Recherche fondamentale

Les souris sont analysées au moment où elles atteignent leurs points limites, c'est-à-dire quand la leucémie s'est déclarée. 3 140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements de moelle osseuse sous anesthésie, jusqu'à une fois par mois pendant toute leur vie, une irradiation, puis une greffe de moelle ou de cellules leucémiques humaines suivie de chimiothérapie. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, développer "à long terme" de nouvelles thérapies contre le cancer pédiatrique le plus fréquent, quand les prélèvements répétés et la maladie induite, eux, courent sur toute la vie des animaux.

Objectifs

Les leucémies aiguës lymphoblastiques B (LAL-B) touchent principalement les enfants, et constituent le cancer pédiatrique le plus fréquent. Les traitements actuels de ces leucémies sont efficaces pour induire une rémission à long terme. Cependant, les cellules souches leucémiques (CSLs) peuvent échapper au traitement et servir de réservoir pour les rechutes de la maladie, ces dernières étant de très mauvais pronostique clinique. Le projet que nous développons représente un challenge important en recherche translationnelle, et a pour objectif d’élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les fonctions aberrantes des CSLs. A cette fin, nous développons des modèles murins génétiquement modifiées pour exprimer des facteurs de transcription oncogéniques, et qui récapitulent efficacement le développement de la leucémie humaine. Nous développons également des modèles de xénogreffes de LAL-B humaines couplés a des traitements de chimiothérapie pour accéder aux cellules responsables des rechutes de la maladie. Par l’utilisation de ces modèles, nos travaux démontrent que les oncogènes sont capables de reprogrammer des propriétés fonctionnelles et moléculaires de cellules souches à une sous-population de progéniteurs lymphocytaires normaux, les convertissant en CSLs résistantes aux traitements, mimant ainsi les caractéristiques des cellules responsables des rechutes de la maladie chez le patient. Nos modèles permettent donc un accès reproductible et non restrictif aux CSLs qui représentent une population cellulaire de premier choix pour le développement de nouvelles thérapies ciblées. Dans ce contexte, nous proposons dans ce projet d’explorer, de caractériser et de cibler les CSLs.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à approfondir notre connaissance sur les cellules qui initient les leucémies aigues lymphoblastiques de l’enfant et de développer à long terme de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Le prélèvement de moelle osseuse et/ou de sang ainsi que les transplantations de moelle osseuse dans des souris receveuses irradiées au préalable se feront sous anesthésie (animal surveillé jusqu'au réveil). Les prélèvements de moelle osseuse, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de deux minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont des procédures de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les prélèvements médullaires, effectués sous anesthésie générale et locale, durent moins de 2 minutes et sont réalisés au maximum une fois par mois au cours de la vie de la souris et sont donc une procédure de degré de sévérité modérée. Les expériences de transplantation nécessitent une irradiation des souris. Cette procédure de degré de sévérité modérée, réalisée une seule fois au cours de la vie de la souris, dure moins de 2 minutes. Les souris sont surveillées attentivement dans les heures qui suivent l’irradiation, et du gel hydratant est ajouté dans la cage durant la première semaine.

Devenir

A l’âge voulu, les souris seront euthanasiées pour prélèvement d'organes.

Remplacement

En complément à nos approches in vivo, notre travail consiste également à confirmer nos observations par des approches expérimentales in vitro sur les cellules de souris mais également sur les cellules humaines. Nous avons notamment validé au laboratoire par des approches in vitro, que les cellules initiatrices de la leucémie sont quiescentes et résistantes aux traitements de chimiothérapie, ce qui constitut une stratégie complémentaire à nos approches de transplantation in vivo. De plus nous utilisons massivement des outils d’analyse à large échelle des données de la littérature, ce qui nous permet d’avancer dans nos démarches scientifiques sans utiliser d’animal.

Réduction

Les études sur l'animal sont réalisées après une étude bibliographique détaillée et une analyse statistique adaptée aux petits échantillons, optimisant ainsi nos protocoles et réduisant au maximum le nombre d'animaux utilisés. Les travaux de la littérature nous aident à déterminer le nombre minimum de souris nécessaires pour garantir la valeur scientifique de l'expérience et éviter qu'elle ne doive être reproduite. De plus, les études longitudinales nous permettent de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

Les animaux bénéficient d'un enrichissement environnemental comprenant l'utilisation de cylindres de coton pour réduire le stress potentiel et la présence d'igloos rigides rouges dans toutes les cages pour offrir un abri sécurisé. En cas de comportement inhabituel tel que la prostration, un pelage terne et hirsute, ou des signes de blessures infligées par d'autres animaux, l'individu concerné est isolé et reçoit une attention renforcée. Une perte de poids soudaine dépassant 20% du poids initial de l’animal est également surveillée (selon une grille de scoring en annexe). Des soins appropriés sont alors prodigués, incluant la désinfection des plaies ou un accès facilité à la nourriture si nécessaire. Si aucune amélioration n'est constatée malgré ces mesures, des décisions seront prises pour mettre fin à la vie de l'animal de la manière la plus humaine possible afin de prévenir toute souffrance inutile, en accord avec les principes des 3R (Remplacement, Réduction, Raffinement). Les souris immunodéficientes sont hébergées dans un environnement répondant aux normes pour prévenir l'apparition de phénotypes dommageables (manipulation PSM, isolateur). Les prélèvements médullaires (de degré de sévérité modérée) sont réalisés sous anesthésie et analgésie, avec l'animal placé sur une plaque chauffante et surveillé attentivement jusqu'à son réveil. Les personnes effectuant ces prélèvements sont formées à cette technique et possèdent les compétences nécessaires pour manipuler les souris et effectuer les gestes techniques dans le respect du bien-être animal.

Choix des espèces

La communauté scientifique internationale privilégie l'utilisation de modèles murins pour étudier les cellules souches hématopoïétiques dans les pathologies hématologiques, en raison de la conservation des gènes et des voies de signalisation entre l'Homme et la souris. Ainsi, les résultats obtenus chez la souris en hématopoïèse sont souvent extrapolables à l'humain. Nous allons mener des études longitudinales tout au long de la vie des animaux, incluant des périodes à un jeune âge (1 et 3 mois) ainsi qu’au stade leucémique (analyse au moment du développement de la maladie lorsque les souris auront atteint leurs points limites). Ces différents stades miment le processus multi-étapes du développement de la maladie, de l’initiation à la transformation tumorale.

Toutes mises à mort pour des analyses moléculaires et histologiques, 746 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie une greffe de cellules sous la peau, puis passe sous le pied à coulisse tous les deux jours pendant quatre semaines, endormie à chaque fois, soit une quinzaine d'anesthésies par animal. La tumeur peut entraîner une perte de poids et des ulcérations cutanées. Le porteur indique avoir déjà obtenu des résultats sur cultures cellulaires en trois dimensions, et conclut qu'il est "nécessaire" de passer à la souris parce que les cultures ne reproduisent pas les échanges entre la tumeur et le reste du corps.

Objectifs

Notre équipe modélise des altérations géniques identifiées dans des cancers et étudie les conséquences moléculaires et cellulaires de ces altérations et leur contribution à l’oncogenèse. Ainsi, dans le contexte des sarcomes, nous avons identifié des altérations génomiques conférant des propriétés oncogéniques in vitro telles que des capacités de prolifération, de clonogénicité et de formation de sphères en trois dimensions accrues. Nous devons valider maintenant nos modèles cellulaires sur un minimum d’animaux pour tenir compte du contexte physiologique.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’étudier le rôle de remaniements génomiques dans l’initiation et/ou la progression tumorale de certains sarcomes L’utilisation du modèle in vivo est une étape primordiale dans la compréhension et la détermination de l’implication de ces changements génomiques dans le développement sarcomateux avec la participation du micro-environnement. Ce serait une avancée majeure sur l’étude du développement de ces cancers et, l’identification des voies dérégulées permettrait de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques afin de mieux prendre en charge ses patients. Les traitements actuels n’étant que peu efficaces sur ce type de pathologie.

Procédures

Les animaux vont subir une greffe sous-cutanée de cellules sous anesthésie, cette greffe nécessite une procédure implantatoire de moins de 5 min, le nombre d'animaux concernés est de 746. La croissance tumorale sera suivie par mesure externe au pied à coulisse (tous les 2 jours pendant 4 semaines) chez l’ensemble des animaux anesthésiés, intervention qui durera environ 5 minutes/animal.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de stress dû à la contention/préhension des animaux. 2/ un risque mineur d’infection pour les injections sous cutanés. 3/ un risque de stress lors des phases d’induction de l’anesthésie (animal placé dans une boîte à induction lors de l’injection et des mesures) et de réveil. 4/ la croissance tumorale peut également induire une perte de poids, des ulcérations et dans de rares cas des douleurs.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort par du personnel expérimenté afin de réaliser des analyses moléculaires et histologiques ultérieures nécessaires à la conclusion du projet. La mort des animaux sera confirmée par l’absence de réflexes, de signes respiratoires et cardiaques.

Remplacement

Les premiers tests ont montré que les modifications du génome jouent un rôle clé dans les sarcomes. Cependant, les cultures de cellules en laboratoire ne sont pas un modèle parfait, car elles ne reproduisent pas les interactions entre la tumeur et le reste du corps. Cela limite leur utilité pour des applications cliniques. De plus, lorsqu’on cultive les cellules en 3dimensions leur capacité tumorale devient encore plus marquée, ce qui montre l’importance de la structuration tridimensionnelle des cellules. Pour confirmer ces premières observations, il est nécessaire de passer à un modèle plus complet : les souris. Les souris avec un système immunitaire incomplet, permettent d'implanter des cellules humaines et d’étudier la formation de tumeurs de manière plus réaliste. Les souris avec un système immunitaire fonctionnel, quant à elles, sont utilisées pour étudier la réponse immunitaire et la croissance des tumeurs dans un système immunitaire fonctionnel. Ces modèles animaux nous aideront à mieux comprendre le rôle des modifications génétiques impliquées dans le développement des sarcomes.

Réduction

La croissance des tumeurs sera suivie de manière régulière pendant toute l’expérience, en mesurant les tumeurs de façon non invasive avec un pied à coulisse tous les 2 jours. Pour analyser les résultats, nous utiliserons un test statistique qui est couramment utilisé dans ce type d'étude. En utilisant un logiciel de calcul statistique, nous avons aussi déterminé qu'il nous faudrait un certain nombre de souris pour que les résultats soient fiables. Nous utiliserons donc des groupes de 8 souris, et répéterons les expériences jusqu'à trois fois si nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre de souris utilisé dans l'étude sera donc le maximum prévu, et pourra être réduit en fonction des résultats obtenus. L’utilisation de certaines lignées cellulaires permettra aussi de diminuer le nombre de souris nécessaires en utilisant les mêmes groupes témoins.

Raffinement

Le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur naissance à leur mort, les animaux seront hébergés en groupe et l’enrichissement de leur milieu de vie sera systématique. Les animaux recevront une surveillance quotidienne et des soins adaptés (mesure hebdomadaire du poids des souris, définition de points limites suffisamment précoces et mise en place de mesures compensatoires et de critères d’arrêt). La croissance tumorale sera suivie par mesure au pied à coulisse ce qui permettra de suivre la croissance des cellules tumorales et d’améliorer le bien-être animal par une prise en charge rapide. Les animaux recevront des analgésiques et des anesthésiques en pré et/ou postopératoire afin de réduire à son strict minimum le stress et la souffrance de l’animal.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris ayant un système immunitaire incomplet, pour pouvoir greffer des cellules humaines mais aussi des souris avec un système immunitaire intact qui nous aideront à étudier comment ce système interagit avec les tumeurs. Nous choisirons des souris de 8 semaines, car elles permettent une meilleure croissance des tumeurs. De plus, en choisissant de jeunes souris, on évite les problèmes liés à l'affaiblissement des animaux plus âgés.

Une injection de cellules tumorales humaines dans la mamelle, quatre gavages quotidiens, deux séances d'imagerie TEP sous anesthésie et une nuit de jeûne : 30 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objectif est de savoir si un traceur radioactif imitant les œstrogènes permet de repérer, sans biopsie, les mutations qui rendent les traitements hormonaux inefficaces. Ces souris sont immunodéprimées pour que la tumeur humaine prenne, ce que le porteur qualifie d'"indispensable" tout en reconnaissant que cet état, qui les expose aux infections, "est considéré comme dommageable". Toutes sont tuées après les examens pour que les tumeurs soient analysées.

Objectifs

Ce projet, réalisé dans 2 établissements utilisateurs, cherche à savoir si un traceur radioactif utilisé en imagerie médicale peut aider à repérer certaines mutations génétiques dans les cancers du sein. Ce produit imite une hormone féminine, appelée œstrogène, et se fixe normalement sur des récepteurs spécifiques dans les cellules cancéreuses. Or, certaines mutations peuvent empêcher ces récepteurs de fonctionner correctement, rendant les traitements hormonaux inefficaces. L'idée est donc de vérifier si ce traceur peut détecter ces mutations sans avoir besoin de faire un prélèvement et ainsi prédire si un traitement hormonal sera efficace ou non pour chaque patiente.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices majeurs, notamment : 1- Mieux prédire l'efficacité des traitements hormonaux : Certaines patientes atteintes d'un cancer du sein reçoivent un traitement hormonal, mais si leur tumeur présente certaines mutations, ce traitement peut être inefficace. Ce projet pourrait aider à adapter le traitement. 2- Éviter des prélèvements invasifs : actuellement, pour analyser les récepteurs aux hormones féminines et détecter d'éventuelles mutations, il faut prélever un échantillon de la tumeur, ce qui peut être douloureux et risqué.

Procédures

Site 1: Les souris recevront une injection de cellules tumorales humaines pour induire un cancer du sein, ce qui prendra environ 10 minutes par souris, sous anesthésie générale. Elles seront gavées 1x par jours pendant 4 jours avec une molécule permettant l'activation des récépteurs aux oestrogènes dans la tumeur, ce qui prends 1 minutes par souris. Elles seront suivies pendant 11 jours et auront 2 examens d’imagerie médicale à J9 et J11, toujours sous anesthésie générale. Site 2: Le premier examen, d’une durée de 25 minutes, servira à détecter la présence du récepteur aux hormones féminines, grâce à une hormone féminine radioactive. Site 2: Après une nuit de jeun, le second examen d’une durée de 25 minutes, permettra d’observer l'activité métabolique de la tumeur, grâce au glucose radioactif. Cette durée de 25-30 minutes comprend l'injection du produit radioactif (5 minutes), l'anesthésie (2 à 3 minutes), l'examen (11 minutes et 20 secondes) et le réveil de l'animal. Site 2: Avant l'examen de l'activité métabolique de la tumeur, un prélèvement sanguin pour mesurer la glycémie sera effectué sur chaque souris, ce qui prendra au maximum 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sont les suivants : • Douleur liée à l’injection mammaire des cellules tumorales. • Irritation des muqueuses de l'oesophage • Hypoglycémie potentielle due à un jeûne d’environ 12 heures avant l’examen. • Hypothermie potentielle causée par l’anesthésie générale. • Douleur liée au développement tumoral. • Le modèle de souris immunodéprimées est indispensable pour permettre l’implantation de tumeur humaines sans provoquer de rejet. Cette caractéristique est essentielle pour garantir la validité des résultats dans un contexte préclinique visant à reproduire au mieux lce qui est observé chez l’humain. L’état immunodéprimé des souris peut entraîner une vulnérabilité accrue aux infections. Bien que les animaux soient maintenus dans des environnements strictement contrôlés, cette condition est considérée comme dommageable. Cette nuisance est compensée par une surveillance quotidienne rigoureuse et des conditions d’hébergement adaptées, visant à minimiser les impacts sur le bien-être des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés après les examens pour permettre l’analyse des tumeurs. Ces analyses sont essentielles pour valider les données obtenues lors des examens d’imagerie.

Remplacement

Les expériences sur les cellules en laboratoire ne permettent pas de reproduire précisément les interactions complexes entre les cellules tumorales, les vaisseaux sanguins et les tissus environnants. L’utilisation d’un modèle vivant est donc nécessaire pour répondre aux questions posées par le projet.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé en fonction d’analyses statistiques basées sur des résultats préalablement obtenus, et des données bibliographiques, afin de minimiser les effectifs nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. De plus, les techniques d'imagerie choisies permettent de suivre les animaux tout au long de l'étude sans avoir à les euthanasier à chaque étape, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux nécessaires.

Raffinement

À leur arrivée, les souris seront installées dans des cages adaptées, avec de la litière changée régulièrement, un enrichissement (comme des tunnels et du coton), ainsi que de la nourriture et de l’eau à volonté. Elles auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement. Ensuite, une injection sera faite afin que les souris développent une tumeur. Leur état sera suivi de près : on surveillera la taille de la tumeur pour s’assurer qu’elle ne grossisse pas trop, et on vérifiera aussi régulièrement leur poids. À partir du 5ème jour, elles seront gavées avec la molécule qui induit l'expression des récepteurs aux œstrogènes. Ce produit peut induire une déshydratation des souris lorsqu'il est donné dans l'eau de boisson, le gavage permet donc d'éviter cet effet indésirable. Pour les examens d’imagerie, les souris seront anesthésiées afin qu’elles restent immobiles. Elles seront placées sur un lit chauffant pour ne pas avoir froid, et leur respiration et leur cœur seront surveillés en continu. Une fois l’examen terminé, elles resteront sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil. Certains examens demandent aux souris d’être à jeun pendant une nuit. Comme cela peut baisser leur taux de sucre, on vérifiera leur glycémie en prélevant une goutte de sang avant de commencer. Pendant toute la durée de cette étude, nous appliquerons les points limites que nous nous sommes fixés afin d’éviter toute souffrance.

Choix des espèces

Des souris femelles immunodéprimées seront utilisées pour permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans rejet. Le cancer étudié étant le cancer du sein, il est plus représentatif de la réalité clinique d’utiliser des femelles. De plus, des femelles âgées de 9 semaines ont une glande mammaire suffisamment développée pour garantir une injection correctement localisée.

Une partie des souris utilisées est génétiquement modifiée pour que leurs macrophages soient privés des deux molécules étudiées. 1 104 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une plaie chirurgicale sur le dos entre les omoplates, puis est rendormie deux fois par semaine pendant trois semaines pour l'observation de la cicatrisation et le changement de pansement. Elles sont mises à mort à la fin du suivi, leurs tissus servant aux analyses post mortem qui closent le projet.

Objectifs

Une meilleure compréhension des mécanismes permettant la réparation de la peau est un enjeu de santé publique. L'avancée de nos connaissances dans ce domaine pourrait permettre l’amélioration du traitement d’épisodes cliniques aiguës (brûlure, choc mécanique, …) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance de ces processus, les mécanismes moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire sont encore mal connus. Des données de la littérature montrent que certaines cellules de l’immunité synthétisent des molécules bénéfiques pour la cicatrisation, en particulier des cellules appelées macrophages . En utilisant un modèle in vitro, nous avons identifié deux molécules, des facteurs de transcription, qui régulent la production par les macrophages d’une partie des molécules bénéfiques pour la cicatrisation. Les facteurs de transcription sont des molécules qui contrôlent généralement l'expression d'un grand nombre de gènes. Nous faisons donc l'hypothèse qu'à travers une étude plus poussée de ces deux facteurs de transcription dans les macrophages lors de la réparation cutanée, nous pourrons identifier de nouvelles molécules impliquées et ainsi faire progresser significativement notre compréhension globale des mécanismes de la réparation tissulaire. Le projet comporte deux objectifs : 1- déterminer si les résultats obtenus in vitro sont valides dans une situation de réparation tissulaire physiologique à l’échelle d’un organisme entier, 2- identifier de nouveaux acteurs moléculaires de la cicatrisation qui interagissent dans les macrophages avec les facteurs de transcription déjà identifiés. Pour atteindre ces objectifs, il est nécessaire d’utiliser un modèle murin de cicatrisation cutanée. Ce modèle reproduit les étapes de cicatrisation tissulaire observée chez l’homme, et nous permet d'étudier le rôle de nos molécules d'intérêt dans un environnement complexe plus représentatif d’une situation physiologique. Nous comparerons des souris normales et des souris qui ne possèdent pas ces molécules dans les macrophages. Ce projet permettra d’identifier de nouveaux acteurs moléculaires impliqués dans le processus de réparation tissulaire.

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet, nous pourrons faire avancer de manière conséquente notre connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent la réparation des tissus après une lésion. En particulier, ces résultats permettront d’identifier de nouvelles molécules contrôlant la fonction des macrophages au cours de la réparation tissulaire. Ces nouvelles molécules pourront être étudiées plus en détails dans de futurs projets, contribuant à l’avancée des connaissances scientifiques. De plus, il est établi que les macrophages jouent un rôle central dans les pathologies inflammatoires quand leur fonction de réparation est altérée, par exemple dans les ulcères, les plaies chroniques des patients diabétiques, et les fibroses (accumulation de tissu fibreux pathologique). De plus, cette fonction de réparation est également diminuée chez les sujets âgés, sans que l’on en comprenne les mécanismes. Mieux connaître les acteurs moléculaires impliqués dans la réparation tissulaire dans les macrophages permettra ainsi de formuler de nouvelles hypothèses sur les causes du dysfonctionnement des macrophages dans des conditions pathologiques. Les nouvelles molécules identifiées dans ce projet pourront ainsi représenter de nouveaux candidats pour des approches thérapeutiques afin d’améliorer la régénération tissulaire et d’empêcher la fibrose dans les pathologies inflammatoires chroniques.

Procédures

Dans notre modèle, nous créons une petite blessure sur la peau des souris, et nous observons ensuite la cicatrisation au cours du temps, en prenant soin de protéger la plaie par des pansements. Pour cela, chaque animal sera anesthésié le temps de la procédure (environ 10 min), puis sera anesthésié à nouveau afin d'observer la cicatrisation et de changer le pansement (environ 3 min à chaque fois, 2 fois par semaine, pour une durée maximale de 3 semaines) .

Impact sur les animaux

Les animaux, sous anesthésie, subiront une chirurgie légère afin de créer une petite blessure sur la peau au niveau du dos entre les omoplates. Les nuisances attendues sont : stress de l'anesthésie (légère et rapide), risque d'hypothermie (modérée et rapide) et douleur liée à une blessure cutanée (modérée et de courte durée). Dans de rares cas, il est également possible que la plaie puisse s'infecter. Les nuisances attendues dans ce cas sont : douleurs liées à une infection (modérée et de courte durée).

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Des données de la littérature montrent que les macrophages, chez l’Homme comme chez la souris, produisent des molécules bénéfiques pour la réparation tissulaire. Nos données obtenues in vitro dans des modèles de culture cellulaire montrent que nos molécules d'intérêt régulent l’expression d’une partie de ces molécules bénéfiques. Nous souhaitons donc maintenant confirmer nos résultats dans un modèle in vivo. Il n’existe pas de méthode alternative pour réaliser ce travail qui nécessite l’analyse de tissus entiers. La peau est un tissu complexe qui comporte de nombreuses cellules qui interagissent afin de maintenir un équilibre. La dynamique du tissu cutané, des cellules immunitaires qu’il abrite ainsi que les interactions et le recrutement potentiel de cellules d’autres organes sont des conditions qui ne peuvent pas être adéquatement reproduites in vitro. De plus, le système immunitaire est un système dynamique dont les acteurs évoluent entre différentes localisations au sein de l’organisme selon des flux très précis. Enfin, certaines populations cellulaires du système immunitaire se spécialisent particulièrement en fonction de leur localisation, en particulier les macrophages. Ainsi, les macrophages de la peau ont certainement des propriétés différentes de celles de tout autre organe. Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro à ce jour malgré l’existence de modèles de peau ne permettent de reproduire cela, ceci nous oblige donc à utiliser des animaux afin de comprendre les interactions cellulaires nécessaires pour la cicatrisation cutanée. Des expériences in vivo sont donc nécessaires pour compléter les découvertes obtenues in vitro. De plus, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé à l’aide d’outils statistiques, pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le nombre de souris par condition est de 12 (4 animaux par expérience, expériences répétées 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante. Dans notre expérience préalable de ce modèle de cicatrisation, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans la cicatrisation de la peau.

Raffinement

Dans le cadre de ce modèle de blessure cutanée, un analgésique est administré aux animaux lors de la chirurgie. Les animaux sont surveillés tous les jours pour l’état général, afin d’assurer leur bien-être et pour surveiller les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des soins post-opératoires spécifiques seront mis en place si nécessaire (par exemple en cas de douleur ou d'infection de la plaie). Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les cellules immunitaires. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés (telles que des souris transgéniques déficientes pour notre molécule d’intérêt ou des techniques d’analyse d’expression de gènes), ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 8 à 12 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux

Les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour accepter la greffe de cellules pancréatiques humaines sans les rejeter. Elles sont 872, toutes tuées deux à six mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après destruction de leurs propres cellules bêta, elles subissent une chirurgie de greffe, jusqu'à cinq injections intrapéritonéales quotidiennes, des prises de sang deux fois par semaine pendant vingt-quatre semaines et des tests de tolérance au glucose de deux heures et demie, avec pour effets attendus des hypoglycémies et une réaction du greffon contre l'hôte pouvant leur faire perdre plus de 20 % de leur poids. Le porteur annonce un modèle plus proche de la clinique humaine et une accélération du développement de thérapies, bénéfices renvoyés au long terme.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui présente deux formes : type 1 (T1D), caractérisée par une absence de sécrétion d’insuline causée par la perte de cellules béta pancréatiques; et type 2 (T2D), caractérisée par une résistance à l’insuline. En 2021, le T1D affectait 9 millions de personnes dans le monde et le T2D plus de 537 millions de personnes (OMS). Le traitement des deux formes de diabète est un enjeu de santé publique majeur, or il n’existe aujourd’hui aucune thérapie curative. Les seuls palliatifs chroniques sont, pour le T1D, l’injection quotidienne d’insuline et, pour le T2D, les approches thérapeutiques diminuant la résistance à l’insuline ou augmentant la sécrétion d’insuline tout en améliorant le profil métabolique. Néanmoins, les traitements actuels restent inefficaces pour soigner durablement les patients. De plus, la qualité de vie des patients reste très impactée (injections quotidiennes, complications, charge mentale) et associée à des risques importants, notamment des épisodes d’hypoglycémie dont certains peuvent être fatals (à une fréquence moyenne de 0.5 à 1 événement par an chez les patients T1D traités). Il est donc indispensable de développer de nouvelles approches thérapeutiques comme la modulation de la réponse auto-immune dirigée contre les cellules béta, l’optimisation de la sécrétion d’insuline et l’amplification de la masse de cellules béta endogènes. Le projet présenté vise ainsi à répondre à ces besoins thérapeutiques par le développement d’un modèle animal humanisé translationnel, plus proche de la réalité clinique humaine. L’objectif du modèle est d’accélérer le développement de nouvelles thérapies et de limiter les échecs cliniques. Les objectifs du projet sont : 1) implémentation d’un modèle humanisé avec la greffe de cellules béta pancréatiques humaines productrices d’insuline dans la souris. 2) validation physiopathologique et pharmacologique du modèle : (a) dans le cadre du diabète auto-immun (T1D) : - Etude de la réaction auto-immune contre les cellules béta humaines du modèle, par des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques ou des cellules mononuclées sanguines périphériques (PBMC) humains, - protection par des cellules immunitaires régulatrices humaines, - et étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à renouveler les cellules bêta endogènes, (b) dans le cadre du T2D : - étude d’efficacité de composés pharmacologiques visant à optimiser la capacité sécrétrice d’insuline de cellules béta humaines.

Bénéfices attendus

Le projet proposera un modèle physiologique et translationnel de souris humanisées en termes de cellules béta, insuline et glycémie humaine. Ce nouveau modèle humanisé permettra de modéliser l’attaque auto immune des CD8+ et PBMC et le rôle protecteur de cellules immunitaires régulatrices. Il permettra également d’évaluer dans un contexte physiologique, l’activité de molécules potentiatrices de la sécrétion d’insuline, en développement dans le traitement du diabète de type 2, ou inductrices du renouvellement des cellules béta humaines, en développement dans le cadre du diabète de type 1. De plus, ce modèle murin de xénogreffe de cellules béta humaines pourrait, à plus long terme, permettre de développer des modèles hautement pertinents de diabète de type 2 à travers par exemple des régimes de type High Fat Diet et ainsi d’évaluer les nouvelles approches de lutte contre l’insulino-résistance et l’amélioration du profil métabolique. A plus long terme, les bénéfices attendus sont une accélération du développement de nouvelles thérapies innovantes pour le T1D et T2D et une amélioration des résultats cliniques (diminution des échecs thérapeutiques) par un meilleur criblage thérapeutique lors des phases préclinique.

Procédures

Les animaux seront soumis aux procédures suivantes: - injection intra-péritonéale jusqu'à 1 fois par jour pendant 5 jours, durée 5 min par injection, - prélèvement sanguin, 2 fois par semaine, pendant jusqu'à 24 semaines, durée 5 min par prélèvement, - chirurgie pour greffe de cellules béta pancréatiques humaines, jusqu'à 1 fois par animal, durée 15 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - échographie, jusqu'à 2 fois par animal, durée 30 min, procédure réalisée sous anesthésie générale, - test de tolérance au glucose, incluant 1 injection intra-péritonéale et jusqu’à 10 prélèvements sanguins pour mesure de la glycémie, procédure effectuée jusqu'à 2 fois par animal, durée 2,5 heures par procédure, - administration intra-péritonéale ou intra-veineuses de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques, jusqu'à 2 fois par animal, durée 5 min par injection.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les souris pourront être soumises à : - une ablation des cellules béta endogènes, - une chirurgie pour implanter des cellules béta humaines, - une administration de cellules immunitaires humaines ou de molécules pharmacologiques. Plusieurs nuisances doivent être anticipées : A) liées à l’ablation des cellules béta endogènes pouvant générer des épisodes d’hypoglycémie. B) liées à la procédure de chirurgie : - Hypothermie liée à l’anesthésie, - Saignements, douleur et stress liés à la chirurgie. C) liées à la greffe de cellules béta : - pas de douleur attendue liée à la taille de la greffe, la taille attendue restant minime, - possible hypoglycémie due à une trop forte production d’insuline par les cellules greffées pouvant éventuellement générer un état de léthargie. D) liées au suivi de la greffe de cellules béta et à l’administration de cellules immunitaires - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des prélèvements de sang. - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de cellules immunitaires. - Réaction immunitaire de la greffe contre l’hôte (GvHD). Les symptômes de la GvHD sont une perte de poids (>20%), une posture courbée, un pelage hérissé et une perte d’activité, - Hypoglycémie transitoire. E) liées au molécules pharmacologiques administrées - gêne/douleur de basse intensité et momentanée lors des injections de molécules pharmacologiques. - Les molécules pharmacologiques qui seront utilisées sont des peptides et molécules connus et n’ont pas d’effet secondaire grave décrit chez la souris.

Devenir

Les animaux utilisés pour la mise en place du modèle diabétique seront euthanasiés 2 mois après la procédure, ce qui est le temps nécessaire pour confirmer le développement du diabète. Les animaux utilisés pour la greffe de cellules béta humaines puis pour l’évaluation de leur rejet et de leur protection seront euthanasiés au plus tard 6 mois après la greffe, ce qui est le temps nécessaire pour obtenir les résultats sur la survie, le rejet et la protection des cellules béta humaines.

Remplacement

Les expériences prévues dans ce projet ne peuvent pas être transposées efficacement dans un système in vitro tout en garantissant d’apporter des informations physiologiques pour les raisons suivantes : - Le projet vise à développer un modèle complexe multicellulaire humain d’une maladie métabolique incluant notamment des régulations faisant intervenir plusieurs tissus ; - L’objectif est d’évaluer l’impact de cellules immunitaires et de molécules effectrices sur la fonction de cellules béta humaines et sur leur capacité à maintenir une glycémie normale dans un environnement métabolique complet (foie, muscle, système digestif).

Réduction

Le principe de réduction du nombre d’animaux a été appliqué en premier lieu en se basant sur des résultats d’études similaires précédentes afin d’estimer statistiquement les nombres d’animaux nécessaires. Par ailleurs, pour les expériences de mise au point de protocoles, les nombres d’animaux nécessaires ont été estimés en se basant sur notre expérience de ce type d’approches. Le nombre de conditions expérimentales à comparer a également été calculé afin d’obtenir les résultats avec le nombre le plus faible possible d’animaux. Enfin, nous procéderons par étapes et conclusions intermédiaires afin, à nouveau, d’éliminer toute utilisation inutile d’animaux. Un second aspect de la réduction du nombre d’animaux est que les personnes qui effectueront les expérimentations seront précisément formées et habituées à chaque procédure afin de réduire au maximum le risque d’échecs mais aussi de nuisance pour les animaux et ainsi le nombre d’animaux qui seront utilisés. Enfin, nous procéderont dans toutes nos étapes à une surveillance des animaux pour les nuisances possibles, de façon à les minimiser et ainsi garantir une reproductibilité optimale de nos résultats et, en conséquence, une diminution du nombre de répétitions des expériences et ainsi du nombre d’animaux nécessaires.

Raffinement

La démarche de raffinement de ce projet implique : - personnel précisément formé aux procédures afin de limiter les nuisances ou la survenue de complications, - surveillance des nuisances possibles à toutes les étapes afin de minimiser les effets néfastes et la souffrance. Des échelles de scoring seront utilisées pour évaluer le bien-être et prendre des actions au plus tôt. Différentes actions seront menées : - Afin de réduire le stress, les animaux seront reçus et acclimatés pendant au moins 5 jours avant une procédure. - Pendant l’hébergement ils auront accès à nourriture et boisson ainsi qu’à différents objets pour enrichir leur environnement. - Pour la chirurgie, avant la procédure, les animaux recevront un analgésique. Puis une anesthésie par isoflurane. Pour prévenir l’hypothermie, un tapis chauffant sera utilisé et l’animal couvert. Dans la phase de réveil, celui-ci sera placé dans une cage en isolation dans un environnement chauffé et monitoré pour sa température corporelle, hydratation, absence de douleur, et de la nourriture et de l’eau seront fournies. Enfin, une analgésie sera administrée en préventif pendant 3 jours, le jour de la chirurgie inclus, 2 fois par jour espacé de 12h. La plaie de l’animal sera surveillée et les agrafes retirées (10 jours après la chirurgie). Après récupération, l’animal sera à nouveau hébergé dans les conditions classique A2 et surveillé tous les jours. L’apparition des points limites sera surveillée avec observation des signes d’hypothermie, de douleur, stress, perte d’activité, déshydratation ou absence de prise de nourriture, perte de poids, infection ou ulcération de la plaie. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal. Dans les cas où il n’est pas possible de rétablir ou soulager l’état de l’animal, l’euthanasie sera appliquée. Nos procédures impactant la glycémie, des mesures, 2 fois par semaine, seront réalisées afin d’anticiper d’éventuels effets indésirables et les actions pour en minimiser les effets appliquées. Notamment dans le cas d’hypoglycémie (insulinome, mort des cellules béta), du sucrose sera fourni dans l’eau. Si un point limite est atteint, des actions de traitement seront prises en accord avec le SBEA et le vétérinaire de la zootechnie afin d’éviter la dégradation de l’état de l’animal, et l’euthanasie appliquée s’il n’est pas possible de soulager l'animal.

Choix des espèces

Le choix du modèle mus musculus est lié à la praticité du modèle (taille, accessibilité) et à la disponibilité d’animaux immuno-déprimés qui favorisent l’implantation de cellules humaines ainsi qu’aux données déjà publiées sur ce type d’approches. Plus spécifiquement, le choix du modèle mus musculus est lié à l’existence de modèles publiés de greffe des cellules EndoC-bH® ainsi que d’injection de lymphocytes T ou de PBMC pour induire le rejet de greffe de cellules béta humaines. Les souris qui seront utilisées seront âgées d’entre 6 et 9 semaines au moment de l’ablation des cellules bêta endogènes. Ceci afin que les implantations de cellules EndoC-bH®, prévues 1 à 4 semaines après, soit faites sur des souris âgées de 7 à 13 semaines soit un âge permettant que l’animal ne soit pas trop petit afin de faciliter la chirurgie, tout en garantissant que les animaux seront adultes sans être trop âgés en fin de protocole soit jusqu’à 6 mois après l’implantation initiale de cellules béta.

6 312 souris mâles génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant cinq injections en une semaine et jusqu'à trois prélèvements sanguins. Certaines sont suivies jusqu'à deux ans et voient leurs lésions évoluer vers des tumeurs volumineuses, avec douleur abdominale, posture voûtée et perte de poids parmi les signes attendus. Le point limite retenu est une prostate de la taille d'une bille à la palpation, qui déclenche la mise à mort. Toutes sont tuées pour prélever la prostate et d'autres organes, le bénéfice avancé se limitant à démontrer l'intérêt des neutrophiles comme marqueur diagnostique ou comme cible thérapeutique.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure caractérisation de la progression des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate développés au laboratoire sont basés sur l’expression de la recombinase chimérique Cre-ERT2 dont l'activité est induite par le tamoxifène dans l’épithélium prostatique, afin d'inactiver à l’âge adulte le gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines (Pten). Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme [4]. À noter que l'inactivation de Trp53 dans les cellules épithéliales prostatiques déficientes en PTEN permet de lever la barrière de sénescence, accélère le développement d'adénocarcinomes et favorise l'apparition de tumeurs sarcomatoïdes métastatiques. De plus, la perte de l'expression du récepteur à la vitamine D (VDR) favorise le developpement de métastases et de tumeurs aggressives. De récentes études, dont les notres, suggèrent un rôle important des neutrophiles, des cellules myéloïdes du système immunitaire, dans la tumorigènese prostatique. Cependant, peu d'information sont disponible sur leur hétérogénité au cours de la tumorigénèse, ni sur l'efficacité de les cibler, voire de les utiliser comme biomarqueur. L'objectif de ce projet est de déterminer en utilisant des technologies innovantes si les neutrophiles contribuent à la progression des lésions précancéreuses de la prostate induites par injection de tamoxifène. Ce projet ce déroulera dans deux Etablissement Utilisateur.

Bénéfices attendus

Le cancer de la prostate est un des cancers masculins les plus fréquents et meurtriers, notamment en raison de limite d’efficacité pour les traitements et les options diagnostiques. Ce projet vise à démontrer l’intérêt des neutrophiles comme nouvel outil diagnostique et comme cible thérapeutique pour ces cancers réfractaires.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections réalisées au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance) (EU1). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur des animaux à chaque point de la cinétique, un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours (EU1). Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris (EU2). Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale, une injection suivi du sacrifice (EU1). (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse). Des cohortes independantes seront injectées avec le radiomarqueur et anesthésiées au maximum 3 fois (30 min max) (EU2). Des cohortes indépendantes seront traitées (10 secondes de contentions) 2 fois par jour pendant une semaine (EU2).

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection, dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Lorsque les souris transgéniques développeront les lésions précancéreuses (PIN), à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. Dans ce cas la souris sera sortie de l'étude. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris, dans ce cas une administration de solution saline sera réalisée. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. Des secheresses ophtalmiques peuvent apparaitre au cours de l'anesthésie, dans ce cas un gel ophtalmique sera appliqué.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. De plus, les études longitudinales chez l'homme ne sont pas ethique puisqu'elle nécessite des biopsies à répétition. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points de cinétique ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction du nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. Pour les analyses moléculaires et de populations cellulaires, plusieurs paramètres seront évalués, notamment les niveaux d’expression des protéines ou des ARN. Pour les études histologiques, les niveaux d’expression des protéines, en plus de leur localisation, seront déterminés par immunofluorescence. Étant donnée l’hétérogénéité phénotypique et la variabilité interindividuelle attendue le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande des cohortes de 20 animaux par point de cinétique, ce qui justifie l’utilisation des test statistiques paramétriques. Afin d’obtenir des résultats significatifs, un nombre d’animaux utilisés par condition (d’un génotype donné à un âge donné) a été calculé en fonction de la différence attendue et de l'hétérogéneité observée. Dans ces conditions, on aura besoin de 20 animaux par groupe. La tomographie par émission de positrons (TEP) est un examen d'imagerie en médecine nucléaire qui est peu invasif, les quantités de produits injectées sont de l’ordre de 0,01 mg/Kg ce qui est extrêmement faible et permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux.

Raffinement

Pour l’ensemble des animaux, des points limites stricts et spécifiques au projet seront utilisés. Les points limites de l’expérience seront un volume de prostate après palpation de la taille d'une bille et le poids de la souris. Si la prostate devient volumineuse, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est trop importante ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Lors de l'anesthésie, une secheresse occulaire et une diminution de la temperature corporelle peut apparaitre. Aucun effet secondaire n'a été rapporté pour les molécules utilisées dans cette étude. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Enfin, nous procéderons à une habituation à la contention pour les injections intraperitoneales (IP). Lors des examens d'imagerie, un gel ophtalmique est appliqué pour éviter le dessèchement oculaire et une injection sous cutanée de NaCl à température corporelle est réalisée pour éviter la déshydratation. De même, la température rectale et la fréquence respiratoire sont monitorées en continu à l'aide d'une sonde rectale et d'un capteur de pression posé sur le thorax. Pendant les séances d'imagerie, les animaux sont placés dans une enceinte chauffée afin de maintenir la température corporelle et anesthésiés à l'isoflurane (air ambiant). La durée d'analyse par imagerie est restreinte au maximum (3 semaines max par souris). Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des effets de la pathologie. Le transport se fera dans un vehicule adapté dans des cages de transcports adaptées et enichies afin d'assurer la sécurité des animaux (en terme de manipulations, d’équipements utilisés, moyens de transport, conditions de transport). De plus, ils seront manipulés en évitant tout effrayement.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans les gènes Pten, Trp53 et VDR le plus fréquemment impliqués dans les cancers de la prostate humain. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de cancer de la prostate (CaP) afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à la prostate qui est un organe qui termine son developpement post-puberté.

Deux des six macaques rhésus de ce projet viennent d'un projet antérieur reposant sur la même approche, ce qui leur épargne la pose d'un implant crânien. Les quatre autres subissent une chirurgie de quatre heures pour fixer une pièce de contention sur le crâne, suivie de plusieurs semaines de convalescence, puis d'un conditionnement comportemental sous restriction hydrique. Tous passent une dizaine de périodes d'enregistrement en IRM fonctionnelle vigile, d'une à deux semaines chacune et de nouveau sous restriction hydrique, plus six sessions sous sédation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué à l'issue, quatre étant réutilisés dans des projets de même nature et deux retournant à l'animalerie après désimplantation, ce que le porteur qualifie d'approche "très économe en termes d'individus impliqués".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à caractériser les réseaux corticaux qui sous-tendent cognition spatiale et cognition sociale chez le singe macaque. L'objectif est double: (1) comprendre comment ces réseaux s'articulent chez le singe et (2) estimer leur degré d'homologie avec les réseaux supportant les mêmes fonctions cognitives chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Les connaissances que ce projet dégageront doivent permettre de mieux comprendre comment cognition spatiale et cognition sociale sont implémentées chez le primate, et en quoi cette implémentation diffère entre l’Homme et le singe macaque. Il s'agit de connaissances fondamentales dont il est difficile de prévoir, par essence, la façon dont elles contribueront à améliorer la santé humaine et/ou animale. Cependant, les troubles touchant la cognition sociale et/ou spatiale chez l'Homme sont suffisament nombreux et invalidants pour justifier de faire progresser nos connaissances fondamentales dans ces domaines.

Procédures

Les 6 macaques rhesus qui participent à ce projet seront impliqués dans une unique procédure qui comporte 4 phases. Deux des animaux seront ré-utilisés d'un projet antérieur (si avis vétérinaire conforme) qui s'appuyait sur la même approche expérimentale, ils n'auront donc pas à repasser les 2 premières des 4 phases décrites ci-après: (A) Pose de la pièce de fixation de tête (n=4): implique une chirurgie d'environ 4 heures sous anesthésie et dans des conditions aseptiques, puis un suivi post-opératoire et une période de convalescence de plusieurs semaines. (B) Conditionnement comportemental (n=4): implique des manipulations quotidiennes d'acclimation à la manipulation, puis un conditionnement comportemental à une tâche de fixation s'accompagnant d'une restriction hydrique contrôlée (quelques semaines à plusiers mois selon les individus). (C) Sessions d’enregistrements IRMf vigile (n=6): implique pour chaque individus une dizaine de périodes d'enregistrement en IRMf, chacune durant entre 1 à 2 semaines. Ces périodes d'enregistrement s'accompagne d'une restriction hydrique et elles sont donc espacées d'au moins un mois pour chaque individus. (D) Sessions d’enregistrements IRMf anesthésié (n=6): implique pour chaque individus 6 sessions d'enregitrement de 45 minutes environ, sous légère sédation et hors périodes de restriction hydriques.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables potentiels sur les animaux impliqués dans ce projet sont: (1) le stress que peut générer la phase d'habituation à la manipulation, à la chaise à primate et à l'immobilisation de tête, (2) les conséquences de l'anesthésie (déshydratation, dépression respiratoire ou dépression du rythme cardiaque), (3) les complications post-opératoires (douleur potentielle, risques d'infection) (4) le stress et la perte de poids associés à la restriction hydrique.

Devenir

A l'issue de l'unique procédure de ce projet, il n'est prévu aucune mise à mort. Les animaux seront replacés ou réutilisés dans des projets scientifiques de même nature, selon leur âge, leur état de santé, conformément à l'avis vétérinaire qui sera émis le cas échéant.

Remplacement

Les capacités cognitives spatiales et sociales que nous cherchons à comprendre s'expriment, par essence, dans des organismes entiers en interaction avec leur environnement. Comprendre comment ces capacités se sont développées chez les primates pour culminer chez l'homme nécessite une approche comparative homme/singe seule à même de nous apprendre comment fonctionnent les réseaux cérébraux sous-jacents. L'objectif est double (1) identifier les spécificités humaines, (2) caractériser les domaines de pertinence du modèle animal pour l'étude de la cognition spatiale et de la cognition sociale. Ces objectifs scientifiques ne peuvent être atteint qu'en étudiant l'organisation anatomo-fonctionnelle du cerveau chez des singes macaques et des humains placés dans des conditions expérimentales similaires.

Réduction

Le nombre d'animaux impliqués dans ce projet (n=6) est suffisant pour appliquer des tests statistiques classiques et extraire des connaissances robustes et généralisables sur les réseaux corticaux supportant cognition spatiale et cognition sociale chez le singe macaque. Du fait de la nature faiblement invasive des approches déployées ici, les mêmes animaux participeront à tous les protocoles d’imagerie fonctionnelle et structurelle, permettant de réduire le nombre d'individus à implanter. Il est a noté que 2 des 6 animaux inclus dans ce projet sont réutilisés suite à leur implication dans un projet antérieur reposant sur des méthodes similaires à celles proposées ici. De même, aucun animal ne sera sacrifié en fin de projet. Ils seront réutilisés dans des projets de même nature si leur âge et leur état de santé le permet, ou seront désimplantés et continueront à être hébergés dans notre animalerie. Cette approche est ainsi très économe en termes d'individus impliqués.

Raffinement

Tout stress ou souffrance des animaux ayant un effet négatif sur les processus cognitifs étudiés, il convient de veiller à les diminuer au maximum. Dans le cadre de ce projet, cela passe notamment par une pose d'implant de tête sous anesthésie générale, l'utilisation d'analgésie en post-opératoire, une surveillance continue des animaux pour détecter tout signe de détresse et un conditionnement comportemental très graduel. Chacune de ses étapes est associée à un ensemble de points limites stricts qui, s'ils sont dépassés, justifieront l'arrêt temporaire ou définitif de la procédure en cours. Par ailleurs, une grande attention est portée à l'environnement de nos animaux, avec des enclos de 4 individus permettant les interactions sociales dans un milieu spacieux et enrichis (perchoirs, lianes, jouets, etc). Des bassines sont aussi présentes dans les enclos quand les animaux en restriction hydrique n'y sont pas. Tout sera mis en oeuvre pour minimiser les nuisances sur les animaux impliqués dans ce projet. Notre recul de 10 ans dans l'emploi de ces approches expérimentales nous permet d'affirmer que leur impact négatif sur la santé des animaux est généralement minime et réversible. Le stress potentiel engendré par la manipulation des animaux et leur contention est réduit au maximum par une acclimatation lente et progressive à ces manipulations. Le stress hydrique potentiel durant les phases de conditionnement ou d'enregistrement est contrôlé de façon fine (évolution du poids, de la prise alimentaire, screening comportemental, complémentation hydrique éventuelle pour assurer les besoins journaliers). Enfin, si la pose d'une pièce de fixation est généralement très bien tolérée par les animaux, nous veillons à prévenir toute infection éventuelle autour de cette pièce par des nettoyages fréquents (une fois par semaine en général et plus si nécessaire).

Choix des espèces

Le singe macaque est un modèle central en Neurosciences Intégratives de par ses similitudes comportementales et cérébrales avec l'Homme et sa facilité de conditionnement sur des tâches cognitives complexes. Beaucoup de nos connaissances sur le cerveau proviennent d'études invasives menées sur ce primate. Avec l'avènement des techniques d'imagerie fonctionnelle chez l'Homme, puis leur implémentation chez le singe, il est devenu possible d'adresser la question des homologies interspécifiques de façon directe et ainsi de baser le transfert de connaissances sur des bases plus solides. Ces 2 espèces de primate ayant divergées il y a environ 25 millions d'années, le modèle singe offre de plus l'opportunité d'interroger d'un point de vue évolutif les substrats corticaux qui ont rendu possible l'émergence de certaines spécificités humaines liées à la cognition spatiale et/ou sociale (manipulation d'outils, hypersocialité, langage, etc.). Les animaux utilisés doivent avoir atteint l'âge adulte pour éviter des problèmes potentiels quand l'implant de tête est posé alors que le crâne n'a pas fini sa croissance. Ils ne doivent pas être trop vieux pour minimiser les risques liés à l'anesthésie et éviter la variabilité potentielle d'un déclin cognitif lié à l'âge.