Recherche fondamentale

Savoir si une inflammation passée modifie la réponse des lymphocytes contre une tumeur conduit à utiliser 300 souris, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles boivent une eau additionnée d'antibiotiques pendant cinq semaines, ce qui provoque une inflammation intestinale, une diarrhée et une douleur abdominale transitoires, subissent une biopsie d'oreille d'un millimètre, un rasage du flanc et une greffe sous-cutanée de cellules tumorales, puis une injection de lymphocytes. Le porteur annonce des points limites précoces et un suivi trois fois par semaine, sans détailler ce qui déclenche l'arrêt. Le bénéfice attendu tient en une phrase de huit mots, l'identification de mécanismes permettant un meilleur rejet tumoral.

Objectifs

Le système immunitaire nous protège des infections et de l’émergence de tumeurs, mais pour fonctionner de manière optimale, il doit constamment se préparer et s'entraîner. Lorsqu’on est malade, l’inflammation générée peut toucher nos lymphocytes. Nous explorons comment cet inflammation passée peut influencer la réponse des lymphocytes contre les tumeurs.

Bénéfices attendus

Identification de mécanismes permettant un meilleur rejet tumoral.

Procédures

Injection aprés anesthésie gazeuse (1 fois 2 min/souris) - Injections (1 fois 20sec/souris)- Légère contention et pesée des souris (20s/3 fois par semaine) – Prélèvement de féces (3 fois, durée de l'intervention 30 secondes environ)- -Rasage du flanc des souris sous anesthésie gazeuse (1x 2 minutes/souris) - Injection sous-cutanée dans le flanc, sous anesthésie gazeuse, de cellules tumorales (1x 2 minute/souris) – Injection sous anesthésie gazeuse, de lymphocytes (1x 2 minutes/souris) - Récolte des fécés : procédure non invasive et rapide (1 fois/ maximun 20s)-Traitement antibiotiques dans l'eau de boisson pendant une durée maximale de 5 semaines.

Impact sur les animaux

-Léger Stress dû aux diverses contentions -Inflammation intestinale transitoire -Problèmes d’hydratation consécutifs à une diarrhée transitoire - Douleur abdominale transitoire -Gêne et léger douleur dues à la présence d'une tumeur sur le flanc de l'animal-Douleur modérée et transitoire lors d'une petite biopsie (1 mm) à l'oreille

Devenir

Les animaux seront mis à mort et les oraganes seront prélévés pour analyses.

Remplacement

La maturation du système immunitaire est un processus complexe qui implique l'interaction de divers acteurs, tels que le microbiote, le système immunitaire inné et le système immunitaire adaptatif, et ne peut actuellement être étudiée qu'à l'échelle de l'organisme entier. Par ailleurs, nous avons renforcé nos hypothèses et éliminé un grand nombre de pistes en effectuant une recherche bibliographique exhaustive et en réalisant divers tests in vitro, réduisant ainsi de manière significative notre utilisation d'animaux dans notre projet.

Réduction

Nous avons toute l’expertise immunologique et technique. Ainsi, il n’y a pas de mises au point nécessaires. Utilisation de techniques d’analyses multiparamétriques ce qui réduit considérablement le nombre de matériels biologiques nécessaires. Optimisation maximale des échantillons biologiques. Le nombre de souris proposées dans ce projet a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Ce nombre a été calculé à partir d’outil statistique. Ce nombre peut encore être réduit si les tests de prises de décisions ne valident pas nos hypothèses avancées. Nous utilisons mâles et femelles ce qui limite considérablement le nombre de souris à générer. Pour éviter d'augmenter le nombre d'animaux, les expériences seront planifiées de telle sorte à béneficier d'un groupe contrôle commun et éviter ainsi de multiplier les groupes contrôles.

Raffinement

- Un suivi quotidien des animaux (zootechnicien +expérimentateur) permettant un repérage rapide des premiers signes de mal être (tel que l’isolement, des mouvements ralentis ou anormaux, présence de selles molles dans la cage). – Des points limites définis et précoces nous permettant d’agir rapidement ont été mis en place. – Anesthésie des animaux lors de manipulations invasives comme l’injection intraveineuse de cellules et ainsi réduire le stress de l’animal et éviter des mouvements de l’animal pouvant le blesser. – Pour favoriser le bien-être des animaux, leur environnement sera enrichi de maisonnettes en cartons pour se cacher et de bâtonnets en coton pour créer un nid. - Pas d’isolement des souris pour respecter au tant que faire ce peu le comportement social des souris. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (3 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris, via notamment l’anesthésie gazeuse et un anesthésique local. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée pourront être utilisés. En cas de douleur détectable, un analgésique sera administré.

Choix des espèces

L’ensemble des outils, anticorps pour ce genre d’études sont développés chez la souris. Le stade adulte (souris 2 mois) est choisi de façon à avoir un système immunitaire mature et une flore commensale stable et complète. Mâles et femelles seront utilisés dans cette étude pour minimiser le biais lié au sexe dans nos observations.

Jusqu'à dix injections intrapéritonéales par animal, une injection intraveineuse sous anesthésie générale, une injection sous-cutanée : le protocole décrit ne va pas plus loin pour 1 488 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour des analyses post-mortem. Il s'agit d'ouvrir la barrière qui protège le cerveau afin de voir si un médicament y diffuse mieux lors d'une maladie cérébrale. Sur le remplacement, le porteur écrit en une phrase que la complexité de cette barrière ne peut pas être répliquée in vitro et qu'elle est conservée entre humain et souris. Il annonce des phénotypes dommageables, perte de mobilité, baisse de la consommation alimentaire et survie médiane de 250 jours, sans nommer la maladie induite ni préciser combien de souris la subiront.

Objectifs

Le cerveau est un organe sensible aux contaminants chimiques ou biologiques éventuellement transportés par le sang. Afin de le protéger, les vaisseaux sanguins du cerveau sont plus imperméables que ceux du reste du corps et forme ainsi une véritable barrière. Cependant, cette barrière représente un véritable obstacle à l'utilisation de médicaments pour traiter les maladies se développant dans le cerveau. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de cette barrière. Le but de ce projet et d’étudier l’impact d’une ouverture de la barrière du cerveau sur la diffusion et l’efficacité d’un médicament lors d’une maladie cérébrale.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des médicaments dans le cerveau lors de maladie ou la barrière du cerveau limite fortement leurs efficacités.

Procédures

Injection intrapéritonéales (< 1 minute) : Maximum de 10 injections par souris. Injection intraveineuse (1 minute) : Maximum de 1 injection par souris. Les injections intraveineuses seront effectuées sous anesthésie générale. Anesthésie générale (maximum 1 heure) : 1 injection par animal. Injection sous-cutanée (1 minute) : Maximum de 1 injections par souris.

Impact sur les animaux

Douleurs légères et transitoires liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances liées à l’apparition de phénotypes dommageables lors de la progression d’une maladie cérébrale : diminution des propriétés locomotrices (perte de mobilité), diminution de la consommation d’aliment induisant une perte progressive de poids et survie médiane de 250jours (des points limites adaptés ont été mis en place pour les différentes procédures)

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

La complexité de la barrière du cerveau ne peut pas être répliquée mais se retrouve conservé entre humains et souris, faisant de la souris est un modèle nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes ainsi que via l’utilisation d’un logiciel statistique en fonction des critères de taille d'effet et d'écart type propre à chaque procédure. Les résultats seront analysés par tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Pour éviter le stress et la douleur, les injections intraveineuses seront réalisées sous anesthésie générale. Les perfusions intracardiaques seront réalisées sous anesthésie générale et antalgie Les procédures se dérouleront sous la surveillance d'expérimentateurs formés. Des points limites adaptés ont été établis dans les différentes procédures, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière du cerveau qui ne peut pas être répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris transgéniques recapitulant des maladies cérébrales humaine. La barrière du cerveau commence à se mettre en place durant le développement embryonnaire, et mature durant le développement post-natal jusqu’au 33ieme jour de vie chez la souris (J33). Ainsi, l’étude se fera aux stades nouveau-nées et adultes avec le but d’étudier l’impact d’une ouverture de la barrière du cerveau pendant la maturation ou pendant le maintien de cette dernière.

2 680 souris et 2 680 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une surcharge d'hormones androgènes leur est administrée chaque jour pendant une à vingt-quatre semaines, par voie orale, par injection ou par implant sous-cutané à libération prolongée, pour reproduire un syndrome des ovaires polykystiques. Les femelles subissent en plus un frottis vaginal quotidien pendant quatorze à vingt-huit jours consécutifs, des prélèvements de sang et d'urine hebdomadaires, et pour certaines une mise à l'accouplement de deux semaines suivie d'une gestation menée à terme. Provoquer l'infertilité ne devrait pas, selon le porteur, entraîner d'autres effets indésirables, et tous les animaux seront tués parce que le prélèvement des ovaires est jugé "indispensable" pour établir l'effet d'un traitement.

Objectifs

Le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) est la maladie hormonale la plus fréquente chez les femmes en âge de procréer, touchant environ une femme sur dix dans le monde. Il se caractérise par un dérèglement hormonal, une production excessive d’androgènes (comme la testostérone), des règles irrégulières et la formation de follicules inachevés dans les ovaires. Le SOPK est l’une des principales causes d’infertilité. L’origine du SOPK n’est pas clairement identifiée, mais elle est probablement multifactorielle (génétique, épigénétique, environnementale). Un lien est souvent rapporté entre l’excès d’androgènes, la résistance à l’insuline et l’obésité, avec environ 35 à 50 % des patientes avec un SOPK qui sont obèses. Les symptômes varient selon les personnes : pilosité excessive, perte de cheveux, acné, règles irrégulières ou absentes. Ces symptômes évoluent avec l’âge, l’hypersécrétion des androgènes aggravant la résistance à l’insuline. Le SOPK augmente aussi le risque de syndrome métabolique (surpoids, dyslipidémie, hypertension, troubles de la glycémie), conduisant à l’insulinorésistance, au diabète de type 2 et aux maladies cardiovasculaires. Il accroît également le risque de cancer de l’endomètre. Le SOPK est une maladie chronique, et actuellement incurable. La prise en charge des patientes vise à améliorer les symptômes par des changements de mode de vie et ou des traitements médicamenteux. La recherche médicale est donc très active, cherchant à comprendre les dysfonctionnements et à développer de nouveaux traitements, notamment des traitements curatifs. Des modèles animaux de SOPK sont décrits dans la littérature, principalement chez les rongeurs. Ceux-ci sont développés via des modifications génétiques, des manipulations environnementales (exposition au stress ou lumière constante) ou l’induction de taux élevés d’hormones sexuelles, parfois combinée à l’induction du diabète (lignée de rongeurs diabétiques ou alimentation riche en graisses (type Western ou High-fat-diet, HFD). Ce projet vise à développer des modèles animaux de SOPK spontané (certaine souche de rat) ou induit par surcharge androgénique, afin de mieux comprendre la physiopathologie du SOPK et de contribuer à la recherche de nouveaux traitements, curatifs ou symptomatiques. Ces modèles animaux chez les rongeurs sont décrits comme mimant le SOPK chez la femme, et répondant aux critères diagnostic de la maladie (critères de Rotterdam).

Bénéfices attendus

Selon l’Organisation mondiale de la santé, le SOPK est un problème de santé publique important et l’un des troubles hormonaux les plus courants chez les femmes en âge de procréer. La maladie touche environ 8 à 13 % des femmes en âge de procréer. Les effets biologiques et psychologiques du SOPK, en particulier ceux liés à l’obésité, à l’image du corps et à l’infertilité, peuvent entraîner des problèmes de santé mentale et une stigmatisation sociale. D’après l’Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm, dossiers SOPK), un des enjeux de la recherche sur le SOPK est le développement de nouveaux traitements qui permettraient de résoudre toutes les complications à la fois, en s’attaquant à la cause du problème et non à chacun des symptômes séparément. Ce projet de recherche permettrait la mise en place d’un modèle robuste et valide de SOPK chez le rat et la souris. Ensuite, l’évaluation de nouveaux traitements du SOPK sur ces modèles animaux, donc une preuve de concept préclinique, avant les essais chez l’homme.

Procédures

Pour l’induction du SOPK, les animaux vont recevoir un traitement par des hormones sexuelles ou autres molécules entraînant un déséquilibre hormonal. Ce sera une administration par jour par voie orale ou parentérale, ou via un dispositif sous-cutané permettant une libération prolongée, pendant 1 à 24 semaines. En plus, les animaux vont aussi recevoir une administration (voie selon la molécule à étudier) du composé à analyser, d’un contrôle négatif (souvent le véhicule du composé à tester) et d’une molécule de référence. La fréquence et la durée du traitement dépendra du composé à tester (une ou plusieurs fois par jour pendant 1 à 24 semaines). Des frottis vaginaux seront réalisés chez les animaux, une fois avant le début des traitements, puis une fois par jour pendant au moins 14 jours consécutifs (28 jours au maximum) afin de déterminer la présence de SOPK. Un test de fertilité par accouplement peut être réalisé afin d’observer le déroulement de la gestation. Les femelles seront mis en accouplement pendant 2 semaines au maximum et la gestation sera mené à terme (environ 3 semaines). Enfin, si le protocole le requiert, des prélèvements de sang et d’urines pourront être envisagés jusqu’à une fois par semaine pendant la durée de l’étude. Chaque prélèvement, réalisé par des personnels tutorés, durera moins de 3 minutes

Impact sur les animaux

L’administration des composés, la réalisation des frottis vaginaux et les prélèvements sanguins peuvent entraîner un stress et/ou une sensation d’inconfort passager chez les animaux. L’excès d’hormones androgènes et la formation des petites follicules ovariens immatures entraîneraient une infertilité mais ne devraient pas provoquer d’autres effets indésirables chez les animaux. Le test d'accouplement peut engendrer un léger stress et anxiété au début, lors de l'acclimatation avec le mâle.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure. En effet, un prélèvement des ovaires est indispensable pour mettre en évidence le SOPK et l’efficacité ou non d’un traitement.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun modèle in vitro pertinent permettant d’évaluer l’efficacité d’un principe actif sur le SOPK. En effet, le syndrome est le résultat d’un ensemble de désordres hormonaux et tissulaires, faisant appel à l’axe hypothalamo-hypophysaire et atteignant en même temps le cerveau et les organes.

Réduction

La réalisation des études se fera de façon à limiter le plus possible le nombre d’animaux utilisés. Une étude pilote sera réalisée pour la validation du modèle. L’évaluation d’un nouveau traitement se fera seulement lorsqu’un modèle robuste et valide sera obtenu. Comme utilisé par les autres équipes de recherche dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe sera entre 5 et 8 au début du projet. Ce nombre sera ensuite affiné après la récolte des premières données avec des tests statistiques. Si un test d’accouplement est réalisé, les rats mâles seront réutilisés dans la mesure du possible afin de limiter leur nombre. Une réduction du nombre d’animaux en testant 2 composés à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence. Des tests statistiques seront aussi réalisés pour comparer les paramètres mesurés dans les groupes d’animaux étudiés. Pour une petite population, le t-test non apparié sera utilisé pour les comparaisons 2 à 2 et une analyse de variance à 1 ou 2 facteurs pour les comparaisons multiples.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés en groupe dans les cages (2 rats et jusqu’à 5 souris) afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un suivi quotidien de tous les rats sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Des points limites adaptés ont été fixés pour la réalisation du projet. L’atteinte d’un point limite sera signalé par le zootechnicien à un responsable des soins et au responsable du projet. Le cas échéant, si les symptômes sont réversibles, l’animal sera sorti de l’expérience et des procédures de soins peuvent être mis en place avant une éventuelle ré-inclusion dans l’étude. Si les symptômes sont irréversibles, l’animal sera euthanasié. Toute décision (sortie de la procédure en cours, soins ou euthanasie) sera prise en concertation avec le responsable du projet, le vétérinaire référent, et/ou le responsable de la structure du bien-être animal (SBEA) et/ou le responsable de la plateforme animalerie.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les rongeurs, que ce soit le rat ou la souris, sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche dans les modèles de SOPK. En effet, les rongeurs ont aussi un axe hypothalamo-hypophysaire qui régule le taux hormonal, qui est essentiel dans l’étiologie du SOPK. Malgré l’absence de menstruation chez la femelle, le suivi du cycle œstral permet d’observer une perturbation de l’ovulation. De plus, le cycle oestral dure seulement 4 à 5 jours chez les rongeurs, permettant d’observer rapidement une perturbation ou l’efficacité d’un traitement. Les animaux seront utilisés à l’âge prépubère (3-4 semaines d’âge) ou à l’âge adulte. En effet, il a été décrit que l’excès d’hormones androgènes à l’âge prépubère, voire intra-utérin, reproduirait mieux les symptômes du SOPK qu’à l’âge adulte.

Diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratation, perte de poids, état du pelage, prostration : une grille de score décide à quel moment le rat quitte l'étude pour être tué au CO2. 288 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour des prélèvements sanguins et tissulaires. Chacun reçoit jusqu'à huit injections intraveineuses d'anticancéreux sur 25 jours et jusqu'à vingt gavages quotidiens de la molécule testée, avec des tests hebdomadaires mesurant l'allodynie tactile et thermique, c'est-à-dire le seuil auquel un contact non douloureux devient douloureux. Le porteur reconnaît que des rats plus âgés seraient mieux corrélés à la clinique humaine, le cancer étant une maladie du sénior, mais indique qu'ils coûtent cher et sont rarement utilisés dans la littérature.

Objectifs

La neuropathie périphérique chimio-induite est un effet indésirable caractéristique des anticancéreux neurotoxiques. Cette neuropathie est la conséquence d'une altération des nerfs des patients et se caractérise par des fourmillements, des picotements et des douleurs distales et symétriques, altérant la qualité de vie des patients, et pouvant perdurer longtemps après la fin des traitements anticancéreux. La prise en charge thérapeutique est très limitée (aucun traitement préventif recommandé et un seul médicament modérément recommandé pour les douleurs associées). Des travaux récents ont mis en évidence l’activation de processus inflammatoires sur des modèles animaux de neuropathies périphériques chimio-induites, avec notamment des modifications de la concentration de marqueurs sanguins pro- ou anti-inflammatoires chez des rats exposés à des anticancéreux neurotoxiques. Ces perturbations ouvrent la piste de la neuroinflammation dans le contexte de ce type de neuropathie. La neuroinflammation et le système immunitaire sont des pistes particulièrement explorées aujourd’hui dans le contexte de la douleur neuropathique contribuant à son maintien au cours du temps, et représentant de nouvelles cibles thérapeutiques. Une nouvelle molécule ciblant ces processus neuro-inflammatoires représenterait un candidat médicament intéressant. De plus cette molécule a déjà été testée dans le contexte de la douleur chez la souris et du cancer chez le rat, et représente ainsi un ligand particulièrement intéressant pour évaluer le rôle du système immunitaire dans le contexte de la douleur neuropathique. L’objectif du projet sera de mesurer l’effet préventif et analgésique de cette molécule chez l’animal vivant (modèles de neuropathies périphériques chimio-induites).

Bénéfices attendus

Ce projet propose d’étudier de nouvelles cibles de traitement des neuropathies périphériques chimio-induites chez l'animal ciblant la neuroinflammation. Rappelons qu’à ce jour la prise en charge de ces neuropathies chez les patients est très limitée, avec aucune stratégie préventive recommandée et un seul médicament modérément recommandé pour le traitement des douleurs neuropathiques associées. Ainsi ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement et de prévention des neuropathies périphériques chimio-induites.

Procédures

Tous les animaux recevront des injections d’anticancéreux. Le nombre total d’injections sera de 8 sur 25 jours pour deux modèles animaux et de 5 sur 9 jours pour un autre modèle animal, par voie intraveineuse, et durée des injections de 10 secondes (max). Tous les animaux recevront des gavages oraux quotidien de la molécule à l’étude pour une évaluation des effets préventifs (20 gavages sur 25 jours pour deux modèles animaux, et 8 gavages sur 9 jours pour un modèle animal), et pour une évaluation des effets analgésiques (3 gavages sur 3 jours pour tous les animaux). Tous les animaux seront suivis par des tests comportementaux hebdomadaires et jusqu’à la fin des injections. Les tests comportementaux dureront au maximum 60 minutes pour un animal.

Impact sur les animaux

La neuropathie induite par les anticancéreux sera associée à des douleurs modérées de type allodynie (stimulus non douloureux chez l'animal sain, ex : sensibilité tactile et thermique). Les administrations répétées d’anticancéreux seront responsables d’une diminution du gain de poids des animaux par rapport aux animaux contrôles. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille (voir annexe), et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des études afin d’effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Ce type d'étude sur modèle animal de neuropathie périphérique chimio-induite n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. Des travaux sont en cours sur cellules souches humaines de neurones ou organoïdes. Mais ces modèles in vitro ne permettent pas encore d'appréhender la complexité de la physiopathologie de ces neuropathies, qui n'est-elle même pas encore complètement élucidée. Enfin, s'agissant d'une étude sur la douleur neuropathique, l'animal vivant est encore nécessaire pour explorer, évaluer et valider les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire pour ce projet sera réduit au minimum. Généralement nous travaillons avec des groupes de n=12 animaux. Dans ce type d'étude exploratoire, il est difficile de réduire le nombre d'animaux au risque de ne pas pouvoir conclure (perte du bénéfice de l'étude et utilisation inutile des animaux). L'approche statistique reposera sur une méthodologie en bloc d'animaux (n=12). Cet effectif tiendra compte de la variance des paramètres étudiés et de la puissance des tests statistiques. Avec ces effectifs, sur les tests comportementaux, des tailles d’effet importantes supérieures à 1 sont attendues (différence des moyennes entre les groupes de l’ordre de 20 points pour un écart-type de 10), assurant une bonne qualité des résultats.

Raffinement

Les tests comportementaux utilisés dans ce projet sont eux aussi bien maitrisés par le personnel technique de notre unité de recherche. Les troubles nociceptifs seront explorés chez l’animal au moyen de tests comportementaux mesurant les seuils d’allodynie tactile ou thermique (stimulus non douloureux perçu comme douloureux), plutôt que des seuils d’hyperalgésie (stimulus douloureux). L’allodynie est un symptôme plus proche de la clinique humaine, et offre une démarche de raffinement et éthique vis-à-vis de l’animal de laboratoire (stimulation nociceptive moins intense). Les animaux seront stabulés dans des conditions standards de 3 animaux par cage (800 cm²), dans une salle climatisée (température 22+/-2°C et hygrométrie 50+/-10%) avec un cycle 12:12 et un libre accès à la boisson et à la nourriture. Pour chaque animal, les points limites seront contrôlés à l’aide d’une grille, et explorant : diarrhée, pâleur des extrémités, déshydratations, point d’injection, perte de poids par rapport à la dernière mesure, yeux, pelage, activité spontanée, et locomotion. Selon le score obtenu par l’animal (points limites), l’animal sera retiré du projet pour une euthanasie rapide par inhalation de CO2.

Choix des espèces

Le rat Sprague-Dawley est habituellement utilisé pour ces travaux portant sur les neuropathies périphériques chimio-induites. D’autres travaux de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures. Enfin, le rat Sprague-Dawley possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux. Les animaux seront agés de 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 6-9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. A noter que des animaux plus âgés (voire « âgés ») pourraient être pertinents car mieux corrélés à la clinique humaine (cancer = maladie du sénior), mais ces animaux âgés ont un coût important et sont rarement utilisés dans la littérature scientifique.

144 souris vont être utilisées, chacune subissant deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, seize prises de sang, dix pesées, quatre jeûnes et 48 heures seule en cage calorimétrique. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après dix semaines d'un régime qui les rend obèses. La question posée est de savoir si une carence en vitamine D chez le père modifie le métabolisme de sa descendance, l'application annoncée étant d'émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer. Le porteur décrit une grille de points limites et un arbre décisionnel, puis ajoute qu'aucune analgésie n'est prévue pendant le protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la carence en vitamine D chez la souris génitrice mâle, sur les trajectoires métaboliques de sa descendance. 9 animaux mâles et 9 femelles issues des géniteurs carencés ou non en vitamine D durant 5 ou 10 semaines seront soumis à un régime contrôle ou un régime obésogène durant 10 semaines. L'évolution pondérale des animaux sera mesurée. Des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés ainsi que des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Enfin une mesure de la dépense énergétique sera réalisée par calorimétrie indirecte. Les animaux seront mis à mort afin de mesurer les niveaux d'expression de différents gènes en lien avec la vitamine D. De plus les mécanismes permettant d'expliquer le passage des effets de la carence paternelle à la descendance seront étudiés.

Bénéfices attendus

Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l’impact d’une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces nécessitant de les héberger individuellement pendant un maximum d'une heure, suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile. A 7 semaines les animaux passeront en cage calorimétriques durant 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. Ce procédé nécessite d'héberger individuellement les animaux pendant 48 heures dans une cage dotée de capteurs permettant de suivre la position de la souris dans la cage, mesurer la nourriture consommée ainsi que les échanges gazeux au sein de la cage. Une fois à 8 semaines de régime les animaux seront soumis à un unique test de tolérance à l'insuline, cette procédure nécessite un hébergement individuel d'environ 2 heures. Durant cette période les animaux recevront une injection d'insuline suivie de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). A 9 semaines à un unique test de tolérance au glucose, ces procédures nécessitent un hébergement individuel d'environ 2 heures, durant ces périodes les animaux recevront un gavage de glucose (durée de la procédure de gavage: 1 minute) suivi de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole. En regroupant les interventions. Les animaux subiront chacun : deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, quatre hébergements individuels (dont trois de moins de deux heures et un de 48h), 16 prises de sang (dont 14 sont des très faibles quantités réalisées pour mesure de glycémie à l'aide d'un glucomètre), 10 pesées (réalisées hebdomadairement) et un régime obésogène.

Impact sur les animaux

Les animaux seront maintenus en hébergement individuel lors des recueils de fèces ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Des prélèvements de sang seront réalisés à la veine caudale (une seule incision mais 7 ponctions, ce qui peut constituer une source de douleur légère et une source de stress modérée, nuisance de gravité modérée, courte durée). L'injection d'insuline intrapéritonéale peut constituer une source de stress et de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Le gavage de glucose peut constituer une source de stress et éventuellement être une source de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). L'induction de l'anesthésie peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Les animaux seront mis à jeûn à quatre reprises, pour à chaque fois une durée de moins de douze heures, ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, durée modérée). Des animaux seront soumis à un régime obésogène répondant à tous leurs besoins nutritionnels susceptible d'entraîner des anomalies cliniques légères (nuisance de gravité légère, durée longue). Enfin, les animaux seront maintenus en hébergement individuel pendant 48 heures lors des mesures en cage calorimétrique, ce qui peut constituer une source de stress de longue durée (nuisance de gravité modérée, durée longue)

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d’intérêt qui seront ensuite analysés.

Remplacement

Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l’impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l’homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d'une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu'il n’est pas possible de reproduire in vitro.

Réduction

Le nombre d’animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de student, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l’environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l’application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Le regime débutera à 6 semaines de vie et sera administré durant 10 semaines. Les différentes procédures seront réalisées durant cette période de 10 semaines de régime. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur pancréas, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour supprimer les cellules non-β de leurs îlots pancréatiques, elles reçoivent trois injections espacées de 48 heures, avant deux tests de tolérance au glucose de deux à six heures chacun : incision de la queue sous anesthésie, injection de glucose, sept à dix microprélèvements de sang, quatre prises de sang plus importantes, et pour certains lots un gavage lipidique. L'objectif est de mesurer ce que ces cellules apportent à la régulation de la glycémie, une question dont le porteur reconnaît qu'elle a été peu explorée. Il écrit travailler par ailleurs sur un simulateur de l'homéostasie glucidique que les données tirées de ces 400 souris viendront enrichir, "afin de réduire encore le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur l’homéostasie nutritionnelle à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).

Bénéfices attendus

Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules. Les principales cellules des îlots sécrétant l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir inactiver les cellules ne produisant pas l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types de cellules. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.

Procédures

Pour induire le phénotype recherché, les animaux recevrons 3 injections (10 secondes par injection) espacées de 48h. Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 2 semaines d’écart (durée du test de 2 à 6h) : une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie, s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 7 à 10 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 4 prélèvements (30 à 60 secondes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 30min à 1h). Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après l’injection de glucose).

Impact sur les animaux

Des souris de ce type sont actuellement en élevage dans un autre laboratoire. En dehors d’une diminution de poids légère et transitoire (1-2 semaines maximum) après la suppression des cellules des îlots qui ne sécrètent pas l’insuline, aucun effet délétère n’a été recensé chez ces animaux. Dans de très rares cas, il peut arriver, malgré les soins post-expérimentaux que la queue cicatrise mal après les prélèvements de sang. Il peut aussi arriver extrêmement rarement, lors de l’injection de toucher un organe entrainant la mort de l’animal.

Devenir

A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.

Remplacement

Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non-β des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Une pré-étude a été réalisée antérieurement dans un autre laboratoire sur ces animaux montrant sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courant largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, le choix des animaux contrôles (témoins) produits permettra de diviser par 2 le nombre total d’animaux à produire. Nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore de 90 notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs îlots pancréatiques pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 400 animaux maximum (au lieu de 900 si les mesures précédentes n’étaient pas appliquées) seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisé assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).

Raffinement

Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 2-3 fois par semaine et tous les jours durant la semaine suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mis à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant injection, expérimentation. Si ce n’était pas le cas après 48h, ce qui n’est encore jamais arrivé lors des précédentes études avec le même type d’induction de phénotype, les mesures graduées et points limites habituels associées de l’animalerie seront appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non sécrétrices d’insuline dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte mâle, de 12 à 22 semaines. Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes de micro-organes in-vitro sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’équilibre nutritionnel des mammifères impliquant de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, reins…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère adulte vivant.