Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
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- Système urogénital
Etude d’une maladie génétique rare vasculaire chez le rat
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour étudier une maladie génétique rare des vaisseaux, 192 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués pour analyse moléculaire et histologique. Le protocole se limite à une biopsie de l'oreille pour le génotypage, à des pesées et à des mesures mensuelles de pression artérielle au brassard sur la queue, entre deux et six mois. Les rats hypertendus se montrent stressés dès qu'on les saisit ou qu'on les immobilise, ce que le porteur relève sans en tirer de conséquence sur le nombre de mesures. Il justifie le passage de la souris au rat par le peu de matériel disponible chez la souris, volume d'aorte et d'artères, et par l'absence de lignée de souris hypertendue.
Objectifs
L'objectif de ce projet est l’étude physiopathologique de modèles rats d'une maladie génétique rare. Nous souhaitons étudier l’effet de la mutation créée dans un fond génétique pur normotendu et dans un fond génétique hypertendu.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de cette maladie vasculaire et de proposer des thérapies ciblées pour améliorer le diagnostic, le traitement et le confort de vie des patients.
Procédures
La biopsie à l’oreille pour le génotypage dure quelques secondes et est pratiquée une fois. Les pesées et mesures de pression artérielle au brassard à la queue durent quelques minutes et sont pratiqués une fois par mois entre 2 et 6 mois. L'injection d'antalgie et le placement en cage pour l'anesthésie gazeuse avant la mise à mort sont pratiqués une fois et durent quelques secondes.
Impact sur les animaux
La biopsie à l’oreille pour le génotypage et la pose de bague induisent un léger stress et une douleur ponctuelle légère. Les pesées, les mesures de pression artérielle au brassard à la queue et la mise dans une cage d’induction à l’isoflurane en fin de procédure peuvent causer un léger stress. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour analyse moléculaire et histologique
Remplacement
L’étude sur cellules en culture ne permet que d’explorer des modifications limitées à un modèle cellulaire dans des conditions de culture particulière. L'étude sur animal entier est donc indispensable pour la compréhension physiopathologique et pour des tests thérapeutiques. Nous venons de montrer l’intérêt de cette recherche translationnelle de la souris à l’homme. L’étude de rats modèles sur fond normo et hypertendu pourra apporter des éléments supplémentaires à cette analyse.
Réduction
Le nombre d'animaux sera réduit au nombre nécessaire déterminé par les résultats d’analyses statistiques.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Des grilles de score de surveillance avec des points limites suffisamment prédictifs seront renseignées. Les rats hypertendus présentent un stress lors de leur préhension ou contention. La pression artérielle et la fréquence cardiaque seront mesurées de façon non-invasive par un brassard à la queue de l’animal placé sur un plateau chauffant dans une boite de contention adaptée. Afin de diminuer le stress de la contention et de la mesure, les animaux seront habitués chaque jour pendant 4 jours à l’âge de 8 semaines. A la fin de la procédure une exsanguination par prélèvement intracardiaque sans ouverture de la cage thoracique sera pratiquée sous surdosage d’anesthésie gazeuse et analgésie.
Choix des espèces
Même si l’analyse de souris transgéniques modèles a été très instructive dans cette pathologie, la limitation du matériel disponible (volume de l’aorte et des artères pour analyse immunohistologique et moléculaire, difficulté d’analyse in vivo par échographie) et l’absence de modèle de souris hypertendue nous a conduit à faire le choix de développer un modèle de rats. Les animaux seront étudiés à l'âge adulte entre 2 et 6 mois pour que le développement de l'organisme notamment au niveau hormonal soit finalisé.
Réponses adaptatives à l’exercice et horloge circadienne
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Quinze jours d'acclimatation en cage chronobiologique, dix à quinze jours d'habituation au tapis roulant, puis un test d'endurance pouvant durer quatre-vingt-dix minutes, avec jusqu'à cinquante stimulations électriques pour forcer la course. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après le test, une scarification de la veine de la queue permet de doser le lactate et le sucre dans le sang, et l'entraînement se poursuit à raison de trois séances de vingt à quarante-cinq minutes par semaine. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, sauf jusqu'à quarante souris qui refuseraient de courir et seraient alors basculées vers d'autres procédures en cours.
Objectifs
Ce projet explore le rôle d’une protéine influencée par l’horloge biologique qui joue un rôle clé dans la gestion des sucres et des graisses, ainsi que dans le bon fonctionnement des muscles. Pour mieux comprendre son impact, les chercheurs ont développé un modèle animal dans lequel cette protéine est absente spécifiquement dans les muscles. Bien que cette absence ne provoque pas de changement visible au repos, les premières analyses suggèrent qu’elle pourrait affecter la capacité du corps à s’adapter à l’effort. Les chercheurs examineront comment les muscles de ces souris réagissent à un effort ponctuel à différents moments de la journée, comment ils s’adaptent à un entraînement prolongé et quelles sont les conséquences sur l’équilibre énergétique et inflammatoire du corps. Les résultats pourraient améliorer notre compréhension des mécanismes régulant l’endurance musculaire et ouvrir de nouvelles perspectives dans le domaine de la santé et du sport. Nous ne disposons pas de modèle de remplacement, cependant le raffinement et la réduction sont particulièrement appliqués. En outre, les procédures sont réalisées durant la phase de veille (donc d'activité) de la souris. A chaque étape du protocole, la règle des 3Rs sera appliquée.
Bénéfices attendus
Ce projet, pleinement justifié d’un point de vue scientifique et conforme à la règle des 3Rs, vise à explorer le rôle d’un gène impliqué dans le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que dans la physiologie du muscle squelettique. Son objectif est d’approfondir l’influence de ce gène, dont l’expression fluctue au cours de la journée et est stimulée par l’exercice physique, sur la fonction musculaire et la coordination des réponses métaboliques et immunitaires à l’effort, soulignant ainsi l'importance du rythme circadien dans ces mécanismes. À court terme, nous pourrons évaluer son impact sur l’endurance, la récupération et l’adaptation musculaire à l’exercice, renforçant ainsi notre compréhension des interactions entre l’horloge biologique, l’activité physique et le métabolisme. L’étude tiendra également compte de l’influence du moment de la journée sur la physiologie de l’exercice. Sur la base des résultats obtenus, nous élargirons l’analyse aux voies de régulation et aux processus métaboliques et immuno-métaboliques les plus affectés par l’inactivation de ce gène dans le muscle squelettique. Par ailleurs, nous examinerons comment le désalignement du rythme circadien perturbe le métabolisme et comment l’exercice musculaire pourrait contribuer à sa régulation. Ce projet pourrait ainsi ouvrir la voie à une optimisation des recommandations en matière d’activité physique, de nutrition et de gestion du rythme circadien, avec des implications majeures pour la santé et la performance physique.
Procédures
Les souris devront réaliser un test de performance physique d'endurance dont la durée peut atteindre 90 minutes selon leurs capacités. La stimulation à la course durant ce test peut nécessiter l'utilisation de la stimulation électrique et dans ce cas, la souris peut recevoir au maximum 50 stimulations électriques à intensité faible induisant un léger picotement. En pratique le recours à la stimulation n'est pas souvent utile lorsque la souris se trouve dans sa phase de veille (active) lors du protocole d'exercice. Une scarification sur la veine de la queue pour prélever une microgoutte de sang, pour doser à l'aide d'une bandelette la lactatémie et la glycémie post-exercice, sera réalisée. Elle peut génèrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de l'acte (
Impact sur les animaux
Il y a peu d’effets indésirables dans ce projet. Avec les systèmes de cycles inversés dans les cages de chronobiologie, nous avons pu observer une forte activité des souris durant la nuit. Le test de performance physique d’endurance et l’entrainement des souris seront effectués pendant la phase active nocturne des souris ce qui limite considérablement le stress lié aux procédures et le recours à un système de stimulation électrique (les souris courent la plupart du temps spontanément après habituation). L’intensité de la stimulation électrique utilisée pour contraindre les souris à courir, s’il le faut lors du test d’endurance uniquement, sera la plus faible possible. Elle est désagréable mais n’induit pas de douleur. Elle ne sera pas forcément utilisée et ne le sera pas du tout lors de l'entrainement et l'habituation des souris. En effet, les souris courent spontanément, sans contrainte et sans s'arrêter, alors qu'elles en ont la possibilité. Une nuisance pourrait être lié au fait de les confiner pour une durée maximum de 90 minutes sur un couloir de course (la largeur de 7 cm est suffisante pour que la souris coure sans se retourner ou se dévier latéralement ; la longueur de 50 cm permet d'avoir une distance suffisante pour éviter tout stress dû à un espace trop restreint et la hauteur des parois latérales de 15 cm minimise l’effet de confinement). Le fait qu'elles soient habituées à cette situation et qu'elles courent durant la procédure de manière volontaire ainsi que leur comportement, nous laisse penser que cette nuisance est minime. Une légère scarification sur la veine de la queue pourrait être considérée comme une nuisance. Elle est effectuée pour prélever une microgoutte de sang pour doser, à l'aide d'une bandelette, la lactatémie et la glycémie post-exercice et pourrait engendrer une douleur aigue d’intensité légère le temps de la scarification sans autre effet indésirable.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes. Les animaux pouvant être réutilisés dans le cadre d'autres procédures en cours, sont ceux qui pourraient refuser de courir à l'issue de la période d'habituation au tapis roulant et qui ne seraient pas inclus dans les procédures. Cela peut concerner au maximum 40 souris pour l'intégralité des 2 procédures.
Remplacement
Nous utilisons des cultures de cellules musculaires et des traitements imitant les effets métaboliques de l'exercice pour étudier leurs réactions. D'autres types de cellules, comme des cellules graisseuses et immunitaires, sont également analysées après exposition aux substances libérées par les cellules musculaires traitées. Dans le cadre d’un projet de recherche, nous collaborons avec des équipes spécialisées pour examiner les fibres musculaires et développer un modèle mathématique du fonctionnement des muscles. Ces méthodes permettent de réduire l’utilisation d’animaux. Cependant, elles ne reproduisent pas les effets réels de l'exercice et de l'entraînement physique sur un organisme entier. C'est pourquoi l'utilisation d'animaux reste nécessaire pour cette étude.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été défini de manière à utiliser le minimum nécessaire pour détecter une différence statistiquement significative avec une puissance minimale de 80 %, tout en tenant compte d’une marge de 20 % de souris potentiellement exclues de l’étude (souris non coureuses). Ainsi, 10 animaux par groupe sont requis pour la procédure 1 (exercice) et 12 pour la procédure 2 (entraînement). Afin de limiter le nombre total d’animaux utilisés et ainsi respecter le principe de réduction de la règle des 3R, nous avons optimisé l’organisation des expériences. Pour éviter de multiplier les manipulations, certaines analyses seront réalisées sur des souris sauvages au cours de la procédure 1. Cela permettra d’évaluer la faisabilité des protocoles et d’effectuer des mesures métaboliques (consommation d’oxygène) ou immunitaires (cytométrie en flux) nécessitant un traitement immédiat des échantillons après prélèvement. Des tests statistiques seront appliqués pour analyser nos résultats.
Raffinement
Pour assurer le raffinement de l’expérimentation et garantir le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place. Tout d'abord, les procédures seront effectuées lors de la phase active de la souris et en lumière rouge afin de ne pas perturber les rythmes veille-sommeil des souris. Les souris seront préalablement acclimatées et de manière progressive durant 15 jours aux cages chronobiologiques. L'environnement dans la cage est enrichi. De plus, les souris seront progressivement habituées à l’exercice sur tapis roulant pendant 10-15 jours afin de limiter leur stress et favoriser l'exercice volontaire sur tapis. Nous limiterons par ces biais le recours à la stimulation électrique qui peut être stressant pour la souris. Les souris seront surveillées quotidiennement par les animaliers et régulièrement par les expérimentateurs pour détecter rapidement tout signe de souffrance et y remédier. Enfin nous utiliserons la méthode "en cup" pour prendre une souris, une technique de manipulation douce et non stressante, qui consiste à soulever l'animal en formant une coupe avec les mains plutôt qu'en le saisissant par la queue. Pour éviter tout stress inutile, les souris destinées à l’euthanasie seront placées dans une salle séparée et les manipulations post-euthanasie se dérouleront dans une autre pièce. Nous veillerons à ce qu’aucune souris ne soit isolée dans sa cage lors des procédures.
Choix des espèces
La souris est un modèle idéal pour étudier l’impact de l’exercice sur la santé, car son métabolisme et son système immunitaire sont proches de ceux de l’humain. La souris est le seul modèle chez lequel des mutants du gène-cible peuvent être générés. Les échantillons permettent d’obtenir assez de matériel pour réaliser des analyses immuno-métaboliques des tissus prélevés. Des travaux antérieurs de notre équipe et les données in vivo de la littérature sont obtenus sur des souris et les modèles génétiques en question, ce qui permet de faire des comparaisons indispensables et de ne pas répéter certaines expériences. Les souris utilisées auront entre 2 et 6 mois, car c'est à cet âge que des études précédentes ont montré une baisse d’endurance.
Evaluation du potentiel anti thrombotique d’un Fab antiplaquettaire ciblant GPIbα
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une partie des souris est importée puis utilisée dès l'âge de trois semaines, sans les périodes d'acclimatation et d'habituation prévues pour les autres. 360 souris vont être utilisées et toutes tuées, 144 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 144 un niveau modéré, 72 opérées sous anesthésie sans réveil. Elles subissent des chirurgies de une heure à une heure trente pour provoquer une thrombose de stent, une thrombose des microvaisseaux ou un infarctus du myocarde, sous ventilation mécanique pour le dernier modèle, avec gavages, injections et un prélèvement de sang de trente minutes sept jours plus tard. Le porteur écrit que l'induction d'une thrombose ne permet pas de maintenir l'animal en vie, et que les modèles in vitro dont il dispose ne sont "pas assez sophistiqués" pour reproduire la complexité du phénomène.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans les phénomènes de formation d’un caillot, appelé thrombose, qui apparaissent dans une artère malade. Ce phénomène est retrouvé dans plusieurs pathologies telles que l’accident vasculaire cérébral (AVC) ou l’infarctus du myocarde. Lors d’un AVC, le thrombus responsable de l’occlusion peut venir de la carotide qui présente un dépôt de substances graisseuses, appelé plaque d’athérosclérose. Dans ce cas, la pose d’un stent pour stabiliser la plaque, maintenir le vaisseau ouvert et éviter une récidive de l’AVC est utilisée en clinique. L’une des complications de cette pose est la formation d’un nouveau thrombus au niveau du stent (thrombose de stent). Nous avons généré un agent qui bloque un récepteur présent à la surface des plaquettes. Il a montré une inhibition de la formation de thrombi dans un modèle in vitro de perfusion de sang humain et de souris sur une surface induisant la formation de thrombi. Nous avons également validé son effet antithrombotique dans différents modèles de thrombose. Dans ce projet, nous souhaitons étudier l’effet antithrombotique de ce traitement antiplaquettaire dans d’autres modèles de thromboses plus spécifiques : la thrombose dans les microvaisseaux, la thrombose de stent, et l’infarctus du myocarde. Nous allons également comparer l’agent aux molécules ou combinaisons de molécules actuellement utilisées en clinique dans ces pathologies afin de déterminer s’il pourrait avoir un avantage par rapport aux traitements actuels.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’observation d’un effet anti thrombotique du traitement dans des modèles spécifiques de thrombose de stent et de thrombose des microvaisseaux. Un agent efficace dans ces conditions pourrait mener au développement d’un traitement de ces pathologies. La mise en évidence d’un effet positif sur l’infarctus du myocarde permettrait d’envisager le développement d’un traitement antiplaquettaire plus efficace dans cette pathologie. Si un effet est observé dans cette étude, cela pourrait conduire à une meilleure prise en charge des patients atteints de ces pathologies à long terme.
Procédures
Pour le premier modèle, les animaux anesthésiés sont soumis à 2 injections et à une chirurgie (1h). Dans le second modèle, certains groupes d’animaux vigiles subiront un gavage. Les animaux anesthésiés subiront 2 injections puis une chirurgie (durée 1h20). Dans le troisième modèle, certains animaux vigiles subiront un gavage. Les animaux anesthésiés seront placés sous ventilation mécanique puis subiront une chirurgie et 2 injections. La procédure durera 1h30. 7 jours plus tard les animaux sont à nouveaux anesthésiés et un prélèvement de sang est réalisé (30 minutes).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée après le gavage, les injections ainsi que d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées. Pour l’infarctus du myocarde, la procédure de chirurgie pourra entrainer des douleurs au site d’incision dans les jours suivants. On peut également s’attendre à des douleurs thoraciques dues à l’infarctus du myocarde et à des difficultés respiratoires.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car l’induction d’une thrombose chez l’animal ne permet pas son maintien en vie après la procédure. De même, le prélèvement d’une grande quantité de sang (prélèvement terminal) n’est pas en adéquation avec un maintien en vie de l’animal après la procédure.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de l’agent antiplaquettaire sur des modèles particuliers de thrombose artérielle. Ce processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs, cellules endothéliales) ainsi que la circulation sanguine (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néanmoins de modèles in vitro qui nous ont permis de préalablement valider la réduction de la thrombose induite par notre agent. Nous avons également validé cet effet dans des modèles in vivo de thrombose plus simple. Les modèles que nous envisageons dans ce projet nous permettront de réaliser cette évaluation dans des situations cliniques pour lesquelles notre agent pourrait être utilisé.
Réduction
Le projet se fera par étapes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs ont été déterminés en amont par une approche statistique. Le critère recherché est la comparaison de moyennes des aires du thrombus dans les 2 modèles de thrombose et des aires de la zone ischémiée dans le modèle d’infarctus du myocarde.
Raffinement
Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation à la manipulation est prévue 5 jours avant le début des expérimentations. Ce point ne concernera pas les animaux importés pour la première procédure car leur utilisation à 3 semaines ne permet pas de respecter ces périodes d’acclimatation et d’habituation après leur arrivée dans notre animalerie. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux au moins 7 jours avant l’expérimentation. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux. • Par une anesthésie avant et pendant la durée des procédures. • Par l’injection sous cutanée d’analgésiant aux sites d’incisions lors des procédures. • Par l’application de gel ophtalmique afin de protéger les yeux • Par l’application d’un anesthésique local après les injections lorsque l’animal est réveillé à posteriori • Contre la déshydratation, une injection sous-cutanée de sérum physiologique chaud est réalisée avant la procédure. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin de lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose. Les techniques de mutation génétique ont permis de générer des souris exprimant le récepteur dans sa version humaine, permettant d’étudier l’effet d’une molécule dirigée contre ce récepteur sur l’arrêt du saignement. Pour la première procédure, les souris sont utilisées à l’âge de 3 semaines. Cet âge précoce permet l’absence de graisses qui rendraient le déclenchement du model impossible. Pour les procédures 2 et 3, les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement, permettant d’obtenir des résultats le plus reproductibles possible.
Fonction des cellules immunitaires natural killer dans les exacerbations de l’asthme allergique induites par des virus
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris dont l'état se dégrade sans répondre aux mesures prévues sont tuées avant le terme du protocole. 528 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un allergène sur une narine sous anesthésie, quatre fois en douze jours ou vingt fois en cinq semaines, puis une infection par un virus du rhume, et pour certains groupes une mesure quotidienne de la respiration dans un système clos pendant cinq à neuf jours, après inhalation d'une molécule qui contracte les bronches. Toutes sont tuées, les poumons devant être prélevés à deux moments, au pic de l'exacerbation asthmatique et en fin d'expérience.
Objectifs
L’asthme est une maladie pulmonaire chronique complexe aboutissant à une obstruction bronchique réversible, qui affecte les enfants et les adultes. Dans le monde, en 2019, on estime que 262 millions de personnes souffraient d’asthme et que cette maladie a entraîné 461 000 décès. Cependant, ces chiffres sont très probablement sous-estimés. L’asthme est sévère pour environ 10% des patients qui souffrent de symptômes persistants malgré une bithérapie de fond incluant des fortes doses de corticoïdes inhalés. Les exacerbations ou aggravations des symptômes d’asthme restent un problème majeur dans le suivi et l’évolution des asthmatiques, qu’ils soient sévères ou non. Elles représentent le motif principal de recours aux soins, et peuvent conduire à l’hospitalisation voire entraîner le décés des patients. Environ 50 à 80% des exacerbations sont associées à des infections virales respiratoires (chez les adultes et les enfants, respectivement). Parmi les virus impliqués, 50-60% sont des rhinovirus, virus qui provoquent un rhume chez les individus sains sans autre conséquence. Même si certains mécanismes impliqués dans les exacerbations ont été identifiés, les connaissances restent insuffisantes pour développer des traitements efficaces. Il y a donc un réel besoin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui conduisent aux exacerbations viro-induites des asthmatiques. Les cellules natural killer (NK) sont une sous-famille de globules blancs. Ce sont des cellules immunitaires impliquées dans la réponse précoce contre les virus, qui sont présentes en grande quantité dans les poumons. Cependant, leurs rôles dans les exacerbations de l’asthme induites par les virus sont largement méconnus. Des études in vitro ont montré que la fonction des cellules NK humaines dirigée contre les rhinovirus était diminuée chez des patients atteints d’asthme sévère. L’objectif de ce travail est de mettre en place un modèle d’exacerbation de l’asthme induite par un rhinovirus chez la souris, afin de caractériser les cellules NK pulmonaires et leurs fonctions et de tester des thérapeutiques capables de restaurer leurs fonctions.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur le rôle de cellules immunitaires particulières (les cellules natural killer) dans l’asthme et ses exacerbations induites par les virus. Mieux comprendre cette maladie est essentiel pour proposer de nouvelles thérapeutiques. En effet, certains patients et surtout les plus sévères échappent aux traitements actuels. A court terme, ce projet permettra de proposer et d’évaluer de nouvelles thérapeutiques dans le traitement des exacerbations viro-induites de l’asthme chez l’adulte.
Procédures
Les animaux recevront sous anesthésie une petite goutte d’un allergène (molécule vis-à-vis de laquelle on peut être allergique) déposée sur une narine. L’allergène sera donné 4 fois en 12 jours, ou 20 fois en 5 semaines, selon le modèle. Les souris seront infectées avec un virus du rhume 1 seule fois, de la même manière : une goutte sur une narine, sous anesthésie. Certains groupes recevront en plus 1 injection unique en intraveineuse avec un traitement, sous anesthésie. Enfin, dans certains groupes, la respiration sera mesurée sur animaux vigiles se déplaçant librement dans un système clos (1 fois par jour pendant 5 à 9 jours).
Impact sur les animaux
Les nuisances de ce protocole sur les animaux sont : • L’anesthésie peut provoquer un stress, une hypothermie, et un risque faible d’arrêt cardiorespiratoire • L‘injection d’anesthésique peut entraîner une courte douleur (moins de 5 minutes) • L’infection avec un virus du rhume peut entrainer des symptomes viraux, inférieurs à ceux de la grippe • La mesure de la respiration peut être source de stress pour les animaux qui peuvent se déplacer librement mais sur une surface réduite. • Certaines mesures de la respiration doivent se faire après avoir respiré une molécule nébulisée induisant une contraction des bronches. Chez les animaux non asthmatiques, il ne se passe rien. Les animaux asthmatiques en exacerbation pourraient présenter des difficultés respiratoires.
Devenir
Afin de caractériser l’inflammation au niveau des poumons pour confirmer l’exacerbation de l’asthme, et évaluer l’effet des traitements, nous devons récupérer les poumons à 2 temps de l’expérience : au moment de l’exacerbation et à la fin de l’expérience. Nous devons pour cela procéder à la mise à mort de l’ensemble des animaux du projet. L’étude cellulaire et moléculaire du poumon est indispensable pour mieux comprendre les mécanimes de l’exacerbation de l’asthme induite par les virus, et evaluer l’effet et l’efficacité des traitements testés.
Remplacement
Il s’agit de l’étude d’une pathologie faisant appel à de nombreux types cellulaires et à de nombreux paramètres dont la complexité et la cinétique ne peuvent être reproduites in vitro, ou modélisées. Nous allions néanmoins ce travail à des études in vitro analysant les fonctions des cellules NK de patients asthmatiques qui pourront enrichir le projet présenté ici, et orienter le choix des molécules ciblées par la thérapeutique.
Réduction
Les effectifs sont ramenés au minimum permettant toutefois d’avoir un effet statistique significatif. Nous effectuons une étude pilote afin d’obtenir des données préliminaires solides et de calculer au plus juste le nombre d’animaux nécessaires en utilisant un outil informatique. Les nombres d’animaux présentés sont donc des nombres maximaux, et sont susceptibles d’être revus à la baisse.
Raffinement
Les expérimentations seront débutées 7 jours après réception des souris pour permettre leur acclimatation. Elles seront anesthésiées avant chaque administration (allergène, virus, traitement) et le jour de la mise à mort. Un test de reflexe des extrémités sera effectué pour vérifier la profondeur de l’anesthésie. Une fiche d’observation sera remplie quotidiennement afin d’assurer un suivi de l’état des animaux et de prendre les mesures adaptées (surveillance accrue, apport de nourriture gélifiée) le plus précocément possible. Si ces mesures sont insuffisantes, et que l’état de l’animal ne s’améliore pas ou se dégrade, il sera euthanasié avant la mise à mort prévue initialement.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris sont des modèles de base pour étudier le système immunitaire, et reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreux anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines au début des protocoles) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet. En outre, notre projet est focalisé sur l’asthme de l’adulte et ses exacerbations.
Etude de l’effet du PEDF sur le processus d’ossification primaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une ablation de la moelle osseuse du fémur sous anesthésie, précédée d'injections de tétracycline dans l'abdomen cinq jours puis un jour avant la mise à mort : 228 souris vont être utilisées, 168 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 60 dans des procédures légères. Toutes sont tuées pour récupérer leurs fémurs. Le projet porte sur le rôle d'une protéine dans la formation de l'os, en analysant des embryons à 16,5 et 19,5 jours de gestation, des souriceaux d'un jour et des adultes de deux mois. Le RNT ne précise pas combien de femelles gestantes sont tuées pour fournir ces embryons, ni comment se répartissent les 228 souris entre les stades étudiés.
Objectifs
Le rôle de cette protéine dans le fonctionnement du tissu osseux est mal connu alors que la mutation du gène codant pour cette protéine induit dès l’enfance des fractures nombreuses et sévères liées à une fragilité osseuse importante (ostéogénèse imparfaite de type VI). Nos premiers travaux ont porté sur un modèle de souris adultes chez qui cette protéine a été supprimée et qui présentaient des anomalies osseuses modestes. Afin de mieux comprendre le rôle de cette protéine dans l’os et d’expliquer pourquoi les enfants sont affectés d’une maladie sévère dès leur plus jeune âge, nous nous proposons d’analyser le squelette et la formation osseuse d’embryons de souris à différents stades de développement. Par la suite nous préciserons les mécanismes affectés par l’absence de cette protéine en reproduisant les stades initiaux de la formation osseuse (ossification) dans un modèle de réparation osseuse chez des souris adultes.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’implication de cette protéine dans la formation osseuse et particulièrement sur le processus d'ossification primaire qui conditionne le devenir de l'os adulte. Sur le long terme, cela nous permettra de mieux comprendre les processus pathologiques impliqués dans l'ostéogénèse imparfaite de type VI et de proposer des traitements adaptés.
Procédures
Injection intra-péritonéale d'une substance (5j et 1j avant mise à mort. Chirurgie au niveau du fémur sous anesthesie gazeuse à l’Isoflurane. Injection de burpénorphine pré et post opératoire en sous cutané.
Impact sur les animaux
Concerant l'injection intra-péritonéale de tétracycline, on s’attend à un léger stress après la manipulation. Cette procédure est donc de classe légère. L'ablation médullaire se fait sous anesthésie gazeuse par Isoflurane. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme. Cette procédure est donc de classe modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer les fémurs
Remplacement
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués. Compte tenu du fait que la moelle osseuse est un tissu complexe constitué de très nombreux types cellulaires, il est impossible de modéliser ces expérimentations in vitro.
Réduction
Le pourcentage des variations observées dans les mesures des paramètres biologiques varie selon la nature du parametre étudié .Pour réaliser une étude statistique solide, nous adapterons le nombre d’animaux nécesaire en fonction de la variabilité attendue des mesures. Dans la plupart des cas ce nombre est limité à 6 souris par groupe, porté à 8 pour l’immunohistochimie des fémurs ablatés, à 10 pour l’histomorphométrie+FTIR et à 12 pour l’expression génique.. Pour réduire le nombre d'animaux dans cette procédure, nous utiliserons le fémur droit de chaque souris comme contrôle.
Raffinement
Les animaux seront manipulés en limitant le stress au maximum, par des personnes compétentes en expérimentation animale, un temps d’acclimatation sera prévu avant toute manipulation et une définition précise des points limites conduisant à l’arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des souris sera mise en place. Une surveillance adaptée (observation régulière des animaux et grille de scoring) sera mise en place post-ablation et permettra de limiter au maximum la souffrance. Une analgésie pré-opératoire sera fait par injection 30min avant chirurgie. La chirurgie se fait sous anesthésie gazeuse. Une analgésie post-opératoire sera effectuée par injection 4h après chirurgie et sera renouvelée au besoin. Cette technique a déjà été utilisée dans notre laboratoire et elle est maîtrisée par un personnel compétent. La procédure n'entraîne pas de douleur ni de problème pour se déplacer chez l'animal sur le long terme.
Choix des espèces
Nous cherchons à étudier la relation complexe entre la microvascularisation et la formation osseuse ainsi que les mécanismes moléculaires impliqués ce qui est impossible à faire in vitro. Nous avons, de plus, validé toutes nos mesures chez des souris et le travail sera effectué chez des souris dont le gène du PEDF a été invalidé. Le mutant KO-PEDF chez la souris est une souche robuste sur laquelle des études ont déjà été faites (Doll et al 2013), c’est donc actuellement le meilleur modèle. Nous étudierons le processus d'ossification primaire sur des souris embryonnaires à 16.5 et19.5 jours post conception ainsi que sur des souriceaux de 1 j. Ce processus d’ossification primaire sera reproduit par ablation médullaire sur des souris de 2 mois
Evaluation de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Rats : 600
Chaque animal peut recevoir jusqu'à quatre mois de traitement, deux injections par jour, et un inducteur d'inflammation dans l'eau de boisson une semaine sur deux, jusqu'à quatre fois. 1 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 400 autres dans des procédures légères, tous tués à l'issue. Ils développent une inflammation intestinale reproduisant la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique, avec perte de poids, douleurs abdominales et diarrhée. Le mode d'administration, la fréquence et la durée des candidats médicaments dépendent de "la demande du sponsor", ces molécules étant celles de clients du laboratoire.
Objectifs
Plus de 3 millions de personnes sont atteintes d'une maladie inflammatoire chronique intestinale en Europe, rendant toujours nécessaire le développement de médicaments plus efficaces et mieux tolérées. Lors des poussées inflammatoires, ces maladies se caractérisent le plus souvent par des douleurs abdominales, des diarrhées fréquentes, parfois sanglantes, ou encore une atteinte de la région anale (fissure, abcès). Ces symptômes font peser sur la maladie un certain tabou, rendant la vie des patients qui en souffrent particulièrement difficile. L’objectif du projet est donc de faire la preuve de concept pharmacologique de candidats médicaments sur un modèle d’inflammation intestinale induite chez le rongeur. Ces composés chimiques vont induire une inflammation de la paroi intestinale et reproduire les symptômes rencontrés chez des patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l'intestin comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique.
Bénéfices attendus
Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques intestinales. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour à terme mieux prendre en charge les patients et les traiter de façon durable.
Procédures
1) Dans le cadre de ce projet, la maladie sera induite soit par prise hydrique avec un inducteur d'inflammation intestinale pendant une période de 7 jours au maximum pour le modèle aigu ou en alternance de périodes où les animaux reçoivent l'inducteur pendant la première semaine puis de l’eau la seconde et ceci jusqu’à quatre fois pour le modèle chronique. Soit par délivrance dans le rectum (environ 20 secondes hors temps d'anesthésie) pour le modèle avec le 2ème inducteur. 2) Les animaux seront soumis aux candidats médicaments à tester dont le mode d’administration, la fréquence et la durée dépendent de la demande du sponsor ((intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) pour une durée totale de traitement de 4 mois maximum). 3) Tout au long de l'étude, les animaux seront attentivement suivis à l’aide d'une pesée quotidienne et d’un score clinique. 4) La perméabilité intestinale pourra être évaluée une fois au cours de l'étude. Pour cela, après 2 heures de mise à jeun, les animaux recevront un composé fluorescent par gavage (30 secondes). 4 heures après l'administration du composé, un prélèvement de sang sera effectué (durée : 1 min maximum), puis les animaux auront de nouveau accès à la nourriture. 5) D'autres prélèvements de sang pourront être effectués tout au long de la procédure (5 prélèvements maximum sur toute la durée du protocle avec 1minute maximum pour chacun chacun et en respectant un teps de récupération nécessaire entre 2 prélèvements).
Impact sur les animaux
Les principaux effets indésirables attendus sur ce modèle animal sont une perte de poids, des douleurs abdominales associées à de la diarrhée, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injections (intrapéritonéales : environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, sous-cutanées environ 2 fois 10 secondes par jour maximum, gavage environ 1 fois 10 secondes par jour maximum, intradermiques environ une fois 3 min par jour maximum, intravasculaires environ une fois 2min par jour maximum) et peuvent engendrer un stress de même que la mise à jeun (2h). Pour pallier à cela, les cages seront enrichies et les animaux seront habitués à être manipulés par les expérimentateurs. Les aiguilles et les sondes de gavage seront adaptés au poids des animaux et au mode d’administration employé.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but d'étudier l'effet du composé testé sur l'inflammation et la résolution de l'inflammation.
Remplacement
Les modifications physiopathologiques nécessaires au développement des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il n'est pas envisageable d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche substitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles animaux pertinents pour permettre une recherche fondamentale et appliquée sur l’inflammation tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique, avant de passer aux essais cliniques chez l'Homme. L'utilisation des rats et des souris semble pertinent de par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent.
Réduction
Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. Lorsque cela est possible, les composés de nos clients seront screenés sur culture cellulaire ou organe isolé en complément des tests sur les animaux. Aucune étude pilote ne sera effectuée de part la robustesse du modèle utilisé.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Le projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective. Les rongeurs seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, en unités ventilées: Tous les animaux bénéficient d’un logement, d’un environnement, d’une alimentation, d’un apport en eau et de soins appropriés à leur santé et à leur bien-être. Les conditions d’environnement et les paramètres d’ambiance dans lesquels les animaux sont utilisés font l’objet de vérifications quotidiennes. Un cycle jour/nuit de 12h/24h est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Tous les animaux disposeront d’un espace suffisant présentant une complexité adéquate pour leur permettre d’exprimer un large répertoire de comportements normaux. Les normes d'hébergement appliquées prenent en compte le nombre, le poids des animaux et la dimension de la cage. Leur environnement sera enrichi (igloo, petite buchette, neslet pour les souris et tunnel, grande buchette, neslet pour les rats) afin d'éveiller leurs sens, leur curiosité, leur activité physique. Il n'est pas prévu d'administrer de molécule autre que celle du client. Il n'y a donc pas de possibilité́ de réaliser un traitement anti-inflammatoire ou anti-douloureux sans compromettre les résultats de l'étude car le but du modèle est d'étudier l'effet de nouveaux composés sur le développement des maladies intestinales inflammatoires dont l'inflammation est une composante majeure. Ainsi, un traitement anti-inflammatoire ou analgésique pourrait interférer avec le composé testé et biaiser le score établi pour caractériser la maladie ainsi que les paramètres mesurés (masure de la production de cytokines inflammatoires, recrutement de cellules immunitaires…). En effet, ces composés utilisent les mêmes voies de signalisation que celles des composés clients à tester. Les animaux seront tout de même pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement après l'induction de la maladie et jusqu'à l'euthanasie par les expérimentateurs ayant connaissance du modèle (grilles de score spéifiques permettant de définir les points limites).
Choix des espèces
D'une part, l’utilisation de modèles animaux dans l’étude des maladies inflammatoires chroniques de l'intestin est très largement documentée dans la littérature scientifique. D'autre part, l'utilisation de rats et de souris se justifie par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), lorsque toutes leurs fonctions biologiques sont matures, afin d’obtenir des paramètres d’induction de la maladie reproductibles.
Thérapie génique rétinienne par injection sous rétinienne de vecteur viral chez le ouistiti
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Pour tester un vecteur lentiviral de thérapie génique de la rétine, neuf ouistitis vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin parce que leurs yeux doivent être prélevés. Un chirurgien ophtalmologue leur injecte le vecteur sous la rétine au cours d'une intervention de une à quatre heures, suivie de quatre à seize séances d'anesthésie de une à quatre heures espacées d'une à deux semaines. Le porteur envisage un traumatisme localisé de l'œil, une hémorragie, et des effets plus graves comme un décollement de rétine ou une endophtalmie, avec douleur, photophobie et baisse de l'acuité visuelle. Il justifie le recours au primate par l'absence de fovéa chez les rongeurs, et prévoit de s'entraîner à l'injection sur des animaux tués dans le cadre d'autres projets.
Objectifs
Les dystrophies rétiniennes génétiques sont des maladies des yeux qui font perdre la vue précocement et ont un impact socio-économique important. La thérapie génique est la solution la plus prometteuse pour soigner ces maladies. Elle consiste à remplacer un gène défectueux par un nouveau gène. Pour cela, on utilise un « vecteur » qui transporte le nouveau gène jusqu'aux cellules de la rétine. L'objectif de cette étude est de tester un nouveau type de vecteur pour améliorer l’efficacité de la thérapie génique de la rétine. Actuellement, il n'y a qu'une thérapie génique pour une maladie des yeux concernant un gène unique (nommé « RPE65 »). Mais il n’est pas possible d’utiliser cette thérapie pour toutes les maladies des yeux d'origine génétique, car les méthodes actuelles ne peuvent pas manipuler des gènes de trop grande taille. La technologie utilisée ici permet de transférer des gènes de toute taille, et serait donc applicable à toutes les maladies rétiniennes. Le gène qui sera utilisé dans cette expérience est de grande taille et ses mutations sont responsables de la plus fréquente maladie génétique de la rétine : la maladie de Stargardt. Des essais cliniques sont en cours concernant cette maladie, cependant les vecteurs utilisés sont inefficaces. Notre projet vise donc à utiliser une nouvelle technologie pour augmenter significativement l’efficacité de la thérapie. Des tests sur la souris avec ce vecteur ont montré une augmentation d’efficacité de ~5 % à ~90 % dans les photorécepteurs, comparé aux thérapies géniques préexistantes. Nous voulons maintenant vérifier si le système fonctionne de la même manière chez les primates non-humain. Nous allons d'abord regarder le taux d’intégration du gène dans les cellules de la rétine, puis nous vérifierons si le fonctionnement de la rétine est modifié après l’intervention.
Bénéfices attendus
Si les résultats obtenus sur les primates non humains sont aussi concluants que ceux observés sur les souris, cela pourrait représenter une avancée majeure pour l’utilisation de ce vecteur chez l’homme, notamment pour les mutations du gène testé dans cette étude, mais aussi pour d’autres gènes responsables des maladies rétiniennes génétiques. Les vecteurs classiquement utilisés, appelés adenoassociated virus (AAV) sont couramment utilisés pour cibler la rétine en raison de leur affinité naturelle pour l'œil. Toutefois, un inconvénient majeur des AAV réside dans leur capacité de charge limitée (taille du matériel génétique), ce qui restreint leur application aux gènes de petite taille. Cette contrainte empêche le développement de traitements pour les nombreuses maladies rétiniennes génétiques causées par des gènes volumineux. Les vecteurs lentiviraux (lentivirus, LV), en raison de leur capacité de charge nettement plus grande, représentent une solution prometteuse. Un autre avantage des lentivirus réside dans la faible réaction inflammatoire qu’ils induisent. Ainsi, ils constituent une option prometteuse pour les thérapies géniques rétiniennes, surmontant les limitations des AAV et offrant de nouvelles perspectives pour traiter de nombreuses maladies rétiniennes génétiques.
Procédures
1 intervention pour des injections sous-rétiniennes de 1 à 4 heures, 4 à 16 sessions d'anesthésie de 1 à 4 heures: il s'agira donc d'anesthésies répétées à 1-2 semaines d'intervalles.
Impact sur les animaux
Le gène lié à cette étude code pour une protéine qui intervient dans le transport de dérivés de la vitamine A au travers la rétine. Une surexpression temporaire de cette protéine chez un animal sain ne causera donc aucun phénotype dommageable mais cette protéine non native pourrait créer une réponse immunitaire inflammatoire. L'injection sous-rétinienne sera effectuée par un chirurgien ophtalmologue. Elle devrait provoquer un léger traumatisme localisé de l'œil, potentiellement une hémorragie localisée. Des effets indésirables plus graves, tels qu’un décollement rétinien ou une endophtalmie, peuvent être attendus, entraînant douleur, photophobie, rougeur, augmentation de la pression intraoculaire et une baisse de l'acuité visuelle. Réponse inflammatoire au vecteur viral : ils sont connus pour déclencher une réponse immune innée et adaptative. Une inflammation locale peut être attendue, généralement transitoire entre ~24-72 heures après la dose. Les signes cliniques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, une fermeture persistante des yeux, une difficulté avec les mouvements oculaires et une augmentation de la pression intraoculaire. Réponse inflammatoire au transgène : L'expression du gène d'intérêt est attendue environ 2 à 3 semaines après l'administration. Cette expression pourrait entraîner une réponse immunitaire anti-transgène. Notre vecteur codera pour le gène natif du tamarin. La production de la protéine transgénique pourrait entraîner une inflammation locale. Les signes cliniques typiques sont l'infiltration cellulaire dans la chambre antérieure ou postérieure, la rougeur ou le gonflement autour de l'œil, des larmoiements excessifs, la fermeture des yeux, des difficultés avec les mouvements oculaires (de façon similaire à la réponse immunitaire au vecteur viral). Enfin il nous faut mentionner le stress lié à la préhension et aux anesthésies répétées que subiront les animaux.
Devenir
Pour la seule procédure, tous les animaux seront euthanasiés à la fin car les yeux doivent être extraits pour l'analyse physiopathologique.
Remplacement
Les aspects de la technologie qui ne nécessitent pas de modèles de primates non-humains (PNH) in vivo ont été développés à l'aide de méthodes in vitro (organoïdes rétiniens humains) et testés par administration chez la souris. Cependant, il n'existe actuellement aucun modèle in vitro capable de simuler l'impact de l'efficacité de la transduction sur l'architecture de l'œil, les mécanismes d'élimination de cette voie d'administration, et la réponse immune innée et adaptative au vecteur. En particulier, la technologie vise à traiter des maladies rétiniennes affectant la fovéa et la macula, des structures oculaires qui ne peuvent pas être modélisées avec précision chez d'autres espèces (sans fovéa, ex : les rongeurs). C'est pourquoi les vecteurs doivent encore être évalués pour leur efficacité et leur sécurité dans des modèles animaux de grande taille avant d'être testés chez des patients humains.
Réduction
Des données préliminaires obtenues sur des organoïdes rétiniens et dans des modèles murins permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir la preuve du concept chez le ouistiti. Les doses utilisées par animal seront étalées de façon à permettre une analyse intermédiaire du tropisme du vecteur. Si la transduction du vecteur s'avère moins variable que prévu, cela pourrait permettre de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour atteindre les objectifs de cette étude. Toutefois, ces injections n'ayant jamais été testées chez les primates non humains, un risque de perte animale et/ou de problèmes liés à l'injection est à prévoir. Pour quantifier les conséquences de l’administration du composé sur le bien-être animal, nous commencerons par injecter un œil à la plus faible dose du protocole à un premier animal. Trois doses seront ensuite testées sur les deux yeux de groupes de deux animaux (n = 6). Nous estimons les risques de sortir du protocole à 20 %, ce qui correspond à 7 animaux, soit 8,4 animaux au total, arrondi à la hausse pour tenir compte de la marge d'erreur. Pour limiter encore ce nombre, nous nous entraînerons à l’injection sur des animaux mis à mort dans le cadre d'autres projets. L’approche statistique consistera à comparer, sur des tranches histologiques, le nombre de photorécepteurs présentant le transgène, en comparant « œil sain vs œil injecté » sur le premier animal, puis à comparer ce nombre en fonction des deux constructions virales chez les animaux injectés bilatéralement, et ceci en fonction des trois doses utilisées sur des groupes de deux animaux. Dans ce contexte, une simple analyse de variance permettra d’évaluer la significativité de l’augmentation de la transduction. À noter que si les premières doses s’avèrent efficaces pour prouver l’amélioration de la transduction (> 80 %), les animaux des doses supérieures ne seront pas utilisés.
Raffinement
Les doses du vecteur ont été adaptées à partir de doses bien tolérées chez d'autres modèles mammifères (souris et rats) et ne dépasseront pas celles bien tolérées lors des essais cliniques chez l’homme. Des méthodes de dosage cliniques modifiées seront utilisées pour l'administration du vecteur. Pour l’administration, la vitrectomie sera évitée afin de minimiser le risque de traumatisme rétinien. Des médicaments pour réduire la réponse immunitaire et soulager la douleur seront donnés avant, pendant et après la chirurgie afin de minimiser les risques d'inflammation et de douleur. L'administration sous-rétinienne, réalisée par un chirurgien ophtalmologue, minimise considérablement la bio-distribution du vecteur et limite la probabilité de déclencher une forte réponse immunitaire. Cette réponse ne devrait pas causer de douleur ou de détresse et se résorbera en quelques jour. La protéine générée par le transgène administré ne sera pas secrétée par les cellules rétiniennes et restera liée à la membrane interne des cellules. Ces caractéristiques devraient minimiser le risque de réponse anti-transgène. Le dosage des animaux individuels sera étalé pour surveiller les événements indésirables liés au vecteur ou au transgène, permettant ainsi des modifications des protocoles, des procédures ou des doses si besoin et si ces changements ne modifient pas les objectifs scientifiques de l'étude. En particulier, avant de l’appliquer à tous les animaux, un premier animal sera injecté sur un seul œil pour vérifier par une observation (photophobie, œil fermé, position prostré) et/ou auscultation (œil rouge et inflammé) quotidienne que le protocole ne génère pas d’impact sur le bien-être de l’animal. En cas contraire, qui reste peu probable compte tenu des mesures déjà prises, nous ajusterons la dose pour les prochains et continueront ainsi animal par animal jusqu’à trouver la bonne dose. Cette approche minimisera la douleur ou les dommages potentiels. Tous les tests ophtalmologiques et de santé seront réalisés sous anesthésie afin d'éviter le stress que cela provoquerait si l'on les réalisait à l'état éveillé. Les procédures de surveillance réalisées sous anesthésie seront exécutées de manière séquentielle pour minimiser le nombre total d'inductions requises. Les animaux seront logés par paires dans des volières adaptées enrichies de divers éléments (hamacs, tunnels, nids suspendus, perchoirs, etc.).
Choix des espèces
L'objectif principal de l'étude est d'examiner l'efficacité de transduction d'un nouveau système vectoriel destiné à des applications cliniques en thérapie génique. L'efficacité prédite de la transduction déterminera la probabilité que
Développement d’un nouveau modèle souris de cancer de la prostate pour tester le potentiel d’une immunothérapie innovante
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système urogénital
92 souris immunodéficientes vont être utilisées et toutes tuées, 87 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, cinq opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller. 77 subissent une greffe de cellules tumorales prostatiques dans l'appareil génital, 58 une injection de moelle osseuse dans le sinus derrière l'œil suivie un mois plus tard d'un prélèvement de sang sous la mâchoire, 24 une exposition à un cocktail antigène-adjuvant par la même voie oculaire. Le porteur décrit des douleurs possibles au site d'implantation en fin de protocole, des métastases osseuses, pulmonaires et intestinales d'intensité variable, et une infection opportuniste qui tuerait l'animal en quelques jours. L'objectif immédiat reste de mettre au point un modèle, l'espoir d'expliquer la résistance des tumeurs de prostate à l'immunothérapie venant après.
Objectifs
L'immunothérapie présente des résultats très mitigés dans le cadre du cancer de la prostate. Mieux comprendre pourquoi les tumeurs de prostates sont aussi résistantes à cet axe thérapeutique représente un enjeu important. Ainsi, le premier objectif de ce projet vise à développer un modèle permettant de mieux comprendre les interactions entre la tumeur et l'infiltrat immunitaire. Dans ce modèle, les cellules prostatiques et immunitaires seront isolées à partir d'un même individu et manipuler en culture de cellule. Ceci permettra l’amplification des cellules et réaliser l'édition du génome sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les cellules, une fois obtenues, seront greffées de manière séquentielle sur une souris réceptrice immunodéficiente. Le second objectif, une fois le modèle en place, correspond à l'analyse de la réponse anti-tumorale par le conditionnement immunitaire via l’exposition de ce dernier à des « néo-antigènes » tumoraux (protéines ayant subi des modifications par suite de multiples mutations présentes dans la tumeur permettant de les distinguer des protéines « naturelles » de l’hôte). Ce projet a pour ambition de mieux comprendre la réponse immunitaire à l'exposition à ces « néo-antigènes » tumoraux et identifier des mécanismes permettant de contourner les mécanismes mise en place par les tumeurs pour échapper à l'immunosurveillance.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point d'un nouveau modèle d'étude du micro-environnement immunitaire des tumeurs prostatiques. Ce modèle permettra à terme de s'affranchir de l'utilisation de modèles transgéniques qui nécessite de nombreux croisements pour obtenir les génotypes d'intérêt et par conséquent des colonies d'animaux importante. Grâce à ce modèle, pratiquement toutes les souris implantées serviront de modèles d'étude. Quelques souris seront utilisées pour permettre l'amplification des cellules de moelle. Au final, ce projet devrait permettre d'établir un modèle pertinent pour comprendre pourquoi les tumeurs de prostate répondent mal à l'immunothérapie et trouver des stratégies alternatives pour contourner cette résistance.
Procédures
77 animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à réaliser la greffe orthotopique des cellules d'intérêt qui dure environ 15 minutes (procédure de mise en anesthésie + geste opératoire + réveil). 58 animaux seront soumis à une implantation de moelle qui sera réalisée, sous anesthésie gazeuse, par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire d'une durée de 3 minutes. Un mois post implantation, ces mêmes animaux subiront un prélèvement sanguin par voie sous mandibulaire d'une durée de 1 minute pour l'analyse des cellules circulantes et assurer la prise de la greffe. 24 animaux seront exposés à un cocktail antigène/adjuvant, sous anesthésie gazeuse, par voie intraveineuse dans le sinus retro-orbitaire d'une durée de 3 minutes.
Impact sur les animaux
L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut entrainer, de manière occasionnelle, certaines douleurs: 1) au niveau du tractus génital (site d'implantation), douleurs qui peuvent être chroniques ou passagères mais de basse intensité et uniquement lorsque le volume de la tumeur atteint une taille critique en fin de protocole 2) formation de métastases au niveau d'organes distants (os, poumons, intestin) ces douleurs ont une intensité variable et très dépendant de l'état de dissémination, également apparition sur la fin du protocole. 3) altération du statut sanitaire de l'animal par une infection opportuniste, c'est un évènement extrêmement rare compte tenu des conditions d'hébergement. Conduit à la mort de l'animal en quelques jours. 4) possible inflammation de la zone de chirurgie ou grattage au cours de la cicatrisation.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'échantillons pour les analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Une étude sur les propriétés des cellules tumorales prostatiques sera réalisé, en amont, pour déterminer les paramètres "agressif" et "invasif" de chaque modèles cellulaires. Ces analyses seront complétées par des co-cultures de cellules immunitaires et cellules tumorales en système en 3 dimensions permettant d'appréhender les modalités d'interaction entre chaque type cellulaire. L'ensemble de ces travaux ont pour but de limiter le recours au modèle animal pour répondre à des questions biologiques ciblées (croissance tumorale, vitesse de prolifération, activité immuno-suppresive etc.). Néanmoins, ces modèles cellulaires possèdent certaines limites qui ne permettent pas de reproduire dans son intégralité la complexité du développement d'une tumeur dans un organisme mammifère, ce qui justifie donc de compléter cette étude par les expérimentations conduites in vivo proposées dans ce projet.
Réduction
Cette même étude pourrait-être conduite sur des modèles de souris transgéniques, en lieu et place de greffes sur un modèle receveur. Dans cette hypothèse le nombre d'animaux générés nécessiterait des colonies de souris conséquentes pour l'obtention des invidus d'intérêt (environ 5 à 10% seulement des souris produites seraient utilisées pour l'étude). Grâce à ce modèle, un animal généré correspondra à un animal utilisé pour les analyses. Par ailleurs, les effectifs proposés de 12 animaux par lot pour les études quantitatives sont nécessaire pour assurer une analyse statistique optimale. Le nombre d'animaux a été calibré pour tester de manière séquentielle 2 clones cellulaires, 2 cinétiques d'implantation des moëlles osseuses et 2 adjuvants pour les test d'exposition aux antigènes tumoraux. Ce déroulé du projet par étape permet sélectionner chacun de ces critères l'un après l'autre et donc limite le nombre d'animaux qui pourrait être utiliser pour chaque combinaison possible.
Raffinement
Le développement tumoral et/ou la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques mis en place le cas échéant quand cela sera possible. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal, à savoir, un tube cartonné, un pad fibre pour le nesting, des buchettes de peuplier pour les activités d'exploration. Les animaux seront, autant que possible, placé plusieurs par cage pour favoriser les interactions sociales. Les animaux seront manipulés en condition low-stress par des prises en main en coupelle et une manipulation fréquentielle sera mise en place en amont des procédures pour un renforcement positif des animaux permettant de limiter le stress au moment des manipulations de chirurgie et de prévèlements. Les animaux utilisés étant porteur d'une immunodéficience, afin d’éviter toute contamination, les animaux seront hébergés en portoirs ventilés dans un secteur spécifique pour les animaux fragiles, en animalerie exemptes d’organismes opportunistes et pathogènes spécifiques. Des contrôles sanitaires réguliers seront réalisés. Sur ce plateau technique, l'eau est autoclavée, la nourriture est irradiée, l’air est filtré, les salles sont en surpression, nous réalisons un change de tenue et protections individuelles. Les animaux sont surveillés tous les jours pour vérifier l’absence de points limites.
Choix des espèces
Le modèle murin immunodeficient correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la dissémination métastatique chez les mammifères. En effet, le modèle souris vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire notamment permettant d’apprécier le tropisme tissulaire des cellules tumorales. Le recours a des modèles comme le rat ou le cochon entrainerait un surcout économique et ne serait pas justifié d'un point de vue scientifique. La complexité biologique de modèles alternatifs tel que des organoïdes n'est pas possible car ne permet pas la recomposition du répertoire immunitaire comme observé in vivo et la complexité de la réponse immune attendu dans un organisme entier. Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
Mise au point de modèles de migraine par injection de neuropeptides chez des animaux mâles et femelles
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisi parce qu'il est "couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années", le rat est l'espèce retenue pour ces deux modèles de migraine. 600 rats, mâles et femelles, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour prélever leur cerveau. Ils reçoivent une injection de neuropeptide directement dans un ganglion nerveux sous anesthésie, puis leur sensibilité cutanée est mesurée pendant quatre heures, par application de filaments fins et jet d'air toutes les trente minutes. Le porteur annonce des points limites fixés par une grille de scores sans dire lesquels, tout en identifiant la douleur comme la principale nuisance du protocole.
Objectifs
Dans notre étude, nous utilisons deux modèles de migraine chez le rat en injectant deux neuropeptides qui jouent un rôle dans les migraines mais agissent différemment. L'un est déjà une cible pour des traitements car il provoque l'élargissement des vaisseaux et augmente la sensibilité aux douleurs dans la tête. Le second, lui, agit autrement et pourrait aider les patients qui ne répondent pas aux traitements ciblant le premier. En comparant ces deux substances, nous cherchons à mieux comprendre leurs effets dans les migraines, et à voir comment elles influencent différemment les mâles et les femelles. Cela pourrait mener à des traitements plus adaptés aux besoins individuels.
Bénéfices attendus
À court terme, ce projet va nous permettre de développer un modèle animal de migraine plus proche de la réalité clinique. Cela nous aidera à mieux comprendre les mécanismes de la migraine, à identifier des différences entre mâles et femelles, et à découvrir de nouvelles options de traitement. La migraine touche plus souvent les femmes, mais la plupart des études ont été faites sur des mâles, alors qu’on sait que le sexe et les hormones influencent la façon dont la migraine se manifeste. À moyen terme, comprendre ces différences et le rôle de différentes zones du cerveau dans ce modèle nous permettra d’approfondir nos connaissances sur la migraine. Par ailleurs, bien que les triptans soient les médicaments spécifiques de la migraine, ils ne fonctionnent que pour environ 60 % des personnes, ce qui laisse penser qu'il existe d'autres mécanismes en jeu.
Procédures
Mesure de la sensibilité cutanée : le jour de l'injection pendant 4h ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal et par l’envoi d’un jet d’air toutes les 30 min pendant 4 h après l'injection des molécules en intra-ganglionnaire (chaque application dure 3 secondes).
Impact sur les animaux
Les injections de neuropeptides induisent une douleur modérée. Une gêne est observée après injection, sans entraver les mouvements. Les injections intra-ganglionnaires provoquent un stress et une inflammation locale modérés. L’anesthésie constitue une nuisance légère, avec un risque de perturbations respiratoires ou cardiovasculaires. Les stimulations mécaniques (filaments de Von Frey, AirPuff) entraînent une douleur modérée. Les manipulations répétées induisent un stress modéré.
Devenir
Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des études transcriptomiques, protéiques et immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe est fixé à un maximum de 10 pour assurer une étude fiable, en tenant compte des étapes clés comme l’habituation, les injections, les observations comportementales, les prélèvements et la préparation des échantillons. Les études comportementales étant un facteur limitant, nous prévoyons suffisamment d'animaux pour garantir des résultats solides pour ce modèle de migraine. Enfin, pour prendre en compte les différences entre mâles et femelles dues aux hormones, l’étude inclura les deux sexes.
Raffinement
Avant les études comportementales, les animaux sont placés dans des cages enrichies (tunnels et contacts sociaux) pendant une semaine, puis habitués au nouvel environnement pendant 4 jours pour réduire leur stress. Avant les injections, les rats sont anesthésiés, vérifié par l'absence de réflexe de retrait. La douleur est la principale nuisance identifiée, et pour les stimulations mécaniques, nous suivons les recommandations internationales pour limiter leur durée et intensité. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores.
Choix des espèces
Le rat est couramment utilisé au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les animaux seront âgés de 6-8 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature. Etant donné que les réponses neurobiologiques aux migraines peuvent différer entre les sexes, mâles et femelles seront inclus dans cette étude.
Etudes Comportementales de souris modèles d’autisme en milieu naturalistique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Les souris de ce projet voient leur accès à l'eau restreint pour les contraindre à apprendre des règles, une puce ayant d'abord été implantée sous leur peau sous anesthésie. 879 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le porteur revendique un "intérêt majeur au niveau éthique" pour son dispositif, qui éviterait le stress de l'isolement et de la restriction alimentaire, tout en décrivant des souris retirées de l'expérience quand elles ne boivent plus pendant vingt-quatre heures et un modèle qui se blesse la peau à force de se toiletter. Toutes sont tuées à la fin, pour prélèvement et analyse post-mortem.
Objectifs
Ce projet a pour but d’évaluer le comportement et les capacités cognitives des souris modèles d'autisme avec une approche plus éthologique, en plaçant des groupes sociaux dans une grande cage d’élevage dans laquelle les animaux peuvent apprendre différentes tâches pendant plusieurs semaines, à différents moments du cycle circadien, et sans intervention d’un expérimentateur car les tâches sont programmées et la quantification des performances est automatisée.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à redéfinir le rôle du cervelet et à élargir les perspectives de la recherche sur l'autisme pour mieux répondre aux besoins de la société. Longtemps considéré comme une structure dédiée au contrôle des mouvements, le cervelet apparaît aujourd’hui comme un centre clé de l’intégration des informations sensorielles et des fonctions cognitives complexes, remettant en question les idées reçues en neurosciences. En étudiant l'impact de certaines modifications génétiques liées à l'autisme sur des circuits spécifiques du cervelet, ce projet explore des mécanismes encore méconnus qui pourraient expliquer les troubles sensoriels et cognitifs associés à l'autisme. Il apporte ainsi un éclairage novateur sur les bases neurobiologiques de ce trouble. L’évaluation automatique des comportements et des capacités cognitives dans notre dispositif permettra d a aussi un intérêt majeur au niveau éthique, car il permet de tester les souris dans leur lieu d’hébergement familier, enrichi par le contexte social et par une activité naturelle de recherche de boisson dans des zones différentes de la cage, en évitant tout stress lié à l’isolement, à la restriction en aliment, à l’anxiété induite par un environnement nouveau, ou à la manipulation par l’expérimentateur. Ce dispositif permet aussi l’obtention rapide de résultats sur des cohortes conséquentes de souris dans des conditions expérimentales stables, à la fois pendant les périodes diurnes et nocturnes.
Procédures
Une implantation sous-cutanée de transpondeurs (puce éléctronique) sera réalisée pour chaque souris au moyen d'une anesthésie gazeuse (durée inférieure à 2 minute par souris). Des groupes de 8 à 16 souris agées de 2 mois à 5 mois maximum seront hebergées pendant 2 à 4 semaines dans une grande cage automatisée permettant de mesurer differents comportements spontanés et différents apprentissages Les animaux seront testés pour leur capacité d’apprentissage et de mémoire (mémoire de travail, mémoire spatiale et mémoire associative) et auront pour cela accès à des récompenses (eau sucrée) ou des contraintes limitant de manière temporaire leur accès à l’eau de boisson.
Impact sur les animaux
Une légere gène pourrait être ressentie suite à l'implantation sous-cutanée de la puce nécessaire au suivi des animaux dans le dispositif. Certaines souris pourraient avoir des difficultés d’accès à la boisson du fait de la pression sociale susceptible de s’instaurer dans un grand groupe, ou dans certains protocoles impliquant une compétition sociale ou quand la règle à apprendre pour accéder à la boisson s’avère trop compliquée pour certaines souris modèles présentant un sévère déficit cognitif. L’un de nos modèles de souris peut parfois développer des plaies cutanées dues à un comportement exacerbé d’auto-toilettage. Par ailleurs, un autre modèle présente une sensibilité́ accrue aux bruits
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem : cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
Aucun modèle mathématique ou in vitro n'existe actuellement pour décrire le lien entre des mutations génétiques de gènes liés à l'autisme et les troubles comportementeaux qui en découlent. Ainsi, l'utilisation d'animaux éveillés s'avère indispensable pour comprendre ces liens au travers différentes observations comportementale. Pour ce faire, l'emploi d'un modèle animal mammifère est essentiel afin d'obtenir des résultats pouvant être extrapolés à la compréhension du processus d’apprentissage humain. La souris représente un choix privilégié en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain.
Réduction
En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux réalisés en en milieu semi-naturalisé et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre nécessaire de souris par groupe à 16 souris. Des tests statistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 879 souris seront nécessaires.
Raffinement
Une semaine avant le début de l’étude, une courte anesthésie (moins de 2 minutes) permet d’injecter sous la peau une petite puce. Une analégsie sera réalisée avant l'injection de la puce. Cette puce sert à suivre l’activité de chaque souris. L’intervention est réalisée par du personnel qualifié et formé à cette procédure. Ensuite, les souris évoluent dans un dispositif expérimental qui leur sert aussi d’habitat. Cet environnement est conçu pour limiter leur stress : elles y vivent en groupe, sans être isolées ni manipulées, et y recherchent leur boisson de manière naturelle, dans différentes zones de la cage. La lumière et la température sont contrôlées pour rester identiques aux conditions habituelles de l’animalerie. Le dispositif comprend quatre abris où les souris peuvent se reposer ou se regrouper. Elles y sont progressivement familiarisées en y vivant en continu pendant plusieurs semaines. Un logiciel surveille leur accès à l’eau et alerte en cas de problème. La quantité de boisson consommée par chaque souris est contrôlée chaque jour pour s’assurer qu’elle boit suffisamment (au minimum 2 à 3 ml par jour pour les protocoles les plus stricts). Si une souris ne boit pas pendant 24 heures, elle est immédiatement retirée de l’expérience pour être hydratée. Si cela arrive pendant la phase de familiarisation, elle peut être réintroduite après une heure si elle ne montre aucun signe de souffrance et a bien bu. En revanche, si elle ne boit toujours pas dans les 12 heures suivantes, elle est retirée définitivement et euthanasiée. Le bien-être des souris est suivi attentivement après l’anesthésie et en cas de retrait du dispositif, grâce à des grilles d’observation spécifiques.
Choix des espèces
La souris représente un choix privilégié pour étudier les alterations comportementales liés à l'autisme en raison de la similitude entre le fonctionnement de son cerveau et les tests comportementaux employés, par rapport à ceux observés chez l'Humain. Il s’agira de souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêtons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois)
Suivi de la franchissabilité d’un siphon par plusieurs espèces de poissons dans une annexe alluviale d’un grand fleuve
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
6 300 poissons sauvages de dix espèces vont être capturés, anesthésiés et incisés sur le ventre pour recevoir une puce électronique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque individu reste entre trente secondes et une minute hors de l'eau, le temps des mesures et de l'implantation du transpondeur. Tous sont ensuite remis à l'eau vivants, l'étude cherchant à savoir quelles espèces et quelles tailles franchissent un siphon de 190 mètres qui coupe une zone humide en deux. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de réaliser ce suivi pour "justifier de la nécessité" d'actions de restauration à proximité de l'ouvrage.
Objectifs
L’objectif principal est d’évaluer la franchissabilité par les poissons d’un siphon (tuyau de 190 m de long) présent dans une annexe alluviale d’un grand fleuve, et qui scinde cette vaste zone humide en deux. Cette annexe fait l’objet d’un projet global de restauration hydrologique au regard de son fort enjeu pour la biodiversité aquatique. Des observations locales tendent à montrer que ce siphon est ponctuellement franchissable par certains poissons mais de nombreuses questions concernent la diversité des espèces et des classes de taille capables de franchir cet aménagement, et les conditions de débit requises. Pour répondre à ces interrogations, et justifier les futurs programme de restauration écologique, une étude par marquage est envisagée. La méthodologie proposée implique l’implantation de puces électroniques, ci-après nommées « PIT tags », dans 10 espèces de poissons sauvage, regroupées en 4 groupes selon leur écologie. Des dispositifs de détection des puces seront installés à l’entrée et à la sortie du siphon. L’étude impliquera la réalisation de 3 campagnes de marquages pour un suivi qui s’étalera au maximum sur 5 ans, pour prendre en compte la variabilité des conditions environnementales. Si le quota d’animaux marqué dans chaque groupe d’espèces n’est pas atteint, le projet prévoit le report des marquages l’année suivante.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mettre en lumière l’effet bloquant du siphon au passage de certaines espèces / classes de tailles de poissons. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour justifier de la nécessité de mettre en œuvre des actions de restauration à proximité de ce siphon.
Procédures
Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et un transpondeur PIT tag sera implanté manuellement sur 6300 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.
Impact sur les animaux
La capture, la transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress sur les animaux.
Devenir
Tous les individus capturés puis marqués seront remis à l’eau vivants pour l'étude de leur comportement in situ.
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici siphon) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.
Réduction
Le projet est prévu sur une durée de 5 ans, avec captures et marquages les trois premières années (maximum 5 ans si reports des marquages en cas de conditions environnementales défavorables). L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire des tendances comportementales, et évaluer la franchissabilité et la sélectivité de l’ouvrage aménagé. Il est adapté au gabarit du milieu (annexe hydraulique d’un grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des PIT tags ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur PIT tag dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser le PIT tag lors de la fraie. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée régulièrement, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière.
Choix des espèces
10 espèces cibles de poissons, présentes dans le milieu naturel et caractéristiques du milieu étudié, seront réparties en 4 groupes ayant une écologie similaire: - Anguille : espèce considérée à part état donné son écologie et son statut de protection - Cyprinidés d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, goujon - Cyprinidés d’eau calme : brèmes, gardon, carpes - Carnassiers : Brochet, silure. 2 stades de développement sont retenus : juvéniles et subadultes-adultes. Au total, les juvéniles représentent environ 18% de l’effectif marqué (1110 individus sur 6300), le reste étant des subadultes et adultes, qui sont les stades préférentiellement ciblés. Les plus petits individus seront relâchés sans être marqués.
Modélisation des maladies inflammatoires de l’intestin chez les rongeurs et évaluation prophylactique et thérapeutique de molécules thérapeutiques
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Quatre cents souris de ce projet passeront ensuite dans un projet de formation interne aux gestes techniques, à condition que la maladie ne leur ait pas été induite. Au total 2 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, la moitié classée sévère, les autres mises à mort en fin d'étude ou à l'atteinte des points limites. Elles subissent des injections intra-rectales de composés dilués dans l'éthanol, des endoscopies pouvant léser ou perforer l'intestin, des prélèvements sanguins et des jeûnes allant jusqu'à douze heures par semaine. Le porteur indique qu'aucun calcul statistique n'a servi à fixer l'effectif, établi d'après le nombre d'études des années passées et une croissance anticipée "en accord avec le plan commercial".
Objectifs
La maladie inflammatoire chronique des intestins (MICI) est une pathologie invalidante caractérisées par une inflammation de la paroi du tube digestif entraînant une dégradation significative de la qualité de vie des patients. Les MICI les plus courantes sont la colite ulcéreuse (ou rectocolite hémorragique) et la maladie de Crohn. A l’heure actuelle, les mécanismes d’apparition de cette pathologie sont peu connus et aucun traitement curatif n’est disponible sur le marché. L’objectif de ce projet est de développer un modèle d’étude fiable des MICI pour permettre d’en accroitre la compréhension et d’évaluer les propriétés immunitaires, thérapeutiques et toxicologiques de candidats médicaments issus de laboratoires académiques, biotechnologiques et pharmaceutiques.
Bénéfices attendus
Les MICI sont des maladies inflammatoires. En basant notre modèle sur des souris ayant un système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les MICI et des potentiels traitements avec davantage de spécificité pour l’espèce cible de ces recherches : l’Homme.
Procédures
Administration vigile ou sous anesthésie générale : durée de l'intervention 4 à 5 minutes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Administration des composés à visées thérapeutiques : durées de 10 à 15 secondes chacune. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Prélèvements sanguins pour le suivi de la pathologie et des effets des traitements : chaque prélèvement aura une durée d’environ 15 à 30 secondes. Le nombre est défini selon le protocole d’étude et dépendra de la fréquence. Ceci sera évalué par le vétérinaire. Des volumes maximaux sont prédéfinis selon le poids des souris. Insertion de sonde caméra (endoscopie) : sous anesthésie pour analyse des intestins, 3 à 4 minutes par analyse. La fréquence est définie par le protocole d’étude et est généralement de 1 par cycle. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages.
Impact sur les animaux
Les MICI se caractérisent par une diarrhée pouvant être sévère et entrainer une perte de poids, une déshydratation, des coliques ou une anémie. Des nuisances peuvent également être induites par l'injection intra-rectale de traitement solubilisé dans l'éthanol (douleur) ainsi que par les prélèvements sanguins (hématome, douleur), l'administration des composés de recherche et les effets potentiellement toxiques de ces composés à visées thérapeutiques dans un contexte préclinique ainsi que par l'endoscopie (lésion de la muqueuse digestive, perforation). Ces nuisances et effets indésirables peuvent se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer, une perforation de l'intestin. L’injections intraveineuse de plasmides peut engendrer des troubles cardio-respiratoires et une altération marquée de l’état général, les minutes suivants l’injection.
Devenir
Tous les animaux en fin d'étude, ayant atteints les point limites ou sur demande du vétérinaire seront euthanasié. Des souris issues de ce projet pourront être réutilisées dans le projet de formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris, sous réserve d’un avis vétérinaire favorable si la pathologie n'a pas été induite sur les souris. Cette réutilisation permet de ne pas commander des souris spécifiquement pour la Formation mais d’utiliser nos souris déjà présentes.
Remplacement
Il n’est à l’heure actuelle pas possible de recréer in vitro un modèle étudiant les interactions complexes qui peuvent exister entre le système immunitaire et un système digestif fonctionnel qui permettrait de reproduire les MICI tout en objectivant les effets thérapeutiques et toxicologiques de composés médicamenteux destinés à leurs traitements. Les modèles murins constituent donc une approche scientifiquement valide, robuste et indispensable au développement et à la mise à disposition de thérapies innovantes pour les patients.
Réduction
Un total de 2000 souris seront utilisées, couvrant une période de 5 ans et permettant de réaliser environ 40 études précliniques de 50 souris. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Aucune approche statistique n'a été réalisée, l’estimation du nombre d’animaux est réalisée sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus maximum. Un jeûne de nourriture pourra être effectué sans dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires (diet gel) pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès que nécessaire (par exemple en cas d’altération de l’état général d’une souris notée lors de l’observation quotidienne). Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins des volume maximaux sont définis, au-delà il s’agira d’un prélèvement terminal sous anesthésie gazeuse. Les fréquences sont limitées et une réhydratation est prévue. Les administrations intra-rectales (hors endoscopie) seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et un volume maximal d'injection est défini. L’endoscopie sera réalisée sous anesthésie générale avec un volume d’injection maximal défini.
Choix des espèces
Les modèles décrits dans ce projet ont été validés chez la souris, de plus, dans le cadre des études conduites par l’entreprise, celle-ci met à disposition des souris humanisées qui peuvent être utilisées dans le cadre de ces projets. Elles permettent d’étudier les interactions entre système immunitaire, pathologie, traitement et aspect toxicologique tout en réduisant la barrière d’espèce homme-animal. Pour obtenir des données scientifiquement valides, il est important d’assurer une comparabilité des résultats entre souches humanisées et non-humanisées, et donc que les études soient réalisées sur souris. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 4 semaines, ces souris pouvant être utilisées dès leur sevrage. Pour les souris humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.