Toxicologie (hors obligations réglementaires)

7 300 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux stades post-larvaires, ils sont exposés pendant 45 jours à un mélange de polluants PFAS dans leur alimentation et à une hausse de la température de l'eau de 5 °C, puis pêchés et tués à douze points de prélèvement. Le porteur décrit un stress léger cumulé qu'il juge modéré, et vise à comprendre les effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination chimique. Les bénéfices annoncés restent une référence pour de futures études en écotoxicologie marine.

Objectifs

Le projet vise à acquérir des connaissances sur les effets interactifs des contaminants chimiques et de l'augmentation de la température sur le bar européen. On s'attend à ce que les écosystèmes marins soient affectés par le réchauffement dû au changement climatique et par le nombre croissant de contaminants chimiques bioaccumulés dans l’environnement, tels que les substances per- et polyfluoroalkyles (PFAS). Ces composés désignent un groupe de produits chimiques manufacturés (composés organofluorés) qui sont utilisés dans l’industrie et les produits de consommation en raison de leurs propriétés antiadhésives, résistances aux fortes chaleurs et imperméabilisantes. Ils sont présents dans une grande variété de biens de consommation, tels que les mousses anti-incendie, les ustensiles de cuisine antiadhésifs, les cosmétiques, les emballages alimentaires et les matériaux comme les moquettes, les tissus antitaches et les vêtements hydrofuges. Compte tenu de leurs utilisations, persistance et omniprésence, ces composés sont identifiés dans tous les compartiments de notre environnement (eau, sol, air) et représentent une menace pour l’environnement marin. Ensemble, ces facteurs de stress (tempérarture et contamination chimique) constituent un défi pour les organismes marins et peuvent nuire à leur croissance et à leur développement. Le projet ambitionne d'étudier simultanément la manière dont l'augmentation de la température pourrait influencer la cinétique d’accumulation de ces contaminants, et la manière dont ces facteurs de stress combinés impactent les fonctions physiologiques d'un poisson de climat tempéré. Une exposition en laboratoire des premiers stades de vie du bar (post-larves) dans le cadre d'une élévation de température de l’eau de +5°C seront mises en oeuvre, avec une contamination alimentaire d'un mélange de contaminant. Ce projet se décline en 3 objectifs : i) étudier la façon dont les contaminants sont assimilés par les poissons à 2 températures différentes ; ii) étudier l’influence de la température sur les voies d’élimination des contaminants et iii) étudier l'impact de l’augmentation de la température de l’eau et de la contamination chimique sur la mise en place de l’axe de la reproduction et du développement des bars.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation fournira des connaissances et des outils pour une meilleure anticipation et compréhension des changements globaux à venir, et servira de référence pour les études futures en écotoxicologie marine. En particulier, sur la façon dont l'histoire environnementale précoce des poissons peut affecter les fonctions physiologiques des stades ultérieurs dans leur capacité à faire face à l'environnement pollué et au changement climatique.

Procédures

Les poissons seront soumis à une contamination de composés organofluorés dans l’aliment pendant une période de 45 jours. Pendant cette période, 8 points de prélèvements seront réalisés à 0, 4, 8, 14, 21, 28, 35 et 45 jours pour suivre les cinétiques de contamination. Cette exposition sera suivie d'une phase d'épuration pendant 2,5 mois avec également 4 points de prélèvements à 48, 53, 75 et 120 jours. Ces prélèvements nécessiteront la mise à mort des poissons.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue correspond à un stress léger pendant les 45 jours de contamination dans les 4 groupes expérimentaux de poissons. Un stress léger supplémentaire (moins d’une minute) sera également généré lors des pêches nécessaires pour la réalisation des prélèvements. Compte tenu de ces deux stress cumulés, les nuisances attendues sont modérées.

Devenir

Mise à mort nécessaire pour réaliser les prélèvements.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier 1/ les cinétiques d’accumulation de contaminants sur des stades précoces (post-larves) dans un contexte de réchauffement climatique ; 2/ paramétrer les effets potentiels de ce multi-stress sur les stades précoces pour appréhender l’impact sur les stades ultérieurs.

Réduction

Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance ont été réalisés. Le nombre d’animaux est estimé afin 1/ d’optimiser les quantités nécessaires pour les différents types d’analyses (chimiques, biochimique et biomoléculaires) ; 2/ de permettre des analyses statistiques fiables malgré la variabilité de la réponse physiologique entre les individus. 3/ le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).

Raffinement

• Un jeûne (minimum 12 heures) sera réalisé avant les manipulations afin d’éviter la régurgitation et le malaise des poissons. • La pêche des poissons se fera à l’aide d’un Becher pour les stades post-larves, puis à l’aide d’une épuisette appropriée à la taille des bacs et des juvéniles. • Au préalable à l’exposition aux contaminants par voie trophique, qui nécessite l’utilisation d’une solution de solvant (méthanol), un test d’appétence a été réalisé sur les recommandations de la cellule SBEA (Structure Bien-Etre Animale) du laboratoire. Aux concentrations utilisées, le méthanol n’altère ni l’appétence de l’aliment, ni la croissance des poissons.

Choix des espèces

Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination par des composés poly et perfluoroalkylés (PFAS) sur la physiologie de cette espèce. Le stade post-larves du bar sera ciblé en particulier puisqu’il est démontré que l’exposition à des changements environnementaux aux stades précoces induit des effets à long terme sur les stades ultérieurs. Par ailleurs, ce stade de vie (fin de développement larvaire) correspond au retour des individus à la côte, où une exposition aux contaminants chimiques est plus importante, particulièrement en zone estuarienne.

1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, subissent des prélèvements de sang et d'urine, un placement en cage métabolique jusqu'à 24 heures, puis une autopsie avec prélèvement des os, pour le compte de clients qui développent des médicaments. Le porteur relie l'intérêt du projet à la qualité de vie de patients humains, mais renvoie ces retombées au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animal ne reproduit le remodelage osseux d'un "organisme entier" et conclut que le recours au rat est "indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet et cette demande de renouvellement afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés en parentérale (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisés sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’administration dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si des prélèvements à l’aorte abdominale sont effectués, ils ne se feront qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant un maximum de 24h où l'urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

1 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des administrations orales et des injections répétées de composés, subissent des prélèvements de sang et d'urine, dont un recueil par pression sur la vessie, avant une autopsie et le prélèvement des os, pour rechercher une toxicité osseuse de médicaments. Le porteur indique qu'une réaction inflammatoire peut apparaître en cas de toxicité. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage de l'os et qualifie l'usage d'animaux d'"indispensable".

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’évaluer les atteintes osseuses potentielles qui pourraient survenir lors de traitements thérapeutiques. En effet, des études de pharmacovigilance ont montré que la fragilisation osseuse peut être induite par des médicaments, par carence ou pertes en calcium, phosphate et vitamine D, ou réduction de la minéralisation / densité minérale de l’os. La classe thérapeutique la plus fréquemment en cause est celle des corticoïdes mais d’autres médicaments sont aussi suspectés comme les antirétroviraux, des antiacides, des médicaments antiépileptiques, des antithrombotiques mais aussi des antidépresseurs, des neuroleptiques, et médicaments utilisés par exemple dans le traitement du cancer du sein. A noter aussi qu’un risque d’ostéoporose est évoqué pour les statines, et retrouvé significatif à forte dose. D’autre part, si le risque d’effets indésirables osseux est plus ou moins bien documenté les mécanismes mis en jeu ne sont pas encore connus avec précision. Il devient donc essentiel et indispensable dans le développement de nouveaux médicaments et tout particulièrement pour les classes thérapeutiques citées ci-dessus, de vérifier l’absence d’effets secondaires délétères pouvant intervenir sur l’os afin de ne pas dégrader la qualité de vie des patients. C’est donc, dans ce contexte que s’inscrit ce projet et cette demande de renouvellement afin d’évaluer sur l’animal les effets secondaires potentiels de composés thérapeutiques actuellement en développement chez nos clients. Les études permettront de définir les types de lésions osseuses qui pourraient être observées, et d’améliorer les schémas thérapeutiques d’administration des composés évalués afin de réduire et/ou abolir les effets délétères, voire même de stopper le développement de certains composés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent sur plusieurs niveaux : - Court terme : chaque protocole inclus dans ce projet, permettra à son échelle d’informer sur la potentielle toxicité osseuse des composés étudiés. - Long terme : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modifications des conditions physiologiques osseuses chez les animaux après application du composé. De plus, ce projet doit permettre d’établir des plans de prévention, prophylaxie (ensemble des mesures à prendre pour prévenir les maladies), et diagnostic robustes indispensables à la prise en charge et au suivi de maladies, chez l'homme et/ou les animaux.

Procédures

Les administrations orales de composés seront réalisées sur animaux vigiles (moins de 5 minutes par administration). Les fréquences d’administration (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les injections de composés en parentéral (sous cutanée ou intramusculaire ou intrapéritonéale : dans le cadrant caudal droit de l'abdomen ventral) seront réalisées sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par injection). Les fréquences d’injection (au maximum 2 fois par jour) dépendent de la prophylaxie des composés testés. Les prélèvements sanguins seront effectués sur animaux vigiles ou anesthésiés (moins de 5 minutes par prélèvement). Un traitement analgésique sera systématiquement appliqué aux animaux. Si un prélèvement à l’aorte abdominale est effectué, il ne se fera qu’en point final sous anesthésie avant sacrifice de l’animal. Les urines pourront être prélevées en cours de protocole sur animaux vigiles, en pressant sur la vessie des animaux (moins de 5 minutes par prélèvement) ou en point final, sur animaux euthanasiés. Elles peuvent être également collectées suite au placement des animaux en cage métabolique pendant 24h au maximum où l’urine libérée par l’animal pendant ce laps de temps sera collectée.

Impact sur les animaux

Une possible réaction inflammatoire pourra apparaître au cours du temps en cas de toxicité osseuse (due à l’administration du traitement thérapeutique). Pour prévenir ce cas de figure, les animaux sont suivis de près et des grilles d’évaluation clinique ainsi que les conduites à tenir en cas de l’observation de ces signes ont été prévus.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires seront utilisés pour doser le composé et/ou évaluer sa toxicité et/ou évaluer les modifications induites par son administration. Les organes seront également utilisés pour doser les composés et / ou réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.

Remplacement

De manière systématique, les composés que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des agents thérapeutiques testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir les différentes constantes du tissu entre les limites des valeurs normales. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l’apparition de lésions osseuses. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux principes actifs et en accord avec l’article R.214-105 du Code rural et de la pêche maritime, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le traitement évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un anesthésique lors des prélèvements sanguins en submandibulaire. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux ou trois fois par semaine. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié. Nous maintiendrons les animaux le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur (lors du traitement expérimental et lors des prises de mesures). Dans la mesure du possible, la prise de mesures sera effectuée dès l’apparition de la première phase de douleur aigüe de manière quotidienne et seulement deux fois par semaine dans les phases de douleurs chroniques

Choix des espèces

La souris a été choisie pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique du rat) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. La souris, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, un volume suffisant de liquides biologiques peut-être récupéré et analysé. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux médicaments. Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et dépendra de l'indication thérapeutique dans laquelle les différents composés seront utilisés.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont contaminés par gavage au césium-137, reçoivent un antidote, puis passent en cage à métabolisme et en tube de contention pour une spectrométrie, avant le prélèvement de leurs organes. L'étude cale un modèle de contamination interne en vue de tester un décorporant, notamment dans un contexte d'"actes de malveillance". Le porteur affirme que le modèle animal reste "indispensable" pour étudier la rétention du césium, tout en reconnaissant que des méthodes in vitro ont servi en amont.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre en place un modèle de contamination interne chez le rat. Il permettra de tester l’efficacité d’un nouvel antidote. Pour être plus efficace que les produits disponibles, cet antidote se présentera sous une autre forme d’administration. Si les résultats obtenus par ce modèle expérimental pilote sont concluants, il sera possible de répondre à des appels à projets en lien avec les actes de malveillance. Si ces études nous permettent de conclure, des études complémentaires seront réalisées pour l’enregistrement et l’obtention d’une nouvelle Autorisation de Mise sur le Marché (AMM).

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à mettre en place un modèle expérimental de contamination interne chez le rat afin de pouvoir tester ultérieurement l’efficacité d’une nouvelle formule de décorporation. Selon les résultats obtenus, nous pourrons compléter ces résultats par des études précliniques nécessaires sur la tolérance. Enfin, si la tolérance attendue est confirmée, nous complèterons par la suite les études nécessaires pour l’obtention d’une nouvelle AMM.

Procédures

Pour l’ensemble des animaux, 40 rats : - gavage à jeun du Cs-137 et de l’antidote oral - injection iv de l’antidote injectable - La collecte des urines et des fèces sera réalisée par passage en cage à métabolisme (durant 24 heures) 4 jours avant contamination puis 24h et 72h après contamination (3 collectes). - Une mesure corps entier par spectrométrie gamma (zooradiamétrie) sera effectuée 4 jours avant contamination, juste après contamination et 24h et 72h après contamination (4 mesures d’environ 20 minutes réalisées en tube à contention après une période d’habituation des animaux).

Impact sur les animaux

Les différentes traitements (injections iv, gavages) peuvent générer du stress dû à la contention et aux interventions pratiquées, un inconfort mineur, une hémorragie ou un hématome ou encore une douleur en cas de geste non maitrisé. Le passage en cages métaboliques peut générer stress et inconfort ; de même pour le passage en tubes à contention. D’après le recul acquis au laboratoire, la contamination à la dose utilisée de Cs-137 ne génère pas de conséquences cliniques notables particulièrement pendant la durée de l’expérimentation (72 heures). L’administration à la dose pharmacologique des 2 produits ne génère pas de conséquence clinique notable chez les animaux. En termes de toxicité, il existe des informations disponibles et publiées sur le Cs-137 et le produit de référence. Des données confidentielles concernant la solution injectable ont en outre été transmises au laboratoire.

Devenir

Le prélèvement des organes sera fait post-mortem (les organes sélectionnés sont des cibles biologiques connues du Cs-137). Les prélèvements concernent tous les animaux du projet

Remplacement

Afin d’étudier la décorporation du Cs-137 et sa rétention au sein d’un organisme biologique complexe, le modèle animal reste indispensable et il n’est pas encore remplaçable totalement par des méthodes alternatives. Cependant des méthodes alternatives (in vitro) ont permis en amont du projet de sélectionner la molécule candidate.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au cours de ce projet, une étude statistique a été menée. Le nombre minimum d’animaux pour obtenir une puissance statistique suffisante est de 10 par groupe. Cet effectif nous fournira des résultats statistiquement robustes.

Raffinement

Les conditions de soins et d’hébergement des animaux sont adaptées à la procédure réalisée afin de limiter au minimum la souffrance animale, une habituation au système de spectrométrie gamma sera réalisée au cours de la phase d’acclimatation pour limiter le stress généré. Si un des indicateurs du bien-être n’était plus respecté, l’euthanasie pourrait s’avérer nécessaire.

Choix des espèces

Le rat est un modèle d’études précliniques utilisé en contamination interne au Cs-137. Les animaux employés dans cette étude pilote seront âgés de 3 mois (stade adulte). Ils permettront de faire la preuve de concept de l’efficacité du modèle expérimental.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections quotidiennes pendant un mois, puis sont soumis une fois à une contention forcée d'une à trois heures destinée à provoquer un stress, avant que leurs organes soient prélevés pour des mesures électrophysiologiques. Le porteur présente ce travail comme une prestation pour des "clients" des industries pharmaceutique et biotechnologique évaluant leurs molécules. Il affirme que l'usage de tissus fraîchement prélevés est "nécessaire" car la complexité des réseaux neuronaux ne se reproduit pas in silico.

Objectifs

Les groupes pharmaceutiques et les sociétés biotechnologiques souhaitent avoir de plus en plus tôt (phases de Recherche et Développement) des informations pharmacologiques fonctionnelles sur leurs molécules en développement pour traiter des maladies du système nerveux central ou pour identifier des molécules anti-stress. Pour une meilleure appréhension (ou prédictibilité) d’éventuels effets secondaires, les agences réglementaires exigent une connaissance complète des cibles et des mécanismes d’action associés à ces nouvelles molécules qui sont soumises à une demande d’autorisation de mise sur le marché. En phase de Recherche et Développement (avant les phases précliniques réglementaires), il n’est pas possible de tester les effets des molécules sur de grande quantité d’animaux, à la fois pour des questions de quantité disponible des molécules (quelques milligrammes le plus souvent) et pour des questions éthiques (aucune idée sur les effets éventuels qui pourraient être observés). Le développement de modèles rongeurs génétiquement modifié (GM) permettent de créer des mammifères mimant des pathologies humaines, leur utilisation est alors un avantage pour l’évaluation de l’efficacité de molécule d’intérêt. Il faut pour cela que ceux-ci soient électrophysiologiquement caractérisés. L'utilisation de tranches et/ou de cellules isolées de système nerveux central (SNC) de rongeurs permet une étude sur l'activité du composé et une information sur ses mécanismes d’action dans le modèle rongeur GM. Pour ce faire, nos laboratoires utilisent deux types de technique le Multi-Electrode Array (MEA) = enregistrements extracellulaires multipoints avec « array » d’électrodes (circuit imprimé) à l’échelle d’une tranche et le Patch-clamp = un enregistrement à l'échelle du neurone. Nous induirons donc un stress chez le rat et enregistreront l’effet de molécule d’intérêt, soit par une exposition, in vivo, au préalable, ou soit par une exposition, ex vivo, sur nos tranches ou cellules. Nous pourrons alors déterminer les effets pharmacologiques et/ou toxiques de nouvelles entités chimiques en développement préclinique afin de permettre à nos clients d’évaluer les propriétés de leur(s) molécule(s) - et/ou les propriétés d’une famille de molécule dans les mécanismes de stress induit par une contention forcée. Le cas échéant, ils pourront ainsi déterminer si une molécule à des propriétés suffisamment pertinentes pour entrer ou non en développement préclinique réglementaire.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mieux caractériser, évaluer et comprendre les effets de futurs candidats médicaments pour traiter les pathologies du système nerveux central liées au stress. Nos techniques mises en œuvre dans ce projet, pour l’évaluation ex vivo des effets pharmacologiques fonctionnels et/ou toxiques sur des explants de tissus vivants, exposés de façon chronique ou de façon aiguë, constitue la meilleure approche car elle permet : - de limiter le nombre d’animaux à tester par l’utilisation de tissus (mesures multipoints sur le même tissu séparé en petits échantillons), - de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de disponibilité dans le système nerveux central et dans la circulation sanguine. Ce projet permet ainsi d’affiner la sélection et l’orientation du développement de futurs médicaments avant de lancer les premières étapes précliniques coûteuses de leur mise sur le marché.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés une fois par jour, au maximum et pendant 3 minutes, pour assurer une exposition in vivo de la molécule à tester. Le protocole est d’un mois. Les contentions répétées nécessaires à ces différentes injections génèrent du stress. Ces animaux traités au préalable peuvent subir ces injections soit par voie orale, soit cutanée ou soit par intrapéritonéale. Ils seront, pour les groupes subissant le stress, exposés, une seule fois entre une et trois heures, au maximum, à une contention qui a pour but de générer du stress que nous cherchons à étudier.

Impact sur les animaux

Notre procédure amène des effets indésirables : *-la manipulation régulière d’un animal, générer du stress. *-l’injection régulière, provoquer des effets indésirables au site d’injection. ; + effets secondaires potentiels des molécules *-Ce projet a pour but de déclencher du stress par une contention forcée d’une à trois heures, nous permettant l’étude des mécanismes du stress.

Devenir

A l’issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort car nous utiliserons les organes pour nos mesures.

Remplacement

Les réactions, après un stimulus générant du stress, sont complexes et mettent en jeu les organes sensoriels, les nerfs sensoriels et une intégration au niveau le système nerveux central, permettant une réaction adaptée. Parce qu’il n’est pas envisageable de réaliser sur l’homme les tests que nous proposons et que la gestion de stress pathologique présente un intérêt de recherche important, nous évaluons et et/ou caractérisons des molécules d’intérêt dans le traitement du stress induit chez le rat. Il nous est nécessaire de réaliser des observations sur des réseaux neuronaux natifs et connectés, « donc les plus physiologiques possibles ». Et ces réseaux doivent être en situation de stress. Pour cela nous devrons, en effet, tester des molécules avec des effets potentiellement inconnus, en les administrant à un rat préalablement stressé. De plus, nos techniques nous obligent à l’utilisation de tissus fraichement prélevés, car il n’est pas possible, in silico, de reproduire la complexité de ces connexions et/ou la particularité d’un neurone spécialisé.

Réduction

Par nos techniques, nous réalisons plusieurs tranches pour une noyau cérébral donné, chaque tranche peut subir un protocole particulier. Nous pouvons, par exemple, à partir d’un même cerveau tester plusieurs concentrations d’un même composé, ou plusieurs composés, ou plusieurs protocoles d’enregistrement, chaque protocole répondant à une question particulière. Alors, notre capacité à utiliser un même animal pour plusieurs mesures et plusieurs conditions d’exposition, diminue le besoin en nombre d’animaux et nous permet de faire, dans un premier temps, une analyse pharmacologique/toxicologique précise à l’échelle du tissu et/ou du neurone et/ou de la protéine tout en s’affranchissant des problèmes de passage de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et des problèmes de pharmacocinétique. Grâce à notre expérience sur les projets antérieurs, nous avons déterminé que 6 animaux contrôles et 6 animaux d’intérêt nous permettent de valider 24-30 neurones ou 18-30 tranches. Compte tenu des variations inter-individus de réponses au stimulus stressant dans ce projet, nous devons augmenter à 10 animaux maximum par groupe. Après la première étape, nous pourrons évaluer la significativité statistique. Si celle-ci est présente, l’étape suivante pourra donc être menée en proposant quatre conditions différentes maximum. Si elle est absente, l’étude sera suspendue.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux (2 rats adultes/cage). Ils bénéficieront d’enrichissement adapté, deux types différents par cage (système permettant la création de nid soit tunnel ou soit pièce de bois à ronger par exemple). Cet enrichissement est validé par le fournisseur ou le partenaire. Les animaux utilisés seront habitués aux différentes contentions utiles pour les voies d’administration des composés à tester. Nous diminuerons les futurs stress dus à ces manipulations. Ces administrations seront réalisées par du personnel compétent et formé en respectant les recommandations vétérinaires. Les solutions injectées seront contrôlées pour s’assurer de leur innocuité. Les animaux seront surveillés deux fois par jour et pesés. Les animaux génétiquement modifiés auront quatre jours d’acclimatation et un mois d’hébergement maximum avant d’entrer dans le projet. Il se fera en groupes sociaux de 2 animaux en mélangeant les génotypes pour assurer la meilleure expression de phénotypes normaux. Chaque lignée modifiée aura une documentation de suivi spécifique répertoriant les symptômes possibles. Les animaux seront asymptomatiques. Toute perte de poids en deçà de la limite préétablie entrainera une sortie du test et des soins en accord avec le responsable de projet et le vétérinaire. Grâce à notre expérience et nos connaissances scientifiques sur des tests que nous maitrisons, nous avons pu établir un nombre d’animaux par condition d’étude soit 10 animaux contrôles et 10 animaux d’intérêt, nous permettant d’obtenir une bonne significativité, réduisant considérablement le besoin en animaux.

Choix des espèces

La grande quantité d’informations scientifiques disponible sur le fonctionnement du système nerveux central des rongeurs, ajoutée à la maîtrise de leur élevage, de leur génétique, de leur relative petite taille et au développement de technique d’enregistrements électrophysiologiques sur explants vivants font de cette espèce un modèle de choix pour l’évaluation pharmacologique de molécules. Ponctuellement, nous utilisons d’autres lignées de cette espèce, après discussion de la pertinence du modèle espèce-lignée-lignée génétiquement modifiée-protocole avec notre client. Toute demande de caractérisation de lignée modifiée fera l’objet d’une analyse bibliographique et circonstanciée en amont. L’impact du phénotype devra être décrit. Nous ne travaillerons qu’avec des animaux asymptomatiques. L’âge des animaux testés est déterminé en fonction du type de test et d’une analyse bibliographique. Nous travaillerons avec des animaux adultes (minimum 6 semaines d’âge) ou âgés en fonction des cibles fonctionnelles à observer et de l’évolution de la pathologie considérée liée au stress. Les choix de l’espèce, de la lignée et de l’âge sont validés en collaboration avec le client. En effet, l’expression phénotypique de la pathologie et/ou d’un déficit et/ou d’une lésion est souvent déterminante pour le choix de l’âge d’utilisation des animaux.

1 600 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent par gavage quotidien des composés perturbateurs de la thyroïde, et leur descendance subit un test auditif par clic mécanique dès l'âge de dix jours ainsi qu'un test de retournement sur le dos. Les animaux sont ensuite tués pour prélever sang, foie, thyroïde et cerveau. Le porteur présente le projet comme un effort de mise au point de méthodes sans animaux, tout en affirmant que des données in vivo chez le rat restent "nécessaires" pour valider ces méthodes.

Objectifs

Les études conduites chez le rat, en parallèle d’essais sur cultures d’hépatocytes et de thyrocytes, auront pour objectifs d’augmenter la connaissance des mécanismes d’action notamment quantitativement de perturbateurs thyroïdiens, directs ou médiés par le foie, sur le neurodéveloppement. Le projet sera utilisé pour étudier précisément le mode d’action de produits déjà étudiés et référencés, connus dans la littérature, agissant comme perturbateurs thyroïdiens. Plusieurs types d’études seront conduites dans le cadre de ce projet. Ces études seront conduites chez la femelle gestante pour étudier l’effet toxique des produits sur la femelle et sur sa descendance. Ainsi trois types de procédures expérimentales sont détaillées : 1. Etudes préliminaires pour la validation des choix des doses et de choix de dose de toxicité du développement chez le rongeur gestant et juvénile. 2. Etudes définitives pour l’étude du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances exposés à des composés ayant une action de perturbation thyroïdienne lorsqu’ils sont administrés à une dose élevée unique à la mère pendant la période de gestation et de lactation (validation qualitative des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs). 3. Etudes d’évaluation du développement neuronal et de la fonction de la thyroïde chez les rats femelles et leurs descendances lorsque les composés sont administrés à des doses croissantes pendant la période de gestation et de lactation (validation quantitative des seuils de dérégulations des évènements clefs impliqués dans le mode d’action de ces perturbateurs).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont multiples : tout d'abord une meilleure connaissance phénotypique et moléculaire d’une altération du neurodéveloppement médié par une baisse d’hormones thyroïdiennes. D'autre part, une démonstration d’un effet dose et d’un effet seuil. Enfin, le but ultime du projet : la création d'un modèle mathématique capable de prédire à partir des résultats d'essais in vitro notamment sur hépatocytes la quantité de baisse d'hormones thyroïdiennes chez le rat et d'en déduire des possibles effets sur le développement cérébral.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures incluant: Un gavage journalier sur femelles adultes vigiles, se faisant en 15 secondes environ, tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l'âge des animaux. Afin d’évaluer si le développement des petits est normal: les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours pour tester le développement du système auditif, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner.

Impact sur les animaux

Les effets toxiques attendus seront modérés car aux doses testées des 2 produits de référence connus, peu d’effets cliniques sont attendus. Les femelles gestantes sont hébergées individuellement pendant la gestation (14 jours), ce qui peut induire un stress léger. Afin d’évaluer si le développement est normal: pour le système auditif, les petits seront isolés quelques minutes et soumis à un son extérieur (clic mécanique) à partir de l’âge de 10 jours, chaque jour jusqu’à l’obtention d’une réponse positive au test. L’animal sera également déposé sur le dos pour évaluer sa capacité à se retourner. La nuisance engendrée est un stress léger car les tests sont peu invasifs et non douloureux. Les produits sont administrés une fois par jour par gavage aux mères (procédure inférieure à 15 sec). Cette procédure à l’aide de sonde souple n’est pas douloureuse mais peut induire un stress léger.

Devenir

Les animaux seront mis à morts afin de prélever du sang et des organes (foie, thyroïde et cerveau) qui seront utilisés pour de multiples analyses (dosage d'hormones, évaluation histopathologique et moléculaire notamment).

Remplacement

Le projet s’inscrit totalement dans le R de Remplacement de « la règle des 3 R » en recherche animale, inscrite dans la Directive 2010/63/UE. Ce projet a justement pour objectif la mise au point de méthodes dites alternatives ou nouvelles approches méthodologiques (NAMs) pour remplacer les études utilisant des animaux par des méthodes de culture cellulaire (ici hépatocytes et thyrocytes, 2D et 3D) combinées à des méthodes informatiques (in silico). Elles permettront de prédire l’effet sur les hormones thyroïdiennes en fonction de l’impact des produits sur les enzymes hépatiques mesurées in vitro et sans recourir à l’animal. Pour valider ces nouvelles méthodes et cette extrapolation entre méthodes in vitro et méthodes in vivo, des données sont nécessaires in vitro mais aussi in vivo chez le rat que concernent cette demande d’autorisation de projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est le nombre minimum nécessaire et suffisant pour répondre de manière robuste aux questions posées. Les études seront conduites de manière séquentielle avec un nombre d’animaux croissants. Ainsi la première étude se fait avec un nombre d’animaux par groupe réduit (4) pour valider le choix des doses et les techniques moléculaires innovantes. Par la suite le nombre d’animaux est augmenté pour avoir une puissance statistique suffisante concernant les paramètres étudiés. Ce projet participe à l'effort de mise en place et de validation de méthodes alternatives pour réduire globalement le nombre d’animaux utilisés en Toxicologie. En effet, l’objectif est de promouvoir les produits au profil le plus favorable et le moins risqué dans les phases avancés (celles qui nécessitent toujours l’utilisation d’animaux d’un point de vue réglementaire), en testant d’abord les produits à travers ces nouvelles méthodes alternatives. De ce fait, un nombre plus restreint de produits resteront à être testés chez l’animal et avec de plus grandes chances de donner des résultats favorables, ce qui réduirait de facto le nombre d’études nécessaires et donc d’animaux.

Raffinement

Les paramètres étudiés sont beaucoup plus nombreux que ceux classiquement testés dans les lignes directrices de l’OCDE, notamment en incluant des biomarqueurs moléculaires au niveau cérébral, comme des spatial OMICs, ce qui permet d’obtenir un plus grand nombre d’informations pour le projet. Ces études sont réalisées avec des produits de référence connus à des doses choisies pour perturber l'homéostasie de l'axe hypothalamo- thyroïdien tout en minimisant les nuisances sur le bien-être animal. Dans ces études les animaux sont hébergés dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence en toxicologie. On s'appuie sur des données scientifiques publiées chez le rat. Les mécanismes de développement du système neurologique du rongeur sont souvent similaires à ceux de l’homme et, ainsi, les données générées chez le rongeur peuvent être extrapolées à l’homme. Ces études seront conduites chez la femelle gestante et allaitante et sa descendance. En effet, la fenêtre d’exposition encadrant la naissance jusqu’à la fin de la lactation a été montrée comme étant la plus sensible aux traitements pouvant impacter le neurodéveloppement.

Un dispositif de contention fixé sur le crâne lors d'une chirurgie d'une heure au plus permet ensuite de faire tourner 110 rates pour enregistrer leurs mouvements oculaires. 242 rates Long Evans vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 140 enfermées 6 heures par jour, cinq jours de suite, pendant une ou quatre semaines, dans des enceintes où elles respirent du styrène ou des isomères du xylène, et 80 témoins à l'air filtré, puis toutes tuées par perfusion intracardiaque pour l'histologie de l'oreille interne. Aux concentrations élevées, le porteur prévoit un effet dépresseur sur le système nerveux central et des effets narcotiques, qui ne devraient pas persister plus d'une heure après la sortie des enceintes. L'étude doit confirmer une toxicité pour l'équilibre suggérée in vitro sur des cultures d'organes issus de rats nouveau-nés. Le porteur annonce aussi deux tests comportementaux de l'équilibre, passés trois fois par 110 rates, sans les nommer.

Objectifs

Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.Cette étude qui consiste à comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux localisés au niveau de l’oreille interne apportera pour la première fois des données sur la dangerosité éventuelle des solvants sur l’équilibre au niveau périphérique. Par ailleurs, cette étude permettra de valider des données obtenues in vitro suggérant un potentiel effet toxique de certains solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre et permettra de proposer ce test comme test de criblage.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de valider des résultats obtenus précédemment avec un test in vitro obtenu à partir de cultures d’organes récepteurs de l’équilibre de rats nouveau-nés et exposées aux mêmes solvants. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro alors ce test pourra être proposé comme test de criblage afin d’identifier les produits industriels rencontrés par les salariés lors d’exposition professionnelles et susceptibles perturber l’équilibre. Par ailleurs, cette étude permettra de comparer la toxicité de solvants aromatiques sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre tous deux situés dans l’oreille interne et apportera des informations nouvelles sur la toxicité potentielle des solvants aromatiques sur le récepteur de l’équilibre, sujet non traité dans la littérature jusqu’alors.

Procédures

Chirurgie crânienne: 110 rates sont équipées d’un dispositif de contention sur le crâne, pour enregistrer le mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par mise en rotation de l’animal. Cette intervention chirurgicale est réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excède pas une heure par animal. Elle est réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures sont effectuées sur les 110 rates ayant subi une chirurgie. Elles sont réalisées avant exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré (T0), après une semaine d’exposition (T1) et après 4 semaines de récupération (T2). Ces mesures nécessitent une mise en contention. Cette procédure ne dure pas plus de à 10 minutes par rate. Tests comportementaux : A T0, T1 et T2, 110 rates sont soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire. Moins de 10 minutes sont requises pour effectuer ces tests. Une fois effectués, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 110 rates sont soumises à une anesthésie médicamenteuse légère pour enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir placé une sonde au niveau de l’oreille. Ces mesures sont effectuées à T0, T1 et T2. Quinze minutes par rate sont nécessaires. Exposition par inhalation au solvant ou à l’air filtré dans des enceintes d’inhalation : Les rates sont disposées dans des enceintes 6 heures/jour pendant 5 jours consécutifs durant 1 semaine voire 4 semaines (4 x 5 jours) et sont exposées soit aux solvants (140 rates) soit à de l’air filtré (80 rates). Prélèvement sanguin à la veine caudale : 56 rates sont soumises à un prélèvement sanguin à la veine caudale sous anesthésie gazeuse. Le prélèvement est réalisé 1 seule fois à l’issue de l’exposition au solvant ou à l’air filtré. La procédure ne dure pas plus de 5 minutes par animal. Au terme des expérimentations, les animaux sont mis à mort par perfusion intracardiaque pour réaliser l’histologie de l’oreille interne.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule, qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. L’étude in vivo se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène (ortho, méta et para) par voie inhalatoire 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 5 jours (ou 4 semaines à raison de 5 jours par semaine). L’évaluation de la toxicité se fera par le biais de mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochléotoxiques et vestibulotoxiques. Ces techniques auront été préalablement validées et calibrées à l’aide d’une molécule, l’iminodipropionitrile, reconnue être à la fois cochléo-et vestibulotoxique. Cette pré-étude a fait l’objet d’une demande d’autorisation de projet. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que des tests comportementaux pour l'équilibre. Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus-post rotatoire ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure du nystagmus-post rotatoire et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie, surface des cages). Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de respecter leur rythme. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper d’un dispositif de contention, seront hébergés seuls pendant une semaine afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à leur nouvel environnement et à être manipulés. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignés à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

60 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée pour analyse et le reste réutilisé ou gardé en vie selon l'avis du vétérinaire. Chaque animal subit sous anesthésie jusqu'à dix injections intradermiques et dix biopsies de peau, après tonte des flancs, pour évaluer la tolérance cutanée de composés candidats médicaments. Le porteur indique que les composés testés peuvent provoquer irritations, inflammations et gonflements. Il rappelle que les dossiers réglementaires exigent au moins deux espèces dont une non-rongeur et retient le mini-porc pour la proximité de sa peau avec celle de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la tolérance de composés au niveau du derme de la peau. Les informations apportées permettent de modéliser le comportement de la molécule dans l’organisme, et contribuent au choix de la voie d’administration et/ou des doses pour les études réglementaires soumises aux autorités de santé pour l’enregistrement de tout nouveau médicament. Elles participent à la sélection de molécules en vue d’une future administration chez l’Homme.

Bénéfices attendus

Les études réalisées dans le cadre de ce projet ont pour but d’évaluer la réaction cutanée suite à l'injection de molécules avant le passage au stade clinique afin d’anticiper les éventuels effets indésirables. Le bénéfice attendu est une meilleure connaissance du comportement biologique des molécules testées, ce qui permettra d’adapter si besoin les conditions d’administration pour permettre d’améliorer la sécurité en vue d’une future administration chez l’Homme.

Procédures

Tonte sous anesthésie : maximum 30 minutes si les 2 flancs sont tondus Injections intradermiques sous anesthésie : maximum 1min pour une injection intra dermique de 100µl Biopsies sous anesthésie et analgésie : environ 5 sec par prélèvement Au total chaque animal recevra au maximum : 10 injections intradermique et sera soumis à 10 biopsies de peau.

Impact sur les animaux

Les tontes, les administrations intradermiques et les biopsies devant être réalisées sur un animal parfaitement immobile, les animaux seront anesthésiés afin d’éviter une contention prolongée, et de limiter au maximum leur stress et d’éviter toutes lésions/irritation après la tonte par exemple. Les prélèvements pouvant potentiellement induire une certaine douleur, une analgésie est prévue. Les composés testés pourront induire des irritations, inflammation, gonflement et feront donc l’objet d’un suivi quotidien des animaux.

Devenir

Les animaux surnuméraires ou les animaux de l’étude pourront être réutilisés dans une autre procédure expérimentale si aucun effet sévère n’est observé à la fin de l’étude, qu’ils ont recouvré leur bien-être général et après avis favorable du vétérinaire désigné. Certains animaux pourront éventuellement être replacés après accord du vétérinaire désigné. D’autres seront euthanasiés afin de prélever des tissus en vue d’analyses histologiques.

Remplacement

Un organisme entier est nécessaire pour caractériser la réaction cutanée de molécules présentant un potentiel thérapeutique, en effet aucun modèle non animal à l’heure actuelle ne peut modéliser la complexité de la réponse immunitaire locale des différentes couches de la peau.

Réduction

Les molécules évaluées auront auparavant été testées dans des tests sur des cellules en laboratoire in vitro afin de n’évaluer que des molécules présentant un potentiel thérapeutique élevé et ainsi réduire le nombre de mini porcs utilisés dans ce projet. Des groupes de 8 animaux au maximum seront utilisés pour évaluer chaque molécule (4 males et 4 femelles). Cependant 4 animaux seront préférentiellement utilisés pour chaque molécule dans le cas où les effets potentiels du produit sont indépendants du sexe de l’animal, ce qui permet d’obtenir des analyses statistiques robustes et une interprétation scientifique des données. Afin de réduire le nombre d’animaux, un effort sera porté sur la réutilisation d'un même animal, après avis favorable du vétérinaire désigné, pour tester une autre voie d’administration, une autre formulation, ou un autre candidat médicament. Dans ce cas, un délai sera respecté pour que l’animal puisse récupérer et pour garantir l’élimination de la molécule de l’organisme.

Raffinement

A l’arrivée, une période d’acclimatation d’au moins 15 jours sera appliquée afin qu’ils s’habituent à l’environnement, aux conditions d’hébergement et aux interactions avec le personnel. La première semaine, les interactions seront limitées à la présence humaine, y compris dans les box avec possibilité de contact physique (palpation des oreilles, cou, dos, pattes…) et habituation à la pesée. A partir de la semaine2, l’habituation aux situations auxquelles les animaux pourront être soumis dans l’étude pourra commencer avec l’habituation aux techniques de contention (préhension, mise en place dans le hamac, …) afin de limiter le stress des animaux pendant l’étude. Aucun geste invasif ne sera pratiqué pendant cette période. Si cela ne nuit pas à l’expérimentation, un morceau de fruit pourra être donné en récompense, et le milieu environnemental pourra être enrichi par l’apport de jouets adaptés (balles, mordillots…). De la musique peut également être présente dans les salles d’hébergement. Afin de limiter le stress, les animaux pourront être légèrement anesthésiés par anesthésie gazeuse au masque de courte durée avant les tontes, administrations et les prélèvements, à condition que cela n’interfère pas avec les objectifs de l’étude. Cette anesthésie restera de courte durée et sera réalisée en plaçant l’animal sur un tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie. Une analgésie est prévue pour les biopsies de peau. Afin de s’assurer du bien-être animal, les animaux seront observés quotidiennement. En particulier, ils seront observés après chaque geste technique (administration, prélèvement), afin de s’assurer de l’absence d’effet indésirable inattendu. Après les biopsies, un pansement sera appliqué sur la plaie, En cas d’altération de l’état de l’animal, la surveillance sera rapprochée et il sera soigné selon les recommandations du vétérinaire et en accord avec le directeur d’étude.

Choix des espèces

Les dossiers réglementaires nécessaires à l’enregistrement de nouveaux médicaments requièrent des données d’études sur au moins deux espèces animales mammifères dont une non-rongeur. Le mini porc est une des espèces non-rongeur qui peut être utilisée. En particulier, le mini porc est souvent utilisé pour les études concernant les réactions cutanées en raison des similarités physiologiques et morphologiques avec la peau humaine, décrites dans la littérature. Les mini porcs utilisés sont âgés au minimum de 6 semaines à réception (animaux sevrés) et au maximum de 12 mois. D’une manière générale, le poids est un facteur déterminant pour la quantité de médicament administré à l’animal (souvent en faible quantité à ce stade de développement) mais également en termes de manipulation de l’animal. Aussi l’âge maximal est fixé à 12 mois pour limiter les difficultés de contention qui peuvent être préjudiciables au bien-être animal. Les animaux seront préférentiellement utilisés à partir de 9 semaines. En effet, c’est à cet âge que l’épaisseur des différentes couches de la peau se rapproche de celle de l’Homme adulte.