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Impact de l’élimination des cellules sénescentes sur la résilience pulmonaire à la ré-irradiation chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Irradiées sur la moitié du thorax sous anesthésie, puis une seconde fois neuf semaines plus tard sur la même zone, 920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs poumons. S'y ajoutent un gavage quotidien jusqu'à dix fois, deux prélèvements sanguins sur souris éveillée et un scanner sous anesthésie gazeuse. Le projet cherche à savoir si deux médicaments éliminant les cellules sénescentes rendent le poumon plus tolérant à une seconde irradiation, une option envisagée pour ré-irradier des patients. Le porteur écrit qu'aucun recul n'existe sur la toxicité d'une ré-irradiation de la même zone thoracique ni sur ses effets cutanés, et n'énonce aucun seuil déclenchant la mise à mort.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement essentiel utilisé chez environ 60 % des patients atteints de cancer à un moment de leur parcours. Grâce aux progrès médicaux, les patients vivent plus longtemps. Cependant, cette amélioration augmente le risque de voir apparaître une récidive du cancer, des métastases ou un nouveau cancer, ce qui peut nécessiter une nouvelle radiothérapie. La ré-irradiation correspond à l’application d’une seconde radiothérapie sur une zone déjà traitée. Elle peut entraîner davantage d’effets secondaires, car les organes pourraient garder une « mémoire » de la première irradiation et être plus fragiles lors de la seconde. Il existe peu d’études cliniques sur ce sujet. Elles portent sur un petit nombre de patients et utilisent des méthodes différentes, ce qui rend les comparaisons difficiles et limite les conclusions sur les risques. Les études chez l’animal sont également rares et peu adaptées à l’homme, car les doses, les protocoles et les intervalles de temps ne sont pas directement comparables. Dans ce projet, nous proposons d’aborder les choses autrement en administrant un médicament connu pour ses effets bénéfiques sur les lésions pulmonaires afin de déterminer si limiter la toxicité d’une première irradiation peut augmenter la tolérance du poumon à une seconde irradiation. Les deux médicaments choisis ciblent les cellules sénescentes, qui sont des cellules « activées » participant à l’inflammation chronique des tissus, et incapables de s’orienter vers la mort cellulaire. Les forcer à mourir empêche leur accumulation dans le poumon et limite les dommages tissulaires. Le modèle utilisé est une irradiation localisée du poumon gauche chez la souris avec un faisceau de la taille du poumon gauche, puis une 2nde irradiation à l’identique (faisceau large), ou en utilisant plusieurs mini-faisceaux. Diviser un faisceau large en plusieurs petits faisceaux (fractionnement de la dose dans l’espace) consiste à alterner des zones irradiées et des zones non-irradiées dans le poumon. Cette technique a été montrée comme moins toxique. Cette stratégie fait partie des options envisagées en radiothérapie afin de pouvoir ré-irradier les patients de manière plus sûre. Nous additionnerons donc dans ce projet l’effet des médicaments et celui du fractionnement de la dose dans l’espace.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre au point un modèle d’irradiation hémithoracique avec ré-irradiation chez la souris, avec l’apport d’une preuve de concept sur l’implication des cellules sénescentes dans le développement des lésions pulmonaires. Il pourrait également montrer qu’en éliminant ces cellules sénescentes, on peut : 1) Réduire les effets secondaires pulmonaires liés à la radiothérapie, 2) Rendre possible une seconde irradiation du thorax dans de meilleures conditions de sécurité, 3) Permettre des traitements plus efficaces et plus intensifs, tout en protégeant les tissus sains. En somme, ce travail vise à ouvrir la voie à des traitements anticancéreux plus performants et mieux tolérés pour les patients atteints de tumeurs thoraciques.
Procédures
Selon les lots : - Irradiation de la moitié du thorax sous anesthésie chimique (durée 5 à 10 min, 2 fois maximum à 9 semaines d’intervalle) - Gavage quotidien (contention 1 min, maximum 10 fois) - Prélèvement sanguin vigile (2 fois, à 3 semaines d’intervalle) - Scanner sous anesthésie gazeuse (durée 4 min)
Impact sur les animaux
D’après la bibliographie, l’irradiation de la moitié du thorax à une dose unique de 30 Gy ne génère pas de mortalité. En revanche, aucun recul n’existe sur la toxicité d’une ré-irradiation de la même zone thoracique, qui pourrait générer de la toxicité. Les effets cliniques de l’irradiation au niveau thoracique sont essentiellement des difficultés respiratoires. Une première dose de 30 Gy peut générer des lésions à la peau. D’après des études précédentes au laboratoire, les lésions cutanées à la peau (irradiation de la patte) après 30 Gy cicatrisent en 40 jours. La ré-irradiation aura lieu 9 semaines après la première, la peau aura donc cicatrisé. En revanche, nous n’avons pas de recul sur les effets cutanés d’une ré-irradiation. Du stress et de l’anxiété peuvent être générés au moment de la manipulation (gavages, pesées).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour prélèvement pulmonaire à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
On ne peut vraiment comprendre comment le tissu pulmonaire réagit aux rayonnements ionisants qu’en l’étudiant dans un organisme vivant, où toutes les fonctions biologiques interagissent entre elles
Réduction
Les expériences faites pour étudier les lésions causées par l’irradiation dépendent beaucoup du fonctionnement naturel du corps (la physiologie). Pour que les résultats des tests statistiques soient fiables, il faut utiliser au moins 10 animaux par groupe exposé à l’irradiation. Cela permet d’obtenir des données suffisamment solides pour tirer des conclusions valables. En revanche, 6 animaux par groupe sont suffisants pour les groupes non irradiés. A noter que l’aspect réponse tumorale sera abordé in vitro sur un modèle de sphéroïdes de cancer pulmonaire.
Raffinement
Les animaux utilisés pour les expériences sont soignés et hébergés dans des conditions adaptées, afin de réduire au maximum leur souffrance. Ils sont surveillés régulièrement, anesthésiés pendant les irradiations et vivent en groupe dans un environnement enrichi pour leur bien-être. Les gestes techniques sont assurés par des techniciens expérimentés.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu et très utilisé pour les recherches avant les essais sur l’humain. C’est aussi l’animal de référence dans notre laboratoire. Les études précédentes sur l’irradiation des poumons ont déjà été réalisées sur des souris. Les animaux utilisés auront entre 10 et 22 semaines, ce qui correspond à l’âge adulte. Nous choisissons des souris adultes car notre recherche porte sur les effets à long terme de la radiothérapie chez les adultes. Les effets chez les enfants (ou jeunes sujets) relèvent d’un autre domaine de recherche. Enfin, des animaux mâles et femelles seront utilisés.
Mise au point et caractérisation d’un modèle d’irradiation localisée et fractionnée de l’intestin grêle chez la souris grâce à l’utilisation d’un matériau radio-opaque
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 330 d'entre elles et sévère pour 90. Chacune subit une chirurgie de trente minutes sous anesthésie destinée à implanter un marqueur radio-opaque repérable au scanner, puis une irradiation de l'intestin grêle, en dose unique ou répartie sur trois séances, avec jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, perte de poids, déshydratation et infection de la suture, et qu'un score de 2 sur l'échelle de suivi du poids et de la cicatrice déclenche la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme que l'évaluation du marqueur implanté exige une validation dans un "organisme entier" et qu'aucune méthode alternative ne reproduit l'ensemble de ces paramètres.
Objectifs
Selon l’Institut national du cancer (INCa), la radiothérapie concerne plus de 50% des patients atteints de cancer. Elle constitue donc un outil thérapeutique majeur et prometteur, au vu des techniques émergentes …). Les cliniciens cherchent à atteindre un équilibre optimal entre l’efficacité du contrôle tumoral et la limitation des lésions aux tissus sains environnants. Comprendre les mécanismes biologiques qui entrent en jeu à différentes échelles (organe, cellules, voies biomoléculaires) est central pour atteindre cet optimum. L’intestin est un organe à risque, car il est souvent situé dans le champ d’irradiation lors de la radiothérapie pour les cancers pelviens. Plusieurs études montrent l’utilisation d’un modèle d’« anse extériorisée » pour une irradiation localisée de l’intestin grêle de rat et de souris : une chirurgie est réalisée, avec ouverture de l’abdomen pour extérioriser une partie de l’intestin, l’irradier, puis replacer l’intestin dans l’abdomen et suturer la peau. Cette approche ne permet pas la réalisation d’irradiations fractionnées, car elle impliquerait de répéter l’intervention chirurgicale à chaque séance d’irradiation, ce qui n’est pas compatible avec le bien-être animal. Or, la radiothérapie en clinique se caractérise par un fractionnement de la dose sur plusieurs séances. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de mettre au point un protocole d’irradiation fractionnée et localisée de l’intestin grêle de souris afin de se rapprocher au maximum des conditions en clinique, et d’accéder à une meilleure compréhension des effets secondaires de la radiothérapie sur l’intestin. Le ciblage de l’intestin est réalisé grâce à l’implantation d’un petit marqueur radio-opaque (visible au scanner), permettant de repérer précisément la zone à irradier lors de chaque séance. Ce projet permettra également d’améliorer les conditions dans lesquelles ce type de chirurgie est réalisé (conditions de stérilité notamment).
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre et caractériser comment l’intestin répond à la radiothérapie réalisée en plusieurs séances (fractionnée), comme c’est le cas chez des patients atteints de cancer. Les connaissances acquises pourraient permettre de développer, sur le long terme, des cibles thérapeutiques afin de réduire les effets secondaires intestinaux de la radiothérapie et d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Pour tous les animaux : o Chirurgie (sous anesthésie, 1 fois, durée 30 minutes) o Pesées et examen clinique (en vigile, 2 fois par semaine, durée 1 minute) Selon le groupe expérimental : o Irradiation locale en dose unique (sous anesthésie, 1 fois, durée 15 minutes) o Irradiation locale en dose fractionnée (sous anesthésie, 3 fois, durée 10 minutes) o Imagerie (sous anesthésie, 3 fois maximum, durée 10 minutes)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles peuvent survenir à différents moments du projet : • La chirurgie peut engendrer, pendant quelques jours, de la douleur, une perte de poids, une déshydratation, un risque d’infection au niveau de la suture et une diminution de la mobilité, chez certaines souris. Ces effets, notamment la perte de poids, la diminution de la mobilité, et l’infection, que l’on peut directement observer voire mesurer, disparaissent dans la majorité des cas 2 à 3 jours après la chirurgie. • La greffe du matériau radio-opaque peut entraîner une inflammation localisée à l’emplacement de la greffe. Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. L’analyse de ces effets est au cœur du projet.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir collecter les tissus pour les analyses.
Remplacement
Le développement des séquelles digestives radio-induites nécessite l’interaction entre les différents compartiments cellulaires de l’organisme. Même s’il est possible aujourd’hui de créer des modèles in vitro qui intègrent les différentes cellules du colon, ces modèles prometteurs ne permettent pas encore de remplacer entièrement à l’expérimentation animale : il est donc important de conserver la physiologie de l’organisme pour étudier les processus biomoléculaires des séquelles des radiothérapies pelviennes. De plus, l’évaluation du matériau radio-opaque implanté nécessite une validation dans un organisme entier pour analyser sa tolérance locale, sa stabilité dans le temps, la précision de sa localisation lors des irradiations fractionnées, et les effets biologiques associés à l’irradiation fractionnée. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire l’ensemble de ces paramètres physiologiques et radiobiologiques. Ce projet nécessite donc de travailler avec un modèle animal permettant de maintenir les interactions inter organes.
Réduction
Les modèles pour l’étude des lésions intestinales radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques significatives sur les paramètres d’étude, le nombre choisi est le nombre minimum nécessaire de souris, soit 10 souris par groupe. En fonction de la structure des jeux de données obtenus suite aux analyses, différents tests statistiques seront utilisés.
Raffinement
Toutes les procédures expérimentales seront réalisées de manière à limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux. Analgésie et anesthésie • administration d’analgésiques en préopératoire et post-opératoire; • anesthésie lors des chirurgies, irradiations et imageries). Conditions chirurgicales et soins post-opératoires Les interventions seront réalisées dans des conditions d’asepsie strictes avec du matériel stérile. La température corporelle sera maintenue à 37 °C à l’aide d’un tapis chauffant et d’un dispositif de maintien au chaud pendant la phase post-opératoire. Les animaux seront réhydratés pendant la chirurgie et en post-opératoire. Suivi clinique et définition des points limites Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique régulier incluant l’évaluation de l’aspect général, de la prise alimentaire et du poids corporel. La cicatrice chirurgicale sera surveillée et désinfectée si nécessaire. Un système de scoring (de 0 à 2) sera appliqué pour le poids et l’évolution de la cicatrice. Lorsqu’un score de 2 est atteint, les souris seront euthanasiées. Des soins supplémentaires pourront être mis en place en concertation avec le vétérinaire et le personnel de l’animalerie si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle expérimental bien caractérisé dans la littérature scientifique et fréquemment utilisé dans les études précliniques portant sur les effets de la radiothérapie. En effet, la physiologie intestinale de la souris présente beaucoup de similarités avec celle de l’Homme, notamment en termes de renouvellement de l’épithélium, d’organisation tissulaire et de réponse aux irradiations. Ces caractéristiques en font un modèle pertinent pour l’étude des lésions intestinales radio-induites. Une irradiation pelvienne en dose unique sur la souris permet de reproduire des lésions intestinales comparables à celles observées chez certains patients présentant des séquelles sévères de la radiothérapie. Les effets d’une irradiation en dose unique ont déjà été décrits dans la littérature et constituent une base pour l’étude proposée. L’impact d’une irradiation fractionnée reste cependant peu caractérisé et représente l’un des objectifs du projet. Le modèle murin apparaît donc comme le modèle in vivo le plus adapté pour répondre aux objectifs scientifiques de cette étude. Afin de reproduire au mieux les caractéristiques de la pathologie étudiée (lésions intestinales et fibrose), les animaux devront être au stade jeune adulte (8 à 10 semaines) lors de leur arrivée à l’animalerie (donc une semaine de plus en prenant en compte la phase d’acclimatation à l’animalerie). Cette tranche d’âge est classiquement utilisée dans les modèles expérimentaux d’irradiation localisée.
Evaluation préclinique de produits de santé pour la chirurgie des tissus mous – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Lapins : 800
Chiens : 96
Cochons : 800
Chèvres : 160
Moutons : 640
Tester des mesh abdominaux, des colles hémostatiques et d'autres dispositifs de chirurgie des tissus mous conduit à utiliser 2 816 animaux non-humains, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 410 d'entre eux étant opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Parmi eux, 800 lapins, 800 cochons, 640 moutons, 320 rats, 160 chèvres et 96 chiens subissent une implantation chirurgicale de 1 h 30 à 2 h 30, jusqu'à trois séances d'imagerie sous anesthésie et des prélèvements sanguins. Les tissus au contact de l'implant sont prélevés après la mise à mort pour analyse microscopique, ce qui exclut de garder un seul animal en vie. Le porteur décrit une activité de prestation, le donneur d'ordre commandant les essais et s'engageant à ne pas les faire refaire à l'identique, et indique que des formations du personnel peuvent être menées dans ce cadre.
Objectifs
Il s’agit d’un projet de recherche et développement qui vise à étudier la performance (efficacité) de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous et/ou d’en évaluer la tolérance (sécurité). Il peut s'agir de produits de renforcement abdominaux (mesh), de produits hémostatiques (colle, poudre, compresses...), de produits pour protection lors d’une cryothérapie, …. Ces produits destinés à être mis en contact avec le corps humain doivent être préalablement testés pour garantir la sécurité des patients et l’efficacité lors de l'utilisation clinique. La réglementation exige de prouver l'efficacité des produits de santé et de réduire au minimum le risque de réactions indésirables pour l'Homme durant l'utilisation clinique. Dans le cadre de ce projet, des formations adaptées pourront être menées afin d'assurer et de maintenir les compétences du personnel de l'EU sur les études couvertes par ce projet. En ce sens, différents types d’essais peuvent être menés : - Essais de performance : - Essais de screening d’efficacité : Les essais de screening d’efficacité vérifient si la performance d’un produit mérite d’être approfondie ou s’il est nécessaire de mener d’autres études avant de passer aux essais de confirmation de performance. Ces essais sont essentiels dans la stratégie de réduction du nombre total d’animaux utilisés. - Essais de confirmation de performance : Les essais de confirmation de performance sont effectués après validation des essais de screening d’efficacité. Comme leur nom l’indique, ils visent à confirmer les résultats obtenus lors des essais préalablement menés sur un produit. - Essais de tolérance locale : Les essais de tolérance locale évaluent la réaction d’un organisme en contact avec un produit étranger. Dans ce projet, ces essais peuvent être réalisés en complément des essais de performance, sur les mêmes animaux. Les critères d’évaluation à prendre en considération sont définis lors de la rédaction du protocole d’essai. Ce projet pourra se conduire dans plusieurs EU partenaires, afin d'obtenir des résultats d'imagerie spécifique non disponible dans notre EU.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d'obtenir des données de performance et de tolérance de produits de santé utilisés en chirurgie des tissus mous. En mimant au plus près l'implantation du dispositif chez les patients, ces études permettront de mieux appréhender la réaction de l’organisme au produit à tester, et ainsi améliorer la sécurité et/ou les performances du produit, avant sa mise sur le marché.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale afin d'implanter le dispositif médical à tester (cette intervention chirurgicale peut durer entre 1h30 et 2h30). Cette intervention a toujours lieu sous anesthésie générale (chimique et gazeuse), et analgésie. L’antibiothérapie est ajoutée au cas par cas en fonction de l’invasivité de la chirurgie et des risques infectieux associés. Des prélèvements sanguins peuvent etre réalisés en cours d'étude (en général un prélèvement à la chirurgie et un prélèvement en fin d'étude, d'une durée de quelques minutes). Ceux-ci pourront se faire sous anesthésie ou non, selon le contexte de réalisation de cet acte (en cours de chirurgie, pendant le temps de l’étude ou juste avant l’euthanasie des animaux en fin d’étude). D'autres types d'interventions non douloureuses, de type scanner ou radiographies pour observer le dispositif en cours d'étude, peuvent être réalisées sous anesthésie légère (en général, en fonction de la durée de l'étude, 1 à 3 sessions d'imagerie peuvent etre envisagées en cours d'étude).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont, selon les procédures, les suivants : - mise à jeun - stress liés à la chirurgie - perte de poids ou d’appétit liée aux effets de l’anesthésie et/ou de la chirurgie, pendant quelques jours - Atteinte de la structure ou du fonctionnement des organes en contact avec le dispositif implanté. (par exemple difficulté à uriner après implantation d’un dispositif au niveau de la prostate.) Les douleurs post-opératoires peuvent apparaitre et seront prises en charge par des mesures de raffinement. Les animaux recevront une anesthésie fixe afin de réaliser l'imagerie, pouvant induire un stress. Du produit de contraste pourra être injecté grâce à un cathéter en intraveineux. Une légère perte de poids (non systématique) pourrait être observée dans les quelques jours suivant l'anesthésie.
Devenir
Pour répondre aux objectifs de chacune des procédures du projet, des observations post-mortem sont nécessaires. En effet, la sécurité des produits est évaluée en observant la réaction des tissus au contact du dispositif à tester, et ceci se fait par prélèvements des tissus et organes entourant le produit, afin de réaliser des analyses microscopiques (histologie notamment, qui est la meilleure méthode d'évaluation des effets locaux induit par un produit étranger à l'organisme, comme l'inflammation par exemple). De même la performance peut, elle aussi, être évaluée par des tests spécifiques sur les organes et le dispositif prélevé (exemple : tests mécaniques sur des prothèses abdominales pour évaluer la résistance du dispositif). En raison des objectifs des procédures de ce projet, il n'est pas possible de maintenir en vie les animaux utilisés.
Remplacement
A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative permettant d’évaluer la performance et la tolérance locale des produits de chirurgie des tissus mous en raison des interactions complexes s'établissant entre le tissus ciblé et le dispositif lui-même. De plus, l’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation que doivent suivre les tests précliniques sur les dispositifs médicaux, avant de pouvoir lancer les tests cliniques.
Réduction
Le donneur d'ordre demandant la réalisation de ces tests s'engage à ne pas faire renouveler à l'identique un essai déjà mené précédemment. Par ailleurs pour réduire le nombre d'animaux inclus en étude, il est possible d'utiliser un même groupe "contrôle" (produit dont l'effet est déjà connu), pour plusieurs groupes "test" recevant des produits à tester différents. Les études de screening permettent également de sélectionner un produit test qui présente le plus d'intérêt à être développé, réduisant de ce fait le nombre de tests sur des produits ayant un intérêt moindre. Les études dites "pilotes" sur quelques animaux seulement, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit ou le choix du modèle expérimental le plus approprié (matériel ou abord chirurgical le plus adéquat…), avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur pour l'élaboration du dossier pour la mise sur le marché (nombre d'animaux minimum, durée de mise en contact minimum, etc).
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, une période d’acclimatation pendant laquelle ils ne subissent aucune manipulation non indispensable est réalisée à leur arrivée dans l’EU. Ensuite, et avant la chirurgie, une période d’habituation aux actes spécifiques est réalisée si nécessaire pour réduire l’aspect anxiogène de ces manipulations (exemples : habituation aux pesées, habituation alimentaire). Des enrichissements sont présents dans l’environnement des animaux (exemple : jouets), et ces mesures sont renforcées en phase post-opératoire (ajout d’enrichissements : pommes dans la litière des porcs, ou friandises dans les jouets, et augmentation de la litière des ovins). Les transports des animaux vers les EU partenaires seront organisés dans le respect du bien-être animal et de la réglementation en vigueur (durée du transport jusqu'à 1h30 en fonction des EU avec ajout de litière et transport en groupe). Un contrôle clinique de chaque animal est réalisé par du personnel qualifié (vétérinaire, technicien ou zootechnicien) au départ et à l'arrivée. Lors des séances d'imagerie externalisées, afin de limiter le stress des animaux, une période de repos adéquate sera instaurée entre la réception des animaux et l'anesthésie et entre le réveil des animaux et le transport retour vers notre EU. La douleur des animaux : la chirurgie est réalisée sous anesthésie et analgésie (à base de morphiniques). En phase post-opératoire, les suivis quotidiens sont renforcés et des soins post-opératoires spécifiques peuvent être mis en place (désinfection des sites chirurgicaux à une fréquence adaptée). Les signes cliniques servant de points limites ont été définis, pour la prise de décision des mesures à mettre en place pour limiter les souffrances. Selon l'espèce, les prises de sang peuvent être réalisées sous anesthésie générale (injectable et/ou volatile, lors d'une phase de chirurgie par exemple), ou sous sédation légère (voir paragraphe sur la liste des médications) avec au besoin une analgésie, afin de maitriser le stress et la douleur potentielle. Les conséquences de l’anesthésie/chirurgie : du gel oculaire est appliqué au niveau de la cornée lors des anesthésies des animaux pour prévenir l'assèchement oculaire. Une attention particulière est portée à la lutte contre l'hypothermie : température de la salle, isolation du sol, couvertures, lampes chauffantes si besoin. En cas de doute, une mesure de la température rectale est réalisée.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans les textes de référence. MODIFICATION V13: l’espèce est également choisie en fonction de sa similarité avec l’humain (exemple pour la prostate du chien qui est plus proche de l’humain que celle des autres espèces. Les produits de petite taille/miniaturisés seront testés préférentiellement chez les rongeurs ou le lapin (norme ISO10993 Partie 6). Les produits de taille importante seront préférentiellement testés chez le porc ou les ovins/caprins. Lorsque plusieurs espèces répondent aux critères, le choix est arbitré par la durée de l’essai (le long terme: espèces à longue durée de vie). Le stade de développement est exprimé en âge ou en poids. Dans la plupart des cas, l’utilisation d’animaux adultes est recommandée. Le stade de développement est pertinemment sélectionné en fonction de l'utilisation clinique du produit ou de sa taille par exemple. En l’absence d’exigence particulière, l’utilisation d’animaux au stade adulte est privilégiée. Cas particulier des porcs domestiques : étant donné les conditions d’hébergement, le comportement social et la manipulation des animaux, l’utilisation de porcs domestiques en croissance (âgés d’au moins 8 semaines) est la plus appropriée dans ce projet.
Mise au point d’une thérapie pharmacologique dans un modèle murin de la maladie de Wolfram
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Les souris utilisées portent la mutation du syndrome de Wolfram et développent, dès 21 jours de vie, une surdité et un syndrome vestibulaire, auxquels s'ajoute un diabète. 1 440 souris sont engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever plusieurs structures cérébrales. Elles subissent des injections quotidiennes pendant deux mois et demi, six contrôles alimentaires de quinze heures, six piqûres caudales sur neuf mois, et le porteur signale une irritation possible aux sites d'injection sur l'abdomen. Des tests comportementaux servent à évaluer les capacités motrices du premier mois à l'âge adulte, sans que le document précise lesquels.
Objectifs
Le syndrome de Wolfram est une maladie génétique rare mais qui ne dispose aujourd'hui d'aucune thérapie. L'identification de la protéine responsable de la pathologie et la compréhension récente de son rôle dans la cellule et son implication dans les processus neurodégénératifs, fondamentaux dans des pathologies comme Alzheimer, Parkinson, la sclérose latérale amyotrophique ou la maladie de Huntington, permet aujourd'hui d'envisager des approches thérapeutiques. Il est important de caractériser les effets thérapeutiques de composés neuroprotecteurs chez les souris pour définir les paramètres d'efficacité des candidats médicaments testés par la suite chez l'Homme. Le modèle d'étude est la souris qui possède la même mutation que l'Homme. Cette souris développe plusieurs déficits d'équilibre et d'audition. Les objectifs de ce projet sont de déterminer l'ampleur des déficits observables et d'évaluer les effets bénéfiques des composés médicaments testés.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d'apporter une preuve d'efficacité des composés testés. Le bénéfice à terme est d'amener en clinique des composés à visée thérapeutique pour des pathologies rares/orphelines (Sclérose latérale amyotrophique, Hungtington...) pour lesquelles il n'existe actuellement aucun traitement.
Procédures
Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : Les animaux seront soumis à 1 contrôle alimentaire (durée 15h), des injections journalières pendant 2 mois et demi et des prélèvements de quelques gouttes de sang mensuellement pour suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murin. Au total, en plus des injections journalières, les animaux seront soumis à 6 contrôles alimentaires, 6 injections et 6 piqures caudales sur une période de 9 mois.
Impact sur les animaux
Les effets attendus seront "légers" à "modérés". Le contrôle alimentaire sur un durée de 15h peut également engendrer un stress. Une irritation peut survenir aux sites d'injections sur l'abdomen de l'animal. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels ( surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.
Remplacement
L’utilisation de modèles murins du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle mammifère est le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques du syndrome de Wolfram, type déficit vestibulaire, dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. Aucune alternative à ce jour ne peut se substituer totalement à ce modèle. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant. Toutes les molécules testées ont été préalablement testées sur des modèles in vitro de culture cellulaire et sur des tests comportementaux sur la larve de poisson zèbre dont l'âge est inférieur à 5 jours.
Réduction
Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe. Ce nombre de 12 souris par groupe fait également références aux études antérieures réalisées au laboratoire. Une veille bibliographique sera également prise en compte durant la durée du projet. Plusieurs structures du cerveau seront prélevées dans cette étude afin de collecter un maximum d’échantillons.
Raffinement
Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en carton pour éviter que les animaux ne se blessent et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Si les animaux présentent un augmentation de leur production d'urine (dû à l'installation d'un diabète) les fonds de cages seront changés plus régulièrement. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine à l’écart du test de comportement afin de retrouver leur environnement sécurisant. Une crème analgésique sera appliquée sur la queue avant les prélèvements de sang. L’état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière en suivant la courbe de poids des animaux. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait interrompu .
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées sur un modèle murin de type syndrome de Wolfram qui mime tous les symptômes que l'on retrouve chez l'Homme atteint par cette pathologie, à savoir un diabète, et une dégénérescence des cellules ciliées de l'oreille menant à des troubles vestibulaires. Les capacités motrices des animaux seront testées dès le 1er mois jusqu'à l'âge adulte.
Evaluation de la tolérance d’agents de transfection et d’acides nucléiques chez le petit animal – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3 060 souris sont utilisées en un an, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent en intraveineuse ou en intramusculaire des agents chimiques de transfection et des acides nucléiques, avec un risque de thrombose, de réaction inflammatoire et de troubles du comportement, et le prélèvement sanguin peut provoquer une lésion oculaire avec opacification de la cornée. Le commanditaire est une société de biotechnologie dont le porteur teste la tolérance des produits, l'étude de toxicité aiguë suivant une ligne directrice de l'OCDE où deux à quatre étapes s'enchaînent selon la mortalité et l'état moribond des souris. Le porteur écrit que cette procédure "utilise très peu d'animaux" et qu'elle "ne vise pas le calcul d'une valeur précise de la dose léthale dans 50% des animaux", sur un projet qui engage 3 060 souris en douze mois.
Objectifs
Notre partenaire est une société de biotechnologie qui soutient la thérapie génique et cellulaire, la fabrication de produits biologiques et la recherche en sciences de la vie grâce à des solutions innovantes de transfection de l'acide nucléique. La mission consiste ainsi à mettre au point des technologies d'administration de pointe pour permettre aux scientifiques de développer des thérapies révolutionnaires à base d'acides nucléiques afin d'améliorer la santé humaine à chaque étape du processus, de la science fondamentale à la clinique. L'administration d'acides nucléiques doit être efficace, fiable et accessible, dans le développement de thérapies à base d'acides nucléiques pour répondre à des besoins médicaux non satisfaits. L'objectif est ainsi de fournir en permanence des produits de référence en termes de qualité, d'efficacité et de sécurité. Ces réactifs qui permettent la délivrance d'acides nucléiques in vitro et in vivo sont utilisés pour un large éventail d'applications, notamment l'expression génétique, la production de protéines et de virus, l'édition du génome et l'interférence ARN, et ce dans un nombre croissant d'essais cliniques à base d'acide nucléique dans le monde entier dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination. Dans le cadre du développement de nouvelles formulations, plusieurs objectifs ont été définis pour ce projet: 1) Evaluer si les systèmes de vectorisation seront transférables à des applications thérapeutiques; 2) Evaluer la tolérance d’agents chimiques pour la transfection in vivo d’acides nucléiques (ARN et ADN) et déterminer des signes de toxicité éventuelles; 3) Evaluer la tolérance d’acides nucléiques pour la transfection in vivo et déterminer des signes de toxicité éventuelles.
Bénéfices attendus
Si les agents de vectorisations et les acides nucléiques testés sont toléres par la souris, ils pourraient être transférables à des applications thérapeutiques en clinique humaine. Ce projet aura pour but de dégager des conditions optimales d’utilisation du système n’ayant aucun impact toxique sur la souris.
Procédures
Les animaux recevront une injection des composés de transfection par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes) ou par voie intramusculaire (durée 2-3 minutes). On réalisera ensuite un prélèvement sanguin (durée 2-3 minutes) avant la mise à mort en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem. MODIFICATION. on réalisera un ou plusieurs prélèvements sanguins.
Impact sur les animaux
Une potentielle toxicité pourra être observée dans ces études, avec notamment un risque de thrombose, de réactions pro-inflammatoires, ou encore du trouble du comportement. Par ailleurs, dans de très rares cas, le prélèvement sanguin peut entrainer une lésion oculaire avec opacification de la cornée.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue des procédures expérimentales en vue du prélèvement d'organes et des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d'évaluer l'administration de produits de transfection délivrant des acides nucléiques. Les premières évaluations seront réalisées in vitro, dans des systèmes cellulaires. Les réactifs retenus seront ensuite évalués in vivo, en vue d'utilisation dans le domaine de la thérapie génique et cellulaire, de l'immunothérapie et de la vaccination.
Réduction
Les protocoles d’études seront réalisés en incorporant le juste nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions. Nous utiliserons 4 males et 4 femelles pour chaque condition utilisée dans l'étude de toxicité (pour chaque réactif à évaluer et selon le délai entre l'administration du produit et les analyses sanguines et histologiques). Cet effectif est réduit au maximum, mais suffisant pour assurer une analyse statistique fiable et reproductible. Dans l'étude de toxicité aigue, nous suivrons la ligne directrice de l'Organisation de Coopération et de Développement Economiques (OCDE), qui consiste en un processus séquentiel, en utilisant 3 femelles par dose. Suivant la mortalité et/ou l’état moribond des animaux, deux à quatre étapes sont en moyenne nécessaires pour évaluer la toxicité aiguë de la substance d’essai. Cette procédure est reproductible et utilise très peu d’animaux. La méthode ne vise pas le calcul d’une valeur précise de la dose léthale dans 50% des animaux, et n'implique donc pas d'analyse statistique, mais repose uniquement sur l'observation des animaux.
Raffinement
Nous réduirons au maximum les techniques douloureuses ou stressantes. Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance. En cas d’observation de la moindre douleur, les animaux seront mis à mort pour éviter toute souffrance. Les animaux seront pesés avant et après administration des composés et observés toutes les jours, notamment l'apparence physique (toilettage, pelage, posture, pupilles), les modifications du comportement (hyperactivité ou mobilité réduite, léthargie, immbolité) ou le comportement après stimulation (prostration, hyperactivité, agressivité, tremblements, convulsions).
Choix des espèces
Le systèmes de vectorisation évalués dans ce projet sont essentiellement utilisés dans les phases de recherche, qui sont majoritairement effectuées chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, à partir de 6 semaines, age qui permet d'identifier une activité maximale des produits lipidiques, autrement dit des réactifs de transfection
Cartographie fonctionnelle du système immunitaire du Nothobranchius furzeri avec l’âge
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Filmés trente minutes dans un bac pour classer leurs performances de nage, traités par un antalgique, endormis, puis injectés dans la cavité abdominale avec un vaccin, 270 killis turquoise d'Afrique sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ces poissons vieillissent vite, six mois de vie en captivité, et le porteur attend chez eux une perte de pigmentation, une émaciation, une baisse de la prise alimentaire et des changements de comportement qu'il qualifie d'anxiété ou de résignation. Les individus sont observés entre 2 et 6 mois, par groupes de 6 à 10, pour relier des populations immunitaires à la perte de mobilité au cours du vieillissement. Tous sont tués et disséqués à l'issue, afin d'extraire les cellules immunitaires de leurs organes.
Objectifs
Aujourd’hui, les personnes âgées de plus de 60 ans représentent 1/4 de la population française et pourraient en représenter 1/3 en 2050. Si l’espérance de vie en France après 50 ans s’avère élevée, le nombre d’années vécues en bonne santé reste inférieur à celui de plusieurs pays de l’UE. Il est donc urgent d’intervenir pour ralentir cette progression défavorable et améliorer la qualité de vie au cours de l’avancée en âge. Dans ce contexte, l'OMS a identifié 5 domaines, la mobilité, la vitalité, les capacités neurosensorielles, le psycho-social et la cognition, qui doivent être préservées ou restaurées chez la personne âgée pour promouvoir son "bien vieillir". L’objectif de ce projet est de caractériser les modifications du système immunitaire associées à la perte de mobilité spontanée, une des grandes fonctions à préserver pour vieillir en bonne santé, en utilisant un modèle animal présentant un vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu au cours du vieillissement. Nous pourrons évaluer quelles populations immunitaires sont associées à la diminution de la locomotion. Les outils développés dans ce projet pour cartographier les réponses immunitaires avec l’âge seront mis à disposition de la communauté scientifique. A plus long terme, les résultats permettront d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de proposer de nouvelles approches d'immunomodulation afin de préserver la mobilité et favoriser le "bien vieillir".
Procédures
Nous utiliserons des poissons mâles pour caractériser les populations immunitaires modifiées avec la perte de mobilité associée au vieillissement. Les principales populations identifiées chez le mâle seront testées chez les femelles. Puis, nous évaluerons la réponse à une vaccination chez les poissons en comparant les réponses immunitaires induites par l'injection intrapéritonéale de vaccin contenant ou non un composé pro-inflammatoire. Les poissons seront traités par un antalgique avant d’être endormis pour prévenir la douleur liée à l'injection et réduire l’angoisse associées à cette intervention. Les poissons injectés seront également traités par un antalgique après l’injection. Les poissons seront filmés au préalable (trois jours à une semaine avant la vaccination) pendant 30 min dans un bac pour enregistrer les mouvements de nage spontanés et permettre de classer les individus âgés en fonction de leur performance physique.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent l’injection du vaccin et les conséquences de la vaccination. Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
Au terme des procédures, tous les animaux (n=270) seront mis à mort et disséqués afin de récupérer différents organes pour extraire les cellules immunitaires ou pour procéder à des analyses histo-pathologique et transcriptomique.
Remplacement
Le processus de vieillissement est très variable d'un individu à l'autre. Pour mieux comprendre ces différentes trajectoires de vieillissement à l'échelle individuelle, il est nécessaire d'étudier l'évolution des fonctions, comme la mobilité, chez des organismes vivants. Les individus âgés nous permettront d’étudier les réponses immunitaires dans leur contexte pathologique et physiologique de vieillissement in vivo. Le Turquoise Killifish est un modèle unique et indispensable pour étudier, de manière intégrée, à l'échelle de l'organisme entier, les réponses immunitaires en fonction de la qualité du vieillissement des individus.
Réduction
Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’individus, en tenant compte des expériences déjà réalisées au laboratoire. Les poissons sont observés aux âges extrêmes de la vie (2 mois à 6 mois) et leur capacité de locomotion est évaluée. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques et fonctionnels généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 6 à 10 individus au total seront constitués pour mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction). Des analyses post mortem sur différents organes seront réalisées afin d'obtenir le plus d'informations possibles pour un même individu.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire) ou l'amaigrissement (creusement de la partie ventrale du poisson). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à un suivi du poids sur 1 semaine. Si la perte de poids est trop importante, le protocole expérimental sera interrompu. La surveillance du poids se poursuivra jusqu'à stabilisation ou atteinte d'un point limite nécessitant la mise à mort de l'individu.
Choix des espèces
Pour étudier les mécanismes en lien avec le vieillissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce de choix, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur en terme de tissus et de cellules présents. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un vieillissement systémique, là aussi comparable à celui des rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d’une exploration fonctionnelle in vivo couplée à des études biologiques intégrées et à la caractérisation de sous-populations cellulaires ex vivo. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.
Irradiation de rongeurs sur une plateforme préclinique
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système nerveux
Rats : 400
La plateforme vend un service d'irradiation à des équipes qui n'ont pas d'irradiateur, et ce projet sert à couvrir réglementairement les animaux venus d'autres établissements pendant leur passage. 4 000 souris et 400 rats y seront irradiés, une à cinq fois, corps entier ou zone ciblée, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, éveillés ou sous anesthésie jusqu'à trente minutes. Le porteur indique qu'ils retournent ensuite dans leur animalerie d'origine, où ils poursuivent les protocoles de leur établissement de rattachement. L'irradiation sert aussi à empêcher le rejet de cellules greffées pour fabriquer des modèles murins de cancers humains, technique que le porteur présente comme un moyen de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
La plateforme propose un service d’irradiation de rongeurs de laboratoire qui comprend la mise à disposition des équipements pour les utilisateurs autorisés ou la réalisation par le personnel de la plateforme, d’irradiations corps entier ou de zones ciblées selon les besoins du demandeur. Dans ce contexte, la plateforme peut accueillir temporairement des animaux extérieurs à l’établissement utilisateur dont elle dépend ; ce projet a pour objectif de couvrir réglementairement ces animaux durant la période d’irradiation sur la plateforme. Ces animaux sont inclus, d’autre part, dans des demandes d’autorisation de projet rattachées aux établissements d’expérimentation dont dépend le concepteur du projet et demandeur de la prestation. Les chercheurs utilisent l’irradiation soit comme sujet d’étude direct pour comprendre les effets cellulaires et moléculaires des radiations avec ou sans co-exposition chimique ou comme outil pour créer par exemple, après transplantation cellulaire, des modèles murins de cancers humains affectant les cellules sanguines. Dans ce cas, l’irradiation permet d’éviter le rejet des cellules greffées. La technique de greffe de moëlle osseuse est utilisée pour réduire le nombre d’animaux et amplifier les animaux modèles de cancers. La plateforme s’engage à réaliser les irradiations seulement si les animaux sont inclus dans une demande d’autorisation de projet qui a reçu un avis favorable de la part du Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche et de l’espace.
Bénéfices attendus
La plateforme, dotée de personnel qualifié et habilité à accueillir temporairement des animaux provenant d’établissements extérieurs, constitue un outil structurant permettant de réaliser des irradiations pour des équipes extérieures qui n’ont pas accès en interne à des irradiateurs. En assurant la traçabilité des autorisations, le suivi des animaux irradiés et la mise à disposition d’équipements d’irradiations, elle favorise la production de données robustes, indispensables pour étayer les futurs développements. Les bénéfices à court terme sont de permettre la réalisation des irradiations nécessaires au bon déroulement des projets accueillis sur la plateforme et les bénéfices à long terme, seront apportés par les projets dans lesquels les animaux irradiés sont utilisés.
Procédures
Irradiation sur animaux vigiles (1 à 5 irradiations, durée 10 minutes maximum) ou animaux anesthésiés (1 à 5 irradiations, 15 minutes) Une Anesthésie sur certains animaux (durée maximale de 30 minutes, 1 à 5 anesthésies)
Impact sur les animaux
Légère perte de poids dans les jours qui suivent l’irradiation sous anesthésie, stress lié aux manipulations
Devenir
A la fin des procédures, les animaux retournent dans leur animalerie d’origine.
Remplacement
Les projets reçus sur la plateforme d’irradiation ont reçu un avis favorable du comité d’éthique de leur établissement et une autorisation du MESRE. Les concepteurs ont démontré l’impossibilité actuelle de remplacer les animaux pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Cependant, les systèmes in vitro sont utilisés en amont des projets in vivo. Ils permettent ainsi, dans un premier temps, d’explorer de manière contrôlée et mécanistique les réponses moléculaires et cellulaires aux rayonnements. Ils offrent la possibilité d’identifier finement les voies de signalisation impliquées, de caractériser les altérations précoces et de déterminer des gammes de doses d’irradiation à tester in vivo. De même, les stratégies thérapeutiques sont d’abord évaluées dans des modèles cellulaires ou à l’aide d’organoïdes tumoraux, permettant d’étudier la radiosensibilité des cellules tumorales, l’effet de nouveaux traitements ou l’impact de certaines combinaisons thérapeutiques sous irradiation. Ces approches permettent de sélectionner les conditions expérimentales les plus pertinentes (doses d’irradiation, concentrations des agents thérapeutiques) avant toute expérimentation in vivo, contribuant ainsi à limiter l’utilisation d’animaux et en ciblant plus précisément les hypothèses biologiques à tester. Elles contribuent également à définir des mécanismes spécifiques difficiles à isoler dans un organisme entier, et à comparer différentes conditions expérimentales. Néanmoins, dans le domaine des effets des rayonnements ionisants, les études in vivo demeurent indispensables. En effet, elles seules permettent de prendre en compte la complexité de l’organisme dans son ensemble, notamment les interactions entre les tissus ou organes, entre la tumeur et son environnement ou encore la distribution dans l’organisme des agents thérapeutiques ainsi qu’étudier les effets à long terme impossibles à mettre en œuvre in vitro.
Réduction
La plateforme accueille uniquement les animaux nécessaires aux expériences autorisées par les établissements de recherche. Le nombre d’animaux est planifié en fonction des besoins scientifiques de chaque projet et des autorisations administratives. Les expériences sont conçues pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, par exemple en suivant plusieurs paramètres sur un même animal au lieu d’en utiliser plusieurs.
Raffinement
Toutes les procédures sont conçues pour minimiser l’inconfort et le stress des animaux. Les irradiations sont réalisées sur des animaux vigiles ou sous anesthésie, et sont de courtes durées. Le maintien de la température corporelle est assuré si nécessaire. Les animaux sont surveillés avant, pendant et après l’irradiation, et tous les signes d’anomalie sont immédiatement signalés au vétérinaire. Des points limites ont été définis pour préserver le bien-être animal et les animaux retournent toujours dans leur animalerie d’origine après la procédure d’irradiation.
Choix des espèces
La plateforme ne permet d’irradier que des rongeurs. La souris est le modèle animal le plus fréquemment utilisé : cette espèce est très utilisée par exemple, pour l’étude des effets sur les tissus des irradiations à moyenne ou forte dose corps pour tester de nouveaux traitements ou dans des gammes de doses faibles à modérée pour étudier la senescence et le remodelage vasculaire. Il existe également de nombreux modèles murins qui miment les cancers et permettent de tester de nouvelles thérapies combinées à la radiothérapie. Le modèle rat est le modèle de référence en toxicologie de l’inhalation dans la littérature. Pour les irradiations, les animaux utilisés sont généralement des animaux jeunes adultes, dont la physiologie et le métabolisme sont stables, ce qui permet d’obtenir des données fiables et reproductibles sur les effets tissulaires et moléculaires des irradiations. L’utilisation d’animaux adultes garantit également une taille et une morphologie compatibles avec le positionnement précis requis par les irradiateurs, ainsi qu’avec l’anesthésie et le suivi post-procédure.
Décrypter les mécanismes biologiques de la radiothérapie spatialement fractionnée sur la réponse vasculaire et immunitaire chez la souris et le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1780
Les animaux qui montrent des signes cliniques anormaux plus de trois jours sont mis à mort. 1 780 souris et 1 780 rats vont être utilisés dans ce projet, dont 2 720 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever poumons et cerveau. Les souris reçoivent une irradiation du thorax qui peut provoquer fibrose, rougeurs, croûtes, détresse respiratoire et mort au bout de cinq à six mois, les rats une irradiation du crâne suivie de dépilations et d'ulcérations pendant cinq à six jours. La rubrique décrivant les procédures reste à l'état de formulaire, l'instruction "pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d'animaux concernés" y figurant en lieu et place des réponses.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement largement utilisé contre le cancer. Elle repose sur l’irradiation ciblée des tissus tumoraux afin de détruire les cellules cancéreuses ou de limiter leur progression, tout en cherchant à préserver au mieux les tissus sains situés à proximité. Malgré les progrès techniques importants réalisés ces dernières années, les effets indésirables sur les tissus non ciblés restent une contrainte majeure de ce type de traitement. Dans ce contexte, il apparaît nécessaire d’explorer de nouvelles approches permettant d’améliorer le rapport entre l’efficacité du traitement et la protection des tissus sains. Parmi ces approches, certaines visent à modifier la manière de déposer la dose dans le volume irradié. Ces stratégies innovantes s’écartent volontairement des pratiques conventionnelles en proposant une distribution volontairement non homogène du traitement. Des travaux antérieurs menés dans différents modèles expérimentaux ont montré que ce type d’approche pourrait à la fois améliorer le contrôle de la maladie et réduire les atteintes aux tissus sains. Des résultats encourageants ont également été observés dans des contextes cliniques exploratoires, suggérant un fort potentiel de transfert vers une utilisation thérapeutique plus large. Cependant, les mécanismes biologiques à l’origine de ces effets favorables restent encore insuffisamment compris. Une meilleure connaissance de ces phénomènes est indispensable pour sécuriser, optimiser et étendre l’utilisation de ces nouvelles modalités de traitement. Ainsi, l’objectif principal de ce projet est d’améliorer la compréhension des réponses biologiques induites par cette approche innovante, en s’intéressant plus particulièrement aux réactions des vaisseaux et du système immunitaire. Ces connaissances permettront d’évaluer le potentiel thérapeutique de cette stratégie et de contribuer à terme au développement de traitements plus efficaces et mieux tolérés.
Bénéfices attendus
Les enjeux autour de ces nouvelles techniques de radiothérapie (SFRT) sont nombreux : • Anticiper leur déploiement rapide, voire imminent, en pratique clinique. • Questionner la justification de ce type de techniques en termes de radioprotection des patients, puisqu’elle repose sur un changement de paradigme important. • Saisir l’opportunité du positionnement de l’institut et de la France autour de cette question Acquérir des connaissances et des compétences autour des concepts liés aux modifications du volume d'irradiation pour alimenter l’expertise concernant la radioprotection des patients.
Procédures
- Irradiations sous anesthésie - Prélèvements de sang sous anesthésie - Imagerie scanner sous anesthésie - Echo doppler sous anesthésie Pour chaque intervention préciser : durée, nombre de fois et nombre d’animaux concernés
Impact sur les animaux
Des effets indésirables pourront être occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Pour le modèle souris, les irradiations localisées au niveau des poumons pourront conduire à de la fibrose radio-induite aux temps tardifs (plus de trois mois post-irradiation). Les souris pourront également développer des lésions cutanées (rougeurs, érythèmes, croutes) suite à l’irradiation. Aux temps les plus tardifs de l’étude (5-6 mois post-irradiation), les animaux pourraient être en détresse respiratoire voire décéder. Les animaux devront donc être surveillés de près et euthanasiés en cas d’atteinte importante de leur bien-être, comme une perte de poids, une mobilité réduite. Concernant le modèle d’irradiation localisée cérébrale chez le rat, suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours). Pour les deux modèles, compte-tenu de l’objectif qui est d’étudier la réponse vasculaire pulmonaire de ces nouvelles stratégies thérapeutiques, il est nécessaire de fixer un temps d’étude long, ici de 6 mois, pour toutes les études envisagées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, les organes d’intérêt (poumon, cerveau notamment) seront prélevés pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et immunitaires dans leur environnement tissulaire complet, qui joue un rôle sur la réponse moléculaire des cellules. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude des lésions pulmonaires et cérébrales tardives radio-induites sont fortement influencés par la physiologie des animaux. Dans le but d’effectuer des tests statistiques sur les analyses histologiques, des microscanners, des analyses moléculaires, des groupes de 20 animaux sont nécessaires. Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide d’un logiciel statistique. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 20 animaux par groupe. Dans certains cas, le nombre d’animaux contrôle est augmenté car toutes les irradiations ne peuvent pas être réalisées le même jour. Les animaux seront suivis 6 mois maximum.
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Tous les animaux du projet seront surveillés afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin Ils seront pesés 2 fois par semaine semaines après l’irradiation. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, de réactivité, prostration, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation de signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera l’euthanasie. Lors des irradiations, afin d’assurer un meilleur réveil, les animaux seront placés en thermacage dès la fin de l’irradiation. Des poches d’eau gélifiées ainsi que des croquettes seront également placés dans les cages de transport. Les souris pouvant montrer des signes d’agressivité, des enrichissements supplémentaires seront mis dans les cages (bâtonnet en bois, dôme en carton, coton, papier kraft si nécessaire).
Choix des espèces
Dans le cadre de ce projet nous utiliserons des rats et des souris qui sont des modèles les plus utilisés pour les modèles précliniques. Le modèle d’irradiation thoracique chez la souris est un modèle très utilisé depuis de nombreuses années au sein du laboratoire pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions pulmonaires radio-induites. Le modèle d’irradiation cérébrale rat est un modèle maitrisé par nos collaborateurs du projet qui participeront aux expériences. Nous choisissons des animaux de même âge, et jeunes adultes, pour éviter l’éventuelle hétérogénéité de la réponse liée à l’âge. Il s’agit de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée. Comme tenu du potentiel caractère agressif des souris mâles, notamment en vieillissant, ils seront hébergés par 3 à 4 avec un enrichissement augmenté par rapport aux standards de l’animalerie. En cas de bagarres et/ou de blessures, les animaux pourront être hébergés en cages individuelles.
Acclimatement et désacclimatement au stress induit par l’oxygène hyperbare, en plongée chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Placées dans un caisson hyperbare jusqu'à des pressions de 5 ou 6 atmosphères d'oxygène pur pendant deux heures au maximum, 156 souris vont subir des crises convulsives, dans des procédures classées au niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang et des tissus. Trois groupes reçoivent en plus une injection intrapéritonéale quotidienne pendant cinq jours, et l'ensemble des animaux passe par un prélèvement sanguin au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur classe le déclenchement de la crise convulsive en "gravité légère ?", point d'interrogation compris, en avançant que "l'expérience humaine nous apprend qu'elles sont indolores", alors que le projet entier est déclaré en gravité sévère. La finalité est militaire, permettre aux nageurs de combat de l'armée française de plonger à l'oxygène pur sans compromettre leur mission.
Objectifs
Dans le cadre de ses opérations, l’armée française demande à ses nageurs de combat d’effectuer des plongées à l’oxygène pur, or ce gaz lorsque respiré à une pression supérieure à 1.7 atmosphère peut provoquer des crises hyperoxiques susceptibles de compromettre la mission et faisant courir un risque de noyade au plongeur. Les effets neurologiques de l’oxygène hyperbare sont connus depuis la fin du XIX siècle et les travaux de Paul Bert ; ils se traduisent par l’apparition de convulsions similaires à celles observées lors de crises épileptiques. Ces crises, indolores, se résolvent rapidement si la pression d’oxygène est réduite. Elles ont été caractérisées chez l’homme et l’animal (sans que le mécanisme en soit clairement identifié) mais la question de l’acclimatement à de fortes pressions d’oxygène reste non étudiée. L‘hypothèse d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare a été suggérée dans quelques articles scientifiques sans qu’aucune étude n’ait encore permis de le confirmer. Si elle s’avérait fondée, elle pourrait constituer une avancée pour améliorer la sécurité des nageurs de combat. La présente étude a pour objectif de déterminer, chez la souris : 1- si un acclimatement à l’oxygène hyperbare est possible et 2- d’étudier les mécanismes physiologiques à l’origine des crises hyperoxiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de vérifier l’existence d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la crise hyperoxique. Ces travaux pourront être bénéfiques pour les forces armées françaises dans le cadre opérationnel de la plongée à l’oxygène pur. Il aura aussi un intérêt en santé humaine dans le cadre de l’oxygénothérapie hyperbare utilisée en clinique humaine. L’oxygénothérapie hyperbare consiste à faire respirer de l’oxygène pur à un patient placé dans une chambre où la pression est supérieure à celle atmosphérique normale (généralement entre 2 et 3 ATA). Dans ces conditions, il existe un risque de déclenchement de crise hyperoxique chez le patient, or l’oxygénothérapie hyperbare est indiquée dans de nombreuses pathologies (intoxication au monoxyde de carbone, gangrène gazeuse, infections nécrosantes des tissus mous, ulcères et plaies rebêles à la cicatrisation, surdité idiopathique, prise de lambeaux de greffe …). Une meilleure compréhension du déclenchement de la crise hyperoxique permettrait une meilleure prise en charge de ces patients.
Procédures
Les souris seront contentionnées une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Dans le cadre de la procédure 2, deux semaines après, ils seront acclimatés à l’oxygène en étant placés dans le caisson hyperbare pour des durées de 30 à 110 minutes à des pressions partielles d’oxygène comprises entre 0.21 et 3.5 atmosphères selon les groupes expérimentaux. Dans le cadre de la procédure 4, trois groupes d’animaux seront injecté quotidiennement sur une période de 5 jours par voie intrapéritonéale (1 à 2 min). Les groupes de souris seront soumis à une plongée simulée en oxygène pur jusqu’à des pressions de 5 ou 6 atmosphères, pour une durée maximale de 120 minutes.
Impact sur les animaux
nces ou effets indésirables attendus sur les animaux Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée), (2) : le stress lié à la réalisation des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 1-2 minutes, réalisé 1 fois sur l’ensemble du projet à l’âge de 10 semaines) (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée simulée (acte de gravité légère, d’une durée totale maximale de 2h30 correspondant au temps de l’exposition hyperbare) (4) : le stress induit par le déclenchement d’une crise convulsive (gravité légère ? ces nuisances très brèves, moins de 1 minute, et l’expérience humaine nous apprend qu’elles sont indolores).
Devenir
Les 156 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Notre travail porte sur l’étude des effets de fortes pressions partielles de gaz. Le manque de connaissances sur les mécanismes à l’origine de la crise hyperoxique et l’absence de marqueurs prédictifs de ces crises ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé en s’appuyant sur les données disponibles dans la littérature. Les effectifs de chaque groupe correspondent ainsi au nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Tout au long des procédures, le remplissage quotidien d’une grille de score et l’identification de points limites prédictifs et spécifiques au projet permettront de satisfaire au bien-être de l’animal. Toute la procédure expérimentale sera réalisée par des personnes formées et habituées à travailler sur des protocoles de plongée simulée chez la souris. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une grille de score adaptée. Le protocole utilisé limite au maximum la durée des crises hyperoxiques en décomprimant les animaux rapidement.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude des effets de l’oxygène hyperbare. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, nous permettant de cibler les pressions et temps d’exposition et ainsi de réduire le nombre de groupes utilisés. Nous possédons en outre des données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ces résultats. Le contexte de cette étude est le maintien opérationnel des nageurs de combat en condition de plongée à l’oxygène pur. Les plongeurs concernés sont de jeunes adultes. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale – 2/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 120
Moutons : 120
Bovins : 40
300 cochons, moutons, bovins et chiens vont être utilisés dans la seconde moitié de ce projet de robotique chirurgicale, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils sont mis à jeun de 6 à 16 heures selon l'espèce, cathétérisés, opérés sous anesthésie générale, certains recevant un implant dont la tenue sera évaluée par imagerie, nécropsie et histopathologie. Le porteur qualifie l'expérimentation sur "l'organisme entier" d'"incontournable" et rappelle qu'il s'agit d'une obligation réglementaire pour les dispositifs médicaux implantables. Le choix des espèces suit des critères anatomiques, les moutons pour leur croissance limitée à l'âge adulte, les bovins pour la taille de leurs organes, les chiens quand ils sont seuls à présenter l'auricule gauche avec ostium, la conduction cardiaque, la prostate bilobée ou la fovéa recherchées.
Objectifs
Les systèmes de robotique chirurgicale sont des dispositifs médicaux destinés à assister ou réaliser des gestes opératoires avec une très grande précision. Ils améliorent l’ergonomie du chirurgien, la stabilité des instruments, la reproductibilité des gestes et la sécurité du patient. Ces technologies reposent sur l’association de bras robotisés, de systèmes de visualisation de haute qualité, de logiciels de planification et de contrôle, ainsi que d’instruments intelligents. La chirurgie robot-assistée connaît un essor important dans de nombreuses spécialités, notamment l’urologie, la gynécologie, la chirurgie digestive, thoracique, orthopédique et la neurochirurgie. Ces plateformes permettent de réaliser des gestes complexes grâce à une meilleure dextérité, à la réduction des tremblements et à un accès facilité à des zones anatomiques difficiles. L’intégration d’outils numériques, tels que la navigation chirurgicale, l’imagerie per-opératoire et l’intelligence artificielle, contribue à optimiser les procédures et à améliorer les résultats cliniques. La robotique est également utilisée dans des actes très spécialisés, comme la chirurgie de précision, la chirurgie guidée par l’image et certaines procédures percutanées. Son caractère mini-invasif permet de réduire les pertes sanguines, la douleur post-opératoire, les risques infectieux et la durée d’hospitalisation, tout en favorisant une récupération plus rapide des patients. Le développement de nouvelles plateformes robotiques et d’instruments chirurgicaux nécessite une phase de recherche et développement rigoureuse. Les prototypes doivent être évalués dans des modèles précliniques animaux afin de reproduire au mieux les conditions anatomiques, fonctionnelles et cliniques des futures applications humaines. Ces études servent à valider la faisabilité technique, les performances mécaniques, la précision des gestes et la sécurité des dispositifs. Le projet poursuit deux objectifs : d’une part, optimiser et fiabiliser les prototypes jusqu’à obtenir des versions démontrant leur efficacité et leur innocuité ; d’autre part, engager ces versions dans un processus de validation réglementaire conforme aux normes applicables (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58). Ce projet de recherche se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).
Bénéfices attendus
L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. La période d'acclimatation d'une durée de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale assistés par la robotique avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales ainsi que les administrations de soins pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans l' EU 1/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés y compris de traitements permettant une analgésie par voie locale, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Cette estimation répond à différents paramètres et en premier lieu aux besoins de la démarche expérimentale spécifique de mise au point et de raffinement des prototypes de dispositifs, puis de validation et d’évaluation des versions des dispositifs jugées efficaces et sécuritaires, mais aussi de l’expérience du laboratoire sur d’autres projets avec ce même type d’approche, elle répond enfin à un besoin de développement et d’évaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Dans ce projet les canins seront utilisés plus rarement que les porcins, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’Homme (entre autres exemples: auricule gauche avec ostium, conduction du tissu cardiaque, prostate bilobée, une fovéa centralis développée...). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs doivent être testés sur des gros animaux avec une anatomie semblable à l’Homme avec les mêmes dimensions et processus de réparation tissulaire, de cicatrisation et compatibles avec l'utilisation d'équipements de chirurgie et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés. Pour chaque dispositif évalué, le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent sera utilisé : - Les ovins pour la durabilité des dispositifs testés, son intérêt principal est sa croissance limitée une fois adulte. - Les porcins seront utilisés pour la robotique digestive ou oculaire par exemple. - Les bovins pour les intérêts anatomiques et fonctionnels liés à la taille de ses organes, au débit élevés des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire), - Les canins lorsqu’ils sont les seuls à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle recherchée (par exemple: auricule gauche avec ostium, conduction du tissu cardiaque, une prostate bilobée, une fovéa centralis développée...). Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale – 1/2
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Cochons : 120
Moutons : 120
Bovins : 40
Valider des prototypes de robots chirurgicaux et des dispositifs implantables avant leur mise sur le marché : 300 cochons, moutons, bovins et chiens vont être utilisés dans la première moitié de ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils subissent des prélèvements sanguins hebdomadaires, la pose d'un cathéter, puis des interventions chirurgicales sous anesthésie générale pouvant durer plusieurs heures, avec parfois l'induction volontaire d'une lésion avant de tester le dispositif. Le porteur affirme que les animaux subiront exactement les mêmes nuisances qu'"un futur patient humain", tout en prévoyant une douleur postopératoire de plusieurs jours selon l'invasivité de la technique. L'effectif de 300 animaux repose sur l'expérience du laboratoire et sur les besoins de mise au point des prototypes, le RNT précisant qu'"aucune approche statistique n'a été réalisée".
Objectifs
Les systèmes de robotique chirurgicale sont des dispositifs médicaux destinés à assister ou réaliser des gestes opératoires avec une très grande précision. Ils améliorent l’ergonomie du chirurgien, la stabilité des instruments, la reproductibilité des gestes et la sécurité du patient. Ces technologies reposent sur l’association de bras robotisés, de systèmes de visualisation de haute qualité, de logiciels de planification et de contrôle, ainsi que d’instruments intelligents. La chirurgie robot-assistée connaît un essor important dans de nombreuses spécialités, notamment l’urologie, la gynécologie, la chirurgie digestive, thoracique, orthopédique et la neurochirurgie. Ces plateformes permettent de réaliser des gestes complexes grâce à une meilleure dextérité, à la réduction des tremblements et à un accès facilité à des zones anatomiques difficiles. L’intégration d’outils numériques, tels que la navigation chirurgicale, l’imagerie per-opératoire et l’intelligence artificielle, contribue à optimiser les procédures et à améliorer les résultats cliniques. La robotique est également utilisée dans des actes très spécialisés, comme la chirurgie de précision, la chirurgie guidée par l’image et certaines procédures percutanées. Son caractère mini-invasif permet de réduire les pertes sanguines, la douleur post-opératoire, les risques infectieux et la durée d’hospitalisation, tout en favorisant une récupération plus rapide des patients. Le développement de nouvelles plateformes robotiques et d’instruments chirurgicaux nécessite une phase de recherche et développement rigoureuse. Les prototypes doivent être évalués dans des modèles précliniques animaux afin de reproduire au mieux les conditions anatomiques, fonctionnelles et cliniques des futures applications humaines. Ces études servent à valider la faisabilité technique, les performances mécaniques, la précision des gestes et la sécurité des dispositifs. Le projet poursuit deux objectifs : d’une part, optimiser et fiabiliser les prototypes jusqu’à obtenir des versions démontrant leur efficacité et leur innocuité ; d’autre part, engager ces versions dans un processus de validation réglementaire conforme aux normes applicables (ISO 10993, BPL OCDE, GLP FDA 21 CFR part 58). Ce projet de recherche se déroulera dans deux Etablissements Utilisateurs (EU 1/2 et 2/2).
Bénéfices attendus
L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité, de l’efficacité et de la sécurité des implants pour améliorer leur tolérance et éviter leur rejet et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire, corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients avec des durées d'hospitalisation et de convalescence réduites.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. La fréquence des prélèvements pouvant être couramment d’un prélèvement par semaine et d'une durée de moins de cinq minutes - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. La période d'acclimatation d'une durée de 7 jours se fera dans l'EU 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale assistés par la robotique avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales ainsi que les administrations de soins pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans l' EU 1/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins, de 6 à 12 heures pour les chiens) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive, - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale avec prise en charge multimodale de l'analgésie per, et post-opératoire avec l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés y compris de traitements permettant une analgésie par voie locale, la protection et la surveillance des plaies, la surveillance du reveil d'anesthésie dans des espaces calmes et spécialement aménagés avec évaluation et scoring de la douleur réguliers, ou la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux avec surveillance des signes de douleur par des Techniciens spécialement formés supervisés par des Véterinaires).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des scanners, IRM par exemple) et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. Les différences interspécifiques de la nature tissulaire, de la forme, de la taille anatomique et aussi de la fonction requièrent l’emploi de plusieurs espèces différentes pour optimiser l’expérimentation et l’évaluation des dispositifs évalués dans ce projet. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur l'animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Cette estimation répond à différents paramètres et en premier lieu aux besoins de la démarche expérimentale spécifique de mise au point et de raffinement des prototypes de dispositifs, puis de validation et d’évaluation des versions des dispositifs jugées efficaces et sécuritaires, mais aussi de l’expérience du laboratoire sur d’autres projets avec ce même type d’approche, elle répond enfin à un besoin de développement et d’évaluation de l’efficacité, de l’innocuité et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs en robotique chirurgicale. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Dans ce projet les canins seront utilisés plus rarement que les porcins, lorsqu’ils sont le seul modèle à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle la plus proche de l’Homme (entre autres exemples: auricule gauche avec ostium, conduction du tissu cardiaque, prostate bilobée, une fovéa centralis développée...). Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateaux techniques opératoires et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (AINS et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées ayant reçu une autorisation AT1 délivrée par la DDPP, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis antidérapants ou cages de transport, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV) et le transport est validé par un Vétérinaire. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs doivent être testés sur des gros animaux avec une anatomie semblable à l’Homme avec les mêmes dimensions et processus de réparation tissulaire, de cicatrisation et compatibles avec l'utilisation d'équipements de chirurgie et d'imagerie standards utilisés chez l'Homme. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés. Pour chaque dispositif évalué, le modèle animal préalablement identifié comme le plus pertinent sera utilisé : - Les ovins pour la durabilité des dispositifs testés, son intérêt principal est sa croissance limitée une fois adulte. - Les porcins seront utilisés pour la robotique digestive ou oculaire par exemple. - Les bovins pour les intérêts anatomiques et fonctionnels liés à la taille de ses organes, au débit élevés des dispositifs cardiovasculaire potentiellement testés dans ce projet (robotique chirurgicale utilisée pour la chirurgie cardiovasculaire), - Les canins lorsqu’ils sont les seuls à présenter la spécificité anatomique ou fonctionnelle recherchée (par exemple: auricule gauche avec ostium, conduction du tissu cardiaque, une prostate bilobée, une fovéa centralis développée...). Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Restauration d’une ovogenèse fonctionnelle chez des souris infertiles par une nouvelle thérapie in vivo 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Les souriceaux chez qui apparaît un phénotype jugé dommageable sont mis à mort aussitôt, et la lignée entière peut l'être. 594 souris vont être utilisées, 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 72 d'un niveau léger, pour tester une injection d'ARN messager dans l'ovaire censée restaurer la fertilité. Les mâles subissent une vasectomie de trente minutes puis sont utilisés pendant un an pour rendre des femelles pseudo-gestantes, les femelles reçoivent deux injections hormonales puis une chirurgie de vingt minutes pour la réimplantation d'embryons, ou une chirurgie de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne. Le porteur affirme que "l'infertilité en elle-même n'entraîne pas d'effet indésirable pour les animaux", alors que les femelles sont tuées pour la récupération de leurs ovocytes et que les ovaires sont prélevés pour vérifier la restauration. Une partie des souris pseudo-gestantes est gardée en vie pour l'allaitement ou pour des tests menés par d'autres utilisateurs.
Objectifs
La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.
Bénéfices attendus
Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.
Procédures
Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.
Impact sur les animaux
Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).
Devenir
La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.
Remplacement
L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.
Réduction
Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.
Raffinement
Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique
Choix des espèces
Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.