Toxicologie (hors obligations réglementaires)

350 miniporcs génétiquement modifiés vont être utilisés, une partie tuée pour des prélèvements terminaux et environ 125 réutilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats médicaments par voie intraveineuse ou sous-cutanée de façon répétée sur deux mois, avec des prélèvements de fluides et de tissus, pour évaluer la pharmacocinétique et la sécurité de ces molécules avant leur première administration humaine. Le porteur décrit un modèle au système immunitaire "plus proche de l'Homme". Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent concernant des candidats médicaments biothérapeutiques dans la recherche contre les maladies cancéreuses, les maladies rares et les maladies immuno-inflammatoires. Ce projet utilise le modèle miniporc génétiquement modifié présentant un système immunitaire fonctionnel plus proche de l’Homme en exprimant des anticorps humanisés. Ces animaux génétiquement modifiés sont plus tolérants aux médicaments biothérapeutiques. Les anticorps dirigés contre le candidat médicament dans les études précliniques peuvent réduire l’exposition des candidats médicaments, réduire leur efficacité et dans certains cas peuvent induire des effets secondaires. L’utilisation de ce modèle permet d’être plus prédictif quant à la formation dans l’organisme d’anticorps dirigés contre le candidat médicament et donc de générer des données précliniques davantage transposables à l’Homme.

Bénéfices attendus

Grâce à l’utilisation du modèle miniporc génétiquement modifié, ce projet permettra de générer des informations essentielles avant la première administration chez l’Homme et de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil non satisfaisant en termes de sécurité, d’efficacité et/ou de pharmacocinétique au regard de l’indication thérapeutique.

Procédures

Les molécules sont administrées aux animaux par différentes voies (principalement intraveineuse et sous-cutanée) de façon unique ou répétée (en général hebdomadaire ou toutes les 2 à 3 semaines) sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements de fluides et/ou tissus biologiques associés à une contrainte légère ou modérée de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour évaluer les effets des candidats médicaments et/ou de leurs métabolites. Leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs (entre 15 et 60 minutes). Des mesures, comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique) et le poids (deux fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ces contraintes correspondent à celles de l’administration des molécules pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une modification du comportement de l’animal, une baisse de la consommation alimentaire, une perte de poids ou une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements et examens nécessaires au cours des études peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ces études nécessitent souvent des prélèvements terminaux (analyse anatomo-pathologique ou quantification de l’exposition tissulaire des candidats médicaments). C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas ces analyses que certains animaux pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 30-40%.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, modélisation in silico, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) ainsi que des données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire. Cependant, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe aujourd’hui aucun modèle in vitro mimant la complexité des interactions (notamment via le système immunitaire) d’un organisme entier et les effets possibles d’un candidat médicament sur celui-ci.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Enfin, ce projet permet indirectement de réduire le nombre de primates non humains utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce à l’utilisation de ce modèle miniporc.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique. La contrainte des prélèvements et administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et training avec distribution systématique de récompenses alimentaires (par exemple, pour certains prélèvements sanguins, mis en hamac après training avec renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et de mettre en place des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support ou analgésie) par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire en application des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

​​Le choix de cette espèce est défini par ses similitudes immunologiques à l'Homme qui font du miniporc génétiquement modifié l’espèce appropriée pour générer des données précliniques transposables à l’Homme.​ Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes afin d’évaluer de manière satisfaisante les profils PK, PD, et toxicologiques des candidats médicaments.

24 lapines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une administration unique d'un mélange de perturbateurs endocriniens, phtalates et phénols, par voie orale ou intraveineuse, restent quarante-huit heures en cage à métabolisme, subissent trois prélèvements de sang de six millilitres, puis sont tuées pour récupérer leur sang chargé de métabolites. Cette étude toxicocinétique préliminaire vise à fixer les doses reproduisant chez la lapine l'exposition de femmes enceintes, le porteur la qualifiant d'"indispensable". Il affirme qu'aucune étude in vitro ne peut prédire le devenir de ces molécules dans un organisme.

Objectifs

La population générale, incluant les femmes enceintes, est exposée à de nombreux perturbateurs endocriniens, tels que les phtalates et les phénols synthétiques (PSP). Les objectifs du projet de recherche sont de déterminer si l’exposition maternelle à un mélange de PSP perturbe la fonction placentaire et affecte la santé de la descendance avec des réponses sexe-spécifiques. Pour cela, ce projet s’appuiera sur le modèle biomédical du lapin, pertinent en termes de placentation, de production d'hormones pendant la vie fœtale, de toxicité fœtale et d’effets métaboliques à long terme chez les descendants. Grâce à ce modèle, les effets de l'exposition maternelle, par ingestion, à un mélange de PSP, mimant l’exposition des mères de la cohorte SEPAGES (cohorte mère-enfant, dédiée à la surveillance de l'exposition aux PSP pendant la grossesse et de leurs effets sur la santé des enfants), seront évalués sur le développement et la croissance fœto-placentaire mais aussi sur la santé postnatale, en tenant compte du sexe des individus. Le mélange de PSP sera défini grâce aux données de la cohorte SEPAGES où des concentrations élevées de phénols, de phtalates et de leurs métabolites ont été détectées dans des échantillons issus de prélèvements répétés d'urine chez les femmes enceintes. Une étude est en cours pour définir, à partir de cette cohorte, les composés associés positivement ou négativement à une modification du poids placentaire, de l’efficacité placentaire et/ou du poids de naissance qui définiront le mélange d’exposition. L’objectif de l’étude préliminaire toxicocinétique qui fait l’objet de cette saisine est de déterminer les doses des PSP qui, administrées quotidiennement par voie orale, permettront de reproduire chez le lapin une exposition aux PSP, représentative de l’exposition de la femme enceinte, en termes de concentrations plasmatiques et urinaires.

Bénéfices attendus

Ce projet aboutira à une meilleure compréhension des effets d'un mélange de PSP sur la santé des mères et de leur progéniture via une exposition par voie orale. Ce projet contribuera à décrypter les mécanismes épigénétiques, et la façon dont ils peuvent induire des effets intergénérationnels comme des troubles cardio-vasculaires, métaboliques ou un dysfonctionnement gonadique. Les résultats obtenus aideront au suivi clinique des enfants SEPAGES après l'âge de 7 ans. De plus, ce projet va générer des informations relatives à la toxicité de l'exposition maternelle aux PSP et aux effets à long terme sur la descendance, ce qui représente un défi pour les autorités publiques telles que l'ANSES/EFSA, en termes de recommandations et d'évaluation des risques, pour les femmes enceintes et les nourrissons. L'étude toxicocinétique est indispensable pour déterminer le protocole d'administration des PSP qui permettra de reproduire chez la lapine l'exposition des femmes enceintes.

Procédures

Dans le cadre de la procédure 1, 24 lapines recevront une administration intraveineuse unique (N=12) ou une administration orale unique (N=12). Les lapines seront hébergées pendant 48h avant ou suivant l'administration dans une cage à métabolisme pour permettre le recueil de la totalité des urines produites à des intervalles de temps définis. Trois prélèvements de sang d'un volume de 6ml seront réalisés par lapine. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 20 à 30 secondes.

Impact sur les animaux

Risques de stress liés à la manipulation pour l’exposition par voie orale ou à la contention pour les prélèvements de sang (durée : le temps de la contention) - Une douleur peut apparaître au point de prélèvement de sang en raison de l’utilisation d’une aiguille (durée : le temps du prélèvement). Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone de prélèvement pour réduire la douleur associée à la ponction.

Devenir

Les lapines seront mises à mort à l'issue de la procédure afin de collecter un volume important de sang contenant l'ensemble des métabolites des substances administrées, dont les métabolites actifs. Le plasma isolé sera ultérieurement utilisé in vitro pour exposer des cellules placentaires en culture et évaluer les effets de l'ensemble des métabolites sur la fonction placentaire.

Remplacement

Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (toxicocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme par le foie, élimination par les reins, …).

Réduction

Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PSP en mélange. En effet, l’administration simultanée de 10 PSP permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PSP et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse utilisée ne s'appuie pas sur des tests statistiques mais sur des modélisations spécifiques qui permettront d'estimer avec précision quel est le devenir dans l'organisme des substances étudiées en optimisant le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

La méthode d'analyse des données qui sera mise en oeuvre permettra de réduire à trois le nombre de prélèvements par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d'analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Pour l’enrichissement, les cages contiennent une chaînette, des mobiles suspendus, une plateforme et des blocs de foin compressé à ronger. Pour le confort de l’animal, les cages disposent de repose-pattes. Les animaux sont en cage individuelle mais positionnées les unes à côté des autres afin que les animaux soient en contact visuel et olfactif. Les salles d’hébergement disposent de blocs de phéromones maternelles (secure rabbit), qui diminuent les sources de stress et apaisent des animaux -L'état de santé des animaux sera surveillé tous les jours (niveau d’activité, comportement, posture au repos, pelage, alimentation, mouvements à la sollicitation). Si un animal présentait une altération de ces critères, une évaluation de la douleur serait réalisée avec la grille dédiée à l’établissement d’un score. Selon le score, une analgésie serait mise en place. Si la douleur persistait, l’euthanasie pourrait être envisagée en concertation avec le vétérinaire. Avant la procédure, les lapines seront habituées à être placées dans une boîte de contention. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la zone d'injection afin de limiter la douleur. Un produit sera utilisé sur la zone de prélèvement de sang pour induire la dilatation des vaisseaux sanguins et faciliter la cathétérisation. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des lapins par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des lapins dans les cages à métabolisme. Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront également habitués à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Pour cela, ils seront placés dans les cages métaboliques pendant une durée croissante, soit successivement 1h, 2h, 4h et 8h par jour. Le contact visuel et olfactif ainsi que l'enrichissement seront maintenus lors de l'hébegement dans les cages métaboliques.

Choix des espèces

L’espèce lapin a été choisie pour plusieurs raisons: i/ type de placentation plus proche de celle de l’humain que celle des rongeurs ii/ taille qui permet de réaliser un suivi de la gestation par échographie iv/ espèce pertinente pour étudier la toxicité sur le développement du fœtus et évaluer les effets à long terme v/ espèce plus appropriée à des fins de toxicocinétiques car, chez le lapin comme chez l'humain l'élimination urinaire prédomine pour les polluants organiques, contrairement à d'autres espèces, comme le rat et le chien, qui sont plutôt des excréteurs biliaires vi/ espèce pertinente car la production de stéroïdes gonadiques pendant la vie fœtale est similaire à celle de l’humain L'étude sera réalisé chez des lapines adultes car elle a pour objectif de définir les doses des composés mimant l’exposition des femmes en âge de procréer qui seront utilisées ultérieurement chez des lapines adultes pour évaluer les effets de cette exposition sur la santé néonatale.

1 200 poissons, 900 goujons et carassins et 300 truites, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et les individus de taille extrême relâchés. Ils sont capturés par pêche électrique, exposés deux à trois semaines à des cocktails de polluants en rivière ou en laboratoire, marqués et parfois injectés d'un antigène mimant une attaque parasitaire, puis euthanasiés par surdose d'anesthésique pour mesurer la contamination de leurs tissus. Le porteur indique choisir des doses faibles et des durées courtes pour observer des effets non létaux tout en limitant la mortalité. Les bénéfices se limitent à "mieux comprendre" les effets des pollutions humaines sur la faune sauvage, et le porteur juge le remplacement par culture cellulaire inapplicable à l'étude de stress multiples.

Objectifs

Les écosystèmes aquatiques sont lourdement impactés par les pollutions organiques (pesticides) et inorganiques (métaux) issues des activités agricoles et industrielles, mais leurs effets à long terme sur la santé et les capacités d’adaptation des organismes aquatiques et notamment des poissons sont encore peu évalués, notamment en conditions réalistes de stress multiples (parasites, température…). Le projet vise à évaluer les impacts potentiels des stress environnementaux multiples (notamment chimiques) en combinant des approches en laboratoire et sur le terrain, au plus près du réalisme environnemental.

Bénéfices attendus

A terme les résultats de ce projet permettront de caractériser les effets des pollutions environnementales sur la santé des poissons, et de mieux comprendre les réponses comportementales et physiologiques des animaux soumis aux stress chimiques. Ils permettront donc de mieux comprendre et anticiper les effets des pollutions d'origine humaine sur la santé de la faune sauvage.

Procédures

Pour tester leur réponse aux stress chimiques, des poissons seront exposés à des polluants en dose et cocktails réalistes au plus proche des concentrations trouvées en rivière, et ce pendant une durée maximale de 21 jours pour éviter tout effet mortel, mais observer des effets physiologiques et comportementaux. Dans un premier temps, des approches en laboratoire seront utilisées afin de tester les effets des polluants en conditions contrôlées sur carassins et goujons, notamment des cocktails de contaminants représentatifs du milieu naturel en se basant sur des bases de données existantes. Pour tester la variabilité de réponse entre populations sauvages hétérogènes, plusieurs populations sauvages de goujons ayant évolué dans des rivières plus ou moins polluées seront comparées. Dans un deuxième temps, des expérimentations d’encagement en rivière seront mises en place afin de tester les réponses des poissons en conditions réalistes de multistress sur le terrain. Des goujons issus de populations plus ou moins exposées aux pesticides, et des truites également issues de zones plus ou moins polluées par des métaux, seront transplantés en cage dans des rivières contaminées ou peu contaminées. Les cages seront de dimensions suffisante avec un grillage fin de 5 mm qui laisse passer les invertébrés pour la nourriture. Les poissons seront exposés pendant 14 à 21 jours à des rivières plus ou moins polluées que leur rivière d’origine. Après toutes les expositions en laboratoire ou rivière, les poissons seront anesthésiés, marqués avec des colorants non toxiques par injection sous-cutanée, mesurés (poids et longueur totale), une unique injection sous-cutanée d’antigène mimant une attaque parasitaire pourra être effectuée au niveau de la queue afin de tester l’immunité des poissons. Au total ces interventions sont réalisées en moins de 2 minutes. Enfin les poissons seront euthanasiés par surdose d’anesthésique, et les taux de contamination de leurs tissus seront mesurés, ainsi que leur état de santé à partir de diverses mesures dans les tissus (nageoires, foie, rein, muscles, sang).

Impact sur les animaux

Pour l’ensemble des démarches expérimentales, excepté celles impliquant le carassin domestique et les goujons d’élevage (animaux d’élevage), la capture des individus sauvages sera réalisée par pêche électrique. Cette procédure de pêche peut causer un stress mais elle sera effectuée par des personnels formés et après demande d’autorisation auprès des autorités compétentes via l’utilisation de matériel spécifique respectant la législation en vigueur. Le voltage utilisé sera adapté pour causer une sédation légère et rapide des poissons qui seront ensuite transportés dans des conteneurs isothermes oxygénés puis acclimatés en laboratoire ou dans les cages en rivière pendant 7 jours minimum pour limiter le stress de capture, de transport et de captivité. Les démarches expérimentales (en laboratoire et en rivière) impliquent des expositions à des polluants qui peuvent causer des dommages mais les cocktails et doses seront relativement faibles car représentatives du milieu naturel. De plus, les durées d’exposition seront relativement courtes (21 jours maximum) pour observer des réponses physiologiques mesurables tout en limitant les dommages pathologiques potentiels infligés aux organismes d’étude et la mortalité. En effet l’objectif étant de mimer des niveaux de stress réalistes et des effets non létaux. Le reste des procédures (mesures, prises de sang, injections) aura lieu sous anesthésie de quelques minutes et devrait causer un stress limité.

Devenir

Les animaux pêchés par pêche électrique seront euthanasiés pour être disséqués post-mortem. Les animaux pêchés mais jugés de taille extrême (trop petit ou trop grand) seront immédiatement remis à l'eau après vérification de leur état après passage dans un seau de réveil.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant de caractériser l’effet des stress multiples sur la variation des réponses physiologiques des poissons d’eau douce, l’utilisation de méthodes de remplacement (par exemple test sur cultures cellulaires) en vue de limiter le nombre d’animaux vivants utilisés dans le projet ne peut être appliquée. Néanmoins, afin de limiter le prélèvement d’individus dans le milieu naturel, des carassins seront utilisés ainsi que des goujons d’élevages pour remplacer une population sauvage (population de référence non polluée) afin d’affiner la caractérisation des processus physiologiques impliqués dans la réponse à une exposition à des stress multiples.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, un maximum d’information sera tiré de chaque individu en utilisant un maximum de mesures sur les organes pertinents. Nous avons préalablement réalisé une étude statistique pour déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser dans chaque procédure et dans chaque lot pour obtenir un résultat statistiquement probant. A posteriori, des traitements statistiques seront également effectués pour mettre en évidence des différences significatives entre les lots et les modalités d’exposition.

Raffinement

Afin de limiter le stress induit par la captivité des animaux (aquariums et cages), les individus seront maintenus en groupe de 5 à 10 individus maximum avec une densité d’environ 1 cm de poisson pour 1 L d’eau. En laboratoire, la photopériode sera fixée à 12h de jour/12h d’obscurité (lors des phases expérimentales) et la qualité de l’eau sera assurée quotidiennement via la mise en place d’un système de filtration propre à chaque aquarium et la mesure régulière des paramètres physico-chimiques. Dans le cas où certains de ces paramètres (en particulier les produits azotés) dépasseraient les optimums de chaque espèce, des renouvellements d’eau partiels seront effectués. Les aquariums d’exposition seront alimentés avec de l’eau du réseau, filtrée et stérilisée. Pour les phases de stabulation, les bacs seront alimentés par de l’eau du réseau. Des refuges seront introduits dans tous les bacs de stabulation et cages afin de limiter le stress et enrichir le milieu. Il n’est pas possible de placer des refuges dans les aquariums d’exposition en raison de l’adsorption des polluants sur les surfaces des refuges. Un suivi régulier des aquariums et des cages sera effectué quotidiennement pour surveiller l’état des animaux notamment pendant les phases d’exposition.

Choix des espèces

La pertinence de l’utilisation des poissons et plus particulièrement des 3 espèces sélectionnées se justifie par le fait que : - Le carassin domestique Carassius auratus est un animal utilisé depuis plusieurs décennies en recherche. Sa physiologie, son mode de vie et ses besoins sont connus et bien documentés. - Concernant les 2 espèces sauvages, le goujon Gobio occitaniae et la truite fario sauvage Salmo trutta trutta, ces dernières ont été sélectionnées car elles sont bien implantées dans notre zone d'étude. Comme pour le carassin, leur physiologie est connue et bien documentée. - Ces espèces ayant des exigences différentes (en termes d'habitat, de régime alimentaire, de déplacement…), elles sont exposées aux polluants de manière différente. Ainsi, les goujons seront soumis à des contaminations liées aux polluants utilisés en agriculture, alors que les truites seront soumises à des contaminations métalliques minières. Tous les poissons utilisés seront des adultes ou jeunes adultes d’une taille d’environ 10 cm (carassins et goujon adultes, truitelles jeunes adultes). Nous utilisons des adultes pour deux raisons essentielles : - la pêche d'adultes dans le milieu naturel permet de ne pas compromettre la régénération des populations sauvages - les adultes sont sexés et donc sexables. Par conséquent le sexe dans animaux étant connu, il est possible d'intégrer ce facteur de variation à notre étude statistique, pour mettre en évidence un éventuel impact du sexe dans le comportement et/ou la physiologie des animaux exposés aux contaminants.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une greffe de cellules hépatiques humaines sous la capsule rénale, subit jusqu'à seize prélèvements sanguins pour suivre la formation d'un hépatome, puis est tué pour l'extraire, certains échantillons nécessitant un second passage dans le rein d'une autre souris. Le porteur décrit des risques d'hypothermie, de saignement, d'infection et de perte de poids liés à la chirurgie. Il présente ces lignées cellulaires comme un moyen de "réduire l'utilisation d'animaux" dans les tests d'hépatotoxicité, tout en fondant leur production sur l'usage de 900 souris.

Objectifs

Les lésions hépatiques sont une des raisons principales du retrait de médicaments du marché tandis que de nombreuses molécules en cours de développement échouent au cours des essais cliniques pour des raisons d’hépatotoxicité. Pour ces raisons, les études d’hépatotoxicité et de pharmacocinétique représentent des éléments essentiels pour réduire les échecs de développement de nouveaux médicaments. Le foie est un organe essentiel d’où les hépatocytes represente environ 70-80 % de sa totalité et ont des fonctions essentielles telles que : la régulation du métabolisme des glucides, des lipides et du cholestérol ; la production de composants du sérum (facteurs de coagulation, albumine, etc) ; la sécrétion et l’excrétion d’acides biliaires et la biotransformation et la détoxification des médicaments et toxines. Les hépatocytes humains primaires (PHH) constituent le modèle de référence pour prédire le métabolisme et l'hépatotoxicité des médicaments en développement. Cependant, leur accès est limité. Devant cet accès très limité aux prélèvements cadavériques d’échantillons de foie humain, rares, au coût très élevé et de qualité très variable notamment en fonction du donneur et du prélèvement, les laboratoires se tournent vers des modèles animaux ou de lignées cellulaires transgéniques très éloignées de la physiologie humaine. Ainsi notre projet a pour objectif de développer des hépatocytes humains hautement fonctionnels, illimités, reproductibles et prêts à l'emploi provenant de différents donneurs, totalement similaires à des PHH. Ceci en se basant sur notre technologie Natline® d’immortalisation et de maturation ciblée de cellules fonctionnelles qui a déjà fait ses preuves avec la création de cellules béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles EndoC-bH1 à -bH5. Ainsi, nous pourrions répondre au besoin très fort des laboratoires de recherche et de développement pharmaceutique de modèles humains physiologiques et prédictifs de la physiologie des hépatocytes et de leur réponse aux toxines.

Bénéfices attendus

Le développement de lignées d’hépatocytes humains fonctionnels, ainsi disponibles en quantité illimitée, aurait des conséquences très bénéfiques pour la recherche et le développement de nouveaux médicaments. En recherche, ces cellules remplaceraient les hépatocytes humains primaires, d’accès limité, et seraient un complément idéal aux lignées cellulaires humaines et modèles animaux. Elles permettraient d’accélérer la recherche sur la physiologie hépatocytaire humaine, les mécanismes des maladies du foie et de toxicité et permettraient la création de modèles pathologiques reproductibles. Concernant la pharmacologie et la toxicologie, l’impact de ces cellules serait immense. La possibilité d’avoir une source illimitée et reproductible de cellules similaires aux hépatocytes humains primaires et représentatives de la variabilité des réponses à l’hépatotoxicité rencontrée dans la population serait un bouleversement pour le processus de développement des médicaments. Une meilleure prédiction de l’hépatotoxicité permettrait de réduire le nombre de médicaments retirés du marché et augmenterait la sécurité des médicaments mis sur le marché, ce qui diminuerait le risque de toxicité hépatique chez les patients. Enfin, l’utilisation de tels hépatocytes humains prédictifs permettrait de réduire l’utilisation d’animaux dans les études de métabolisme et d’hépatotoxicité.

Procédures

Deux interventions: 1) Chirurgie pour greffe sous la capsule rénal de la souris (1 greffe par souris) et 2) prélèvement sanguin pour suivre le succès de la greffe (toutes les 2 semaines après la greffe ou tous les mois, en fonction des premiers résultats et du développement de l'hépatome, 16 prélèvements maximum par souris). La chirurgie, une procédure d’environ 30 min, sera effectuée sous anesthésie et analgésie et il y aura un analgésique administré en préventif pendant 3 jours. Pour la prise de sang, il s'agit d'une procédure sans anesthésie et analgésie car très peu douloureuse. La souris aura une gêne au moment de la piqure ce qui ne durera que très peu de temps. Les prélèvement s’effectueront par la queue de l’animal ou par voie submandibulaire.

Impact sur les animaux

Pour ce projet, les souris seront soumises à une chirurgie afin de greffer des cellules ou tissus humains dans la capsule rénale. Ainsi, la chirurgie et les jours qui suivent sont les moments pendant lesquels les animaux pourront subir des effets indésirables et des nuisances. Les effets indésirables et nuisances possibles sont de la douleur et du stress liés à la chirurgie et une gêne et/ou douleur occasionnée par la plaie. Dans le cas de complications liées à la procédure celles-ci pourraient se traduire par une hypothermie liée à l’anesthésie, un saignement dû à la chirurgie, une infection suite à la chirurgie et une perte de poids. L’amplification des hépatocytes humains sous la capsule rénale des animaux ne devrait pas générer de douleur ou d’inconfort supplémentaire étant donné que leur taille restera très modeste. Néanmoins, dans le cas où un hépatome se formerait vite, l’expérience serait arrêtée au plus tôt et l’animal serait euthanasié et le tissu prélevé afin de minimiser les effets indésirable sur l’animal. La formation de l’hépatome sera suivie via des prélèvements réguliers de sang (1 fois toute les 2 semaines à 1 mois, selon les premiers résultats), pour la mesure de l’albumine humaine. Concernant ces prélèvements sanguins, il s’agit d’une procédure légère qui pourrait occasionner une gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements.

Devenir

Tous les animaux utilisé dans se projet seront soumis à une chirurgie pour la greffe de hépatocytes sous la capsule rénal. Ils resteront en vie le temps que l’hépatome progresse et ils seront mis a mort à la fin de l’expérience pour l’extraction de l’hépatome (les hepatocytes). Le cas écheant ils seront mis a mort après l'age de 20 semaines.

Remplacement

Afin d’assurer le succès de notre projet de développement d’hépatocytes humains hautement fonctionnels, stables et en quantités illimités similaires aux PHH, nous nous baserons sur la méthodologie qui a permis la génération des cellules bêta pancréatiques EndoC-bH1 à -bH5, la plateforme NatLine. Une des étapes de cette plateforme est la transplantation de cellules primaires récemment transduites avec un gène immortalisant dans la capsule rénale de la souris SCID afin de permettre l’amplification sélective de cellules différenciées et leur maturation. Pour le développement des cellules EndoC-bH, cette étape a été indispensable, aucune autre stratégie n’ayant permis d’obtenir l’amplification de cellules béta pancréatiques humaines fonctionnelles sécrétrices d’insuline et répondant aux incrétines. Plusieurs travaux décrivant l’immortalisation in vitro d’hépatocytes humains primaires à différents stades de développement ont été publiés par d’autres équipes, mais aucune de ces lignées cellulaires n’a aboutit à des cellules avec des caractéristiques fonctionnelles proches des hépatocytes primaires, principalement en ce qui concerne leur capacité à détoxifier les toxines, ce qui empèche leur utilisation dans les études de pharmaco-toxicologie. Pour cette raison, la greffe initiale des hépatocytes primaires dans la capsule rénale de souris apparait indispensable pour pouvoir assurer l’obtention de lignés d’hépatocytes similaires aux hépatocytes primaires humains. Par ailleurs, dans le cas des cellules béta pancréatiques, après récupération du premier insulinome pour chaque échantillon primaire donné, cet insulinome a du être transplanté à nouveau sous la capsule rénale d’un seconde animal. Sans quoi ces lignées primaires ne survivaient pas in vitro. Seulement après un second passage dans l’animal, les lignées d’insulinome créées étaient suffisamment stabilisées pour pouvoir être adaptées à la culture in vitro. Dans le cas des hépatocytes nous procéderons de la même manière en séparant les hépatomes primaires en deux afin de tenter leur culture in vitro tout en sauvegardant une partie d’hépatome in vivo. Après les premiers essais, si les premiers hépatomes survivent in vitro, nous éliminerons cette étape de passage secondaire dans la capsule rénale de souris et la remplacerons par leur culture in vitro. Cela aura pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention des lignées d’hépatocytes.

Réduction

Nous avons estimé que le projet nécessiterait l’utilisation d’un nombre maximal de 900 animaux. Ce calcul est basé sur l’utilisation de 3 animaux pour la greffe primaire puis d’un maximum de 6 animaux pour les greffes secondaires soit jusqu’à 9 animaux par échantillon primaire de foie. D’autre part, basé sur l’expérience de la génération des cellules béta EndoC-bH, nous avons estimé qu’il nous faudrait un total de maximum 100 échantillons primaires, étalés sur une période maximale de 5 ans, pour générer environ 30 à 40 lignées cellulaires stables à partir desquelles seraient caractérisées les 5 à 10 lignées d’hépatocytes humains les plus fonctionnelles et représentatrices de la diversité de métabolisme hépatique. L’expérience des cellules béta nous a montré qu’il pourrait être indispensable de procéder à une ré-implantation des hépatomes primaires incapables de survivre in vitro. Si cela n’est pas le cas pour les hépatomes et que lors des premières expériences pilotes nous observons qu’ils peuvent être amplifiées in vitro tout en acquérant un caractère de cellules fonctionnelles, nous n’effectuerons plus de passage secondaire dans la souris pour les échantillons primaires suivants. Ceci aurait pour conséquence de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet de jusqu’à 400 animaux (30 échantillons primaires x 9 souris puis 70 échantillons primaires x 3 souris = 480 animaux) si nous considérons qu’il nous faudra traiter un tiers des échantillons primaires via un passage secondaire dans l’animal avant d’avoir un recul suffisant sur notre capacité à amplifier in vitro des lignées fonctionnelles à partir des hépatomes primaires.

Raffinement

Afin de réduire au maximum les nuisances et douleurs induites par la procédure (chirurgie) et subies par les animaux, différentes actions seront menées. Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus dans les locaux de la zootechnie et seront acclimatés pendant au moins 5 jours avant la procédure. Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets prévus pour enrichir leur environnement. Avant la procédure (30 mins), les animaux seront soumis à une injection sub-cutanée d’analgésique en préemptif. Ils seront ensuite soumis à une anesthésie injectable à la kétamine et à la xylazine Ces deux derniers composants entraînent une anesthésie, d’une durée de 20 à 30 minutes et celle-ci sera re-administrée dans l’éventualité où la procédure prendra plus de temps, à une dose équivalente au tiers. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera placé sous l’animal et celui- ci sera couvert tout au long de la procédure. Dans la phase de réveil, l’animal sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur et confort pendant les heures qui suivent la chirurgie, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, soit 6 à 8 heures après la chirurgie puis 2 fois par jour espacé d’environ 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (7-10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les condition d’hébergement classique A2 de nos installations et surveillé tous les jours. De plus l’apparition des points limites sera surveillé afin d’éviter la souffrance de l’animal ou résoudre d’éventuelles complications opératoires ou post-opératoires. Ainsi, l’animal sera surveillé pour des signes : d’hypothermie, de douleur ou stress, de perte d’activité, de déshydratation ou d’absence de prise de nourriture, de perte de poids, pour l’apparition d’ une infection ou d’une ulcération de la plaie. Dans le cas où un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’évité la degradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il ne sera pas possible de reverser ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée.

Choix des espèces

Nous avons mis au point chez la souris, un modèle expérimental qui permet de récapituler la différenciation du pancréas humain. Ainsi, en greffant sous la capsule rénale de souris SCID immuno incompétentes des fragments de pancréas embryonnaires humains immatures, nous sommes capables de reproduire le développement du pancréas tel qu’il a lieu in vivo. Cette méthode, associée à la transduction lentivirale d’un oncogène, nous a permis de générer les seules lignées cellulaires béta pancréatiques humaines entièrement fonctionnelles (EndoC-bH). Ces lignées cellulaires ont depuis été adoptées par plusieurs centaines de laboratoires dans le monde. Cette stratégie sera appliquée ici à l’amplification et à la maturation d’hépatocytes humains pour lesquels il n’existe pas de modèle cellulaire humain définitif. Ce modèle expérimental n’a été testé que sur la souris et pas sur d’autres espèces, rendant nécessaire le choix de la souris pour mener le projet hépatocytes. Les souris qui seront utilisées auront entre 6-20 semaines au moment de l’implantation des cellules ou tissus humains transduits. Ceci car avant l’animal est trop petit et donc la chirurgie est plus compliqué du fait de leur petite taille. En autre, l’amplification in vivo du tissu pourra prendre ensuite jusqu’à 8 mois ( notre expérience avec le développement des cellules béta), ce qui fait que l'animal ne doit pas être trop âgé.

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit un cathéter posé dans la veine jugulaire, des administrations orales jusqu'à deux fois par jour et des prélèvements sanguins et urinaires répétés, pour mesurer la toxicité osseuse de composés développés par les clients du laboratoire. Le porteur annonce une inflammation transitoire aux sites d'implantation et d'injection ainsi qu'un stress lié à l'isolement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, les rats étant tués pour prélever leurs os. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux d'un organisme entier et juge l'usage d'animaux "indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la pharmacocinétique ainsi que sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie, et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Un cathéter connecté à un dispositif facilitant les prélèvements récurrents de sang sera posé dans la veine jugulaire de l’animal (45 min environ par animal). Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles via le dispositif de prélèvement (moins de 3 min par prélèvement). Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant euthanasie de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Inflammation transitoire au niveau du site d’implantation de cathéter - Inflammation transitoire au niveau du site d’injection du traitement - Stress dû à l’isolement des animaux en cage métabolique pour une durée maximale de 24h

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer la toxicité systémique par numération sanguine et/ou évaluer les modifications éventuellement de biomarqueurs du remodelage osseux et du métabolisme phosphocalcique. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront stabulés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

1200 animaux, dont 500 souris, 500 rats, 80 macaques crabiers, 80 porcs et 40 chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la grande majorité étant tuée et environ 38 non-rongeurs réutilisés ou adoptés. On leur induit des lésions par des produits chimiques administrés jusqu'à deux mois, avec prélèvements répétés, pour rechercher des biomarqueurs de toxicité. Le porteur décrit une baisse d'activité, une perte de poids et des atteintes d'organes, la plupart des animaux étant tués pour analyse anatomo-pathologique. Il présente le recours à l'animal comme "requis" pour transférer ces données à la clinique et estime à 10 à 15 % les non-rongeurs réutilisables.

Objectifs

Un médicament n’est mis sur le marché et rendu disponible aux patients qu’après une longue phase de Recherche et de Développement. Le défi majeur pour la recherche biomédicale est de découvrir de nouveaux médicaments plus efficaces et mieux tolérés. Actuellement, de nouveaux besoins et enjeux apparaissent, notamment le développement et l’intégration de biomarqueurs au sein même des études chez l’animal de laboratoire afin de permettre une meilleure sélection des candidats médicaments, l’accélération du développement, l’amélioration du suivi personnalisé et du taux de réussite. Un biomarqueur est « une caractéristique biologique mesurable liée à un processus normal ou non. En médecine, il est utilisé pour le diagnostic, la réponse à un traitement ou la toxicité d’une molécule et est dosé préférentiellement dans le sang ou l’urine ». Ce projet utilise des modèles animaux de lésions/atteintes fonctionnelles chimio- ou génétiquement induites avec pour objectifs d’une part d’évaluer des biomarqueurs de toxicité précoce (trouver de nouveaux biomarqueurs plus précoces, plus spécifiques, plus sensibles et qualifier leur cinétique d’apparition), et d’autre part d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments (par exemple diminution de toxicité hépatique ou rénale) grâce au suivi de ces biomarqueurs. Il nécessite la mise en œuvre de modèles animaux rongeurs ou non-rongeurs mimant le processus complet le plus proche de l’Homme.

Bénéfices attendus

L’identification, la cinétique d’apparition et la validation de nouveaux biomarqueurs comme indicateurs de toxicité précoce permettra de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs et/ou d’arrêter plus précocement le développement de molécules ayant un profil toxicologique non acceptable au regard de l’indication thérapeutique. À plus long terme, les biomarqueurs les plus pertinents pourront être proposés comme outils futurs d’adaptation dans les essais cliniques (diagnostic, médecine personnalisée, etc.). L’évaluation d’efficacité de candidat-médicament sur des atteintes lésionnelles ou fonctionnelles établies, via le suivi de biomarqueurs permettra, à terme, de proposer des médicaments capables d’améliorer le confort des patients et leur observance au traitement.

Procédures

Pour induire une lésion ou une atteinte fonctionnelle modérée, un produit est administré aux animaux, par différentes voies (principalement orale et intraveineuse) de façon quotidienne ou hebdomadaire sur une durée maximale de 2 mois. Des prélèvements associés à une contrainte légère de quelques minutes (en début et fin d’étude) sont nécessaires pour caractériser des biomarqueurs d’intérêt ; leur fréquence et volume sont conformes aux recommandations éthiques en vigueur et sont réalisés sous anesthésie/analgésie quand ils sont invasifs ( entre 15 et 30 minutes). Des mesures comme par exemple la température corporelle (avec une puce électronique), le poids ( 2 fois par semaine) sont réalisées en fonction de l’objectif de l’étude. La durée maximale des études sera de 2 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus chez les animaux seront limités à une contrainte modérée. Ils correspondent aux conséquences de l’atteinte fonctionnelle et/ou lésionnelle ainsi que celles de l’administration des candidats médicaments pouvant se traduire chez l’animal par exemple par une baisse d’activité, une perte de poids, une modification de la température corporelle. Par ailleurs, les prélèvements nécessaires au suivi des biomarqueurs peuvent entraîner des nuisances de courte durée (ex : contention, isolement de l’animal de quelques heures pour le recueil d’urine).

Devenir

Ce type d’étude nécessite le plus souvent une analyse anatomo-pathologique terminale pour évaluer les atteintes sur les organes et tissus. C’est seulement lorsque les objectifs de l’étude ne nécessitent pas cette analyse et que les atteintes/lésions sont réversibles que certains animaux non-rongeurs pourront être ré-utilisés après approbation du vétérinaire. L’estimation de ce nombre d’animaux est d’environ 10-15%. Certains de ces animaux pourront être proposés à l’adoption via des associations et des structures d’accueil spécifiques et en accord avec les autorités compétentes.

Remplacement

Le recours à l’animal de laboratoire est requis pour avoir la possibilité d’identifier ou de valider des biomarqueurs présents dans les fluides biologiques ou certains tissus (ex : sang, salive, urines, fèces, liquide cérébro-spinal, peau, moelle osseuse) et de transférer les connaissances scientifiques acquises au cours de ces études aux études cliniques. La médecine translationnelle s’appuie sur les progrès de la recherche faite avec des modèles animaux pour développer de nouvelles techniques médicales pour le suivi des effets d’un médicament. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui intègre revue bibliographique, tests in vitro (cellulaires et organoïdes) voire données recueillies chez les patients, ce qui permet de limiter le recours à l’animal de laboratoire.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe et le nombre de groupes sont définis sur des bases scientifiques (bibliographie et données historiques) et/ou avec l’apport des biostatistiques afin d'avoir un effectif minimum mais statistiquement exploitable pour pouvoir interpréter les différents effets. De plus, lorsque les objectifs d’étude le permettent et en accord avec le vétérinaire, certains animaux peuvent être réutilisés, ce qui participe à diminuer le nombre total d’animaux utilisés. Ce projet permet indirectement de réduire le nombre d’animaux utilisés dans d’autres projets de Sécurité Préclinique grâce l’utilisation de ces biomarqueurs.

Raffinement

Ce projet fait l’objet d’une démarche qualité rigoureuse avec la réalisation des études par du personnel formé et compétent, le respect des impératifs éthiques tels que les modalités d’administration et de prélèvements réalisés sous anesthésie-analgésie pour les plus invasifs, l’hébergement et l’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. La contrainte des prélèvements / administrations sous contention est minimisée par la mise en place d’habituations et la distribution de récompenses alimentaires (renforcement positif). L’état clinique des animaux est surveillé au moins quotidiennement, des pesées ou autres mesures (températures, examens sanguins, etc.) sont réalisées régulièrement afin d’anticiper au maximum l’apparition de toute douleur et d’appliquer des mesures spécifiques (changement de dose, arrêt anticipé de l’étude, mise en place de soins de support/analgésie) mis en place par le responsable d’étude en concertation avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce pour les études précliniques de toxicologie générale est défini par les lignes directrices internationales (ex ICH, OCDE) définissant qu’elles doivent être conduites à la fois chez le rongeur (rats, souris) et chez le non-rongeur (mini-porcs, chiens ou primates non humains). C’est sur ces mêmes espèces que seront réalisées les études d’évaluation ou de validation de biomarqueurs de toxicité afin de pouvoir mettre en évidence un lien entre la toxicité observée et la variation du ou des biomarqueurs. Les animaux utilisés sont des animaux sevrés, juvéniles ou adultes pour évaluer de manière satisfaisante le profil des biomarqueurs.