer d'un contrôle sain, il apparaît nécessaire d'obtenir des cellules de la soeur de portée de ces 4 chiens, non porteuse de la mutation. Ce projet a donc pour objectif la réalisation d'une biopsie musculaire sur cette chienne, en vue d'une mise en culture. Cela contribuera à une validation approfondie du traitement de thérapie génique en cours de mise au point pour ce modèle, et plus largement pour une application à l'ensemble des myopathies centronucléaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de disposer d'une lignée stable utilisable comme contrôle sain des cellules issues des animaux malades, déjà disponibles, pour effectuer in vitro toutes les étapes qui peuvent l'être avant de passer à l'in vivo, dans une optique de remplacement.

Procédures

L'animal subira une biopsie d'un muscle de la cuisse sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée. La durée totale (de l'anesthésie au réveil) de l'intervention sera d'environ une heure.

Impact sur les animaux

La biopsie musculaire peut être un acte douloureux, tant pendant qu'après la chirurgie. Cette douleur sera prévenue par administration de morphiniques. Malgré le soin apporté à l'asepsie chirurgicale et aux sutures, des complications sur le site opératoire sont possibles (mais très rarement rencontrées) : collection liquidienne sous-cutanée, déhiscence des points, infection de la plaie (exceptionnel) par exemple. Les soins vétérinaires adaptés seront apportés au cas par cas.

Devenir

La chienne sera proposée à l'adoption, étant une chienne saine et la récupération attendue à l'issue de ce projet étant complète.

Remplacement

L'établissement d'une lignée de cellules musculaires issues d'un animal directement apparenté aux animaux malades dont les cellules sont déjà utilisées ne peut s'affranchir d'un prélèvement de tissu chez l'animal. Par contre, l'établissement de cette lignée contribuera au remplacement dans les étapes de mise au point de produits thérapeutiques, limitant donc au maximum les étapes de validation chez l'animal.

Réduction

Un prélèvement sur un seul animal (par ailleurs le seul existant) de la même portée que les animaux malades, dont les cellules ont déjà fait l'objet d'une mise en culture, sera nécessaire et suffisant pour obtenir la quantité de cellules musculaires nécessaires pour mettre en oeuvre les expériences prévues in vitro. Cette quantité sera également suffisante pour répéter la procédure plusieurs fois si jamais la première tentative ne fonctionnait pas.

Raffinement

Les biopsies musculaires seront réalisées chirurgicalement, sous anesthésie générale, et une analgésie adaptée sera mise en place. La cicatrisation de la plaie sera suivie quotidiennement dans les jours suivant la biopsie, et jusqu'au retrait des points cutanés 12 jours après. Sur le plan de l'hébergement, la chienne sera hébergée sur litière, et aura à sa disposition une plateforme, une corbeille de couchage et des jouets. Elle bénéficiera de sorties quotidiennes 7j/7 et d'interactions quotidiennes avec l'Homme. Un vétérinaire est présent 7j/7.

Choix des espèces

Sans doute parce qu'il coévolue avec l'Homme depuis sa domestication, le chien, lorsqu'il est atteint par une maladie génétique, développe des signes cliniques proches de ceux des patients. C'est le cas des maladies neuromusculaires, telles que la myopathie centronucléaire (CNM): plusieurs chiens ayant développé des CNM liées à des mutations dans des gènes connus chez l'Homme ont été décrits, et manifestent des signes cliniques semblables à ceux des patients. Une portée générée à partir du border collie présentant la mutation spontanée dans le gène DNM2 a pu permettre une première description des 4 chiens malades rapprochant les signes cliniques et anomalies fonctionnelles observées de la maladie humaine. Il existe d'autres modèles spontanés canins de CNM liées à différents gènes, et le développement d'une thérapie "multi-myopathies" ciblant DNM2 dans notre modèle permettrait de réaliser une preuve de concept dans d'autres CNM canines avant un essai clinique. La chienne est maintenant une jeune adulte de 4 ans. Des cellules musculaires peuvent être cultivées à partir de biopsies musculaires issues d'animaux de tout âge.

165 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris, porteuses de lésions musculaires induites lors de projets antérieurs, sont soumises à des examens d'imagerie par résonance magnétique sous sédation répétée, puis tuées pour confronter les images à l'analyse des tissus, afin de chercher des marqueurs non invasifs de la fibrose musculaire. Le porteur décrit l'imagerie elle-même comme atraumatique et sans douleur. Il affirme qu'aucun protocole in vitro n'atteint le niveau d'organisation du muscle et conclut que les études in vivo sont "indispensables".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’exploiter des outils IRM (imagerie par résonnance magnétique) et SRM (spectroscopie par résonnance magnétique) pour caractériser certains modèles murins de pathologies musculaires et de les confronter à l’histologie, dans le but de trouver des marqueurs RMN permettant d’évaluer la fibrose musculaire de manière non-invasive.

Bénéfices attendus

les bénéfices attendus de notre recherche visent au développement de nouvelles connaisances portant sur les lésions musculaires observées au cours de diverses pathologies musculaires. A terme ces connaissnaces doivent permettre le développement de nouveaux biomarqueurs pour ces pathologies. L'avantage évident d'une approche RMN réside dans le caractère non invasif de l'examen et dans sa capacité à réaliser des examens 'corps entier' et non seulement localisés à une région. L'aspect translationnel de notre recherche est renfocé par la modélisation chez le mammifère non humain (souris) de pathologies humaine.

Procédures

durant les examens RMN les aniamux ne sont soumis à aucune intervention nuisible pour leur état de santé, dans la mesure où les examens se limitent à les évaluations par imagerie ou spectroscopie. Le stress des animaux est limité dans la mesure où tout examen RMN se fait sous sédation, avec un monitorage continu de la respiratoire.

Impact sur les animaux

Les examens RMN appliqués à l'animal nesont pas différents dans leur nature de ceux utilisé chez l'homme et restent donc parfaitement non invasifs. Les modèles murins mis à notre disposition ont pour certains subis une intervention visant à créer un modèle de lésion et régénération. Au stade où ils seront utilisés en RMN les lésions seront cicatrisées et on n'observe pas d'invalidité chez ces animaux. Le degré de récupération fait partie intégrant du projet de recherche.

Devenir

les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pourvoir réaliser une confrontation anatomo-pathologiques avec les images obtenues par RMN.

Remplacement

Le muscle est un ensemble organisé de fibres musculaires, cellules hautement différenciées et spécialisées, et du tissu interstitiel. La fonction musculaire est dépendante du fonctionnement des cellules musculaires, mais aussi d’une combinaison des fonctions vasculaire et nerveuse de l’individu. A l’heure actuelle, il n’existe aucun protocole in vitro permettant d’atteindre ce niveau de différenciation et d’organisation, ce qui rend les études in vivo indispensables pour les études sur la structure et le fonctionnement du muscle.

Réduction

La réduction du nombre d’animaux est assurée par la minimalisation de la variabilité entre individus : un fond génétique Rag2-/-Ilr2b-/- pour l’étude de la dégénérescence/régénération et de la fibrose musculaire et un fond génétique C57Bl/6J Rj pour la mise au point des outils méthodologiques, et tous les animaux d’une même lignée proviennent d’un même fournisseur pour minimiser les variations sanitaires.

Raffinement

Le raffinement avant l’expérimentation sera fait par enrichissement de l’environnement avec du papier absorbant ou des tubes en carton et par élevage des souris en groupes (maximum 5 individus par groupe) dans des portoirs ventilés munis de cages jetables contenant de la litière de contact. La température est maintenue à 23 ± 1 °C avec une hygrométrie entre 40% et 70% et le cycle d’éclairage est de 10h/14h. Les animaux seront observés quotidiennement afin de s’assurer de leur bonne santé et une prise de poids sera effectuée avant chaque examen RMN. Toute perte majeure de poids, modification importante du comportement ou de l’état général pouvant laisser supposer une douleur sera considéré comme point limite. Enfin toutes les expérimentations RMN se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles tout le long des acquisitions. L’imagerie et la spectroscopie RMN étant atraumatiques par définition et les animaux sédatés tout au long de l’acquisition, aucune analgésie n’est nécessaire.

Choix des espèces

Du fait de leur petite taille et de la facilité pour les héberger, les souris sont un ordre animal facile à manipuler. De plus, de nombreux modèles de pathologies neuromusculaires ont été développés chez la souris. Par sa petite taille, la souris est aussi un candidat idéal pour une étude histologique du muscle entier, ce qui est particulièrement intéressant, voire fondamental, pour une étude comparative entre l’IRM et l’histologie. Les espèces de l’ordre des souris sont donc appropriées pour la recherche dans le domaine des maladies neuromusculaires. Au laboratoire, un grand nombre d’outils ont été développés pour la recherche en imagerie et en spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour étudier le muscle squelettique des rongeurs, en particulier des souris. Tous les animaux auront atteint l’âge adulte, les greffes musculaires étant effectuées au minimum à 2 mois. Tous les animaux auront donc atteint leur taille adulte au moment de la greffe et des expérimentations RMN. Le génotypage par tatouage des phalanges sera effectué par l’équipe UMRS 974 dans les projets antérieurs à l’actuel projet (réutilisation des animaux). Les animaux de génotype différent seront maintenus dans des cages différentes afin de s’affranchir de toute erreur de génotype lors des expérimentations.

42 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur rompt chirurgicalement le ligament croisé du genou pour provoquer une arthrose, avant de poser un dispositif externe de distraction lors d'une seconde opération, avec un risque d'infection, de fracture ou de luxation. Le porteur décrit une douleur et une perte de mobilité du genou, les articulations étant prélevées après euthanasie pour analyse. Il affirme qu'aucune autre méthode ne peut remplacer l'animal et retient le lapin comme premier modèle de grande taille avant l'humain.

Objectifs

L’arthrose est une cause majeure de douleur et d’incapacité chez les personnes âgées. Cette maladie articulaire dégénérative ne résulte pas simplement d’un processus d’usure mais plutôt d’un remodelage anormal des tissus articulaire induit par des médiateurs inflammatoires. Il n’existe à ce jour aucun traitement capable d’enrayer l’évolution du processus arthrosique. Les options de traitement restent limitées et ne sont capables que de ralentir la progression de cette maladie. Lorsqu’un traitement chirurgical s’impose, la seule intervention possible avant la prothèse de genou est l’ostéotomie qui permet de décharger l’articulation affectée. Pour pallier à ce manque de traitement, nous avons développé un dispositif externe de distraction articulaire. Ce dernier a pour objectif de favoriser la réparation du cartilage en soulageant la charge appliquée sur l’articulation du genou. Cette étude comprend deux objectifs distincts. Le premier est de mettre au point le dispositif final de distraction articulaire (taille du dispositif, types et tailles des vis utilisées …) afin de permettre un confort optimal des animaux tout en maintenant au mieux la distraction. Le deuxième est d’évaluer l’effet de ce dispositif combiné ou non à une ostéotomie sur le développement de l’arthrose au niveau du genou.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de montrer que la distraction articulaire via la pose de ce dispositif externe permet de lutter contre les atteintes ostéo-chondrales et inflammatoires induite par l’arthrose. In fine, le but de ce projet est de montrer que le dispositif externe pourrait representer une alternative plus efficace dans le traitement de l’arthorse que celui pratiqué actuellement en médecine humaine à savoir l’ostéotomie.

Procédures

Les animaux seront soumis a une ou deux procédures chirurgicales sous anesthésie générale selon le groupe (durée de la procédure de 1 heure environ). Un à trois prélévements de sang seront réalisés pendant l'anesthésie pour réaliser des analyses sanguines (prélèvements réalisés en quelques secondes dans le cathéter artériel mis en place pour le suivi de la pression artérielle pendant l'anesthésie).

Impact sur les animaux

La rupture chirurgicale du ligament croisé craniale provoque une instabilité du genou qui entraine le developpement accélré de l'arthrose du genou. Les nuisances sont la douleur et la perte de fonction du genou (amplitude de mouvement diminuée). Complications post-opératoires potentielles de l'intervention chirurgicale d'implantation du dispositif de distraction et de stabilisation du genou : complications infectieuses (Infection superficielle du site opératoire, arthrite septique fémoro-tibiale); œdème/hématome sévère au niveau du site chirurgical avec boiterie empêchant l’animal de se déplacer, complicaton du montage distractif (fracture fémorale ou tibiale, luxation articulaire du genou opéré).

Devenir

La première procédure correspond à la déstabilisation de l'articulation du genou pour induire une arthrose, tous les animaux seront maintenus en vie. Suite à l'induction de l'arthriose du genou, la deuxième procédure vise à mettre en place le dispositif de distraction articulaire et à suivre l'évolution de l'arthrose, tous les animaux seront euthansiés afin de récupérer les articulations affectées pour analyses histoligiques et par imagerie.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes permettant d’éviter ou remplacer l’utilisation des animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Etude préalable sur pièce anatomique pour permettre une première phase, utilisation d'une modèle d'arthrose bien connu et maîtrisé, traitement statistique des résultats obtenus

Raffinement

Les manipulations se dérouleront dans le strict respect du bien-être des animaux. L’hébergement est assuré dans des cages individuelles conformément à la réglementation en vigueur avec enrichissement. Le modèle chirurgical est maîtrisé et réalisé par des chirurgiens qualifiés. Des traitements analgésiques adaptés seront mis en place et ajustés au niveau de douleur identifiée individuellement sur chaque lapin. Toute maladie concomitante apparaissant pendant l’étude fera l’objet de soins et traitements adaptés. L’échec aux traitements conventionnels et l’impact de la maladie sur les résultats de l’étude seront évalués comme point limite. Les animaux ont accès librement aux granulés spéciaux pour lapins et à l’eau de boisson (ad libitum). L’enrichissement du milieu se fait par des jouets et des blocs de foin compacté et une tablette surélevée permettant aux lapins de se placer au-dessus ou en dessous. Les moyens mis en œuvre pour détecter, identifier et mettre un terme sans délai aux douleurs, souffrance et angoisse potentielles consiste en une surveillance quotidienne des animaux, l'administration d'analgésiques pour gérer la douleur peropératoire et l'utilisation d'un arbre décisionnel d'intervention (soin, analgésie, euthanasie) à partir des signes comportementaix et physiques observés sur les animaux. Par ailleurs, le soin des lapins est assuré par un personnel qualifié dans un hébergement conforme et enrichi. Les animaux sont manipulés dans un environnement calme et sous sédation ou anesthésie dès lors que la manipulation est stressante et source d’inconfort. L’immobilisation chimique est réalisée par voie sous-cutanée ce qui évite de requérir à une contention physique pour réaliser l’injection des produits sédatifs et analgésiques.

Choix des espèces

Le choix des lapins est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes : maturité squelettique - Premier modèle animal de type "grand animaux" avec la possibilité d'avoir un dispositif de distraction à l'échelle du futur dispositif humain - Modèle d’arthrose induite du genou chez le lapin largement répondu et décrit dans la littérature et correspondant à l'articulation cible chez l'homme. Animaux adultes (squelette arrivé à maturité)