Toxicologie (hors obligations réglementaires)

3 260 souris vont être utilisé·es, dont 2 960 réutilisées dans d'autres procédures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent des cellules souches humaines après irradiation, puis des injections, gavages et prélèvements sanguins répétés jusqu'à huit fois, avec un suivi par imagerie. Il s'agit d'une plateforme produisant à la demande des souris "humanisées" pour le système immunitaire, fournies à des laboratoires pour tester vaccins et traitements. Le porteur présente ce modèle comme une alternative au primate non-humain et affirme qu'il est le "seul modèle d'hématopoïèse humaine expérimentale".

Objectifs

L’étude in vivo de la physiopathologie de nombreux pathogènes humains ainsi que l’analyse de l’activité et de l’innocuité des traitements et vaccins contre ces pathogènes ne peut être réalisé chez l’Homme pour des raisons éthiques. Pour répondre à la nécessité croissante d’utiliser des modèles expérimentaux reproduisant l’infection par ces pathogènes dans un modèle expérimental, des modèles de souris humanisées pour le système immunitaire (souris HIS) ont été développés au cours des deux dernières décennies. Ces souris HIS sont des modèles in vivo précliniques qui permettent d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…). Dans ce projet, nous proposons de produire des souris HIS qui seront par la suite soit utilisées par des laboratoires de recherche dans le cadre de leurs projets de recherche sur les pathologies humaines et/ou de développement de nouveaux vaccins ou traitements. Dans ce projet, nous testerons l’activité de nouvelles immuno-modulateurs thérapeutiques ou de nouveaux vaccins afin de tester leur activité et/ou leur impact sur le système immunitaire humain.

Bénéfices attendus

Ces souris HIS générées dans ce projet permettront d’étudier l’immunité antitumorale, les interactions hôte/pathogène de pathogènes humains mais également de tester l’efficacité et la toxicité potentielle de nouveaux vaccins ou traitements (anticorps, immunomodulateurs…).

Procédures

irradiation (1 par animal, durée : quelques minutes) - prélèvement sanguin (1 à 8 par animal, durée : quelques secondes, intervalle 2 à 4 semaines) - injection hydrodynamique (1 par animal, durée 7-8 secondes) - injection intra-péritonéale (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1jour à 1 mois) ) - injection intra-veineuse (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - injection intra-musculaire (1 à 3 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1semaine à 1 mois) - injection sous-cutanée (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) -administration dans eau de boisson (1 à 8 par animal, durée 24h à 1 mois, intervalle 1 jour à 1 mois) - administration par gavage (1 à 8 par animal, durée quelques secondes, intervalle 1 jour à 1 mois) - imagerie IVIS (2 à 10 par animal, durée 5min, intervalle entre 3 jours et 1 mois)

Impact sur les animaux

Immunodéficience : du fait de leur degré d’immunodéficience, ces animaux sont très sensibles aux infections. TSLP : Après irradiation les souris transgéniques pour TSLP peuvent développer avec l’âge des tumeurs d’origine murine. Après humanisation, ces souris peuvent développer des dermatites. L’apparition des signes cliniques est suivie régulièrement et des soins seront apportés en cas d’apparition de symptômes. Irradiation : de potentiels effets néfastes à long terme de l’irradiation, tels que le développement de tumeurs, pourraient apparaitre. Cependant, cette procédure est appliquée depuis de nombreuses années dans le laboratoire et il n’a été constaté des signes cliniques de ces effets néfastes que dans une minorité (5 mois). Injection Hydrodynamique : un risque de dyspnée peut arriver dans les 5-10 minutes après injection. Si une dyspnée est observée la souris sera mise à mort.

Devenir

Les animaux portant un système immunitaire humain générés dans une procédure pourront être inclus d'autres procédures du même projet (par exemple pour booster certaines cellules humaines, augmenter le nombre de cellules myeloides humaines, valider l’activité d’immuno-modulateurs) ou d'autres projets à la demande des utilisateurs de la plateforme). Les autres souris utilisées pour valider l’activité d’immuno-modulateurs seront mises à mort pour analyse des différents organes post-mortem.

Remplacement

Les modèles in vitro ne permettent pas d’étudier la réponse du système immunitaire humain dans son ensemble, contre des tumeurs ou des pathogènes à tropisme exclusivement humain ni de prédire l’efficacité et l’innocuité de nouveaux vaccins ou traitements immunomodulateurs contre ces tumeurs ou pathogènes. Historiquement, le modèle de choix pour ces études est le primate non humain, le modèle de souris HIS est un modèle alternatif qui peut permettre de limiter le nombre d’études sur le primate non humain.

Réduction

Nous évaluons notre niveau de production de souris HIS à 380 souris la première année, 570 la deuxième année, 770 chaque année pour les 3 années suivantes, soit un total de 3260 souris sur 5 ans. Ces chiffres ont été calculés en tenant compte 1. du nombre d’opérateurs de la plateforme (facteur limitant la production la première année et qui passera de 2 à 4 FTE entre les années 1 et 3), 2. du nombre d’utilisateurs intéressés par les modèles développés par notre plateforme qui est estimé à 4 la première année, 6 la deuxième année et devrait se stabiliser à 8 par an à partir de la 3ème année. 3. du fait qu’environ 80% des animaux présenteront un niveau d’humanisation >10%, 4. du fait que la plateforme fournira en moyenne 75 souris humanisées par utilisateur et par an (15 pour étude pilote et 30 pour expérience principale, en comptant 1 étude pilote et 2 expériences principales /utilisateur/an).

Raffinement

La planification des expériences en amont et la concertation entre le personnel de la plateforme et les utilisateurs sont des atouts pour l’élaboration d’une méthodologie efficace, et le recours à un nombre limité d’animaux. Par ailleurs, lorsque cela sera nécessaire, des études pilotes seront réalisées en amont des études principales. Enfin, l’état clinique (pelage, mouvement, activité, pâleur, signes de bagarres, apparition de tumeurs) des animaux sera suivi deux fois par semaine pour permettre la détection de signes de souffrance. En cas d’apparition de signes de souffrance, un analgésique pourra être administré aux souris. Si les signes de souffrance persistent, une mise à mort sera effectuée pour prévenir toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris humanisée présentant un système immunitaire humain (HIS) est le seul modèle d’hématopoïèse humaine expérimentale. Il s’agit d’un modèle de petite taille, d’une manipulation aisée et d’un coût relativement faible par rapport aux modèles classiques de l’infection (primates non-humains). A l’heure actuelle, seule la souris propose un niveau d’ingénierie génétique suffisante pour permettre la construction à façon de souches profondément immunodéficientes, ce qui est la condition sine qua non à une prise de xénogreffe humaine efficace et prolongée. Les souris HIS sont générées par injection de cellules souches isolées dans des souriceaux nouveau-nés de moins de 9 jours car les nouveaux nés sont plus permissifs à la greffe dans les premiers jours de vie. Le contrôle qualité par vérification du niveau d’humanisation dans le sang sera réalisé à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines. Ce nombre de semaines correspond au temps minimum nécessaire au développement du système immunitaire humain dans une souris à partir de cellules souches hématopoïétiques. Les souris HIS seront ensuite utilisées entre 12 et 25 semaines de vie. Cet intervalle d’âge correspond à la période pendant laquelle le système immunitaire humain est le plus stable chez la souris.

1 664 ombles chevaliers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les effets d'un toxique issu des particules d'usure de pneu et d'une hausse de température. Les poissons sont exposés dès les premiers stades de vie à la molécule 6PPD-quinone par balnéation, puis filmés par groupes de cinq pour mesurer leur activité et leur vitesse de nage. Le porteur indique attendre une mortalité d'environ 10 % liée à la température et une hausse supplémentaire liée au toxique, et tue tous les individus, ces stades précoces étant jugés les plus sensibles. Il affirme que le modèle poisson n'est "pas remplaçable ni substituable" pour cette question.

Objectifs

Les lacs péri-alpins tiennent une place particulière en raison de leur réserve en eau douce, et des nombreux services écosystémiques rendus. Néanmoins, ces derniers constituent également une zone importante de stockage des micro-plastiques, dont la majorité serait des résidus de pneus dus à un intense trafic routier. Une étude a mis en évidence une forte contamination du lac Léman aux micro-plastiques dont 60% sont des particules de pneus (TWP pour tire wear particles). La connaissance des impacts de ces micro-plastiques sur la faune aquatique reste encore parcellaire, en particulier sur les poissons. Quelques études ont porté sur les produits issus de la dégradation de la gomme des pneus et de ses additifs, dont beaucoup sont toxiques pour les poissons. En effet, les 2/3 des TWP et autres débris déposés sur la route peuvent ruisseler avec la pluie. La molécule 6PPD-quinone (6PPD-Q), dont la source principale dans les milieux aquatiques provient du lessivage des particules de pneus à partir des routes, est connue pour sa forte toxicité pour les organismes piscicoles et sa présence en quantité non négligeable (jusqu’au mg/L) dans l’eau de ruissellement de chaussée. Elle a récemment été identifiée comme responsable du « syndrome de mortalité par ruissellement urbain » chez le saumon coho adulte et semble particulièrement toxique pour les salmonidés. Le mode d'action précis de la 6PPD-Q est toutefois encore inconnu sur les stade embryo-larvaire, même s’il semble être lié à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Les effets de la 6 PPD-Q sur les premiers stades de vie de ces salmonidés sont encore indéterminés à notre connaissance. Les effets sont connus chez les larves de zebra fish, ou cette molécule n’entraine pas d’augmentation de la mortalité mais à des effets neurotoxiques et entraine de nombreuses malformations cardiaques. A ce titre, nous nous proposons d’explorer les effets de cette molécule sur les premiers stades de vie de l’omble chevalier qui est un salmonidé vivant dans les lacs péri-alpins. De plus, l’omble chevalier est un bon candidat pour ce projet car il possède un temps de vie embryolarvaire long (4-5 mois), connu et maitrisé par le laboratoire. De plus, l’étude de l'impact d'une molécule toxique est classiquement analysée au stade juvénile, stade qui permet plus facilement de mettre en évidence des effets sur la mortalité, le développement, effets tératogènes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise donc à produire des connaissances et un seuil de toxicité des effets de la contamination à la 6PPD-Q durant premiers stades de vie de l’Omble Chevalier, salmonidé vivant dans les lacs peri-alpins dans un contexte de réchauffement climatique.

Procédures

Les animaux feront l’objet de prise vidéos pour l’observation de leur comportement lors des stades d’alimentation exogéne (750 DPF) et juvénile (840 DPF). Ainsi, les animaux seront testés par groupe de 5, ils seront acclimatés durant 2h dans le système expérimental et seront filmés à l’aide d’une webcam connectée à un ordinateur placé hors de la salle de test (afin de ne pas déranger les poissons durant le test) durant 10 minutes. Ces tests permettent d’évaluer différents comportements, tels que l’activité, la vitesse de nage, grâce à un logiciel de suivi vidéo. Ainsi, la prise de vidéo ne devrait impliquer qu’un léger stress du au changement de bac.

Impact sur les animaux

Compte tenu du peu de connaissance de l’impact de la 6PPD-Q sur les poissons non modèle aux stades embryolarvaires, nous pouvons supposer que les effets devraient être modérés car les doses de 6PPD-Q testées sont des doses environnementales. La seule étude à notre connaissance portant sur les premiers stades de vie a été réalisée sur les larves de zebra fish, où peu de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) pour les concentrations testées dans ce projet. De plus, pour les animaux incubés à 8,5°C nous pouvons nous attendre, au vue de la littérature, à une hausse de la mortalité de 10%.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérimentation car d’après la littérature, les premiers stades de vie sont les plus sensibles aux molécules toxiques ainsi il sera inutile de poursuivre les expérimentations au-delà des stades de développements cruciaux choisis.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé pour répondre à la problématique posée (règle des 3 R : Remplacement) étant donné le peu de connaissance sur les premiers stades de vie de poisson et en particulier sur les salmonidés qui semble particulièrement sensible à la 6PPDQ. Ainsi, le modèle poisson est pertinent pour cette étude car il n’est pas remplaçable ni substituable.

Réduction

mixtes (GLM). L’effectif de 60 individus par temps de prélèvement est un minimum pour avoir la quantité de matière nécessaire à nos analyses, mais également pour prendre en compte la variabilité interindividuelle, tout en limitant au maximum le nombre d’individus mis à mort (Règle des 3 R : Réduction). 1 440 individus seront utilisés et mis à mort (60 individus prélevés par temps de prélèvement * 2 conditions thermiques) * 6 conditionnements (témoin eau 0ng/l, témoin éthanol 1.5ng/l stade 200 DPF puis eau claire, 1.5ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le développement embryo-larvaire, 3ng/l stade 200 DPF puis eau claire ; 3ng/l avec balnéation de la 6PPD-Q durant le stade embryo-larvaire) * 2 stades de développement (740 DPF et 820 DPF) = 1 440 individus. Au total pour l’expérimentation, nous aurons besoins de 1 440 individus pour les mesures morphologiques et comportementales. Nous pouvons prévoir une mortalité maximum au cours de l’expérimentation d’environ 10% dû à la hausse de température durant le développement embryo-larvaire . Ainsi, 1584 (1440+1440*0,1) individus seront utilisés pour l’effet température. Si nous nous basons sur la seule étude de toxicité de la 6 PPD-Q réalisée au stade larvaire sur les larves de zébra fish à nos concentrations nous pouvons nous attendre à avoir de faible hausse de mortalité (2.26% de mortalité à 1ng/L et 7.5% de mortalité à 10ng/L) , les expérimentations sur l’omble chevalier adultes à nos doses ne montrent pas de mortalité , nous pouvons nous attendre à une hausse de 5% en raison de son affinité présumé pour les salmonidés. Ainsi, 1664 (1584+1584*0,05) individus seront utilisés au cours de l’étude

Raffinement

L’eau sera renouvelée au 2/5 (soit 16 L) tous les 2 jours à partir du commencement du nourrissage soit à 700 DPF pour éviter une accumulation de déchets métaboliques, favorable aux pics azotés et à la survenue de pathogènes. Les animaux seront visités au minimum 1 fois par jour durant la semaine et une fois durant les weekends, une surveillance rapprochée sera mise en place en cas de perturbation (hausse de la mortalité, sous-alimentation). De plus, dans chaque bassin, des galets seront installées pour permettre aux alevins de se cacher (règle des 3 R : Raffinement). Un couvercle sera également mis sur les bacs afin d’éviter tout stress dû à la lumière, les stades embryo-larvaire vivant dans des gravières à 50m de fond. Les animaux seront nourris ad libitum pendant toute la durée de l’expérience à partir de 700 DPF.

Choix des espèces

L'omble chevalier est une espèce sentinelle du changement climatique des lacs alpins qui sont concernés par une forte pollution aux particules de pneu (responsable de 60% de molécules plastiques présente dans le lac léman). Ainsi, cette espéce est à la fois exposé aux particules plastiques et à la hausse des températures dans nos lacs alpins et péri-alpins. De plus, les stades embryonaires choisis pour cette étude sont connus pour être plus sensibles aux polluants.

1500 souris et 450 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des administrations répétées de composés chimiques ou biologiques par diverses voies, avec des prélèvements sanguins pouvant atteindre 20 % du volume circulant et jusqu'à une vingtaine d'interventions par semaine, pour évaluer la toxicité de candidats médicaments sur des rongeurs génétiquement modifiés au niveau du système immunitaire. Le porteur indique que les effets attendus vont de la perte de poids aux atteintes rénales, hépatiques ou immunitaires liées à la souche et au produit testé. Il affirme que ces études réglementaires "nécessitent encore" l'animal et ne peuvent pas être réalisées in vitro.

Objectifs

Ces études peuvent servir à mettre en évidence la nécessité de travailler avec un type de rongeurs en particulier, en recherchant/vérifiant les homologies avec l'homme (par exemple vérification de la liaison du candidat médicament à sa cible pharmacologique dans cette espèce). Ces études permettent d’obtenir des données sur la réponse immunitaire, la toxicité éventuelle du composé, de bien choisir les doses dans les premières études règlementaires, et peuvent également être des études règlementaires. Elles peuvent permettre de comprendre grâce à des investigations perfectionnées les mécanismes de toxicité (toxicité rénale, hépatique, testiculaire...) ou les profils d’immunotoxicité, afin d'établir la pertinence de ces effets observés chez le rongeur en comparaison avec l'humain, avec pour objectif d'assurer la santé des patients humains. Elles permettent également de sélectionner un composé possédant un rapport efficacité/toxicité optimal dans une espèce rongeur. L'efficacité d'un composé peut également être testée sur un modèle pathologique ou un animal transgénique, ici des animaux génétiquement altérés au niveau du système immunitaire. Il est attendu d'utiliser en moyenne 30 rats ou 50 souris par étude et de réaliser jusqu'à 15 études rat et 30 études souris sur la durée du projet (soit environ 3 études rat/an et 6 études souris/an).

Bénéfices attendus

Le développement de composés pharmaceutiques ou chimiques requiert des explorations in vivo chez le rongeur ainsi que des études réglementaires à proprement parler. Ces études peuvent être demandées par les autorités réglementaires, pour affiner ou mettre en place des conditions expérimentales, ou pour répondre à des questions de sécurité, ou pour explorer les mécanismes d’action. Ces études peuvent donc servir à affiner les expériences en amont des études réglementaires qui devront être réalisées par la suite, en permettant de limiter le nombre global d'animaux utilisés dans le développement d'un produit. Elles peuvent aussi directement contribuer à assurer la sécurité non-clinique des médicaments en comprenant mieux leurs mécanismes.

Procédures

Les animaux sont traités, par différentes voies (principalement orale et injection intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse) de façon journalière ou hebdomadaire (ex : composés biologiques), avec le produit d’intérêt. La durée des administrations est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 30 minutes maximum, dans le cas de perfusions intraveineuses chez le rat. La durée des études peut être courte (un jour) ou longue [en général de 1, 3 ou 6 mois pour les études règlementaires].. Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur : -Prélèvements multiples: -jusqu’ à 7,5% du sang total circulant peut être prélevé en 24h sans récupération - jusqu’ à 10% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 7 jours de récupération - jusqu’ à 15% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 2 semaines de récupération - jusqu’ à 20% du sang total circulant peut être prélevé en 24h avec 3 semaines de récupération -Prélèvement unique: maximum 15% du volume sanguin circulant Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/ contrainte pour l'animal). La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1 heure par animal par jour (en considérant, par exemple, une journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min).. Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant, par exemple, une administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse, n’excédant pas 18h est aussi possible.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent : - au phénotype dommageable de la souche utilisée (ex : sensibilité aux infections opportunistes...) ; - aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) ; - aux effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés.

Devenir

Les études de toxicologie incluent souvent une analyse histopathologique pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus. De plus, les animaux ayant un phénotype dommageable pendant les études ou bien se développant avec l’âge, aucun animal ne sera gardé à l’issue de ces études.

Remplacement

L’évaluation de la toxicité de candidats médicaments selon les règlementations en vigueur nécessite encore l’utilisation d’animaux, et ces études ne peuvent pas être réalisées in vitro. Il n’existe pas encore de méthode alternative in vitro pour mettre en évidence certains effets, en raison notamment de la complexité des organismes vivants, et en particulier des réponses immunitaires. De plus, certaines études ne peuvent pas être réalisées dans des souches sauvages ou transgéniques à phénotype non- dommageable qui ne sont pas adaptées à la recherche de mécanismes d’action ou d’un effet toxique spécifique (ex : immunotoxicité…). Un animal transgénique ou exprimant certaines caractéristiques ou déficiences dans le système immunitaire représente parfois un meilleur modèle pour l’évaluation d’un produit.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude: un ou deux sexes, animaux satellites ou non pour analyses de toxico-/pharmacocinétique ou pharmacodynamie, nombre de temps intermédiaires pour des sacrifices ou analyses spécifiques, type de marqueurs mesurés (sensibilité des méthodes d’analyse), comparaison avec des composés de référence, nombre de doses testées, criblage de plusieurs produits, etc. Pour les études à objectif règlementaire, le nombre d’animaux est précisé dans les lignes directrices correspondantes. En se basant sur des tests statistiques, comprenant a minima des tests de normalité, analyse de la variance et tests comparant les moyennes des groupes, le nombre d’animaux utilisés sera le minimum possible en fonction de ces considérations et des objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement (en fonction des signes attendus) afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité (liste non exhaustive). Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et si besoin, au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés...) et que la douleur ne peut pas être suffisamment limitée à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Prélèvements sanguins : Des techniques de prélèvement (ex : veine caudale, sublinguale, jugulaire, sous-mentonnière, mandibulaire...) sont utilisées quand elles sont compatibles avec les volumes de sang/fréquences à obtenir. Certains traitements peuvent être réalisés sous anesthésie pour éviter stress, douleur ou inconfort, comme par exemple les administrations intramusculaire, intra-articulaire ou intra-vésicale Les animaux sont hébergés conformément à la Directive 2010/63 avec enrichissements. En général l’hébergement est groupé mais peut être individuel si un protocole expérimental particulier le requiert ou si des problèmes de comportements antisociaux sont anticipés chez certains animaux (notamment les souris mâles âgées de plus de 6 semaines); dans ce cas, ce choix devra être dûment argumenté. Des portoirs ventilés pourront être utilisés selon le phénotype dommageable, le cas échéant après avis du vétérinaire sanitaire.

Choix des espèces

Le choix du rongeur est justifié par : - les objectifs de l’étude : disponibilité d’un modèle de maladie, rongeurs utilisés pour d’autres études précliniques, présence du récepteur pour le composé, données de pharmacocinétique, pharmacodynamie, modèle de déficience dans un gène ou d’un mécanisme d’intérêt, - la comparaison possible avec d’autres études dans ces espèces, - la quantité de données disponibles sur la souche, - des aspects pratiques de manipulation, - sa place dans la phylogénie (l'utilisation de rongeurs sera privilégiée, en première intention, plutôt que celle du chien, du porc ou du primate). Les animaux ont en général 6 à 8 semaines d’âge en début de traitement, correspondant à un âge de croissance, selon les recommandations générales de la règlementation. L’âge peut varier en fonction des objectifs de l’étude (par exemple animaux juvéniles de moins de 6 semaines, matures de plus de 8 semaines, âgés...).

90 souris et 30 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie réutilisée d'une étude à l'autre, le reste tué. Ils reçoivent jusqu'à cinq administrations de composés chimiques ou biologiques par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, pour déterminer les doses toxiques avant de futurs tests d'efficacité. Le porteur indique que les effets peuvent aller de la perte de poids aux stéréotypies, à la prostration et à la détresse respiratoire, l'atteinte d'un point limite déclenchant la mise à mort. Il affirme que l'étude est "indispensable" et ne peut pas se faire autrement que sur des animaux vivants, les tests in vitro étant jugés insuffisants.

Objectifs

L’objectif du projet est de collecter des données de tolérance et de toxicité pour des nouveaux composés chimiques et biologiques dont la bibliographie est insuffisante ou inexistante. La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette étude pour chaque nouveau composé, est indispensable pour connaître les doses à utiliser pour les futures études d’efficacité in vivo sans risquer de tester des doses toxiques. Elle permettra également de réduire le nombre d’animaux utilisés dans la phase de test d’efficacité biologique.

Procédures

Administration de composés par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse, ou sous cutanée ;10 secondes par administration ; maximum 5 administrations / animal.

Impact sur les animaux

Nous cherchons à déterminer si les produits testés induisent de réactions toxiques pour l’animal à certaines doses. Si c’est le cas, ces nuisances s’exprimeront par : - une perte de poids - des modifications du comportement: . des comportements stéréotypés marqués (animal tournant en rond, se cabrant, agressif) . diminution de la mobilité, prostration . diminution de l’alimentation et du toilettage, voire de l’aspect général de l’animal (pelage sale autour face/ région urogénitale, hirsute) - des effets sur l’activité respiratoire

Devenir

Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés, et considérés comme en utilisation continue étant donné qu’ils seront utilisés dans les mêmes procédures. Si une autre étude sur un nouveau biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si aucune étude n’est planifiée, les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude.

Remplacement

Le but de cette étude est de déterminer une activité toxique in vivo et ne peut donc pas être réalisée par d’autres moyens que d’utiliser des animaux vivants. En effet les études de toxicité in vitro sont insuffisantes et un composé peut se révéler toxique chez l’animal à des doses non toxiques in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est basé sur les recommandations OCDE, considéré comme suffisant pour conclure (3 animaux par groupe); moins de 3 animaux par étude serait insuffisant. Un animal pourra être utilisé pour une deuxième étude dans les cas suivants : Si une autre étude sur un nouveau composé chimique est prévue dans les 3 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés. Si une autre étude sur un nouveau composé biologique est prévue dans les 5 semaines suivantes, les animaux pourront être réutilisés.

Raffinement

Voici la liste des points limités : Perte de poids > 15% Changements majeurs : - Diminution marquée de la motilité - Absence d’alimentation et de toilettage - Prostration - Comportements stéréotypés marqués (tourne en rond, se cabre, agressivité) - Recroquevillé - Effets marqués sur la respiration avec détresse respiratoire - Décoloration et fourrure sale autour de la bouche et de la région urogénitale Pour l’administration par voie Intra péritonéale, surveillance au point d’injection. Si un des points limites est observé, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

L’OCDE recommande d’utiliser des rongeurs pour ce type d’étude. Nous avons choisi les souriscar cela est suffisant dans le cadre de notre projet, les tests d’activité biologique des composés étant réalisés chez la souris. La souris est par ailleurs l'espèce la plus utilisée sur le campus. Nous avons complété cette demande pour le hamster car c'est à priori une autre espèce pour laquelle nous pourrions être sollicité (études SRAS-CoV-2 ou virus de la même famille). Si nous sommes sollicités pour tester des molécules qui vont être étudiées chez d'autres espèces, nous discuterons avec le scientifique de la nécessité de définir la DMT chez cette espèce. Des animaux adultes seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les adultes ; des jeunes animaux ou des animaux âgés seront utilisés si les études d’activité biologique seront réalisées chez les jeunes ou les animaux âgés respectivement.

8 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Achetés déjà cathétérisés, ils reçoivent l'Enniatine B, une mycotoxine des céréales, par voies orale et intraveineuse, avec des prélèvements sanguins répétés et un séjour en cage à métabolisme, pour valider un modèle mathématique censé remplacer ensuite l'expérimentation. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale pour reproduire la cinétique plasmatique, qu'il juge "indispensable" à la validation du modèle. La mise à mort est justifiée par le fait que leur cathétérisation les rend inutilisables ensuite.

Objectifs

Les Enniatines sont des mycotoxines produites par des souches de champignons Fusarium et appartiennent à la classe la plus courante de contaminants des céréales. L’Enniatine B est la molécule la plus prévalent parmi les 28 homologues identifiés dans cette famille de molécules et par conséquent nos concitoyens peuvent être exposés à de faible doses de manière chronique dans leur alimentation quotidienne. Malgré le nombre considérable de propriétés pharmacologiques et toxicologiques et la prévalence de cette mycotoxine dans les aliments à base de céréales il est éthiquement impossible d’étudier in vivo sa toxicologie et donc sa toxicocinétique (et notamment son devenir plasmatique) chez l’humain. Ainsi ce projet de recherche se propose d’utiliser des méthodes alternatives permettant de pallier ce manque de données toxicocinétiques chez l’humain. Ces alternatives reposent sur 3 étapes: a) la génération in vitro (à partir d’essais de laboratoires sur cellules) de données essentiellement de métabolisme qui constituent l’élément principal des différences inter-espèces dans la pharmacocinétique de la molécule étudiée puis b) par l’extrapolation vitro/vivo permettant de prendre en compte le changement d’échelle de la cellule à l’organe et enfin c) par une autre modélisation mathématique dite « pharmacocinétique basée sur la physiologie » permettant d’intégrer ces données cellulaires et tissulaires au fonctionnement de l’organisme (animal ou humain) entier. Les essais in vitro ont déjà été réalisés en incubant l’Enniatine B avec des cultures primaires d’hépatocytes humains et de rats. Il s’agit désormais de valider les extrapolations des cellules a l'organisme faites pour le rat en générant des données in vivo du devenir plasmatique et en les intégrant au modèle mathématique. Le rat a donc été choisi car la comparaison avec l’humain aura été préalablement réalisée à partir d’expérimentations in vitro réalisées sur des hépatocytes primaires de ces deux espèces.

Bénéfices attendus

D’une manière globale, ce projet vise à déterminer les paramètres métaboliques quantitatifs de l’enniatine B: clairances in vivo et in vitro. Ces nouvelles données permettront de développer un modèle mathématique humain de l’enniatine B basé sur l’extrapolation de l’in vitro vers l’in vivo et permettront d’estimer les concentrations plasmatiques en enniatine B en fonction des scénarios d’exposition. Parallèlement, nous déterminerons les réponses moléculaires induites par l’enniatine B après exposition aigüe et répétée sur des hépatocytes primaires de rat et d’humain. Ces réponses permettront de définir les concentrations effectrices de toxicité. Ces concentrations effectrices pourront être comparés aux concentrations plasmatiques déduites du modèle mathématique et ainsi déterminer un risque de toxicité de l’enniatine B pour l’Homme.

Procédures

Le design de prélèvements se fera en deux séquences. Lors de la première séquence 4 rats seront choisis aléatoirement et recevront l’administration par voie iv (en moins de 10 secondes) et seront placés en cage à métabolisme afin de recueillir l’ensemble de leurs urines (recueil continu de l'ensemble des urines grâce à la cage à métabolisme). Deux rats se verront prélevés 0,1ml de sang 0min, 10min, 20min, 45min, 2h et 6h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 5, 15min, 30min, 1h, 4h et 8h après l’administration. Lors de cette même séquence les quatre autres rats recevront l’administration par voie orale (en moins de 10 secondes). Deux rats se verront prélevés 0,1mL de sang 0h, 1h, 4h, 7h, 9h et 11h après l’administration tandis que les deux autres rats se verront prélevés 0,1ml de sang 1/4h, 2h, 6h, 8h, 10h et 12h après l’administration. L’ensemble des prélèvements de sang pour chaque rat sur cette première séquence est de 0,6 mL soit si l’on approxime le volume total individuel de sang à 30 mL, un prélèvement de 2% de ce total. Entre chaque administration, un temps suffisant pour permettre l’élimination de la molécule et la reconstitution d’une partie du sang des rats, sera respecté. Ce temps de récupération sera de 1 jour. Lors de la seconde séquence, le principe des séquences veut que les 4 premiers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie orale et à l’inverse les 4 derniers rats recevront cette fois-ci l’administration par voie iv. Les prélèvements de sang réalisés sur chaque individu ont été limités à 6 prélèvements de chacun 100 μl par rat et par séquence. Ce qui fait pour chaque rat un prélèvement total de 4% du volume de sang individuel.

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, les rats seront achetés cathétérisés au fournisseur. A l’aide du cathéter, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme (1 gavage par animal) mais la contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus d’une à deux minutes. De plus l’inconfort due au maintien en cage à métabolisme nécessaire au recueil de l’ensemble des urines, sera réduit à son strict minimum vis-à-vis de toute la durée d’hébergement (qui lui se fera en cage individuel), c’est-à-dire la phase de prélèvement de 8 heures après l’administration par voie intraveineuse (sur 4 rats lors de la première séquence et sur les 4 autres rats lors de la seconde séquence).

Devenir

Chaque rat sera mis à mort à l’issue de la seconde séquence de prélèvement de la procédure dans des conditions éthiques, étant donné qu'ils ne seront ni réutilisés, ni replacés ni adoptés du fait de leur cathétérisation.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternative non-animale pertinente actuellement permettant de reproduire la cinétique plasmatique et urinaire (avec la variabilité interindividuelle existante) des molécules chez des animaux vivants, indispensable à la validation des modèles mathématiques (qui une fois validés permettent de remplacer des expérimentations animales par simulation d’autres scénarii d’exposition).

Réduction

Dans un effort de réduction, le nombre d’animaux est calculé de manière à obtenir la quantité de prélèvements sanguins suffisante. Nous utiliserons 8 rats au total. La subdivision des groupes de 4 rats en deux sous-groupes permet de couvrir l’ensemble des échéances de cinétique et leur exploitation par une approche de population garantie ainsi une estimation de la variabilité interindividuelle des paramètres pharmacocinétiques de la population et de chaque individu. En outre, le design en séquences permet d’utiliser les mêmes animaux entre 2 administrations, en garantissant la fiabilité des données grâce à l’instauration d’un temps de récupération.

Raffinement

Concernant le raffinement, des points limites ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux. La douleur, le stress ou les contraintes seront atténués par des méthodes ou médications appropriées. Une analgésie sera mise en place si nécessaire. La contention sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Les prises de sang répétées seront effectuées par le cathéter permettant ainsi une récolte de sang non-douloureuse et limitant le stress. Les cathéters seront nettoyés à chaque utilisation avant fermeture avec un désinfectant à base de Chlorhexidine et une surveillance sera effectuée afin de détecter d’éventuels signes d’infection au niveau de cette ouverture sensible sur le système veineux. La procédure expérimentale est conçue pour limiter autant que possible la souffrance animale, en minimisant les interventions sur les animaux au strict nécessaire. Les animaux seront hébergés sur litières dans des boites en polypropylène, en respectant les normes (dimensions notamment) du bien-être animal et avec, à disposition, des enrichissements appropriés (hamac, igloo, jouets tels que des balles...). Les rats seront seuls par cage afin de limiter les risques d'arrachement du cathéter. L’hébergement en cage à métabolisme plus stressant pour l’animal mais nécessaire à un recueil rigoureux de l’ensemble des urines, sera limité à une période de 8 h par animal.

Choix des espèces

Sur la base de connaissances acquises sur l’Enniatine-B lors d’étude in vitro à partir de matériel biologique relevant des rats Sprague-Dawley, il convient de générer des données in vivo chez cette espèce afin de pouvoir les comparer aux données in vitro pour valider cette extrapolation et pouvoir la poursuivre avec le modèle mathématique. Les rats utilisés seront des rats Sprague-Dawley males d’environ 200-250 g (6-8 semaines). Ce stade a été choisi pour limiter la quantité d’Enniatine-B nécessaire tout en maximisant la possibilité d’obtenir des échantillons sériés de plasma. L’étendue indiquée ici dans leur stade de développement est due aux éventuelles contraintes du fournisseur en charge de la pose chirurgicale de cathéter.

6 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intrathécale sous anesthésie et plusieurs prélèvements de liquide céphalo-rachidien et de sang, certains sur animal vigile, avant une autopsie, pour valider une technique d'administration en vue de futures études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique qu'au réveil peuvent survenir une désorientation, une hypothermie ou une apnée, et que les prélèvements sur animal vigile peuvent être désagréables. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe et que le macaque est "pertinent" par sa proximité phylogénétique avec l'humain.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de valider le modèle d’administration intrathécale (voie basse [lombaire] et voie haute [base du crane]) chez le primate non-humain. Ce modèle sera validé grâce à l’injection d’un produit pharmaceutique de référence dont la pharmacocinétique et la biodistribution seront évaluées et via une évaluation histopathologique complète afin de confirmer que la procédure d’administration intrathéchale (voie haute et voie basse) sera compatible avec une étude de toxicologie générale. Ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux central qui seront injectées par voie intrathécale chez l’homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle d’administration intrathécale chez le primate non-humain permettra la réalisation d’études de toxicologie règlementaire qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement, avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intrathécale chez l’homme). De plus la validation pourra contribuer à la mise sur le marché de nouvelles thérapies sûres pour les patients atteints de pathologie du système nerveux central (exemples: maladies de Parkinson et Alzheimer ou le dystrophie musculaire).

Procédures

L’injection unique intrathécale et les prélèvements de liquide céphalo-rachidien (4 temps, d’une durée d’envion 45 min par procédure) seront réalisés sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et analgésie périopératoires (induction anesthésique via une injection intramusculaire). Une évaluation neurocomportementale sera réalisée en post-administration/prélèvement (durée d’environ quelques minutes) afin de déceler toute potentielle atteinte neurologique en lien avec la procédure. Une analgésie préventive (pré et post procédure pendant 2 jours), des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des prélèvements sanguins seront réalisés à raison de 4 temps (durée d’environ quelques minutes) dans les 24h suivant l’injection. Dès que possible, les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal anesthésié à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les autres occasions, les prélèvements sanguins seront de courte durée (quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les procédures d’administration/prélèvement intrathécale se faisant sur animaux anesthésiés qui seront mis à jeun la veille de la procédure. Lors du réveil anesthésique une désorientation/perte d’équilibre et une hypothermie peuvent être observées temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante sera mise en place. Des évènements anesthésiques liées à l’anesthésie volatile peuvent survenir (apnée). Certains prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sous anesthésie et seront donc sans effet attendu pour les animaux. Pour les prélèvements sanguins (PS) qui seront réalisées sur animaux vigiles celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. Les signes cliniques suivant pourraient être observés en cas de réaction exagérée au produit pharmaceutique de référence : • Troubles de la coordination des mouvements • Diminution de l’appétit • Somnolence • Vomissement • Diarrhée Ces signes cliniques devraient être seulement transitoire et seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure d’ administrations/prélèvements de liquide céphalo-rachidien (LCR) d’un point de vue histopathologique. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animale permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité, notamment systémique et neurocomportementale des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapie innovante, telle que la thérapie génique. Il n’existe pas non plus d’alternative non animale pour valider que la technique d’administration intra thécale aboutit à une exposition de l’animal au produit pharmaceutique de référence et que celle-ci est bien tolérée (analyse histopathologiqueà. Le macaque cynomolgus est un modèle animal pertinent car il est proche de l'Homme d’un point de vue phylogénétique, transcriptomique et anatomique, permettant le développement de candidats médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique (pharmacocinétique et la biodistribution du produit réference). De plus, dans les études réglementaires de toxicologie 3 animaux par groupe sont généralement utilisés. Au total, 6 animaux seront utilisés dans ce projet : 3 animaux par localisation (zone lombaire ou cisterna magna).

Raffinement

Le produit pharmaceutique de référence sera injectée à une seule occasion et à une dose subclinique pour laquelle aucun effet toxique n’est attendu. Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans des procédures internes et présentés dans la section points limites de ce projet (section 4.2). L’injection intratéchale sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique. Une analgésie préventive sera mise en place avant administration de l’élément de référence/prélèvements de liquides céphalo-rachidien (LCR) afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux. Des mesures de prévention de l’hypothermie seront appliquées pendant l’anesthésie et au réveil. En raison du potentiel impact de l’administration intrathécale et des prélèvements de LCR, une évaluation neurocomportementale sera réalisée à deux occasions après adminisration et chaque prélèvement de LCR (+4h et +24h post-procédure). De plus, lorsque possible, les prélèvements sanguins (PS) seront réalisés sur animal anesthésié, à l’occasion des prélèvements de LCR. Pour les PS qui seront réalisées sur animaux vigiles (sans anesthésie) celles-ci pourraient être associées à des sensations désagréables de ponction mais seulement pendant une courte durée. L’euthanasie sera considérée pour les signes cliniques suivants : • convulsions ne rétrocédant pas spontanément ou à l'administration d'anti-convulsivants ou convulsions répéétes dans la même journée • Incapacité prolongée de l'animal à se déplacer ou pertes d'équilibres durables impactant la qualité de vie de l'animal.

Choix des espèces

Les études réglementaires de toxicologie doivent se faire chez une espèce pertinente pour l’évaluation de la sécurité des futurs candidats médicaments. La pertinence du primate non-humain est basée sur une homologie phylogénétique, anatomique et transcriptomique importante avec l’Homme. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du système nerveux central (SNC) sont basées sur des produits biologiques ou de thérapie génique (oligonucléotide) qui nécessitent une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation d’autres modèles non-rongeur (tel que porc et chien) est inapproprié dans ces études. L’utilisation du primate non humain pour la validation du modèle d’administration intrathécale est donc justifiée puisque les études précliniques non rongeurs sur ces nouvelles thérapies seront réalisés chez le macaque. La validation du modèle d’administration intrathécale ne nécessite pas de pré-requis d’âge et se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.

4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.

Objectifs

Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.

Bénéfices attendus

Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.

Procédures

Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)

Impact sur les animaux

L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.

Réduction

Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p

Raffinement

Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.

Choix des espèces

Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).

242 rates vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles inhalent du styrène ou des isomères du xylène six heures par jour, cinq jours par semaine, pendant une à quatre semaines, et une partie subit une chirurgie du crâne pour implanter un système de contention à vis destiné à mesurer les mouvements oculaires, avant la mise à mort et le prélèvement des oreilles. Le porteur indique que les fortes concentrations peuvent déprimer le système nerveux et provoquer des effets narcotiques et des troubles de l'équilibre. Il présente l'étude comme la validation in vivo d'une toxicité déjà suggérée in vitro, en vue d'un éventuel test de criblage des polluants industriels.

Objectifs

Ce projet vise à étudier la potentielle toxicité de quatre solvants aromatiques présents dans l’industrie, le styrène et les trois isomères du xylène, sur l’organe périphérique de l’équilibre, le vestibule, situé dans l’oreille interne. Il s’agit également de comparer cette potentielle toxicité à celle décrite avec ces solvants sur la cochlée, organe périphérique de l’audition, également situé dans l’oreille interne.

Bénéfices attendus

La toxicité vestibulaire de certains solvants aromatiques a été suggérée précédemment par une étude in vitro. La présente étude permettra de valider (ou d’infirmer) ces informations grâce à une approche in vivo. Si les résultats in vivo confirment les résultats obtenus in vitro, alors ce test pourra potentiellement être proposé comme test de criblage afin d’identifier les polluants industriels susceptibles de perturber l’équilibre des salariés.

Procédures

Les animaux seront exposés par inhalation à différentes doses de styrène ou d’un des 3 isomères du xylène. Cette exposition durera entre une et quatre semaines, à raison de 6 heures / jour, 5 jours par semaine. Afin de déterminer les effets de ces différentes substances sur l’oreille interne, l’audition et l’équilibre des animaux seront testées avant exposition, à la fin de l’exposition puis 4 semaines après. L’audition sera estimée par la mesure des produits de distorsion, une méthode non invasive utilisée pour le dépistage des surdités chez les nouveaux nés. Chez le rat, elle nécessite une anesthésie médicamenteuse légère. L’équilibre sera estimé par des tests comportementaux et par la mesure de la persistance des saccades oculaires après rotation (nystagmus post-rotatoire). Cette dernière mesure demande une contention de la tête, qui nécessite l’implantation à demeure d’un système de contention (pas de vis). Cette chirurgie crânienne est réalisée, une seule fois, 4 semaines avant le début de l’exposition. Chez la moitié des animaux, un prélèvement sanguin à la queue sera réalisé sous anesthésie gazeuse en sortie d’exposition. Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort et les oreilles prélevées pour observer les dommages causés par les expositions aux solvants.

Impact sur les animaux

Certains animaux seront opérés afin de recevoir un dispositif de contention pour mesurer les mouvements oculaires. Afin d’éviter les douleurs post-chirurgicales, un antalgique morphinique sera délivré avant de réaliser l’anesthésie. Par ailleurs, il n’est pas exclu, que les animaux recevant une anesthésie par voie générale ou gazeuse, dans le but de réaliser des tests auditifs ou des prélèvements sanguins, ressentent du stress. Néanmoins, celui-ci devrait être mineur car les animaux sont habitués à être manipulés et les gestes sont opérés par du personnel qualifié. Les tests comportementaux, mais également la mise en rotation des animaux lors de la mesure des saccades oculaires, pourraient générer chez les animaux, pendant un court instant, un désagrément se traduisant par des troubles de l’équilibre. Certains animaux seront exposés à des concentrations élevées de solvant 6 heures/jour, 5 jours par semaine durant 4 semaines. Ces concentrations élevées pourront avoir un effet dépresseur sur le système nerveux central et des troubles sensori-moteurs comme des effets narcotiques pourront alors être observés. Néanmoins, ces troubles ne devraient pas persister dans l’heure qui suit la sortie des chambres d’inhalation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive des rates exposées par voie inhalatoire aux solvants par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements et l’histologie des tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études sur l’animal et par des approches épidémiologiques en entreprise. En revanche, les effets de ces substances sur le vestibule (récepteur de l’équilibre), qui se trouve également dans l’oreille interne, n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle de culture de l’organe récepteur, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données in vitro doivent être confirmées par une étude in vivo avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces subtances sur cet organe. La présente étude se propose d’exposer des rates au styrène et aux différents isomères du xylène par inhalation. L’évaluation de la toxicité se fera par des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui permettront de comparer de manière objective les effets toxiques sur la cochlée et sur le vestibule. Des analyses histologiques seront également réalisées post mortem. Cette étude évalue donc la fonction de deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être appliquées que sur des organismes vivants. D’autre part, pour modéliser la toxicité de ces agents chimiques chez l’Homme, il est nécessaire qu’ils soient métabolisés par des organismes vivants

Réduction

La démarche consiste à tester dans une première phase expérimentale (phase 1) les effets vestibulaires d’une forte concentration de styrène pendant une exposition courte (5 jours). Si celle-ci ne génère pas d’effet vestibulaire, une nouvelle exposition à la même concentration sera réalisée pendant 4 semaines (phase 2). Si aucune vestibulotoxicité n’est observée, la recherche de seuil d’effet (phase 3) ne sera bien évidemment pas réalisée, et les expérimentations seront stoppées. Dans le cas contraire, la phase expérimentale 3 sera menée en exposant les animaux à des concentrations de styrène plus faibles (la durée dépendra des résultats des phases 1 et 2). Enfin, la phase 4 s’attachera à évaluer la vestibulotoxicité de chacun des isomères du xylène (la durée de l’exposition dépendra une nouvelle fois des résultats des phases 1 et 2). Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures des saccades oculaires après rotation ne permettant pas les mesures des produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront prévus. Ainsi pour chaque solvant et concentration, 2 groupes expérimentaux seront prévus, l’un pour la mesure des saccades oculaires après rotation et l’autre pour les mesures de comportement suivies des mesures des produits de distorsion acoustique (idem pour les contrôles). Lors de chaque campagne, un maximum de conditions expérimentales seront testées simultanément afin de limiter le nombre de groupes contrôles associés. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé par un calcul de puissance (logiciel G-Power). Le résultat de ce calcul est de 10 animaux par groupe. 22 animaux surnuméraires (soit 10% de l’effectif prévu) seront nécessaires en cas de mortalités (anesthésie, perte de casques...). L’étude nécessitera au maximum 242 rates (dont les 22 surnuméraires). Ce nombre pourrait être réduit si les résultats des phases 1 et 2 sont négatifs.

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les rates seront placées dans les conditions standard d’hébergement pour cette espèce (température, hygrométrie). Aucune expérimentation ne sera réalisée lors de la première semaine afin de laisser le temps aux rates de s’habituer à leur nouvel environnement. Par ailleurs, les rates, animaux nocturnes, seront placées en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h afin de réaliser les expérimentations pendant leur phase d’activité. Elles seront stabulées à 2 ou 3 par cage pour permettre les liens sociaux de s’établir. Les animaux seront habitués à être manipulés en amont des expérimentations. Les animaux soumis à une intervention chirurgicale recevront une médication adaptée à savoir une analgésie pré-opératoire avant de réaliser l’anesthésie et des anti-inflammatoires seront administrés en post-opératoire. Après l’intervention chirurgicale, les animaux seront surveillés et pesés quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance ou une perte de poids trop importante nécessitant une prise de décision immédiate. Ils seront hébergés en cage individuelle pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose et leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton ou du « sizzle nest » pour constituer des nids. Pendant les phases d’exposition par inhalation aux solvants, les rates seront également surveillées toutes les deux heures afin de déceler d’éventuels signes cliniques traduisant un mal-être de l’animal qui nécessiterait d’isoler immédiatement l’animal. Des fiches de suivi seront renseignées à cet effet.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle recommandé pour les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Des femelles ont été choisies pour réaliser les expérimentations car celles-ci grossissent moins avec l’âge que les rats mâles et le dispositif pour enregistrer le mouvement oculaire après mise en rotation de l’animal ne permet pas de faire ces mesures sur des animaux de plus de 300 g. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les enzymes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.