Maladies animales

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinq lots, ils sont inoculés par voie nasale avec trois nouvelles souches du virus du syndrome dysgénésique et respiratoire porcin ou une souche de référence, puis subissent quatorze écouvillonnages nasaux et prises de sang. Le porteur indique attendre une fièvre transitoire et une baisse d'appétit, peut-être des troubles respiratoires, et prévoit la mise à mort de tous les animaux pour un examen des lésions. Il affirme que le modèle in vitro sur macrophages ne suffit pas et que le recours au porc reste "obligatoire" pour évaluer la pathogénicité des souches.

Objectifs

Le Syndrome Dysgénésique et Respiratoire Porcin (SDRP) est une maladie virale spécifique des porcins. L’infection par le virus du SDRP (SDRPV) induit des troubles de la reproduction chez les femelles gestantes, et des problèmes respiratoires et des retards de croissance chez les porcelets qui s’accompagnent d’une dégradation du bien-être des animaux. En raison de sa capacité à réduire les défenses immunitaires de son hôte, ce virus favorise les co-infections virales et bactériennes au niveau respiratoire chez les porcs en croissance. Ainsi, les animaux des élevages infectés par le SDRPV sont plus souvent malades et consomment plus d’antibiotiques. La lutte contre le SDRP en élevage fait appel essentiellement à la vaccination à l’aide de vaccins vivants qui ont démontré leur efficacité pour limiter les troubles de la reproduction et respiratoires. Cependant, sur le terrain, des difficultés à contrôler la transmission virale à l’aide de ces vaccins sont souvent rencontrées. Ainsi, depuis plusieurs années, des recherches sont menées pour évaluer les modes de propagation des souches SDRPV présentes dans les élevages de porcs et cherche à identifier les facteurs qui pourraient diminuer l’efficacité vaccinale. Pour cela, un modèle expérimental d’infection de porcelets exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) a été développé mais la souche de référence utilisée induit très peu de clinique chez ces animaux : aucun symptome respiratoire, peu de fièvre et quelques retards de croissance individuels, qu’on ne retrouve pas toujours à l’échelle du groupe. De même, à l'autopsie, des lésions pulmonaires sont rarement observées. Ceci constitue une limite du modèle, réduisant la démonstration d’efficacité vaccinale aux seuls paramètres virologiques. C’est pourquoi l’objectif de cette étude est d’évaluer, chez des porcelets EOPS, l'infection par 3 souches de SDRPV plus récentes, en comparaison de celle par la souche de référence habituelle, afin d’identifier une nouvelle souche permettant de faire évoluer le modèle vers une manifestation de la maladie plus marquée.

Bénéfices attendus

Si au moins une des 3 nouvelles souches de SDRPV évaluées dans ce projet permet d’observer davantage de signes cliniques et/ou une multiplication virale plus importante qu’avec la souche de référence, les résultats de cette étude nous permettront de la remplacer dans le modèle d’infection SDRPV. Celui-ci deviendrait alors plus pertinent pour évaluer l'efficacité des vaccins.

Procédures

Les animaux (n total = 30) recevront à J0 par voie intranasale du SDRPV (4 lots de 6 porcs : « SDRPV A », « SDRPV B », « SDRPV C » et « SDRPV REF ») ou du milieu de culture (lot Témoin) ; une inoculation intranasale prend moins de 30 secondes par animal. Les animaux (n total = 30) seront soumis à 14 écouvillonnages nasaux et prises de sang sur animal vigile ; ces prélèvements ne durent que quelques secondes.

Impact sur les animaux

L’inoculation de la souche de référence de SDRPV par voie intranasale induit un stress pour l’animal au moment de l’inoculation mais peu de signes cliniques apparaissent par la suite, se résumant généralement à une fièvre transitoire et modérée accompagnée d’une légère baisse d’appétit. Avec les nouvelles souches, il serait possible d’observer ces signes de façon un peu plus marquée, éventuellement accompagnés de quelques troubles respiratoires. Selon la gravité des symptômes, un suivi rapproché des animaux sera mis en place.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’évaluer la présence de lésions induites par l’infection des différentes souches de SDRPV et de quantifier le virus présent dans différents tissus prélevés lors de l’examen nécroscopique.

Remplacement

Le modèle d’infection in vitro des macrophages alvéolaires porcins par le SDRPV peut permettre de comparer les cinétiques de réplication de différentes souches virales. Ainsi la vitesse de multiplication d’une souche in vitro peut présenter un lien avec son niveau de virulence. Néanmoins, pour évaluer la pathogénicité des souches de virus du SDRP, le recours au modèle porc reste obligatoire.

Réduction

Afin de réduire le nombre de groupes et donc d’animaux à utiliser, une étude préliminaire in vitro de comparaison des cinétiques de réplication (sur macrophages alvéolaires porcins) a été réalisée pour 5 nouvelles souches en parallèle de la souche de référence. Cette étude permettra de pré-sélectionner les 3 souches avec les cinétiques de réplication les plus rapides qui seront évaluées in vivo. Pour répondre aux objectifs de l’étude in vivo, il est nécessaire d’inclure 5 lots d’animaux, 3 lots inoculés par chacune des 3 souches SDRPV à évaluer, 1 lot témoin positif, inoculé avec la souche SDRPV de référence, qui sera notre base de comparaison, et 1 lot témoin négatif, inoculé avec du milieu de culture. Tous les lots comporteront 6 animaux chacun de façon à avoir des données statistiques fiables.

Raffinement

Chaque lot sera logé dans une animalerie différente contenant 2 parcs hébergeant chacun 3 porcs. Les animaux seront élevés en groupes stables au cours de toute la durée du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes et des plaques de couchage dans les jours qui suivent le sevrage. Enfin, les porcs auront à leur disposition des matériaux manipulables qui seront renouvelés au cours de l’expérimentation. Après chaque prélèvement, une récompense type grenadine sera distribuée aux animaux. Une attention particulière sera apportée au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale. Si les animaux manifestent des signes cliniques graves (atteinte d’un point limite), ils seront mis à mort après concertation avec les personnes responsables de la mise en œuvre du projet.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible du SDRPV Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et inoculés à 6 semaines d’âge. Cet âge correspond à la période de post-sevrage, à un moment transitoire où le système immunitaire devient mature, période propice aux infections SDRPV.

96 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Inoculées avec le virus de la maladie de Marek, elles subissent huit prélèvements de sang et trois prélèvements de plumes, et le porteur indique s'attendre à ce que la majorité développe la maladie, avec fièvre, paralysie, lymphome, perte de plumes ou mort subite. Les oiseaux sont hébergés en isolateurs qui restreignent leurs mouvements, et ceux présentant des symptômes graves sont euthanasiés après confirmation du diagnostic. Le porteur affirme qu'aucune approche in vitro ne permet d'étudier la latence virale et qu'aucun autre modèle animal ne convient, ce virus n'infectant que les gallinacés.

Objectifs

Le virus de la maladie de Marek est un herpès virus aviaire hautement contagieux et entrainant des lymphomes mortels pour les animaux dans un délai de quelques semaines. Ce virus est actuellement sous contrôle grâce à des protocoles de vaccination très stricts, bien que ceux-ci ont montré des failles dans les dernières années. Ce virus est également un outil en recherche biomédicale de par son côté modèle d’oncogenèse viro-induite. L’objectif de ce projet est d’approfondir les connaissances sur l’oncogenèse induite par ce virus. Alors que celle-ci a été longtemps réduite au résultat de l’expression d’un facteur de transcription viral dérégulant la biologie cellulaire des cellules infectées de manière latente, les découvertes successives d’acides ribonucléiques (ARN) non-codants impactant le cycle viral et l’oncogenèse viro-induite ont remis en cause ce modèle. Dans le cadre de ce projet, nous proposons qu’un ARN non-codant nouvellement découvert et encodé à partir du même gène permettant l’expression de l’oncogène majeur du virus puisse avoir un impact sur l’apparition de la lymphomagenèse. Pour répondre à cette question deux virus OGM ont été produits en laboratoire et testés in vitro avant cette approche in vivo. L’approche in vitro a montré ses limites car l’effet est suspecté de se produire durant la latence du virus, qui n’est pas observable dans les modèles cellulaires. Ce projet nécessitera au maximum l’utilisation de 96 poules.

Bénéfices attendus

L’étude de l’impact de l’ARN circulaire étudié sur l’oncogenèse requiert un volet in vivo pour répondre à la question de recherche. Actuellement, et depuis leur première description en 2018, aucun ARN circulaire viral n’a été décrit pour ses rôles promouvant l’oncogenèse viro-induite in vivo. Le virus de la maladie de Marek est un modèle adéquat pour investiguer ce pan inexploré de l’oncogenèse viro-induite. Au travers de ce projet, nous espérons comprendre le rôle de l’ARN circulaire associé au locus de l’oncogène majeur du virus de la maladie de Marek. Les bénéfices sont donc à répartir sur plusieurs niveaux : 1- Maladie de Marek : Meilleure compréhension du cycle viral et de la tumorigenèse viro-induite 2- Biologie moléculaire : Descriptions de nouvelles fonctions des ARN circulaires, notamment viraux 3- Virologie : Description d’un pan très récent de la virologie.

Procédures

une inoculation de virus sur animaux vigiles + 8 prélèvements de sang sur animaux vigiles + 3 prélèvements de plumes sur animaux vigiles. Durée de chaque acte : moins d’une minute.

Impact sur les animaux

1/ L’hébergement des animaux en isolateurs est nécessaire dans le cadre des recherches portant sur le virus de la maladie de Marek. Cependant, l’hébergement en isolateurs peut induire une compétition sur les ressources alimentaires en fonction de la fréquence des nourrissages. Ce type d’hébergement réduit également la liberté de mouvement des animaux. 2/ La maladie de Marek est une maladie virale hautement contagieuse et fatale pour la majorité des animaux infectés. Il est attendu que la majorité des animaux de l’étude soient atteints de la maladie durant le temps de l’étude. Parmi les symptômes possibles : fièvre, paralysie, mort subite, lymphome, perte de poids, perte de plumes, difficultés respiratoires, ailes pendantes, boiterie. 3/ Les prises de sang et prélèvements de plumes entraineront un stress récurrent chez les animaux concernés. Ces manipulations entraineront également des douleurs ponctuelles : un animal dont la contention serait mal assurée pourrait se faire mal ou se blesser ; l’injection intramusculaire peut entrainer une douleur au niveau du site d’injection et les prises de sang peuvent être sources d’hématomes au site de prélèvement. Les prélèvements de plumes entrainent une douleur ponctuelle pour l’animal.

Devenir

En fin d’expérience, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser différents prélèvements d'organes et de plumes.

Remplacement

Il est impossible de remplacer le modèle par des approches in vitro ou in silico car les méthodes actuelles n‘offrent qu‘une approche limitée de la maladie. Notamment, il n‘est pas possible d‘étudier in vitro la latence virale, responsable de la lymphomagenèse. L’utilisation d’un autre modèle animal, moins sensible, est également impossible car cet herpès virus n’infecte que les gallinacés.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque lot a été établi afin d’être en conformité avec le principe de réduction des règles de bien-être animal et de manipuler un nombre d’échantillons suffisants pour établir si les différences mesurées entre lots sont statistiquement significatives et donc non dus au hasard. Les meilleurs tests statistiques seront appliqués dans les comparaisons des différents groupes pour permettre un traitement optimal des données.

Raffinement

Une visite des animaux est effectuée 2 fois par jour par le personnel technique qualifié afin de détecter l’apparition de symptômes de la maladie ou tout autre signe anormal lié à la santé et au bien-être des animaux. Les animaux présentant des symptômes graves de la maladie de Marek seront euthanasiés après confirmation du diagnostic par le responsable du projet. Les animaux présentant des symptômes légers feront l’objet d’une surveillance accrue pour détecter l’apparition de nouveaux symptômes. L’ensemble des gestes techniques est assuré par du personnel formé et compétent, ce qui limitera le stress des animaux. La contention est effectuée en douceur et les prélèvements sont le plus rapide possible. Les prélèvements de plumes et de sang sont réalisés simultanément pour limiter le stress. Le nombre de prélèvements a été réduit au minimum et espacés au minimum de 7 jours pour limiter la manipulation et la souffrance liées aux prélèvements répétés. Dans le cas des prélèvements de plumes, de petites plumes seront prélevées, ce qui limite la douleur par rapport aux prélèvements de plus grosses plumes. Afin de limiter la douleur lors de l’inoculation du virus, nous utiliserons des seringues avec des aiguilles fines et courtes. Les injections seront réalisées sous PSM (poste sécurité microbiologique) avant l’entrée des animaux dans les isolateurs afin de faciliter la manipulation, notamment la contention des animaux et ainsi rendre l’injection plus simple et moins stressante pour les animaux. des vers de farine seront testés comme aliment de récompense après les prélèvements. Des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Le virus de la maladie de Marek ne provoque des lymphomes que chez les gallinacés. L’utilisation de la race choisie permet d’obtenir des effets plus importants et donc, de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude. De plus, chaque année, malgré la vaccination, des élevages de poulets présentent des cas de maladie de Marek malgré la vaccination. Cela peut être dû à une mauvaise vaccination, à des souches hypervirulentes ou à des environnements très contaminés. Pour des raisons techniques, les poulets seront infectés à l’âge de 14 jours. Ils seront euthanasiés à maximum 75 jours d’âge. L’âge d’inoculation de 14 jours a été déterminé car il permet de commencer les prélèvements sanguins dès le début de l’expérience, tout en restant suffisamment sensible à la maladie pour obtenir des résultats robustes en un minimum de temps.

42 chiens de moins de 11 kg vont être utilisés, tous réutilisables ensuite pour d'autres procédures, dans des actes impliquant un niveau de souffrance modéré. Sans chirurgie ni anesthésie, ils reçoivent un comprimé vétérinaire par voie orale puis subissent dix-neuf prélèvements sanguins en quarante-neuf jours, pour comparer des formulations d'un même principe actif. Le porteur indique que l'effectif et le protocole sont fixés par le "Donneur d'Ordre" selon les recommandations réglementaires. L'objectif est la mise sur le marché d'un nouveau médicament vétérinaire.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'étudier la pharmacocinétique de différentes formulations d'un produit vétérinaire canin à base du même principe actif chez le chien de moins de 11kg.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra le développement et la mise sur le marché d’un nouveau médicament vétérinaire avec la formulation optimale pour le traitement des animaux.

Procédures

Pour l’ensemble des 42 chiens aucune intervention chirurgicale n’est prévue ni procédure d’anesthésie. Les interventions planifiées sont les suivantes : • Examen clinique sur animaux vigiles à l’inclusion puis 2 fois au cours de l'étude • Administration unique d'un comprimé par voie orale sur animaux vigiles • Prélèvements sanguins sur animaux vigiles à 19 reprises en 49 jours

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu de dommage durable ou d’effet secondaire grave suite à l’administration du traitement dans ce projet car l’absence de toxicité du principe actif testé a préalablement été vérifiée par le Donneur d'Ordre.

Devenir

Suite à un repos suffisant et sur avis du vétérinaire, tous les animaux peuvent être réutilisés pour une autre procédure expérimentale

Remplacement

L'utilisation de chiens sur ce projet est justifiée car ils représentent l’espèce cible du produit et qu'il n’existe pas de méthode alternative pour ce type de test.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet est de 42 chiens ce qui correspond au minimum requis pour répondre à l’objectif. En effet le projet sera mené sur 7 groupe de 6 chiens. Ce nombre d’animaux par groupe est défini par le Donneur d’Ordre selon les recommandations en vigueur dans le pays pour lequel les tests sont menés comme les lignes directrices de l’agence européenne du médicament ou les monographies de pharmacopée européenne relative au produit testé.

Raffinement

Les volumes administrés sont en accord avec les recommandations du Gircor. La pharmacocinétique reposera sur des prélèvements sanguins dont la fréquence et le volume des prélèvements seront déterminés en fonction du respect du bien-être et de la santé des animaux et respecteront les recommandations du Gircor. Les interventions effectuées dans ce projet seront réalisées par des personnes compétentes et les techniques utilisées viseront à limiter au maximum la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Un suivi attentif des animaux sera réalisé afin de détecter tout signe de douleur ou d’inconfort au cours des tests. Des mesures adaptées de gestion de la douleur et de l’inconfort seront prises le cas échéant, et, en fonction de la gravité, la nécessité d’arrêt du test sera évaluée pour les animaux concernés.

Choix des espèces

Le chien est l’espèce du produit étudié. Chiens de poids et d’âge correspondant à celui indiqué pour le traitement.

36 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Vaccinés puis inoculés par voie trachéale avec un virus grippal sur animaux vigiles, sans anesthésie, ils subissent des écouvillonnages nasaux et des prélèvements sanguins répétés sur plusieurs semaines, avant d'être tués pour l'examen des lésions pulmonaires. Le porteur indique que l'infection provoque hyperthermie, baisse d'appétit et troubles respiratoires. Le projet vise à comprendre la diffusion d'un nouveau virus dans la filière porcine, enjeu sanitaire, "économique" et de santé publique.

Objectifs

Chez le porc, la grippe est une affection respiratoire touchant près de la moitié des élevages français. Cette infection virale a des conséquences sanitaires et économiques importantes pour la filière porcine, mais a également un impact en termes de santé publique. En effet, les virus influenza ont un caractère zoonotique, c’est-à-dire qu’ils peuvent se transmettre de l’animal à l’homme. En 2020, la surveillance des virus influenza porcins dans les élevages de porcs français a montré l’émergence d’un nouveau virus H1avN2, appelé H1avN2 #E. Ce virus est désormais responsable de la majorité des infections grippales, supplantant le virus H1avN1 qui était prépondérant depuis plus de 40 ans. L'analyse de son génome a montré de nombreuses spécificités génétiques qui pourraient avoir un impact, entre autre, sur sa virulence, sa capacité de transmission ou son échappement à la couverture vaccinale. Ce projet expérimental a trois objectifs : 1/ comparer les réponses de porcs infectés par le nouveau virus H1avN2 #E à celles observées chez des porcs infectés par le virus H1avN1, 2/ évaluer la protection conférée par le vaccin trivalent actuellement disponible sur le marché français vis-à-vis de ce nouveau virus, en comparaison à celle conférée vis-à-vis du virus H1avN1, et 3/ comparer la protection induite par une primo-infection H1avN1, à celle d’une primo-infection H1avN2 #E, vis-à-vis d’une ré-infection par un virus H1avN2 #E chez les animaux vaccinés ou non.

Bénéfices attendus

Les données obtenues aideront à comprendre pourquoi le virus H1avN2#E a pu se propager si rapidement dans la population porcine et quel est le risque potentiel pour la filière. Ce projet ne peut se faire sans un recours à l’expérimentation animale mais des travaux menés in vitro par ailleurs permettront de compléter les données obtenues ici afin d’apporter de nouvelles connaissances sur le phénotype de ce nouveau virus.

Procédures

Tous les actes prévus sur les animaux se feront sur animaux vigiles. Aucune anesthésie n’est prévue dans ce protocole lors des différentes interventions du fait de leur rapidité (moins d’une à deux minutes) et de leur caratère peu invasif. La moitié des animaux (3 lots vaccinés) recevront deux doses de vaccin contre la grippe en intramusculaire à 3 semaines d’intervalle. Une semaine après l’injection de la deuxième dose de vaccin, tous les animaux (36 animaux) recevront du virus ou du milieu de culture (lots témoins) par voie trachéale (jour 0 (J0)). Trois semaines plus tard, les animaux ayant reçu du virus seront de nouveau inoculés par voie trachéale. Les prélèvements prévus sur animaux sont : 1/ un écouvillonnage nasal à J0, J1, J3, J5, J7, J9, J11,J14, J21, J22, J24, J26, J28, J30, J32 et J35 pour les lots infectés par un virus ou à J0, J7 et J14 pour les lots témoins, 2/ un prélèvement de salive quotidien de J0 à J14 puis de J21 à J25 pour les lots infectés par un virus ou uniquement à J0, J7 et J14 pour les lots témoins, 3/ une prise de sang (2 ou 3 tubes en fonction des jours) avant la vaccination (uniquement pour les lots vaccinés) puis à J0, J7, J14 et J21, pour tous les lots, et J28 et J35 pour les quatres lots ayant reçu du virus. Le prélèvement de salive de nécessite pas de contention des animaux. Les vaccinations, les inoculations, les écouvillonnages nasaux et les ponctions sanguines nécessitent une contention des animaux. Ces actes sont réalisés par un personnel très expérimenté et sont effectués le plus rapidement possible afin de réduire au maximum le temps de contention. A l’issu de ces actes, les animaux sont récompensés par la distribution d’une friandise type sirop de grenadine.

Impact sur les animaux

Suite aux inoculations par un virus grippal, une hyperthermie transitoire est attendue, ne persistant guère plus de 2 jours, ainsi qu’une baisse d’appétit pendant les 3 - 4 jours suivant l’infection et des troubles respiratoires (dyspnée, toux, éternuements). Dans les lots vaccinés contre la grippe, moins de symptômes devraient être observés.

Devenir

Les deux lots qui ont reçu du milieu de culture ne seront pas nécessaires pour répondre au 3eme objectif ; ils seront donc mis à mort à 12 semaines de vie. Les quatre lots primo-infectés par H1avN1 ou par H1avN2 seront quant à eux re-infectés par H1avN2 et mis à mort deux semaines plus tard, soit à 14 semaines de vie. Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour pouvoir récolter des prélèvements de poumons et scorer les lésions macroscopiques pulmonaires potentiellement causées par le virus grippal.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer/comparer les manifestations cliniques, l’excrétion virale et les réponses inflammatoire, anti-virale et immunitaire (humorale et cellulaire) de l’hôte, vacciné ou non, après infection par des virus influenza. Ceci nécessite donc de passer par des expériences sur l’animal vivant, des analyses in vitro ne permettraient pas de répondre aux objectifs.

Réduction

Il est nécessaire d’avoir 6 lots d’animaux au total. En effet, pour répondre au premier objectif qui est d’étudier les réponses du porc à l’infection par ce nouveau virus, il est nécessaire d’avoir 3 lots d’animaux à comparer : 1 lot inoculé par le virus H1avN2#E, 1 lot inoculé par le virus H1avN1 et 1 lot inoculé par du milieu de culture (témoin). Le deuxième objectif de ce projet est d’évaluer la protection des animaux vaccinés (vaccin trivalent Respiporc Flu 3) vis-à-vis de ce virus, comparativement au virus H1avN1. Le même dispositif sera donc appliqué sur des animaux vaccinés. Il y aura donc : 1 lot vacciné puis inoculé par le virus H1avN2#E, 1 lot vacciné puis inoculé par le virus H1avN1 et 1 lot vacciné puis inoculé par du milieu de culture (témoin). Ainsi, ces 3 lots seront comparés entre eux mais aussi avec les 3 lots non vaccinés jusqu’à 21 jours après l’inoculation. Enfin, pour répondre au troisième objectif, les quatres lots vaccinés ou non ayant reçu du virus grippal seront de nouveau inoculés par le virus H1avN2#E 3 semaines après la 1ere inoculation. Les lots primo-infectés par le virus H1avN1 seront comparés aux lots primo-infectés par le virus H1avN2#E. Aucun lot supplémentaire ne sera nécessaire pour répondre à cet objectif. Chaque lot comprendra le même effectif, à savoir 6 animaux. Ce nombre est le minimum pour obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

L’expérimentation sera conduite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Chaque lot sera dans une animalerie différente contenant 2 parcs, soit 3 porcs par parc jusqu'à la fin du projet. Ils seront alimentés à volonté et auront accès à discrétion à de l’eau. Le confort thermique des animaux sera assuré par des lampes chauffantes. Enfin, ils auront accès à des jouets. Un soin particulier sera apporté au suivi clinique de chaque animal au quotidien pendant toute la durée de la procédure expérimentale.

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible des virus influenza porcins H1avN1 et H1avN2#E Les animaux seront sevrés à 4 semaines d’âge et auront une semaine pour s’acclimater à leur lieu d’hébergement avant la vaccination. La moitié des animaux sera vaccinée contre la grippe à 5 et 8 semaines d’âge pour que les animaux vaccinés aient développé une réponse post-vaccinale au moment de l’inoculation du virus grippal. Tous les animaux seront inoculés à 9 semaines d’âge. Cet âge correspond à la fin de la période de post-sevrage, à un moment où le système immunitaire est considéré comme mature. Suite aux projets expérimentaux d’infections grippales menés précédemment avec des animaux de différents âges, nous savons que le stade physiologique de l’animal influe sur le développement ou non des signes cliniques de la grippe. Dans nos conditions expérimentales, nous savons que des animaux de 9 semaines développent des symptômes grippaux lorsqu’ils sont inoculés par voie trachéale avec une souche H1avN1, c’est pourquoi nous prévoyons d’inoculer les animaux à cet âge (par cette même voie) afin de savoir si une souche H1avN2 #E induit ou non la même sévérité de signes cliniques. Les animaux infectés par un virus grippal seront inoculés une seconde fois avec une souche H1avN2 #E, 3 semaines après la première inoculation, une fois que la réponse immunitaire mémoire est établie.

1000 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés avec des trypanosomes, prélevés chaque jour d'une goutte de sang à la queue puis exsanguinés sous anesthésie, une partie des souris étant exposée aux piqûres de mouches tsé-tsé pour étudier la transmission. Le porteur indique que l'infection peut rendre les animaux moribonds ou prostrés, le poil hérissé, et décrit des points limites déclenchant une euthanasie précoce. Il affirme que ces souches parasitaires ne peuvent pas être maintenues in vitro et que l'hôte vivant reste nécessaire pour tester molécules et vaccins.

Objectifs

L’objectif de ce projet est donc d’amplifier des souches sanguicoles de trypanosomes (Trypanosoma brucei gambiense, Trypanosoma evansi, Trypanosoma brucei brucei, Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax) conservées en azote liquide, par passage sur souris et rats afin de a) produire des souches en quantité massive pour production d’antigènes parasitaires nécessaires aux tests de dépistage type ELISA et pour des études de caractérisation du protéome, du transcriptome et du secrétome des trypanosomes dans l’objectif de développer de nouvelles molécules afin de proposer des tests diagnostiques plus sensibles et spécifiques, b) réaliser des stabilats cryoconservés de trypanosomes pour entretien de notre cryothèque, c) réaliser des repas sanguins infectants de glossines (sur souris balb/c et génétiquement modifiées) pour étudier les modalités de la transmission vectorielle des trypanosomoses africaines humaine et animale, d) tester des molécules candidates afin de mettre au point un traitement contre les trypanosomes humaine et animale et d’étudier l’efficacité de certaines d’entre elles pour développer un vaccin anti-maladie. e) évaluer l’importance de la localisation des parasites dans le derme au cours de l’infection en fonction de l’espèce de trypanosome et valider sa valeur diagnostique.

Bénéfices attendus

Notre unité de recherche développe des approches multidisciplinaires visant à améliorer la compréhension des mécanismes infectieux dans les maladies induites par des protozoaires parasites de la famille des trypanosomatidae (les trypanosomes). Ces maladies transmises par des vecteurs (glossines essentiellement) sévissent dans des zones rurales pauvres des pays africains et constituent un obstacle majeur à l’installation humaine et au développement de l’élevage et de l’agriculture avec un fort impact socio-économique pour des populations déjà fortement appauvries. Des moyens de lutte existent, basés sur la lutte anti-vectorielle et l’utilisation d’outils diagnostiques et de traitements curatifs, mais bien qu’utilisés de façon raisonnée et intégrée, ils montrent de plus en plus leurs limites (chimiorésistances développées par les populations d’insectes et les parasites par exemple). Nos travaux s’inscrivent dans un souci d’amélioration des outils diagnostiques existants (amélioration et développement de tests de dépistages), d’identification de molécules ayant une action curative ou préventive, de mise au point d’un vaccin efficace pour protéger les populations humaines et animales et enfin, d’amélioration des outils de la lutte anti-vectorielle.

Procédures

Injections et prélèvements sanguins sur animaux anesthésiés. 40 rats et 300 souris seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes (dans certains cas une immunosuppression sera, au préalable, réalisée par injection), un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 210 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 à 10 jours maximum, une anesthésie par injection d’un mélange anesthésique sera ensuite réalisée suivi d’un repas de glossines de 10 minutes. 240 souris seront immunisées trois fois à deux semaines d’intervalle, puis seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement sur 2 mois maximum et une exsanguination sous anesthésie profonde sera ensuite réalisée. 30 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes, 90 souris seront inoculées une fois avec des souches de trypanosomes et une fois avec la molécule à tester et 30 souris seront inoculées une fois avec la molécule à tester. Sur ces 150 souris un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé quotidiennement pendant 10 jours. 60 rats seront inoculés une fois avec des souches de trypanosomes un prélèvement d’une goutte de sang à la queue sera réalisé avant l’inoculation et quotidiennement pendant 10 jours, un prélèvement de peau à 2 endroits différents sera réalisé deux fois à J4 et J10 après l’inoculation.

Impact sur les animaux

Les animaux infectés voient une parasitémie se développer dans leur sang, les nuisances vont de l'asymptomatisme à un changement d’apparence physique tel que le poil hérissé pendant plus de 3 jours, avec un aspect général moribond ou un état de prostration. Les inoculations peuvent provoquer du stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des souris et rats seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de récolter les parasites ou le sérum des animaux.

Remplacement

Les souches parasitaires que nous utilisons ne peuvent pas être maintenues in vitro, elles sont extracellulaires et se développent dans le sang de leur hôte, voire dans le derme. Ils entretiennent avec l’organisme hôte des relations étroites de nature cellulaires et chimiques nécessaires à leur développement et il nous est impossible de les reconstituer en utilisant des milieux artificiels même complémentés. De même, les mécanismes de transmission à la glossine nécessitent également l’utilisation du modèle animal. Les « tests de molécules à visées thérapeutiques et vaccinales », bien que nous mettions en place des tests in vitro et ex vivo visant à étudier leurs effets sur les cellules de l’hôte, nécessitent l’hôte pour avoir une vue d’ensemble des mécanismes complexes mis en jeu lors d’une infection. La mise en évidence de parasites dans le derme ne peut se vérifier que par le mode in vivo.

Réduction

Les animaux utilisés sont reduits au strict minimum.

Raffinement

L'espériencce des utilisateurs a permis la définition de points limites qui permettent grâce au suivi quotidien des animaux et de leur parasitémie, de procéder à l'euthanasie précoce d'un animal qui commence à présenter des signes de malêtre.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont des espèces classiquement utilisées pour la multiplication des souches de trypanosomes africains. Elles développent une infection comprise entre 3 et 10 jours post-infection en moyenne en fonction de la souche parasitaire utilisée. Le cas échéant, des souris génétiquement modifiées pourront être utilisées pour l’étude des interactions hôtes/pathogènes/vecteur. Les rats sont utilisés lorsque la quantité de parasites à produire est plus importante (cas de la production d’antigènes parasitaires). Des souris et des rats adultes seront utilisés afin d’optimiser la quantité de parasites à produire ou de sérum à récolter.

6 chevaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, conservés vivants et réaffectés ensuite à des travaux pratiques d'enseignement. Sous anesthésie générale, on leur crée des plaies cutanées sur les membres, avec deux biopsies et un séjour de deux mois au box. Le porteur indique que les désagréments tiennent aux plaies et au confinement prolongé, compensé par des promenades, et attend un pansement utilisable en clinique. Il affirme que la cicatrisation ne peut être reproduite sur cultures de cellules et qu'il faut travailler sur "l'espèce cible", le cheval ayant un métabolisme cicatriciel spécifique.

Objectifs

1. Diminuer le temps médian normal de cicatrisation par seconde intention de la peau (0.09 mm/jour, 42 jours pour une plaie de 2.5x2.5 cm) du cheval grâce à l’utilisation d’un pansement collé par rapport à une plaie non traitée pour diminuer le temps de convalescence et le coût global du traitement dans l’espèce concernée. 2. Améliorer la cicatrisation par seconde intention d’une plaie de membre chez le cheval traité par pansement collé en diminuant l’incidence de production d’un tissu de granulation exubérant.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce produit qu'il soit utilisé rapidement en clinique, pour faciliter la cicatrisation des plaies distales, pour lesquelles, actuellement, nous n'avons pas de traitement.

Procédures

Les chevaux subiront une intervention chirurgicale sous anesthésie générale qui consiste à créer des plaies cutanée de petite taille au niveau distal des membres thoraciques. Ils seront ensuite conservés au box pendant 2 mois pour la cicatrisation. L'intervention dure moins d'une heure. Lors de la chirurgie on réalise une biopsie cutanée. Après 60 jours, on réalise une seconde biopsie, sur le tissu cicatriciel, sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les animaux vont soubir deux types de désagréments : - les plaies cutanées l- le séjour prolongé de 2 mois en box

Devenir

Au terme de la cicatrisation cutanée, les chevaux pourront être conservés. Après un temps de repos, ils serviront en pédagogie, en participant à des travaux pratiques peu invasifs.

Remplacement

La cicatrisation cutanée dépend de l'état de propreté de la peau, de la qualité de l'irrigation qui garantit la nutrition et de l'immobilité. Toutes ces conditions sont difficiles à reproduire avec des cultures de kératinocytes. Il faut pouvoir travailler avec l'espèce cible parce que le cheval a un métabolisme de cicatrisation très spécifique.

Réduction

Nous travaillons avec un nombre d'animaux qui a été réduit au maximum parce que nous utilisons chaque cheval pour réaliser 2 plaies sur chaque membre. Ceci donne deux lots de 12 plaies, un lot traité avec le traitement expérimental et un lot traité avec la méthode classiquement reconnue. Les temps médians de cicatrisation sont évalués pour les deux groupes.

Raffinement

Les plaies seront maintenues propres. En cas de douleur manifeste, les chevaux recevront des anti-inflammatoires non stéroïdiens. Les chevaux seront promenés régulièrement pour compenser l'ennui de la vie au box.

Choix des espèces

Nous testons le produit de cicatrisation afin de savoir s'il accèlère la cicatrisation chez les Chevaux, c'est pourquoi nous travaillons avec cette espèce, dont le métabolisme cicatriciel est très spécifique. Nous ne pouvons pas utiliser le poneys, dont le métabolisme est très différent. Adultes, pour avoir des animaux qui ont un métabolisme adapté

192 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les poissons sont exposés par bain à la bactérie Aeromonas salmonicida et subissent deux prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point une infection expérimentale par balnéation et déterminer la dose létale médiane. Le porteur indique que l'infection peut provoquer un mal-être allant de l'inconfort à la douleur, les poissons moribonds étant retirés et tués par surdosage d'anesthésique. Il justifie le recours aux animaux en affirmant que l'évaluation d'un antibiotique ou d'un vaccin "ne peut se faire que sur animaux vivants".

Objectifs

Le projet FEAMP Medic'eau vise à optimiser les données posologiques des antibiotiques et les conditions d'administration des vaccins utilisés en aquaculture afin d'améliorer leur efficacité et de réduire l'usage d'antibiotiques en élevage aquacole

Bénéfices attendus

Nous maitrisons actuellement les infections expérimentales à A. salmonicida chez la Truite arc en ciel par administration par voie intra-musculaire. Cependant, ces modalités d'infection sont éloignées des modalités naturelles

Procédures

Prises de sang sur animaux anesthésiés. Prélèvement deux fois (T0 et Tfinal) de 200 µl de sang. exposition à une infection bactérienne

Impact sur les animaux

Les manifestations cliniques de l'infection expérimentale peut entrainer du mal être chez le poisson allant de l'inconfort à la douleur;

Devenir

L'euthanasie des poissons est prévu en fin de protocole, pour des raisons notamment sanitaire (impossibilité de relacher ou réutiliser des poissons potentiellement infectés par A. salmonicida)

Remplacement

L'objectif du projet Medic'eau étant d'évaluer l'efficacité d'un traitement antibiotique et/ou de la vaccination contre la furonculose, cela ne peut se faire que sur animaux vivants.

Réduction

l'objectif du protocole est de mettre au point le challenge infectieux par balnéation permettant de déterminer la DL 50. Afin de vérifier que les poissons survivants ont bien été infectés, une analyse immunologique sérique sera effectuée sur chacun des poissons. Du fait de la variabilité individuelle importante de certains paramètres immunitaires, les modèles statistiques avec un risque alpha de 0,05 et une puissance de test de 95% préconisent des lots de 10 poissons nécessaires/restant en fin d'expérimentation

Raffinement

Les animaux seront observés 2 fois par jour durant toute le durée du protocole (4 semaines). Les points limites sont d'une part les paramètres d'ambiance de l'élevage (température, oxygène). Si les paramètres critiques sont atteints (température > 20°C, oxygène 1 cm2) seront retirés de l'expérimentation et euthanasiés par surdosage d'anesthésique.

Choix des espèces

La truite arc en Ciel est l'hôte naturel d'Aeromonas salmonicida Les truites utilisées pèseront environ 200g. La furonculose est une maladie que l'on observe à différents stades d'élevage (alevins, portion -200-250g- et grosse truite > 1kg). Sur le terrain les problématiques sont plus importante chez les truites pesant plus de 1 kg car elles arrivent en fin de production. Du fait du matériel de la station aquacole (taille des bassins), il ne nous est pas possible d'élever des truites arc en ciel de cette taille (> 1 Kg) en nombre suffisant et pour permettre l'aquisition de résultats répétables. L'étude sur des poissons de poids de 200 g est un bon compromis entre le poids et le nombre de poissons pouvant rentrer dans l'étude. A ce poids (200g) les animaux sont considérés comme physiologiquement proche des animaux d'un poids plus élevé > 1 Kg (hors période de gamétogènèse). Les truites utilisées seront des femelles triploides, ne rentrant pas en gamétogènèse, et représentant le type de truite arc en ciel le plus élévée en aquaculture.