Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
Test du micronoyau sur érythrocytes de mammifères. Ligne directrice de l’OCDE n°474
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1440
2 880 rongeurs, 1 440 souris et 1 440 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, pour un test réglementaire de génotoxicité suivant la ligne directrice OCDE n°474. Les animaux reçoivent les substances par instillation intratrachéale sous anesthésie, par inhalation "nez seul" avec contention dans des tubes jusqu'à quatre heures, ou par gavage, jusqu'à vingt-huit administrations. Le porteur indique que ces expositions peuvent induire des effets locaux et généraux "susceptibles de faire souffrir les animaux", avec des signes affectant la respiration et les muqueuses. Il justifie le recours à l'animal par les exigences réglementaires et affirme que les méthodes alternatives validées "ne permettent pas à elles seules" cette évaluation.
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre à des exigences réglementaires de détermination de leur toxicité et de sécurité. Les tests validés pour en caractériser les dangers suivent notamment les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la capacité d'une substance chimique à altérer le génome suite à son exposition par voie orale et par inhalation chez le rongeur (rats ou souris). Les signes de toxicité, la mortalité et des analyses ex vivo après l’exposition aux substances permettront de déterminer les potentielles atteintes cellulaire induites et d’évaluer leur dangerosité.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur la capacité d'une substance chimique à altérer le génome suite à leur exposition aiguë et subaiguë pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
Observations cliniques (moins de 5 min/observation) : jusqu’à 3 fois par jour. Pesées (moins de 5 min/pesée) : au maximum 1 fois par jour. Administration dans la trachée (moins de 10 min/exposition) : 1 à 28 administrations (1/j) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1 à 28 expositions (1/j) ; habituation à la contention imposée par le placement dans les tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/j/3 jours consécutifs), exposition aux substances d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 28 gavages (1/j) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Mesure de la consommation alimentaire, exposition de plus de 7j (moins de 5 min/mesure) : 4 à 12 mesures (1 à 3 mesures/semaine/1 mois). Mesure de la température rectale, exposition de plus de 7j (moins de 5 min/mesure) : 4 mesures (1 mesure/semaine/1 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations pour mesure et mesure de la température rectale. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 9 prélèvements (1 à 2 prélèvements/semaine/1 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations pour prélèvement et prélèvement d’une goutte de sang.
Impact sur les animaux
Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Administration dans la trachée : stress lié à l’anesthésie ; Mesure de la température rectale : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour la réaliser et à la manipulation ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions aux substances d’essai. Les expositions de substances d’essai pourront également induire des effets locaux et au niveau de la totalité de l’organisme susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d’étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rongeur.
Remplacement
Dans certains cas, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale actuellement validées par la réglementation, ne permettent pas à elles seules de déterminer les capacités à altérer le génome via une exposition aiguë et subaiguë à des substances chimiques par voie orale ou par inhalation. Les études in vivo sont pour cette évaluation requises. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474 (utilisation de rats ou de souris mâles et/ou femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur la substance d’essai et ses analogues sera réalisée préalablement aux expérimentations pour déterminer la stratégie de test et la dose initiale à tester parmi des niveaux prédéfinis par les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques. Elle sera choisie comme étant la dose la plus proche de celle qui devrait a priori permettre de déterminer la dose maximum tolérée (choix justifié par des données toxicologiques sur la substance) ou la plus pertinente pour limiter le nombre d’animaux utilisés (dose intermédiaire définie par les ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474 en l’absence d’informations). Pour l’étude de recherche de la dose maximum tolérée et l’étude de confirmation, le taux de mortalité, le nombre d’animaux moribonds et l’occurrence de signes de toxicité détermineront la poursuite des études. Pour ces deux études, seule une analyse descriptive des données sera réalisée. Pour l’essai définitif et l’essai limite, des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rongeurs (rats ou souris) et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par sexe et par groupe expérimental pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, soins, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rongeur car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°474, d’utilisation d’espèces chez lesquels il est établit que l’élimination par la rate des cellules micronuclées ne compromet pas la détection des entités nucléaires anormalement formées dans une cellule vivante. Cela ayant été démontré chez le rat et la souris, ces modèles animaux sont pertinents pour réaliser ces études. Des souches communément utilisées en laboratoire seront utilisées.
BIOEQ : Etude de bioéquivalence chez le rongeur après exposition subaiguë à un produit chimique.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 250
300 rongeurs, surtout des rats, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie étant tuée et une autre réutilisée. Ils reçoivent un produit chimique par la nourriture ou par gavage quotidien, suivi de prélèvements de sang répétés, pour mesurer la biodisponibilité selon la taille des particules. Le porteur indique que les animaux exposés à des substances non homologuées sont tués, quand cent rats et vingt souris pourront être réutilisés. Il présente ces essais comme un préalable réglementaire au choix des doses des études de toxicologie.
Objectifs
Ce projet permet de vérifier l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit à tester. Cette étude est nécessaire pour le bon choix des doses des études de toxicologie si la taille des particules du produit varie d’un lot à l’autre. La voie de synthèse peut évoluer au cours du développement d’une molécule en fonction des quantités synthétisées et faire varier la taille des particules formées.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de ces études sont de déterminer la biodisponibilité du produit en fonction de la taille des particules. Ainsi les études menées pourront répondre à la question suivante : l’exposition interne déterminée par les concentrations plasmatiques varie-t-elle en fonction de la taille des particules ? Ces études apporteront des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures en fonction de la taille connue des particules du produit à tester.
Procédures
Les animaux seront exposés au composé par la nourriture (durée maximale 15 jours) ou le cas échéant par gavage journalier (procédure inferieure à 1 minute) à l'aide de sonde souple adapté à leur taille. En fin d'exposition: prélevements de sang (microprelevements de 20 ou 50µL exceptionnellement 100µL) sur animal vigile à la veine saphène ou la cas échéant caudale (durée maximale de la contention et du prelvement 2 minutes; au maximum 6 prises de sang le premier jour de l'évaluation, puis une prise de sang par jour jusqu’à la fin de la période de réversibilité (8 jours maximum).
Impact sur les animaux
Aucun effet toxique majeur n’est attendu sur ce projet, la forte dose choisie ne devant pas excéder la dose maximale tolérée chez l’animal (et définie au préalable). Les animaux peuvent être soumis à des gavages journaliers à l'aide de sonde souple qui peuvent induire une gène légère lors de la contention. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d’une période de 24h. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire une douleur légère et de petits hématomes qui disparaissent rapidement.
Devenir
Les animaux exposés à des substances chimiques non encore homologuées sont euthanasiés.
Remplacement
Des essais in vitro sont utilisés dans l’unité d'expérimantation pour déterminer le profil toxicocinétique des molécules suivis par des études in vivo de toxicocinétique après administration unique. Ces études permettent de définir la période d’administration et de réversibilité de cette procédure mais ne répondent pas à la question de l’impact de la taille des particules sur la biodisponibilité du produit.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux par groupe (6) définit par l'experience du laboratoire et permettant une analyse statistique et deux doses testées par produit. Un total estimé d’environ 60 rats pourront être utilisés chaque année pour tester environ 2 molécules différentes, pour un total d’environ 300 rongeurs sur 5 années pour ce projet. Exceptionnellement, des souris pourront être utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages appropriées avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et à leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés tous les jours (week-ends compris). Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance et leur bien-être. Les échantillons de sang prélevés sont faits par la veine saphène (50 µL/prélèvement pour le rat et 20 µl pour la souris - volume ne dépassant pas le volume de 7.5% du volume circulant sur 24h). Pour les rats, la veine caudale peut également être utilisée avec 100 µl par prélèvement. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes régulières de maintien des compétences. Des points limites ont été identifiés par le laboratoire, qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal. Une évaluation rétrospective sur le bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal sur toutes les études. La priorité est de garantir le bien-être des animaux en n’administrant les produits qu’à des doses appropriées : la forte dose sera définie sur la base des résultats observés dans des études de 14 ou 28 jours avec administration quotidienne du produit par voie orale. On retiendra donc des doses inférieures à la dose maximale tolérée chez l’animal utilisé.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites dans ce document sont réalisées chez le rongeur (mâle ou femelle) pour permettre d’avoir le bon niveau d’information pour le choix de doses des études ultérieures. Le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel, les autres études de toxicologie étant réalisées sur ces espèces. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes (à partir de 6-7 semaines et jusqu’à 15 semaines) conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire.
Utilisation de l’imagerie in vivo pour l’évaluation des candidats vaccins et l’amélioration des vaccins existants
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 200
Hamsters dorés : 300
Autres rongeurs : 200
Lapins : 100
Cochons : 100
Macaques à longue queue : 80
8 980 animaux non-humains vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, une partie tuée et les autres réutilisés, adoptés ou renvoyés à l'élevage. L'effectif comprend 8 000 souris, 300 hamsters dorés, 200 rats, 200 autres rongeurs, 100 lapins, 100 porcs miniatures et 80 macaques à longue queue, infectés par des bactéries ou virus modifiés puis suivis par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les produits sont "en général bien tolérés" et n'attend que des réactions locales, sans détailler les effets de l'infection sur chaque espèce. Cette société décrit un service d'évaluation de vaccins destiné aux dossiers réglementaires et affirme que l'imagerie in vitro ne peut se substituer aux "organismes entiers".
Objectifs
Ce projet a pour objectifs d’évaluer la qualité de nouveaux vaccins (exemple à la base de l’ARNm) ou de vaccins existants grâce à l’imagerie par fluorescence et/ou par bioluminescence, ou par mesure du poids moléculaire des lipides grâce au MALDI-MSI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization as a Mass Spectrometry Imaging). Les critères d’évaluation sont : - La protection des vaccins développés en traitements préventifs et/ou thérapeutiques de maladies infectieuses grâce au suivi des pathogènes (bactéries/virus génétiquement modifiées) ou marqués par des molécules fluorescentes - La biodistribution et le mécanisme d’action des différentes molécules (ex : cellules, antigènes, adjuvants, anticorps, nanoparticules). Le suivi de certaines molécules d’intérêt par fluorescence est possible grâce à un fluorochrome (molécules assez petite) pouvant se greffer sur des molécules biologiques avec une perturbation nulle ou minimale de leurs propriétés physico-chimiques. Ainsi, la fluorescence peut par exemple être utilisée pour un suivi de biodistribution effectué par exemple sur des anticorps, des peptides, ou bien des acides nucléiques. L’imagerie par bioluminescence est une modalité faisant appel au génie génétique. Son principe repose sur l’intégration du gène codant pour la luciférase qui est une enzyme présente, à l’état naturel, dans des organismes tels que la luciole ou l’anémone de mer. Si ce gène est correctement intégré, les cellules vivantes exprimeront la luciférase qui, au contact de son substrat, la luciférine, donnera lieu à une réaction enzymatique émettrice de photons. Ces photons seront détectés par la caméra à haute sensibilité. Il sera alors possible de localiser et de quantifier in vivo les cellules ayant intégrées la construction luciférase.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont multiples : i) Sélection des antigènes et des adjuvants constituant le vaccin, ii) Évaluation de la biodistribution et des mécanismes d’action du vaccin, iii) Évaluation de la performance du vaccin au niveau préclinique avant les essais cliniques chez l’homme, iv) Support au développement des procédés des antigènes et des adjuvants. Ces différentes données précliniques ont pour but de supporter des essais cliniques et l’enregistrement du candidat vaccin ou l’amélioration de vaccins existants. Ces données sont généralement incluses aux différents dossiers réglementaires.
Procédures
En plus des paramètres mesurés par imagerie in vivo, des prélèvements de sang ou autres fluides biologiques (écouvillonnages nasaux, vaginaux, lavages broncho-alvéolaires, liquide cérébro-spinal, etc.) peuvent être réalisés afin d’étudier la virémie ou la bactériémie à des temps intermédiaires. Occasionnellement, différents organes et fluides physiologiques sont prélevés en fin d'étude après euthanasie des animaux pour déterminer des charges virales, bactériennes, parasitaires, l'expression d'antigènes in vivo, réponses immunes pré et post-infection etc. Occasionnellement, des animaux infectés peuvent être euthanasiés avant la fin de l'étude pour répondre à des questions particulières (imagerie ex vivo, réponses immunes précoces à l'infection contre une charge infectieuse, etc.) Concrètement, les animaux sont soumis à : - Des observations cliniques quotidiennes (observation de l’état général des animaux, des sites injectes, gonflements des ganglions, mobilité, etc.) - Des pesées quotidiennes ou hebdomadaires (contention pour mesurer l’évolution du poids corporel) - Des anesthésies volatiles quotidiennes ou hebdomadaires ou chimiques, - Des injections par différentes voies d’administration, intramusculaire de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intranasale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, sublinguale de 1 à 3 injections à 1 à 4 semaines d’intervalle, intraveineuse , intrapéritonéale - Des prélèvements de sang, d’organes (1 fois en prélèvement terminal), de fluides corporels (urine, salive), fèces etc. - Des euthanasies en phase terminale effectuées sous anesthésies par du personnel spécifiquement formé et selon la procédure en vigueur.
Impact sur les animaux
Le projet consiste en l’administration d’un ou plusieurs antigènes marqués ou non et si nécessaire d’un adjuvant marqué ou non. Les produits sont en général bien tolérés. Aucune réaction systémique n’est attendue. Quelques réactions locales (rougeur, nodule, abcès froid) sont possibles.
Devenir
Certaines procédures nécessitent de l’imagerie ex vivo sur des organes spécifiques ce qui implique une euthanasie des animaux. Les autres animaux peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.
Remplacement
Des essais in vitro sont également utilisés pour déterminer les seuils de détection in vitro et ex vivo des appareils d’imagerie, ils apportent des données complémentaires mais, à ce jour, ne peuvent se substituer aux essais in vivo sur des organismes entiers.
Réduction
Les schémas expérimentaux de ce projet feront l’objet d’une revue par des biostatisticiens, afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaire. Il est à noter que l’imagerie in vivo permet un suivi longitudinal sur une durée définie de chaque animal qui est par conséquent son propre témoin, ce qui permet de réduire considérablement le nombre d’animaux par étude. En effet, en se basant sur les études effectuées au cours des 5 dernières années, maximum 1000 souris par an seront dédiées aux études de biodistribution et de criblage des molécules, antigènes etc. Environ 50 souris par groupe avec 2 à 4 groupes par étude et 4 à 5 études par an. De plus, maximum 600 souris par an seront utilisées pour les autres études, par exemple, mécanisme d’action et la formation et preuve de concept. Maximum 60 hamsters et 40 rats par an seront dédiés à des études avec des agents pathogènes. Pour ces études 4 à 6 animaux par groupe seront utilisés avec 3 à 4 groupes par étude. Maximum 2 à 3 études par an seront réalisées. Maximum 20 lapins par an seront utilisé pour des recherches spécifiques d’inflammation. Pour ces tests 3 à 5 animaux par groupe avec 1 à 2 groupes par étude sont prévus. Une à deux études par an seront effectuées pour ces recherches spécifiques. Concernant les miniporcs et les PNH, nous allons effectuer deux études maximums par an et par espèce. Ces études rares seront dédiées pour étudier les mécanismes d’action de certaines molécules spécifiques ainsi que l’immunogénicité de ces molécules chez ces espèces. Quatre à six animaux par groupe avec 1 ou 2 groupes par étude sont prévus.
Raffinement
Pour les procédures ou d’effets indésirables sont attendus, des points limites sont mis en place afin d’éviter aux animaux toutes atteintes potentielles à leur bien être tout au long des dites procédures. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des dispositifs d’enrichissement. Les locaux utilisés sont conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. De plus, le raffinement réside dans deux caractéristiques principales. Tout d’abord, dans la majorité des cas, cette technique est non invasive puisque les souris sont simplement anesthésiées pendant une courte durée lors des acquisitions d’images et réchauffées grâce à un plateau chauffant afin d’éviter les risques d’hypothermie. D’autre part, la sensibilité des appareils d’imagerie in vivo permet de diminuer les doses de pathogènes administrées aux animaux par rapport aux modèles classiques.
Choix des espèces
L’imagerie préclinique in vivo est une technique initialement adaptée au petit animal (principalement la souris et les rats/hamster avec un poids inférieur à 200g). Ceci est dû à la détection difficile du signal lumineux dans les tissus profonds des animaux de plus grande taille. Néanmoins, de nouvelles techniques semi-invasives permettent d’étendre le champ d’application de l’imagerie in vivo à des espèces plus grandes (ex : lapin, miniporc, macaque) et font l’objet d’une procédure spécifique. Le modèle animal utilisé est sélectionné également en fonction des antigènes évalués, du type de réponse immune analysé et des données de la littérature ou des connaissances scientifiques. D’autre part, certaines espèces animales sont sensibles aux pathogènes d’intérêt et d’autres non. D’autres aspects techniques sont aussi à prendre en compte : taille des animaux (voie ou volume des administrations, volume de prélèvement…), disponibilité des outils immunologiques adaptés à l’espèce (cytokines, marqueurs cellulaires…). Les souris mutantes ou transgéniques constituent dans certains cas une opportunité unique pour étudier les mécanismes d’actions et les voies associées à la réponse immunitaire.
Effets des polluants sur les poissons hôtes et leurs parasites : une étude expérimentale sur le modèle chevesne-acanthocéphales
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
320 chevesnes sauvages vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Capturés par pêche électrique et maintenus jusqu'à dix mois, ils subissent des endoscopies, une infestation contrôlée par des parasites intestinaux et une exposition à des polluants par ingestion, avant dissection. Le porteur reconnaît un stress de captivité, des lésions du tube digestif et des pathologies liées aux polluants. Il affirme que l'étude des interactions hôte-parasite ne peut se faire in vitro ou in silico.
Objectifs
La pollution des cours d'eau affecte les organismes et peut se répercuter sur les interactions biotiques. Certains parasites sont connus pour accumuler des polluants depuis leur hôte, ce qui pourrait aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques, comme cela a été montré chez un poisson d'eau douce, le chevesne Squalus cephalus infestés par des acanthocéphales. Ce projet vise à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les relations hôtes-parasites. Tout d'abord il s'agira de tester les méthodes d'endoscopie pour surveiller la présence de parasites intestinaux dans le tractus digestif des poissons. Des manipulations expérimentales de la charge parasitaire et de l'exposition aux polluants seront menéeschez des chevesnes issus de populations sauvages, hébergés en conditions semi-naturelles, afin d'évaluer les réponses écophysiologiques. La règle des 3R a été prise en compte de la manière suivante : 1. remplacement : les questions de recherche portent sur les interactions biotiques, entre un poisson hôte et les parasites intestinaux en réponse à la pollution environnementale, il n'est pas possible de conduire des études in vitro, ex vivo, in silico pour y répondre. 2. réduction : les effectifs ont été réduits à 20 individus par groupe, effectif minimum suffisant pour tester avec robustesse les hypothèses, 3. raffinement : les conditions d'hébergement en mésocosmes ont été optimisées, plusieurs points limites ont été retenus, et les manipulations expérimentales se font dans la gamme de variation communément observée en milieu naturel, que ce soit pour la prévalence en parasites, ou pour l'exposition aux polluants.
Bénéfices attendus
Le projet développera une méthode pour un examen interne des parasites intestinaux. L’endoscopie est une technique maitrisée et courante en médecine humaine et vétérinaire, mais très peu utilisée en écologie. Le développement de la micro-endoscopie permettra d’améliorer les connaissances sur l’état de santé des animaux sauvages, à l’échelle des individus et des populations, sans recourir à des euthanasies. Cette technique permet d’acquérir de multiples donnéeset le suivi à moyen et long terme l’évolution de l’infestation et du développement des parasites. L'étude expérimentale répond également à des questions de recherche fondamentale en écotoxicologie à l'échelle des interactions biotiques, qui sont encore très peu étudiées, les effets étant principalement étudiés à l'échelle des organismes ou des populations.
Procédures
Les individus seront capturés en milieu naturel par pêche électrique, hébergés pour une durée de 10 mois maximum, dans des très grands mésocosmes avec enrichissement du milieu (radeaux flottants végétalisés). Chaque acte durera moins de 5 minutes, sur des poissons anesthésiés. Les interventions consisteront à 1) réaliser un examen par endoscopie (2 examens par individu), 2) manipuler expérimentalement la charge en parasites, via l'utilisation d'un anthelminthique suivie d'une infestation expérimentale par ingestion de cystacanthes (stade juvénile des acanthocéphales à raison de 0, 5 ou 10 parasites par individu, qui seront déposés dans le tractus digestif des chevesnes anesthésiés). Le développement des acanthocéphales nécessite 5 mois d'attente, les chevesnes ne seront pas manipulés pendant ce temps. 3) manipuler expérimentalement l'exposition à des polluants à des doses réalistes d’un point de vue environnemental afin de déterminer les conséquences sur les conditions hôtes-parasites. L'exposition aux polluants se fera par ingestion, à raison d'une fois par semaine pendant 4 semaines. Une prise de sang (sera réalisée sous anesthésie par ponction de la veine caudale afin d’évaluer les conséquences physiologiques, puis les poissons seront immédiatement euthanasiés et disséqués pour quantifier les niveaux de polluants dans les tissus, étudier les effets écophysiologiques et évaluer les conséquences de l’exposition pour les parasites.
Impact sur les animaux
Les nuisances sont : le stress de captivité, stress thermique (les mésocosmes sont à l’extérieur et sont influencés par les températures atmosphériques). L'endoscopie peut provoquer des lésions et irritation du tractus digestif après la phase de réveil post-anesthésie. L'anesthésie et la manipulation hors de l’eau peut engendrer de l'hypoxie, déshydratation, hyperthermie. Lors de l'infestation expérimentale, la fixation des parasites peut provoquer des irritations et lésions de la muqueuse du tractus digestif et limiter les apports nutritifs. L'exposition expérimentale aux polluants peut engendrer des pathologies.
Devenir
L'euthanasie se justifie par la nécessité de comparer le nombre réel de parasites intestinaux par dissection, par rapport au nombre estimé par endoscopie afin de valider la méthode et par le fait que les analyses écotoxicologiques doivent être réalisées sur certains tissus (foie, muscles, rein, tractus digestif) et sur les parasites intestinaux qui ne peuvent être prélevés que post-mortem.
Remplacement
Le projet consiste à tester les effets de l'exposition aux polluants à des niveaux réalistes d'un point de vue environnemental, sur les interactions biotiques, plus particulièrement sur les relations entre les chevesnes et les parasites acanthocéphales. Les acanthocéphales sont des parasites intestinaux présentant la remarquable capacité d'accumuler des polluants depuis leur hôte définitif, les chevesnes, pouvant aboutir à une atténuation de certains effets écotoxicologiques. Pour comprendre les effets à cette échelle biologique (relation entre deux organismes vivants), il est nécessaire d’étudier les effets sur ces organismes. Il n’est donc pas possible de le remplacer par des modèles in silico, in vitro ou ex vivo.
Réduction
320 animaux seront utilisés, soit 20 animaux par lot pour 16 lots au total. Cet effectif correspond au nombre minimum d'animaux calculé à partir de calcul de puissance en supposant une taille d’effet similaire à ce qui a été obtenu lors d’études précédentes. Les données obtenues feront l'objet de traitement statistique des données a posteriori
Raffinement
Les conditions d’hébergement ont été raffinées avec les mésocosmes extérieurs, de grande taille, équipés de radeaux végétalisés flottants permettant de diversifier l’habitat, d’offrir des caches, abris, ombrage et nourriture diversifiées et de contribuer à l’épuration de l’eau. Avant chaque manipulation, les poissons seront anesthésiés. Chaque acte durera moins de cinq minutes. Il seront ensuite surveillés pendant la phase de réveil. Un suivi journalier des poissons et des mésocosmes sera effectué. Lorsque les poissons seront manipulés, des points limites ont été établis afin de réagir rapidement à l’apparition de symptômes attestant d’une souffrance. Le franchissement d’un point limite (anomalie du comportement, altération du rythme operculaire, hypersécrétion de mucus, lésions, pathogènes) engendrera le retrait immédiat de l’individu du mésocosme et sa mise en surveillance. Un avis auprès du vétérinaire référent sera sollicité, un traitement adéquat sera administré ainsi qu’un soulagement de la douleur si nécessaire. Une détérioration plus sévère ou durable de l’état sanitaire conduira à envisager l’euthanasie, qui sera réalisée à l’écart, après anesthésie.
Choix des espèces
L'espèce a été choisie car 1. plusieurs études ont montré l'accumulation de divers polluants dans leurs parasites acanthocéphales, au point que les chevesnes sont devenus une espèce modèle, 2. cette espèce est ubiquiste et abondante dans les cours d'eau français, 3. de précédentes études (en parasitologie et en écotoxicologie) ont été menées avec succès sur des chevesnes en captivité. Les chevesnes seront adultes, d'une taille moyenne de 15 cm. Cette taille est nécessaire pour l'utilisation de l'endoscope.
Evaluation préclinique de substances d’essai
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 4200
Cochons d'Inde : 420
Lapins : 60
Chiens : 120
Furets : 60
Cochons : 60
8 520 animaux non-humains de sept espèces, souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour évaluer la pharmacocinétique et la toxicité de candidats médicaments. Ils reçoivent des substances par de multiples voies, jusqu'à 91 jours de suite, et subissent des prélèvements répétés de sang, de liquide céphalo-rachidien ou d'urine. Environ 4 200 sont tués, notamment après prélèvement terminal ou administration de substances toxiques, les autres étant réutilisés selon un score qui les envoie à la mort au-delà d'un seuil, et 60 chiens rendus à l'élevage. Le porteur affirme que ces modèles animaux "ne peuvent pas être remplacés" par des méthodes alternatives.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas d’effet sur l’animal.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations de substance par diverses voies (intrapéritonéale, per os, souscutanée, intraveineuse, intramusculaire, intraplantaire, intranasale, intratrachéale, intradermique, transdermique ou transmucosale, intrathécale, injection dans le genou ou la cheville), de manière unique ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale (de manière systématique pour les voies intradermique, intrathécale et injection dans le genou ou la cheville, et à l'appréciation du responsable de projet pour les autres voies). En routine, les administrations sont réalisées sur des groupes de 5 mâles et/ou 5 femelles pour les rongeurs et de 3 mâles et/ou 3 femelles pour les non-rongeurs. A l'administration de substance peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides physiologiques, tels que le sang, le liquide céphalo-rachidien ou l'urine, de manière unique ou répétée à diverses fréquences. Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié au gaz isoflurane. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un rat de 300g, un volume de 200 µL de sang pourrait être prélevé à la veine sublinguale à chaque point-temps. Dans ce cas, une réhydratation de l’animal (injection sous-cutanée de sérum physiologique, à volume égal à celui prélevé) est prévue pendant les premiers jours de l’étude, tant que la fréquence de prélèvement est supérieure ou égale à 1 tous les 24 heures. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines. Par exemple, chez un chien de 10 kg, un volume d’au moins 5 mL pourrait être prélevé à la veine jugulaire à chaque point-temps. De manière générale, le volume total prélevé chez un animal est proportionnel à sa volémie totale et par conséquent, à son poids corporel.
Impact sur les animaux
Des effets toxiques majeurs ne sont pas attendus. A ce stade du développement du médicament, il est usuel d’avoir déjà des notions de toxicité des composés. Il n’est donc pas attendu de sévérité forte liée au médicament. Une procédure spécifique est toutefois présente dans ce dossier pour prendre en compte ce cas rare ou lorsque les prélèvements vivo sont importants
Devenir
Pour les 6 procédures décrites dasn ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu une substance toxique (atteinte des points limites) ou dont les effets à long terme sont inconnus, sont mis à mort. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux issus de groupe contrôle ou ayant reçu une substance dont les effets à long terme sont connus, et n'ayant pas subi de procédure de catégorie "sévère". La réutilisation des animaux (souris, rats, cobayes, lapins, furets, cochons et chiens) est soumise à l’approbation du vétérinaire. Un suivi de la réutilisation est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. Dans le cas des rongeurs, les scores de réutilisation (procédure légère: 1 point, procédure modérée: 4 points) s’incrémentent pour chaque procédure appliquée à l’animal. La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8. Au-delà, les animaux sont euthanasiés. Dans le cas des non-rongeurs, l’état des animaux est évalué à chaque fin d’étude.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études.
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, voir section 3.4.13.). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur. Le choix de l'espèce sera fonction de la substance testée et dépendra des tests préliminaires de pharmacocinétique ou d'innocuité. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique. Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis la période néonatale jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Etude de l’impact d’une exposition chronique au PFOS sur la réponse immunitaire à la vaccination anti-grippale chez des souris B6C3F1.
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées au polluant PFOS par gavage deux fois par semaine pendant vingt-huit jours, vaccinées contre la grippe, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés en rétro-orbitaire. Le porteur les fait tuer pour prélever les organes cibles du système immunitaire. Il affirme que la souris est le "meilleur modèle" et qu'il n'existe "pas encore" de méthode alternative, tout en présentant l'objectif final du programme comme la mise au point de tests sans animaux.
Objectifs
De nombreuses substances chimiques produites par l’activité humaine polluent l’environnement. Ces polluants environnementaux sont multiples et leurs effets néfastes sur la santé humaine sont nombreux. Parmi les polluants environnementaux, certains sont des polluants organiques persistants, c’est-à-dire qu’ils s’accumulent dans l’environnement mais aussi dans les organismes, comme l’organisme humain, du fait d’une très lente élimination. Ils représentent une large famille de plusieurs milliers de composés produits intentionnellement par synthèse chimique pour leurs propriétés diverses. Ces substances se répandent dans l’environnement lors de leur production et de leur utilisation. La population humaine y est donc largement exposée, notamment, par ingestion ce qui peut entraîner de nombreux problèmes de santé comme la perturbation endocrinienne (maladies thyroïdiennes, problèmes de fertilité…), des lésions hépatiques et des cancers. L’agence sanitaire européenne a proposé une réévaluation de la toxicité de ces polluants organiques persistants en incluant leurs effets sur le système immunitaire. L’objectif de cette expérience pilote consiste à mettre au point un protocole adapté visant à analyser, chez la souris, les conséquences d’une exposition par ingestion (gavage) à un polluant organique persistant, sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination anti-grippale. L’administration par ingestion a été choisie afin de mimer le principal mode d’exposition de la population humaine. Le polluant choisi pour cette expérience est l'un des plus connus de sa catégorie.
Bénéfices attendus
Ce programme de recherche en immunotoxicologie englobe de nombreux laboratoires de recherche français et étrangers. Il s’agit d’une démarche de caractérisation des effets de polluants environnementaux sur l’organisme. Ces effets constituent un réel enjeu de santé publique. Ce projet d’immunotoxicologie dont fait parti cette première demande d'autorisation à projet, a pour objectif de développer des biomarqueurs d’exposition et des méthodes de mesures standardisées avec l'objectif à la fin de la réalisation complète du programme de mettre en place des tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Procédures
Gavage : 2 fois par semaine pendant 28 jours. Le temps de gavages est de moins d'une minute. Injection intra-musculaire : 2 injections maximun sur 74 jours. Une injection dure environ 30 secondes. Prélèvements sanguins tous les 5 jours pendant 47 jours. Comme ce prélèvement se ferra au niveau sinus retro-orbitaire en tenant compte de la sédation par inhalation, de la contention et de la récupération du sang la durée est estimée à 3 minutes par prélèvement.
Impact sur les animaux
Le gavage peut induire une iritation de l'oesophage. La toxicité du polluant peut provoquer une réaction chez l'animal. La vaccination en intra musculaire peut provoquer une douleur localement. Les prises de sang répétés engendrent des contraintes aux animaux à cause de la contention et du renouvellement de leur volume sanguin induit par les prélèvements et pouvant avoir une influence sur leur état général.
Devenir
A l'issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les organes cibles pour étudier dans le détail le système immunitaire.
Remplacement
La souris est le meilleur modèle pour ce genre d’étude d’immunotoxicité sur la réponse vaccinale et il n’existe pas, encore à ce jour, de méthode alternative à ce modèle. Il permet d'étudier la réponse intégrée de l'organisme, cruciale dans la réponse immunitaire. Dans cette DAP nous prévoyons une première partie expérimentale afin de mettre au point nos techniques d'analyse et de valider le design expérimental post mortem prévu. Selon les résultats obtenus grâce à cette étude, un nouveau projet sera mis en oeuvre sur des souris mâles et femelles en testant différentes doses de polluant, probablement plus faibles que la dose utilisée dans cette présente expérience . Ceci permettra d’évaluer l’effet genre ainsi que la relation entre la dose de polluant et son effet sur la réponse vaccinale. Dans l’ensemble notre projet permettra de mieux comprendre l’impact des polluants environnementaux sur la réponse immunitaire consécutive à une vaccination dans un modèle in vivo. Les résultats obtenus in vivo seront comparés à ceux que nous obtiendrons en parallèle sur des modèles in vitro et ex vivo (cellules humaines) afin d’aider à la mise en place de tests réglementaires robustes ne faisant pas appel à l’expérimentation animale.
Réduction
Les procédures ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement exploitables. De plus, afin d’obtenir le maximum d’informations sans augmenter le nombre d’animaux utilisés, nous élargirons notre étude à d’autres tissus que ceux composant le système immunitaire (rate, sang), notamment le foie, qui joue un rôle crucial dans le métabolisme et la détoxication. Afin de rationaliser le recours aux animaux, le plan expérimental prévoit le prélèvement de plusieurs tissus sur une même souris (rate, foie, sang), la congélation de plusieurs échantillons d’un même tissu pour des analyses a posteriori (par notre laboratoire ou dans le cadre de collaborations), ainsi que l’analyse de plusieurs paramètres sur un même prélèvement (ARN, protéines). En particulier, nous travaillons en concertation avec différents laboratoires de recherche impliqués dans le programme et avons établi une procédure de partage des prélèvements biologiques murins afin d'optimiser l'utilisation des souris.
Raffinement
Les procédures ont été pensées afin de limiter la douleur, des points limites nous permettant d’estimer le degré de douleur ou d’inconfort ont été définis et une grille de scoring a été établie. Des actions d'enrichissement du milieu de vie sont proposées pour réduire les nuisances. Les animaux seront hébergés en portoir ventilé par groupe de 5 avec accès ad libitum à l’eau et à la nourriture et à de l’enrichissement comme des maisons type igloo en plastique ou en carton. Pour réaliser les prélévements de sang les animaux seront sédatés par une anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle est couramment utilisé dans le domaine de la toxicologie selon la bibliographie. Les animaux seront expérimentés à partir de 7 à 8 semaines d'âge, qui correspond à la fin de la phase exponentielle de croissance, selon la fiche référence de la souche du fournisseur et cet âge.
Toxicité d’aérosols de type « mélanges gaz/particules » d’intérêt défense : cas des résidus de combustions issus de propergols solides composites
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
782 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils sont exposés par inhalation "nez seul" pendant quatre heures à du chlorure d'hydrogène et des particules d'alumine, subissent aspirations oropharyngées, instillations intratrachéales, gavages, jusqu'à vingt-cinq prélèvements de sang, des tests d'anxiété et de mémoire, une trachéotomie puis une perfusion intracardiaque. Le projet vise à définir des valeurs limites d'exposition pour les personnels du Ministère des Armées et du secteur aérospatial soumis aux résidus de combustion des missiles. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas de méthodes alternatives" et que les études in vivo sont "indispensables", ne retenant que des mâles au motif qu'aucune donnée féminine n'est disponible.
Objectifs
Avec l’émergence de nouveaux systèmes d’armes, le cumul des expositions des personnels du Ministère des Armées devient de plus en plus complexe, et ces derniers peuvent de fait être exposés à des mélanges de polluants au cours de leur carrière. C’est notamment le cas lors de l’utilisation de propulseurs tels que les propergols solides composites nécessaires à la mise à feu rapide de missiles où les personnels peuvent être exposés simultanément à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines par inhalation. Seule une étude sur les effets de ce type d’exposition a montré des phénomènes d’inflammation pulmonaires et systémiques précoces. L’objectif de ce projet est de poursuivre cette évaluation, en déterminant notamment si l’inflammation observée à court terme est persistante et si ces expositions impliquent d’autres types d’effets. Les résultats de ce projet devraient permettre de contribuer à définir des valeurs seuils chez les travailleurs du Ministère des Armées et du secteur aérospatial (valeurs limites d’exposition professionnelles) susceptibles d’être exposés à ce type de substances dans leur environnement professionnel, d’établir de nouvelles recommandations et d’identifier des biomarqueurs à analyser pour un meilleur suivi médical (examens pulmonaires, prises de sang, tests cognitifs, etc.).
Bénéfices attendus
Les études réalisées dans le cadre de ce projet permettront : - De déterminer les effets à long terme de l’exposition aiguë et subaiguë à des mélanges de chlorure d’hydrogène et de particules d’alumine (fibrose pulmonaire, atteintes cognitives, pathologies neurodégénératives, génotoxicité, etc.) ; - D’obtenir des informations sur les mécanismes d’action toxiques induits par ce type d’exposition ; - De comparer les données in et ex vivo obtenues à des données d’études in vitro réalisées en parallèle, et de définir si les modèles in vitro testés permettent une bonne prédictivité de la toxicité de ces substances/mélanges ; - De fournir des données contribuant à l’établissement de valeurs limites d’exposition professionnelles et de préconisations pour le suivi des personnels du Ministère des Armées par la médecine de prévention.
Procédures
Identification (moins de 5 min) : 1 fois ; anesthésie, perçage d’une oreille à l’aide d’une pince et tatouage en utilisant une encre dédiée (animaux stabulés plus d’un 1 mois). Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Aspiration oropharyngée (moins de 10 min/exposition) : 5 aspirations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par aspiration oropharyngée. Instillation intratrachéale (moins de 10 min/exposition) : 5 instillations (jour 1, 2, 3, 6 et 7) ; anesthésie, manipulations pour exposition et exposition à la solution d’essai par instillation intratrachéale. Exposition par inhalation en mode "nez seul" : 1, 4 (1 exposition/jour/4 jours consécutifs) ou entre 16 et 24 expositions (1 exposition/semaine/4 à 6 mois) ; habituation à la contention des tubes d’exposition (stabulation dans les tubes jusqu’à 30 min/jour/3 jours consécutifs), exposition aux substances/mélanges d’essai (4h/exposition). Gavage (moins de 3 min/administration) : 1 à 3 gavages (jour 1, jour 1+24h et jour 1+45h) ; contention manuelle des animaux vigiles, gavage avec la solution d’essai. Prélèvements de sang (moins de 5 min/prélèvement) : 1 à 25 prélèvements (2 prélèvements/semaine/12 mois) ; contention manuelle des animaux vigiles, manipulations et prélèvement d’une goutte de sang. Comportement (15 min à 1h15/évaluation suivant les tests) : 3 ou 4 fois (1, 3, 6 et pour certains animaux 12 mois après la dernière exposition) ; placement des animaux vigiles dans des dispositifs de mesure de l’activité, de l’anxiété et des capacités de mémorisation, et enregistrement de leurs déplacements. Pléthysmographie (moins de 1h15/évaluation) : 2 à 48 fois (1 évaluation/semaine ou par mois/2 semaines à 12 mois) ; placement des animaux vigiles dans des enceintes de pléthysmographie corps entier et enregistrement de paramètres respiratoires. Mécanique pulmonaire (moins de 45 min) : 1 fois préalablement à la fin de l’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, acte chirurgical (trachéotomie), administration d’un myorelaxant et mesure de la mécanique pulmonaire. Perfusion intracardiaque/exsanguination (moins de 45 min) : 1 fois en fin d’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie, actes chirurgicaux (laparotomie et thoracotomie) et perfusion avec du tampon phosphate salin.
Impact sur les animaux
Tatouage : stress lié à l’anesthésie ; Aspiration o.p. : stress lié à l’anesthésie ; Instillation i.t. : stress lié à l’anesthésie ; Exposition par inhalation en mode "nez seul" : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Gavage : stress lié au gavage et à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Prélèvements de sang : stress lié à la contention manuelle nécessaire pour le réaliser ; Analyse comportementale/pléthysmographie : Stress lié à la manipulation et au placement dans les dispositifs de test, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront notamment les expositions/administrations des substances/mélanges d’essai. Les expositions/administrations de substances/mélanges d’essai pourront également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, les muqueuses et la physiologie, pourront être observés.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps de fin d'étude définis en fonction des analyses ex vivo prévues selon une méthode autorisée chez le rat.
Remplacement
Il n’existe pas à l’heure actuelle de méthodes alternatives à l’expérimentation animale qui permettent seules de déterminer la toxicité aiguë et subaiguë de l’exposition par inhalation à du chlorure d’hydrogène et des particules d’alumines, seuls et en mélange, notamment des effets cliniques, pulmonaires, cognitifs et systémiques immédiats, et à court et à long terme. Les études in vivo sont pour cette évaluation indispensables. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires d’utilisation du rat, de souche couramment utilisée en laboratoire, au stade jeune adulte au moment de l’exposition aux substances/mélanges d’essai et de mâles. L’âge et le sexe des animaux utilisé a été défini comme étant représentatifs de la population humaine cible de ce projet. Seuls des mâles seront utilisés car il n’est pas attendu de variations significatives entre les deux sexes concernant les paramètres qui seront analysés, que le sexe n’est pas un facteur d’intérêt dans ce projet et que des données étant actuellement uniquement disponibles chez des mâles, seule l’étude de ce sexe sera pertinente pour la confrontation des données.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été déterminé sur la base de l’effectif minimum nécessaire pour mettre au point et valider un protocole de développement de fibrose pulmonaire, un protocole d’induction de génotoxicité et évaluer la toxicité de l’exposition aux substances/mélanges d’essai chez le rat. Il a été établi à partir des données bibliographiques disponibles sur l’induction de ces modèles pathologiques et par rapport aux paramètres in vivo (fonctions respiratoires, mécanique pulmonaire, fonctions cognitives) et ex vivo (biodistribution de l’alumine, marqueurs histologiques et biochimiques de toxicité et de génotoxicité) qui seront étudiés pour permettre une analyse statistique robuste et une extrapolation inter-espèces pertinente des résultats. Des tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution seront utilisés pour les comparer et ainsi évaluer les effets de l’exposition aux substances/mélanges d’essai. De plus, plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront adaptées aux rats et enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par groupe expérimental (2 ou 3 animaux par cage) pour leur socialisation. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et ainsi limiter le stress pouvant être ressenti durant les expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour favoriser leur développement cognitif. Pour les animaux exposés par inhalation « nez seul », des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec ces objets et de se cacher. Préalablement à la 1ère exposition, ces animaux seront habitués à la contention imposée par le placement dans les tubes en y étant stabulés jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs. Les tubes seront tapissés de matériaux absorbants pour assurer le confort des animaux. Après chaque phase d’habituation, de la nourriture sera déposée dans leurs cages d’hébergement en guise de récompense. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués (manipulation précautionneuse, surveillance continue, posologie adaptée, etc.), des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur (perte de poids, lésion, comportement anormal, etc.) et des actions correctives visant à soulager les animaux (surveillance accrue, traitements médicamenteux, etc.) ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude des effets respiratoires, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire. Des animaux jeunes adultes (âgés de 6 semaines au moment de la 1ère exposition) seront utilisés. L’âge des animaux au cours de l’étude (jeunes adultes/adultes étudiés durant au maximum 12 mois) sera ainsi représentatif des scénarios d’exposition réalistes étudiés.
Evaluer la biocompatibilité et l’efficacité de biomatériaux implantés in vivo chez le rat dans un défaut généré dans la calvaria
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
250 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit la création d'un trou dans l'os du crâne sous anesthésie, le comblement par un biomatériau maintenu vingt semaines, des prélèvements de sang hebdomadaires sur animal vigile et des radiographies répétées. Le porteur relie ce test à l'obtention du marquage CE d'un substitut osseux, prévu par la directive européenne sur les dispositifs médicaux. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit le remodelage osseux et que le recours à l'animal est "indispensable".
Objectifs
Les objectifs du présent projet sont : - De caractériser in vivo la biocompatibilité d’un biomatériau (substitut osseux) dans un environnement osseux. - D’évaluer la capacité du biomatériau étudié à induire une formation osseuse suite à la création d’un défaut dans la calvaria (os du crâne)
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet se mesurent à plusieurs niveaux : - Court terme (3 mois): chaque protocole, permettra de générer des informations sur la biocompatibilité du biomatériau étudié telles que l’évolution de l’inflammation des tissus post-chirurgie ainsi que la cicatrisation initiale autour du biomatériau. - Long terme (5 mois) : ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’évaluation, la détection, le contrôle ou les modalités de reconstruction osseuse (ex : mesure du taux de calcification, intégration du biomatériau) chez les animaux après implantation du biomatériau.
Procédures
La création d’un défaut osseux est prévue pour chaque animal. Cette procédure durera environ 20 min et se fera sur animal anesthésié. Le biomatériau de comblement sera ensuite appliqué et maintenu en place pendant 20 semaines. Des prélèvements sanguins sont prévus 1x/semaine sur animal vigile pendant toute la durée de l’étude. Chaque prélèvement durera moins de 5 min. Des radiographies sont prévues 2x/mois sur animal anesthésié pendant toute la durée de l’étude. Chaque radio durera moins de 5 min.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours des études d’efficacité préalablement réalisées et appuyées d’une veille bibliographique inhérente au biomatériau. Plus précisément, nous surveillerons quotidiennement l’apparition d’effets délétères qui pourraient survenir, comme un comportement anormal de l’animal, une perte de poids, difficulté à se déplacer…. Ces effets délétères ont préalablement été anticipés et listés au même titre que leurs actions correctives afférentes. Les nuisances attendues sur les animaux sont : - Traumatisme et inflammation transitoire au niveau du site d’implantation du biomatériau. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une anesthésie, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus. - Traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang. Cette procédure étant douloureuse à court terme, une analgésie, et un suivi spécifique sont prévus.
Devenir
A l’issue du protocole tous les animaux seront humainement euthanasiés et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins seront utilisés pour évaluer la toxicité éventuelle du biomatériau et/ou évaluer les modifications induites par son implantation. Les organes seront également utilisés pour réaliser des analyses histopathologiques et d’imagerie.
Remplacement
De manière systématique, les biomatériaux que nous évaluons in vivo ont fait l’objet de tests préliminaires in vitro mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des biomatériaux testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble des organes/tissus d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. De plus, le tissu osseux est un tissu en perpétuel remodelage avec une activité de résorption et de formation osseuse. Cet équilibre repose sur des mécanismes de régulations systémiques et locaux grâce à une communication étroite entre les différentes cellules osseuses afin de maintenir l’homéostasie du tissu. Ce mécanisme complexe ne peut être mimé par un modèle simple de culture in vitro. Il n'existe donc pas de méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer le remodelage osseux. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. Etant donné la variabilité probable des réponses aux biomatériaux testés, 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable tout en prenant en compte le bien-être animal. Ce nombre d’animaux a été déterminé par approche statistique (calcul de puissance), sur nos données historiques et l’utilisation de chaque animal a été optimisée (analyses et recueil de données longitudinales, études pilotes…) tout en limitant les contraintes au maximum. Cet effectif sera revu à la baisse dans le cas où le biomatériau évalué est connu, et après analyse des résultats d’études précliniques préliminaires d’efficacité, afin de donner des résultats reproductibles et similaires d’un animal à l’autre. Pour chacune des procédures, des tests statistiques seront réalisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents biomatériaux pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière spécifique, augmentation de l’enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation et ajout de nourriture appétente), nous utiliserons un analgésique lors des prélèvements sanguins à la jugulaire et des traitements antalgiques dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué et un suivi approfondi avec prise de poids et observations sur des caractéristiques spécifiques (gonflement, locomotion, sensibilité mécanique, ...) sera effectué deux fois par semaine minimum. Tout animal ayant atteint un ou plusieurs des points limites (repérés le plus précocement possible grâce à un suivi quotidien et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié.
Choix des espèces
Le rat a été choisi pour ce projet car cette espèce mammifère (à l’identique de la souris) présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires notamment en termes de remodelage osseux, proches de celles observables chez l'homme. Le rat, étant fréquemment utilisé à des fins de recherche, l’étude des effets de composés chez cet animal de laboratoire, permet de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, la taille de cet animal permet d’obtenir un volume suffisant de liquides biologiques parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ce rongeur permettront de confirmer la biocompatibilité du biomatériau et de faciliter la transposition à l’homme dans le cadre des premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux biomatériaux. De plus, une analyse in vivo de la biocompatibilité de biomatériaux est requise par la loi afin de pouvoir être marqué CE au titre de la directive européenne 93/42/CEE. Sous le couvert de la réglementation française (article R. 214-87 du Code rural et de la pêche maritime), le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction des données préliminaires du client et de l’analyse de la littérature par rapport au biomatériau étudié.
Prélèvements biologiques chez le rongeur et le lapin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Rats : 800
Lapins : 350
1 950 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie ou impliquant un niveau de souffrance léger, une partie euthanasiée pour prélever organes et tissus, d'autres réutilisés, gardés en élevage ou adoptés. Ils subissent des prélèvements de sang par différentes voies, dont la ponction du sinus rétro-orbital sous anesthésie et la ponction intracardiaque terminale, pour fournir sang, sérum, urine et organes à la communauté scientifique. Le porteur affirme que ces produits biologiques ne peuvent pas être obtenus par des méthodes de remplacement. Le projet a pour objet de prélever sur ces animaux la matière biologique utilisée dans d'autres recherches.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de fournir à la communauté scientifique des produits biologiques provenant de l’espèce lapin ou de différentes espèces de rongeurs génétiquement altérés ou non génétiquement altérés (rat, souris,). Ces produits biologiques, essentiels pour l’avancement de la recherche biomedicale, le développement des therapies innovantes et la conduite des tests in vitro ou ex-vivo, sont du sang, plasma, sérum, des fèces, de l’urine, du liquide cérébrospinal et divers tissus (moelle osseuse, organes, … ) Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale qui seront ensuite utilisés dans le cadre de l’évaluation de la sécurité de futurs médicaments ou produits biologiques.
Bénéfices attendus
Les prélèvements biologiques provenant du lapin ou de rongeurs sont utilisés par exemple comme : -outil de diagnostic/ réactif pour des tests biologiques -matrice pour des essais ex vivo et/ ou la mise au point/ validation de méthodes analytiques indispensables pour des futures études in vivo -pour obtenir des contrôles analytiques ou des données références sur une souche animale. Ce projet a pour but de mettre à la disposition de la communauté scientifique ou de l’industrie divers produits biologiques (sang et ses dérivés, urines, fèces, liquide cérébrospinal, …) en provenance du lapin, du rat et de la souris. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques.
Procédures
Les méthodes générant le moins de stress pour l’animal (temps de contention réduit, pas de nécessité de vasodilatation) et les moins traumatisantes pour l’animal seront privilégiées : veine jugulaire ou saphène par exemple. Dans le cas où ces sites ne peuvent pas être utilisés ou les volumes demandés sont trop importants, la veine sublinguale ou en dernier recours le sinus rétro-orbital seront utilisés et l’animal sera préalablement anesthésié par voie gazeuse (ex : Isoflurane). Le prélèvement en intracardiaque (ou aorte ou veine cave caudale) sera réservé aux grands volumes de sang ne pouvant être prélevés par d’autres voies et sera terminal sur animal préalablement anesthésié. Les prélèvements auront une durée de l’ordre de la minute. Fréquence pour les procédures où ce ne sera pas un prélèvement unique : Rat (sublinguale) 2 sur 7 jours Rat (Sinus retro-orbital) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Rat (caudale) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (jugulaire) : 6 sur 24h, et 10 sur 7 jours Rat (saphène externe) : 4 sur 7 jours: Rat (submentale) : 2 sur 7 jours Rat (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (submentale) : 2 sur 7 jours Souris (submandibulaire) : 2 sur 7 jours Souris (caudale) : 3 sur 7 jours Souris (saphène) alternance site G/D : 2 sur 7 jours Lapin (oreille) : 8 sur 24h, et 12 sur 7 jours Pour les prélèvements de diurèse, une mise à jeun éventuelle sera appliquée (maximum de 16h avec mise à jeun).
Impact sur les animaux
Les nuisances pour les animaux peuvent être les suivantes : - Stress, inconfort ou douleur brève, n’excédant pas quelques minutes de prélèvement de sang ou fluides corporels Des points limites identifiés dans les procédures internes seront apppliqués. En cas d’atteinte de ces points limites, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance (mise en place d’un traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie)
Devenir
En accord avec le plan d’étude utilisé les animaux pourrons être 1) euthanasiés en fin d’expérimentation en vue d’examens et de prélèvements d’organes ou tissus (examens macroscopiques, microscopiques et/ou squelettiques); 2) gardés en vie si pas de besoin de prélèvement; 3) adoptés en accord avec la structure en charge du bien-être animal et les vétérinaires ; 4) hébergés en attente d’inclusion en étude, conditionnée par un examen vétérinaire favorable.
Remplacement
L’objectif du projet étant de fournir aux scientifiques des produits biologiques provenant de lapins ou de rongeurs et ceux-ci ne peuvent pas être produits par des méthodes alternatives.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé en fonction de la quantité de sang ou de tissus ou d’autres prélèvements biologiques nécessaire, de manière à respecter les recommandations éthiques en vigueur sur les volumes prélevés et les temps de récupération. Les animaux pourront être réutilisés pour certains prélèvements biologiques à condition de respecter les procédures de réutilisation des animaux et sur avis du vétérinaire.
Raffinement
Les rongeurs hébergés sur site seront hébergés dans des cages sur fond plastique et sur de la litière avec un enrichissement adapté (par exemple : papier kraft, tunnel, …). Les rats (mâles et femelles) et souris femelles seront hébergés en groupes sociaux. Les lapins seront hébergés en cage sur fond plastique munie d’une plateforme de repos, avec contact visuel et olfactif avec les congénères. De la musique sera diffusée pendant la période 6h-18h. Un enrichissement adapté sera fourni : par exemple mousquetons/rondelles métalliques, rondins végétaux et bâtonnet de bois à ronger. Tous les animaux (rongeurs, lapins) sont observés au moins 1 fois par jour afin de permettre la détection rapide de signes cliniques et d’agir au plus vite pour limiter toute souffrance ou douleur inutile. En cas de signes cliniques, ayant des répercussions sur le bien-être animal, des mesures rapides et appropriées seront prises par le vétérinaire. En cas d’atteinte d’un point limite, des mesures seront rapidement prises pour limiter la souffrance de l’animal (traitement analgésique, suspension de la procédure ou euthanasie).
Choix des espèces
Les espèces utilisées dépendent des espèces sélectionnées pour les études précliniques in vivo (analogie du récepteur entre l’homme et l’animal, similitude du profil des métabolites, données de pharmacocinétique/ pharmacodynamie, …) et des tests biologiques à faire. De la naissance à adulte mature qui a terminé sa croissance. L’âge de l’animal dépend des besoins du scientifique, de la classe d’âge visée dans l’utilisation clinique du produit (mise au point /validation de méthodes analytiques).
Le test d’observation d’Irwin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3600
7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.
Objectifs
Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Devenir
A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.
Prélèvements biologiques chez le primate non humain pour des essais ex vivo et/ou pour le développement ou la validation réglementaire de méthodes analytiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
Macaques rhésus : 30
120 macaques à longue queue et 30 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés d'un projet à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des prélèvements répétés de sang, d'urines, de biopsies cutanées ou d'organes et de liquide cérébrospinal, sous contention ou anesthésie, pour valider des méthodes d'analyse de laboratoire. Le porteur indique que ces prélèvements servent à qualifier des essais réglementaires sur des candidats médicaments, et que les animaux sont euthanasiés en fin de vie sur avis vétérinaire. Il revendique le primate comme seule espèce pertinente et qualifie ces prélèvements d'indispensables.
Objectifs
Aujourd’hui, de plus en plus de candidats médicaments sont des protéines thérapeutiques (ou molécules biologiques plus ou moins complexes), et le primate non humain est souvent la seule espèce adéquate pour évaluer la toxicité ou l’activité pharmacologique de ces composés, du fait des homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme. Ces études d’évaluations sont requises par les autorités réglementaires et des lignes directrices existent pour définir leur conduite. Elles comportent de nombreuses analyses de laboratoire pour évaluer la concentration plasmatique (ou autres matrices) du composé testé, et la corréler avec son activité pharmacologique ou toxique. Compte tenu des enjeux et de la réglementation, il est indispensable que les résultats générés soient fiables et robustes. Ceci ne peut être assuré qu’après avoir démontré les performances analytiques des essais au cours de leur qualification et/ou validation analytique. Cependant, la composition des échantillons analysés peut influencer les résultats d’analyse et la performance d’un essai, il est donc nécessaire que ces paramètres soient évalués dans le même type d’échantillons que ceux à analyser. Par conséquent, effectuer les prélèvements biologiques provenant de primates non humains, en amont ou en parallèle de la réalisation des études, est indispensable pour valider les essais utilisés lors des analyses d’échantillons d’études. Par ailleurs, le développement et la validation règlementaire de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles et précises dans les laboratoires contribuent aux 3R, notamment en limitant les quantités de matrice biologique nécessaire et en permettant des interprétations plus fines.
Bénéfices attendus
Le projet permet d’obtenir des matrices (prélèvements sur animaux) nécessaires au développement et à la validation d’essais analytiques au sein de l’établissement utilisateur afin d’assurer la génération de données validées règlementairement, fiables et exploitables, nécessaires et indispensables au développement de candidats médicaments. Le bénéfice est d’une part scientifique et réglementaire (court et moyen terme) : le projet permet d’assurer l’accès pour les laboratoires aux matrices biologiques nécessaires pour les développements et validations, en appui aux études de toxicologie réglementaire et au développement de médicaments, et de bénéficier de prélèvements de qualité, notamment en évitant des contraintes de conservation ou de transport. D’autre part, il y a un bénéfice important sur les 3R (bénéfices à court, moyen et long terme) : les techniques et les méthodes de laboratoires deviennent de plus en plus sensibles et précises et le développement de nouvelles techniques de laboratoire permet de raffiner (ex : diminution des volumes de matrices prélevées, augmentation des paramètres pouvant être analysés et de ce fait amélioration des conclusions des études) et en conséquence de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant. Un exemple concret correspond au développement d’approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®, électrochimie luminescence ou PCR digitale).
Procédures
Les prélèvements seront réalisés en respectant les recommandations éthiques en vigueur adaptées au type de prélèvement et en respectant une période de récupération adaptée pour l’animal entre deux prélèvements. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile : sang (unique ou répété) par les voies veineuses périphériques), urines, selles, frottis vaginal, nécessitent une contention de courte durée, manuelle (moins de 5 minutes) et/ou en chaise de contention (jusqu’à 30 minutes ou 1 heure maximum). Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex jeune animal) ou sous sédation (ex cas des animaux matures) : salive, larmes, sécrétions nasales, récolte du sperme ; si une sédation est requise, elle sera de courte durée (environ 5-15 minutes) et l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Les prélèvements réalisés sous anesthésie générale : biopsie cutanée ou d’organes, liquide cérébrospinal, liquide synovial, humeur aqueuse ; l’animal sera surveillé jusqu’à son réveil complet. Dans certains cas particuliers les prélèvements exigent des contraintes d’hébergement particulières : Mise à jeun (préalablement à une anesthésie, maximum 18 heures) ; Hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés, pour recueil d’urine/fèces en cage à diurèse, en vue d’une analyse individuelle, maximum 18 heures).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont minimes et correspondent essentiellement au stress et douleurs liés à la contention et aux types de prélèvements : -Prélèvements sur animaux vigiles : hématome transitoire sur le site de prélèvement sanguin, légère douleur provoquée par la ponction à l’aiguille, stress provoqué par la contention et/ou l’hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores… préservés), le cas échéant -Sédation/Anesthésie générale : effets cardiorespiratoires, hypothermie, stress provoqué par les manipulations liées à l’anesthésie -Prélèvements plus invasifs comme les biopsies : douleurs au niveau du site de biopsie, stress provoqué par l’intervention post-opératoire comme la contention pour les soins post-opératoires et les injections répétées. -Stress lors de contrainte occasionnelle liée à l’hébergement, notamment lors d’hébergement individuel, et de contention à la main ou en chaise le cas échéant.
Devenir
Après avoir pris en compte les effets subis par l’animal notamment lors de la participation dans les projets précédents et en tenant compte d’autres questions sanitaires, selon l’avis vétérinaire si ces animaux ne peuvent plus être réutilisés, le vétérinaire peut donner l’autorisation d’euthanasie. Dans ce cas-là les différents organes et du sang peuvent être prélevés et mis à disposition des laboratoires à la fin de vie de ces animaux. Selon l’avis vétérinaire les animaux peuvent être gardés en vie sous la responsabilité de l’établissement. Le suivi des animaux est maintenu selon les procédures de l’établissement et conformément aux règlementations et recommandations en vigueur (Directive 2010/63, AAALAC et autres recommandations éthiques internes). Ils pourront possiblement être sélectionnés selon des critères bien définis et réutilisés dans un projet.
Remplacement
Les lignes directrices de validation de méthodes recommandent que les essais soient validés dans les mêmes matrices que les échantillons d’étude (même espèce), afin de s’assurer de la performance des essais dans leur utilisation réelle. A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode in vitro permettant de synthétiser ces produits biologiques en raison de la complexité des matrices biologiques utilisés dans ce projet, et les matrices primates ne peuvent pas être remplacées par des matrices d’autres espèces du fait de la règlementation et de la nature des candidats testés (ex : protéines thérapeutiques).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet sera déterminé strictement selon les besoins des laboratoires et la réglementation en vigueur en termes de validation d’essais. Les prélèvements seront effectués pour les analyses prévues en utilisant le nombre d’animaux minimum requis. Par ailleurs, le développement de nouvelles méthodes et de techniques plus sensibles dans les laboratoires permet de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, contribuant ainsi à la réduction (3R).
Raffinement
Les techniques et les méthodes de laboratoire deviennent de plus en plus sensibles et précises, ce qui renforce l’efficacité des analyses. Les essais ex vivo réalisés en amont des études précliniques in vivo s’inscrivent dans une stratégie 3R (réduction et raffinement) car ils permettent de caractériser le candidat médicament (sélection du meilleur candidat, connaissance du profil métabolique, pharmacologique et toxicologique) avant de démarrer les essais sur l’animal. Les méthodes développées et validées dans ce projet permettent en particulier d’optimiser les doses utilisées ensuite pour les études vivo, et de limiter la quantité de matrice biologique nécessaire, ex : approches permettant de doser plusieurs analytes à partir d’un volume réduit de plasma (analyses Multiplex avec la technologie Luminex®) et techniques plus sensibles et plus précises (électrochimie luminescence ou PCR digitale permettant des interprétations plus fines). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites (ex : plaie, gonflement au niveau du site de prélèvement, amaigrissement) qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux.
Choix des espèces
Les lignes directrices rendent indispensable l’utilisation d’un non-rongeur pour chaque nouveau médicament avant tout essai clinique et mise sur le marché. L’espèce primate est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anticancer). Le choix du primate non humain est justifié par les homologies génétiques, immunologiques et physiologiques avec l’homme, nécessaires pour prévoir au mieux l’activité toxique ou pharmacologique de nouveaux candidats médicaments chez l’homme. Parmi ces composés, on peut citer les anticorps thérapeutiques (ou autres peptides ou protéines), qui présentent une spécificité importante pour leur cible et qui souvent ne se lient pas sur les cibles d’autres espèces plus éloignées sur le plan phylogénétique comme le chien ou les rongeurs. Par ailleurs, de nombreux composés jouent un rôle dans la modulation du système immunitaire, comme les immunosuppresseurs ou immuno-activateurs (cas des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires en immuno-oncologie). Dans ces conditions, il est indispensable d’administrer ces composés chez l’espèce dont le système immunitaire se rapproche le plus de celui de l’homme. D’autres classes de thérapies avancées, comme certains virus oncolytiques par exemple, n’infectent que l’homme et le primate non humain. Animaux juvéniles d’au moins 22 mois, soit l’âge moyen auquel les animaux sont reçus à l’établissement utilisateur et auquel les animaux sont inclus dans les études réglementaires. Pour certains prélèvements biologiques, des animaux matures (maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés en fonction des besoins scientifiques et selon la disponibilité des animaux non attribués dans un autre projet au moment du besoin.
Mise au point de la mesure de la vitesse de conduction nerveuse chez le primate non humain
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
6 macaques à longue queue vont être utilisé·es, gardés en vie pour une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit cinq sessions de mesure de la conduction nerveuse sous anesthésie générale, avec insertion d'électrodes et stimulation des nerfs périphériques, espacées d'au moins trois jours. Le projet vise à valider cette mesure chez le primate non-humain pour l'intégrer aux études réglementaires de toxicologie. Le porteur indique que l'évaluation de la toxicité chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire et retient le primate pour son homologie avec l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de développer et valider la mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. Cette méthode permettra l’obtention d’enregistrement fonctionnels de l’activité du système nerveux périphériques dans les études réglementaires d’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques. La validation permettra de s’assurer que l’appareil d’enregistrement et le test mis en place permettent de mesurer la conduction nerveuse de façon fiable et reproductible chez le primate non-humain avant l’intégration dans les études de toxicologie réglementaire.
Bénéfices attendus
La validation de cette technique permettra d’effectuer la mesure de la conduction nerveuse et ainsi d’évaluer une possible atteinte du système nerveux périphérique lors de la réalisation d’études de toxicologie règlementaire (notamment pour des candidats médicaments appartenant à des classes pour lesquelles des neuropathies ont déjà été mise en évidence chez l’homme ou ayant une indication en lien avec le système nerveux). Cette technique sera aussi utilisé pour l’évaluation du fonctionnement du système nerveux pendant les études réglementaire pour les thérapies innovantes telle que la thérapie génique (pour lesquels les vecteurs employés présentent un tropisme pour le système nerveux) . La surveillance de l’état du système nerveux périphérique par la mesure de la conduction nerveuse lors des études réglementaires permettra une meilleure anticipation des effets adverses pouvant survenir chez l’homme notamment lors des essais cliniques. Cette méthode étant translationnelle, elle pourra aussi être utilisée chez l’homme lors des essais cliniques en se basant sur les résultats obtenus chez l’animal afin de monitorer le développement potentiel de neuropathies. A terme, ce projet contribuera aussi à la réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques en permettant l’enregistrement de paramètres additionnels (mesure de la conduction nerveuse) chez des animaux déjà inclus dans les études de toxicologie réglementaire au lieu de réaliser des études spécifiquement pour évaluer ce point (étude standalone).
Procédures
Chaque session de mesure de conduction nerveuse sera réalisée sous anesthésie générale. 5 sessions d’enregistrement par animal seront réalisées. Une mise à jeun sera prévu avant chaque anesthésie. Les sessions d’enregistrement seront espacées d’au moins 3 jours.
Impact sur les animaux
La procédure étant réalisée sous anesthésie générale, il n’y pas d’effets négatifs attendus liés à l’insertion d’électrodes et à la stimulation des nerfs périphériques chez l’animal (celle-ci étant réalisée en routine sans anesthésie ou analgésie chez l’homme vigile dans le cadre des examens cliniques d’enregistrement de vitesse de conduction nerveuse). Chez l’animal, les procédures d’enregistrement (durant environ 15 minutes et jusqu’à 45 minutes maximum) se font sur des animaux anesthésiés (afin que ceux-ci soient immobiles et ne ressentent pas l‘introduction des électrodes ni le spasme ou le pincement potentiellement induit par le courant électrique) mis à jeun au minimum 6 heures avant la procédure . La fréquence respiratoire sera monitorée au cours de l’anesthésie. Lors du réveil anesthésique, des pertes d’équilibres et une hypothermie légère peuvent être observée temporairement. En cas d’hypothermie, une prise en charge par lampe chauffante et par air chaud pulsé si nécessaire sera mise en place.
Devenir
Le degré de sévérité de la procédure étant classé à priori comme léger les animaux seront gardés en vie pour une éventuelle réutilisation après une période de repos.
Remplacement
Bien que des alternatives in vitro et in silico à l’usage d’animaux afin d’évaluer la sécurité et la toxicité des candidats médicaments soient en développement, l’évaluation non-clinique de la toxicité des médicaments chez une à deux espèces animales reste une exigence réglementaire en Europe à ce jour car il n’existe pas actuellement d’alternatives qui permettent de déterminer la toxicité de substances suite à une exposition systémique sans le tester dans l’animal. La technique de mesure de la conduction nerveuse doit donc être validée dans les espèces chez lesquelles elle sera par la suite utilisée dans le cadre des études réglementaires.
Réduction
Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis pour pouvoir conclure à la validation de la technique. La sensibilité du test de conduction nerveuse a également été prise en compte pour déterminer le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux seront observés au minimum une fois par jour afin de détecter rapidement tout signe clinique. La procédure d’enregistrement sera réalisée sous anesthésie avec un agent ayant des propriétés analgésique avec une surveillance anesthésique (au minimum fréquence respiratoire et température corporelle de l’animal). Si la température corporelle centrale est en dessous de 36°C, des mesures pour réchauffer l’animal seront prises (mise sous lampe chauffante ; utilisation de cage de réveil avec air chaud pulsé, couverture de l’animal, air chaud compulsé...). Si l’animal ne répond pas aux mesures de réchauffement, l’euthanasie sera considérée. L’anesthésie sera réversée par l’utilisation d’un antagoniste médicamenteux pour faciliter le réveil.
Choix des espèces
De nombreux traitements innovants nécessitent une homologie importante avec l’homme afin d’évaluer les potentiels effets toxiques. Dans ce cas, les études de toxicologie réglementaire doivent être conduites chez le primate non-humain. Or, ces thérapies sont à risque de causer des neuropathies chez l’homme. L’intégration de la mesure de la conduction nerveuse dans les études de toxicologie règlementaire sera donc essentielle pour évaluer ces risques. La technique de mesure de la conduction nerveuse, ayant vocation à être incorporée à des études de toxicologie règlementaire, doit être conduite chez les espèces qui seront utilisées dans ces études. Cette intégration nécessite donc la validation préalable du test de mesure de la conduction nerveuse chez le primate non humain. La validation du test de conduction nerveuse se fera sur jeunes adultes/adultes comme pour les études de toxicologie réglementaire.