Recherche fondamentale

Vingt-quatre gavages, deux séances de contention forcée de deux heures, un puçage, une prise de sang : chaque souris passe par cette série avant d'être tuée pour l'étude de ses tissus. 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole teste par voie orale des métabolites bactériens dans un modèle murin de syndrome de l'intestin irritable, en mesurant la perméabilité intestinale, l'inflammation et la sensibilité viscérale, avec une priorité donnée aux femelles. Le porteur annonce deux séries de tests anxiodépressifs de deux heures sans préciser lesquels, et écrit attendre de l'administration du métabolite qu'elle "exacerbe" les altérations intestinales du modèle.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de tester in vivo (par administration orale) la capacité de ces métabolites bactériens à moduler les fonctions de l’intestin dans un modèle murin de SII. Plus particulièrement, nous évaluerons leurs effets sur (i) la perméabilité intestinale, (ii) l’inflammation, (iii) le stress oxydant, (iv) la viscéro-sensibilité et (v) la motricité intestinale. L’impact de ces métabolites sur la composition du microbiote sera également étudié dans les deux sexes. Le SII étant à prédominance féminine, la priorisation de nos études se portera sur les souris femelles. Les souris mâles seront également utilisées pour nous permettre de comparer l’effet sexe dans ce modèle murin de SII.

Bénéfices attendus

Nous anticipons que l’administration de ce métabolite exacerbera les altérations de l’homéostasie intestinale rencontré dans ce modèle murin. Ces travaux pourront conduire à la mise en place d’études ultérieures utilisant des probiotiques spécifiques capables de métaboliser/utiliser ces métabolites délétère et in fine réduire l’abondance de ces métabolites

Procédures

Les souris seront sujets aux interventions suivantes : 1- Puçage, 1 fois, 5 min/souris. 2- Gavages oraux, 24 fois, 5 secondes/souris 3- Stress de contention, 2 fois, 2h/souris 4- Tests anxiodépressifs, 2 fois, 2h/souris 5- Prise de sang, 1 fois, 1min/souris 6- Mise à mort, 1 fois, 2 secondes/souris

Impact sur les animaux

Les procédures impliquent l’administration orale récurrente de plusieurs substances afin de déclencher des effets cliniques modérés (troubles fonctionnels intestinaux). Pour cette raison, ces procédures sont classées dans la catégorie modérée. Le stress étant une composante indéniable dans la physiopathologie du SII, 2 séries de stress seront réalisés avec un délai suffisant pour une récupération maximale. Les animaux seront acclimatés aux pièces d’hébergement et manipulés fréquemment. Les études utilisant ce modèle murin de SII ne mentionnent pas de mortalité particulière mais la souffrance animale sera évaluée quotidiennement.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée par la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet.

Remplacement

Le syndrome de l’intestin irritable implique de nombreux acteurs cellulaires dont le fonctionnement ou le métabolisme est altéré. En exemple, les cellules épithéliales intestinales (colonocytes, cellules muqueuses caliciformes, cellules L enteroendocrines), les cellules immunitaires intestinales (mastocytes et lymphocytes), les cellules nerveuses intestinales (cholinergiques) et les bactéries du microbiote intestinal. Le recours à l'expérimentation animale est de fait nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie du SII et intégrer la dérégulation globale de tous ces acteurs. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques sont menées actuellement sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies régulant la fonction de barrière intestinale, l’inflammation, le stress oxydant et les fonctions neuroendocrines. Nous possédons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales pouvant modéliser ces nombreux acteurs. Ces lignées ont été spécifiquement achetées grâce à des financements antérieurs. Nous possédons aussi l’expertise de la technique de co-culture sur inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire. Ces outils in vitro sont indispensables car ils nous permettent de sélectionner les métabolites bactériens les plus intéressants à tester chez l’animal parmi la quinzaine que nous avons pu identifier dans la littérature.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, l'effectif a été évalué par l'utilisation de tests statistiques. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0.00%. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Le protocole est optimisé de manière à réduire de manière significative l’utilisation importante d’animaux dans ce projet.

Raffinement

D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (coton pour le nid, maisons en carton, balles, tunnels, différents types de litière, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une évaluation du bien-être de l’animal sera réalisée quotidiennement à l’aide du score de la « Mouse Grimace Scale » et les animaux recevront une injection d'analgésique adaptée pour prendre en charge la douleur si besoin. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. En situation de douleur persistante, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier le dialogue altéré entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau dans le contexte du SII. Le recours à des modèles animaux est de fait indispensable pour (i) mieux comprendre l’influence bénéfique ou délétère de métabolites fécaux sur les animaux, et (ii) Identifier les effets sexe-dépendants en présence de ces métabolites. Le modèle murin est communément utilisé dans notre unité pour étudier les troubles fonctionnels intestinaux associés à d’autres pathologies comme l’obésité (alimentation riche en lipide) ou encore l’anorexie mentale (anorexie basée sur l’activité). La souche choisie de nos souris a un taux de réponse élevé à ces troubles par rapport à d'autres espèces animales voire d'autres souches. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie également par les quantités et le coût des métabolites administrés. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront livrées à l’animalerie centrale à leur septième semaine de vie pour un début de protocole à 9 semaines. À ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux aux différents protocoles qui induisent des troubles fonctionnels intestinaux sans mortalité particulière

Capturées au début de leur migration en eau douce, anesthésiées puis opérées moins de cinq minutes pour recevoir un émetteur radio dans la cavité générale, des lamproies marines adultes restent en vivier jusqu'à retrouver équilibre, respiration régulière et nage active. 50 lamproies, des poissons d'une espèce classée en danger en France, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour savoir où elles se reproduisent et ce qui peut les bloquer en chemin. Le porteur table sur un taux de prédation de 80 % par le silure, d'après la littérature, si bien qu'une dizaine seulement pourraient atteindre les frayères. Toutes sont relâchées dans la rivière, et les émetteurs sont récupérés après leur mort, au plus tard à la mi-juillet 2025, l'espèce mourant après sa reproduction.

Objectifs

La lamproie marine est une espèce menacée en déclin en Europe et en particulier en France. Le manque de connaissance sur leur écologie limite les actions de gestion. On n’observe généralement plus (ou moins) de frayères en amont des bassins versants malgré la présence d’individus à l’aval, observés par comptages au niveau de stations de contrôle. Le premier objectif de ce projet est de déterminer s’il existe des sites de reproduction sur des sites inconnus, potentiellement en eau profonde où les prospections classiques à pied ou en embarcation ne sont pas possibles. Le second objectif est de vérifier si les individus dénombrés aux stations de contrôle parviennent sur des sites de reproduction et quels sont les points bloquants si des difficultés sont rencontrées.

Bénéfices attendus

Les populations de lamproie marine connaissent un fort déclin actuellement et les informations sur leur cycle de vie manquent pour prendre des mesures de conservation adaptées. Un des principaux bénéfices du projet est de connaître le devenir des individus en amont d’un bassin versant. A l’heure actuelle, les sites de reproduction des individus franchissant le barrage demeurent incertains, car on ne les observe plus ou très rarement sur les frayères historiques. Selon une première hypothèse, les individus pourraient se reproduire en milieu plus profond, en aval du bassin versant (secteurs impossible à prospecter à l’œil nu). Une autre hypothèse émise est que les individus ne parviennent plus aux sites de frai et meurent sans s’être reproduits. Des points de blocages pourraient ainsi être identifiés. La prédation par le silure a récemment été montrée. L’espèce étant largement présente sur le bassin étudié, il est vraisemblable que les lamproies soient également prédatées sur ce bassin. Mieux connaître la migration et les sites de reproduction permettra d’adapter au mieux les mesures de gestion de l’espèce.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule opération chirurgicale visant à l'introduction dans la cavité générale de matériel scientifique (radioémetteur). Cette opération durera moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

L’étude implique l’insertion par chirurgie de l’émetteur radio réalisée sous anesthésie. Les nuisances potentielles (douleurs, saignements, infection) sont limitées par l'utilisation de mesures prophylactiques et des traitements médicamenteux (antibiotique et antalgique) adaptés et définis avec la collaboration d'un vétérinaire spécialisé. Cette intervention est considérée comme "modérée". Les individus choisis auront un poids qui leur permettra de supporter l'insertion du matériel scientifique. Ce dernier ne dépassera pas 2% du poids de l'animal comme recommandé dans la littérature.

Devenir

L'observation s'effectue dans le milieu naturel : a l'issue de la procédure expérimentale (insertion d'un radioémetteur), les animaux sont relâchés dans le cours d'eau. Les lamproies meurent naturellement à l’issue de la reproduction (espèce sémelpare), soit au maximum à la mi-juillet 2025 pour les individus marqués. Les émetteurs seront récupérés après la mort.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de connaître le comportement de migration et de reproduction de la lamproie marine en milieu naturel. Il n’est donc pas possible de remplacer l’espèce par un autre modèle d’étude ou par des alternatives non animales.

Réduction

L’effectif prévu est de 50 individus. Ce nombre est l’effectif minimal d’individus pour obtenir une vision représentative des différents comportements individuels sur les sites de reproduction et du taux de prédation par le silure sans toutefois impliquer une fraction importante de la population si l’on se base sur les effectifs comptés ces 3 dernières années. En tablant sur un taux de prédation de 80% sur les individus marqués, comme documenté dans la littérature, une dizaine d’individus pourraient atteindre les sites de reproduction. Une expérience sur un autre cours d’eau mettant en œuvre un protocole de marquage identique a montré que la mortalité liée au marquage est limitée. Les émetteurs seront récupérés après la mort des individus, pour récupérer les données enregistrées.

Raffinement

Les principales mesures de raffinement concernent la limitation des nuisances (angoisse et douleur) lors de la manipulation des animaux avant, pendant et après la chirurgie et la limitation des risques d'infection post-opératoire. La combinaison d'utilisation de produits anesthésiques de concentration adaptée (1- concentration pour l'anesthésie pré-opératoire et 2- pour le maintien de l'anesthésie pendant l'opération) et d'antalgiques limitent directement l'angoisse et la douleur pendant et après l'opération, et l'administration d'antibiotiques limite les risques d'infections liés à l'opération. Les mesures prophylactiques classiques (désinfection du matériel) limitent également les sources d'infection pouvant induire des nuisances post-opératoires. Les opérations de chirurgie seront effectuées par du personnel habilité et spécifiquement formé par un vétérinaire. Le protocole opératoire est co-construit avec un vétérinaire. Les conditions environnementales d'importance première pour les poissons (température et oxygénation de l'eau) seront contrôlées avant, pendant et après la capture et l'opération. Les individus seront placés dans un vivier et, après une période d’observation jusqu’à la reprise d’équilibre, d’un rythme de ventilation régulier et de nage active, ils seront relâchés dans la rivière.

Choix des espèces

L’espèce ciblée, la lamproie marine, est une espèce en classée en danger (EN) par l’UICN en France et dont les effectifs sont en constante diminution ces dernières années. Il est donc nécessaire d’acquérir des connaissances sur son comportement de reproduction et sur les menaces/contraintes que l’espèce est susceptible de rencontrer au cours de sa migration et de sa reproduction. Ces informations sont cruciales pour prendre les mesures de gestion et de conservation appropriées. Les individus utilisés seront des adultes capturés juste avant leur maturité (caractères sexuels secondaires encore non visibles), en début de période de migration en eau douce. C’est à ce stade que la migration de montaison a lieu, et durant laquelle les individus sont exposés à de multiples pressions qu’il est nécessaire de mieux caractériser (obstacles et prédation notamment).

Gavées chaque jour pendant 75 jours, soumises à quatorze prélèvements de fèces de vingt minutes chacun, puis à un test de tolérance au glucose de trois heures, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses et en sucres qui leur est imposé doit provoquer l'obésité, avec une mobilité réduite et un risque de dermatites et d'ulcérations cutanées. Le porteur signale aussi un risque de lésion de l'œsophage lié au gavage quotidien, et annonce deux tests d'évaluation de l'anxiété de vingt minutes sans préciser lesquels. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever l'intestin, le foie et le cerveau, afin de mesurer l'effet de probiotiques et de prébiotiques sur le microbiote intestinal.

Objectifs

L'épidémie d'obésité qui sévit à travers le monde (15,7 % des Français sont considérés obèses) est liée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Au cours des dernières décennies, la recherche s’est tournée vers l’analyse du microbiote intestinal et de nombreuses publications ont démontré un rôle important de la dysbiose microbienne dans le développement des maladies métaboliques et inflammatoires. 38 000 milliards de bactéries vivent dans le microbiote et interagissent avec l'hôte, ce qui équivaut à plus de 100 fois le nombre de cellules de l'organisme humain. D'après l'ISAPP, l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics : " Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte". "Les prébiotiques sont des substrats qui sont utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte, conférant un bénéfice pour la santé." Les prébiotiques et les probiotiques jouent des rôles complémentaires importants pour la santé intestinale. Il a été prouvé par plusieurs études que les probiotiques et les prébiotiques ont un rôle essentiel dans la gestion de l'obésité. Les probiotiques et les prébiotiques ont amélioré les niveaux de leptine et d'enzymes hépatiques liés à l'obésité. Les probiotiques et prébiotiques agissent en supprimant l'inflammation, en renforçant la barrière intestinale, en régulant l'activité des enzymes intestinales et la fonction neuroendocrine, affectant ainsi le stockage et la dépense énergétique. L'impact des modifications au niveau du microbiote peut agir directement sur l'axe intestin-cerveau. L'objectif de notre projet est de mettre en lumière l'importance de nouveaux probiotiques et des prébiotiques en tant que stratégie complémentaire pour traiter l'obésité, en agissant sur le microbiote intestinal, l'homéostasie intestinale ainsi que l'axe intestin-cerveau.

Bénéfices attendus

Pour évaluer l'efficacité des probiotiques ou des prébiotiques contre l'obésité en analysant les modulations du microbiote intestinal, il est impératif d'utiliser un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro ne peut remplacer la richesse du microbiote intestinal. A travers ce modèle, on peut tirer plusieurs bénéfices tels que : 1-Trouver des prébiotiques et probiotiques capables de réduire l'obésité chez la souris. 2-Observer une diminution des biomarqueurs liés à l'obésité. 3-Mettre en évidence des changements bénéfiques dans la composition du microbiote intestinal, avec une augmentation de l'abondance relative des bactéries bénéfiques. 4- Etudier l'impact des traitements sur l'axe intestin-cerveau. Nous espérons ainsi démontrer l'efficacité des prébiotiques et ainsi que des probiotiques pour la perte de poids et la normalisation de certains paramètres métaboliques tout en décryptant les mécanismes potentiels par lesquels les probiotiques et prébiotiques peuvent influencer la composition corporelle et le métabolisme.

Procédures

Gavages quotidien pendant 75 jours, qui dure moins de 30 seconde par souris. Prises de feces 14 fois pendant le protocole qui dure 20 min par prise. Test de tolérance au glucose, réalisé une seule fois et qui dure 3h avec une seule injection d'insuline. Test de tolérance à réalisé une seule fois pendant le protocole, avec une seule injection d'insuline. Deux tests d'évalution de l'anxiété chaque test dure 20 minutes par souris.

Impact sur les animaux

1 Le stress causé par le gavage quotidien, ainsi que le risque d'endommager l'œsophage. 2 Lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline , les injections peuvent entraîner de la douleur et de l'inconfort. Il est possible que ces procédures provoquent de l'irritation péritonéale. 3 L'obésité est le résultat d'une prise de poids excessive causée par un régime riche en graisses et en sucres. Cela va provoquer : • Une diminution de la mobilité due à un excès de poids. L'excès de sébum accroît le risque de lésions cutanées telles que les dermatites et les ulcérations.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser les différentes analyses sur les organes tels que l'intestin, foie et cerveaux.

Remplacement

On a effectué une phase in vitro. L'impact des prébiotiques ainsi que de nouvelles souches potentiellement probiotiques a été testé in vitro. En analysant le spectre antimicrobien, la résistance aux enzymes, le pH et l'impact sur des cellules in vitro, on peut évaluer leurs effets anti-inflammatoires. En effectuant cette étape, on peut réduire le nombre de prébiotiques et de probiotiques utilisés pour la partie in vivo. Seuls les candidats ayant un impact sur la flore, une diminution de l'inflammation et une réduction de l'oxydation seront utilisés pour la partie in vivo. D’autre part, l'étude du microbiote intestinal nécessite obligatoirement l'utilisation d'un modèle animal puisqu'il est impossible de reproduire, in vivo , la structure écologique, constituée par des milliards de bactéries représentant 1000 espèces bactériennes majoritairement incultivables.

Réduction

Pour optimiser le nombre d'animaux nécessaires, on utilise les analyses statistiques standards. Il y aura que 8 animaux dans chaque groupe expérimental. Le nombre d’animaux a été optimisé via des méthodes statistiques standards. Dans le contexte de l'expérimentation animale, l'utilisation de tests statistiques appropriés peut contribuer à réduire le nombre d'animaux requis, tout en maintenant la validité scientifique de l'étude.

Raffinement

Amelioration de l'enrichissement par:. 1. Cylindres en plastiques : Ces cylindres offriront aux souris des possibilités supplémentaires d'exploration et de cachette, stimulant ainsi leur comportement naturel. 2. Bâtonnets à ronger : Ces bâtonnets permettront aux souris de satisfaire leur besoin naturel de ronger, contribuant à leur bien-être dentaire et comportemental. 3. Matériel de nidification supplémentaire : Nous fournirons des morceaux de coton supplémentaires pour permettre aux souris de construire des nids plus élaborés. Pour réduire le stress des animaux lors des manipulations, nous mettrons en place un protocole de pré-entraînement qui comprendra les étapes suivantes : 1. Habituation à la manipulation : Nous manipulerons doucement les souris pendant de courtes périodes (30 secondes à 1 minute) pendant la semaine précédant le début des procédures expérimentales. Cela permettra aux animaux de s'habituer au contact humain. 2. Simulation de procédures : Nous simulerons certaines procédures non invasives, comme le pesage ou le placement dans la cage de gavage, sans effectuer réellement ces procédures. Cela aidera les souris à se familiariser avec ces situations. 3. Exposition progressive aux équipements : Nous introduirons progressivement les équipements utilisés lors des procédures (comme les sondes de gavage) dans l'environnement des souris, sans les utiliser, pour réduire leur caractère anxiogène. Pour améliorer les conditions de vie des animaux en captivité et réduire les sources de stress, nous mettrons en place les mesures suivantes : 1. Surveillance documentée pendant les procédures expérimentales : • Mise en place de fiches de suivi individuelles pour chaque animal • Observation et enregistrement des signes spécifiques : • Poids • Présence de lésions cutanées • Comportement (isolement, posture inhabituelle, piloérection) • Consommation d'eau et de nourriture • Qualité du pelage • Mobilité 2. Protocole d'action en cas de détection de signes de détresse ou de malaise : • Consultation immédiate du vétérinaire responsable • Administration d'analgésiques si nécessaire • Ajustement des conditions d'hébergement (ex : isolation temporaire, enrichissement supplémentaire)

Choix des espèces

Les études sont réalisées sur des souris car il s’agit du modèle expérimental chez l’animal le plus utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des effets induits par l'obésité en modèle riche en gras et sucres. La souris est un modèle remarquable pour étudier l'obésité, les animaux qui développent une inflammation et une résistance à l'insuline. En outre, nous avons mis au point tous les outils et techniques nécessaires pour mener à bien cette étude lors de nos travaux antérieurs sur ce modèle Le début des traitements à 6 semaines coincide avec le début de maturation de la flore intestinale.

Une greffe de tumeur sous la peau puis huit injections dans l'abdomen : 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour les analyses histologiques et la mesure de la progression tumorale. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids. Il s'agit de tester un anticorps dirigé contre une protéine appelée LVRF sur des tumeurs de médulloblastome, cancer cérébral de l'enfant, l'effectif de chaque groupe étant calé pour obtenir 80 % de chances d'un résultat statistiquement significatif. Les souris appartiennent à des lignées immunodéficientes, retenues parce qu'elles laissent se développer des cellules humaines greffées, et le porteur affirme qu'aucun système ne reproduit aujourd'hui la complexité du médulloblastome hors de l'animal vivant.

Objectifs

L’objectif est de tester in vivo l'efficacité d’un anticorps (anti-LVRF) sur la progression de tumeurs de médulloblastome. La validation in vivo de l'efficacité de ce composé sur le développement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Bénéfices attendus

Les médulloblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes chez les enfants. Ils représentent 20% des tumeurs du système nerveux central chez l'enfant. Malgré les traitements standards (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie), la plupart des patients récidivent. Le taux de survie à 5 ans varie de 80% à 50%. Il est donc important de proposer aux patients de nouveaux traitements médicamenteux pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement ciblant la protéine LVRF permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.

Procédures

Les 40 animaux recevront une greffe sous-cutanée de cellules tumorales de médulloblastome (une seule intervention de 1 minute environ). Chaque animal recevra également un total de 8 administrations par voie intra-péritonéale (30 secondes/administration).

Impact sur les animaux

La manipulation, contention des animaux, les injections de cellules, d'anesthésiques ou d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. Le développement tumoral est susceptible d'entraîner une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, pour les analyses histologiques ou de progression tumorale.

Remplacement

L'efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale des médulloblastomes nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des médulloblastomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux prévu dans chaque groupe est basé sur un calcul d'effectif permettant de prédire que nous avons 80% de chance d’obtenir un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal. Pour le bien- être de l'animal, les souris seront logées selon les normes requises avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Les cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée.

Choix des espèces

Le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de médulloblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 5 semaines et utilisées à l’âge de 6 semaines, en accord avec les protocoles décrits pour ces modèles physiopathologiques.

1 298 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie pour prélever leur moelle osseuse. Trois injections sous-cutanées hebdomadaires d'un médicament dont un effet secondaire connu est la fibrose médullaire, ou une injection unique d'un anticancéreux qui détruit la moelle, servent à abîmer le tissu avant l'expérience proprement dite : une injection rétro-orbitale de colorant ou de cellules à greffer, sous anesthésie maintenue jusqu'à la mise à mort, quarante-cinq minutes plus tard au maximum. La question posée porte sur la perméabilité des vaisseaux de la moelle osseuse, avec l'espoir à terme de mieux réussir les greffes ou de freiner les métastases osseuses. Le porteur écrit que ces expériences sur animal vivant sont "irremplaçables", faute de modèle in vitro reproduisant la complexité de la moelle.

Objectifs

Nous nous intéressons à la barrière sang-moelle osseuse formée par les microvaisseaux de la moelle osseuse, le site unique d’entrée dans la circulation de toutes les cellules sanguines et le site d’entrée des cellules souches lors de greffes de moelle osseuse. Il n'existe à l'heure actuelle aucun médicament pour contrôler la perméabilité et les mécanismes de sa régulation n'ont pas été étudiés. Il est particulièrement important d’entreprendre ces études car différentes pathologies sont susceptibles de modifier la fonction de barrière des vaisseaux sinusoïdes. C'est le cas lors de cancers de la moelle osseuse, et également généralement lors des traitements chimiothérapeutiques des cancers solides. Les objectifs globaux du projet sont de comprendre comment est régulée la perméabilité de cette barrière vis-à-vis des molécules et des cellules. Nous étudierons cet aspect chez la souris saine et après avoir induit des modifications du tissu médullaire à l'aide de traitements actuellement utilisés chez l'homme. La perméabilité aux molécules sera évaluée par la mise en place de modèles d’injection de colorant puis observation après mise à mort des souris et analyse des tissus. La perméabilité aux cellules sera évaluée après greffe de cellules souches (prise de greffe). Nous avons déjà objectivé des acteurs potentiellement importants et pour les étudier nous disposons de souris génétiquement modifiées pour ces protéines et chercherons à évaluer la perméabilité de leurs vaisseaux sinusoïdes, en comparaison avec les souris contrôles appropriées.

Bénéfices attendus

Les bénéfices à terme visent d’une part les patients développant une fibrose de la moelle ou traités par chimiothérapie, avec la possibilité, une fois la connaissance acquise sur les mécanismes, de pouvoir favoriser ou freiner le passage des cellules sanguines à travers la barrière. Un autre bénéfice important vise cette fois l'entrée de cellules dans la moelle. En comprenant le comportement de cette barrière, on pourra envisager de la moduler pour par ex. accélérer/améliorer la prise de greffe de moelle, ou à l’inverse freiner l’entrée de cellules tumorales pour diminuer les métastases osseuses.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de substances induisant des modifications du tissu médullaire. La fibrose est induite par injection sous-cutanée (SC) (durée 3 secondes), 1 fois par semaine, pendant 3 semaines (3 interventions), d'un médicament autorisé pour relever la numération plaquettaire chez des patients thrombopéniques et qui a pour effet secondaire d'entrainer des myélofibroses. La chimiothérapie est mimée par injection unique (une intervention) en intra-péritonéale (IP) (durée 3 secondes) sur souris vigile, d'un médicament utilisé dans le traitement des cancers et ayant pour effet secondaire d'entrainer une myélosuppression transitoire. Puis les souris seront soumises à une intervention unique consistant en une anesthésie générale (injection unique d'anesthésiant, 3 secondes). Ensuite, une seule injection, soit de colorant, soit de cellules à greffer, sera effectuée sur les souris toujours sous anesthésie générale, en RO (durée 3 secondes) et l'anesthésie est prolongée jusqu'à la mise à mort des souris (au maximum 45 minutes après l'injection des colorants ou cellules).

Impact sur les animaux

D’après notre expérience, les traitements sont susceptible d'entrainer une modification modérée et transitoire de la numération sanguine. Les souris sont susceptibles d’être stressées du fait de l’induction de l’anesthésie générale ou de la contention. L'injection IP entrainera une probable douleur passagère au point d’injection.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux sont mis à mort pour prélever les tissus d'intérêt et pouvoir analyser la capacité de perméabilité vasculaire des vaisseaux, selon les conditions

Remplacement

La moelle est l'un des tissus les plus complexe de l'organisme de par la grande diversité de cellules qui le compose, du réseau microvasculaire extrêmement dense, ainsi que toutes les interrelations biochimiques entre cellules dont nous ne connaissons encore pas grand chose. De ce fait, des expériences sur animal vivant sont irremplaçables car il n'existe pas actuellement de modèles in vitro mimant cette complexité. En outre, nous utilisons des modèles de souris inactivées pour des protéines ou mimant une mutation humaine.

Réduction

Les méthodes pour visualiser la perméabilité vasculaire sont bien décrites dans la littérature et nous nous y réfèrerons concernant les doses à injecter. Néanmoins, pour l'un des colorant qui n’a pas été testé dans la moelle, nous prévoyons des études pilotes pour définir les doses à utiliser et ainsi éviter de multiplier les expériences pour pouvoir réduire au final le nombre d'animaux. Pour toutes nos expériences, nous avons utilisé des tests statistiques adaptés pour déterminer un nombre d’animaux qui nous permettra d’atteindre l’objectif de votre projet. Lorsque c’est possible, une série de traitement sera utilisée pour différents types d’analyses, afin de réduire le nombre d'animaux.

Raffinement

Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués : - Par l’hébergement en groupes sociaux. Les cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui permet aux souris d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 3 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. - Par l'habituation à la contention pour les procédure qui sont répétées, et la distribution de nourriture en gel apétente après chaque geste comme récompense.- Par une anesthésie générale de l’animal avant l’injection des colorants ou cellules, et l’application de collyre avant injection rétro-orbitale, lorsque la souris est anesthésiée, et maintien de l’anesthésie après injection durant le temps de circulation du colorant ou des cellules greffées, au maximum 45 min. - Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant les anesthésies, et l'application de gel hydratant sur les yeux. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites, s'ils sont atteints, permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car nous disposont de souris génétiquement modifiées avec inactivations de gènes ou reproduisant des mutations humaines. Les animaux seront utilisés au stade jeune adulte, entre 8 et 18 semaines, ceci afin d'éviter des modifications de la moelle liées au vieillissement qui pourraient augmenter les variabilités. Mâles et femelles seront évalués.

4 200 souris vont être utilisées par groupes de sept, chaque expérience étant répétée trois fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs poumons. Une partie reçoit des cellules tumorales pulmonaires par voie intraveineuse, une autre une injection intrapéritonéale hebdomadaire pendant dix semaines d'une molécule chimique qui déclenche un cancer du poumon, avec pour effet possible une gêne respiratoire. Le porteur décrit l'enjeu comme la compréhension du rôle d'un type de globule blanc, les cellules lymphoïdes innées 3, dans l'efficacité d'une chimiothérapie, le bénéfice pour les patients étant renvoyé au long terme. Le seuil de mise à mort est fixé à un score de 8, ou de 4 pendant trois jours d'affilée, la mise à mort se faisant par dislocation cervicale.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé majeur dans le monde. Il est donc important de trouver des traitements afin de le soigner. Plusieurs études se sont déjà attachées à identifier le rôle des différents globules blancs au cours d’un cancer et d’autres études ont montré que la chimiothérapie pouvait moduler les proportions des différentes populations de globules blancs. Il a été montré que l’efficacité du cisplatine dans le cancer du poumon chez la souris est dépendante d’un certain type de cellules immunitaires, les cellules lymphoïdes innées 3 (ILC3). Les ILC3 possèdent une protéine d’intérêt, qui est aussi retrouvé dans deux autres types de globules blancs. Les ILC3 pourraient être à l’origine de structures qui permettre une meilleure réponse immunitaire anti cancéreuse. Ainsi, nous voulons étudier dans un premier temps le rôle des cellules exprimant la protéine d’intérêt sur l’induction de la formation de ces structures après traitement par chimiothérapie grâce à des souris ne possédant pas du tout cette protéine dans un modèle de cancer du poumon. Par la suite, nous voulons étudier uniquement le rôle des ILC3 dans l’induction de ces structures. Pour cela, nous allons utiliser des souris possédant la protéine d’intérêt uniquement dans les ILC3 permettant leur étude précise.

Bénéfices attendus

Le cancer est un problème de santé public majeur. Il est donc nécessaire de trouver des traitements efficaces et bien supportés par le patient. Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Les animaux reçoivent les cellules tumorales du cancer du poumon non à petites cellules murin en intra-veineuse (1 minute pour l’injection). Pour l’injection de la molécule chimique conduisant à un modèle de cancer du poumon semblable à ce qui peut se développer chez l’humain, les souris vont recevoir une injection en intra-péritonéale une fois par semaine, pendant 10 semaines. La durée de l’injection est d’environ 30 secondes. Par la suite, un suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine : les souris seront traitées en intra-péritonéale (30 secondes). 1,3,5,7 et 10jours après le traitement par chimiothérapie, les souris sont mises à mort sous anesthésie générale (5 minutes pour l’anesthésie et 10 secondes pour la mise à mort).

Impact sur les animaux

Le développement des deux modèles orthotopiques du cancer du poumon peut conduire à une difficulté respiratoire. Les animaux seront étroitement surveillés. Si la difficulté respiratoire devient trop importante, l’animal sera mis à mort. Les chimiothérapies utilisées peuvent entraîner une perte de poids chez les souris. Ainsi, le poids des souris sera vérifié 3 fois par semaine.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les poumons.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=7 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répéterons les expériences 3 fois de manière indépendante. Le test statistique utilisé sera celui le plus adapté en raison de la taille des groupes.

Raffinement

L’animal aura un temps d’acclimatation de minimum une semaine avant toute manipulation par l’applicateur du projet. Afin d’améliorer le bien-être des animaux, les souris ne seront pas isolées. De plus, de l’enrichissement sera présent dans les cages tel que des jouets, des frisotis pour leur nidification et des tubes pour qu’elles puissent se cacher. Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites ont été établis en fonction des manipulations réalisées avec une grille de score associée. Si ce score atteint 8 ou s’il atteint 4 trois jours d’affilés, les souris seront mises à mort par dislocation cervicale

Choix des espèces

Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les modèles expérimentaux pour lesquels on trouve plus facilement et en plus grand nombre des réactifs spécifiques à l’espèce. Les souris sont l’espèce de référence pour les études précliniques en cancérologie, permettant la reproduction et la validation des résultats facilement pas la communauté scientifique. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 7 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature.

Déjà utilisées dans un projet antérieur, cinq macaques à longue queue femelles de trois à quatre kilos sont soumises à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et pourront être réutilisées ensuite dans un autre projet après accord du vétérinaire. Chacune reçoit un anticorps antiviral radiotracé par le nez sous anesthésie légère, subit une imagerie scintigraphique, une intubation trachéale avec une heure d'assistance respiratoire, des lavages nasaux et des prises de sang répétées. L'étude porte sur cinq individus sans analyse statistique, le porteur admettant que l'effectif et l'hétérogénéité du dépôt dans les voies respiratoires ne s'y prêtent pas. Le renforcement positif est écarté pour les lavages nasaux, les zootechniciens jugeant qu'un macaque non coopérant fait courir au personnel un risque de morsure.

Objectifs

Selon l’organisation mondiale de la santé, les infections des voies respiratoires basses demeurent la maladie transmissible qui fait le plus de morts dans le monde, et se placent au quatrième rang des principales causes de mortalité. Ces infections dues, entre autres, à des virus respiratoires entraînent des millions d’hospitalisations chaque année et est une cause importante de décès chez les personnes fragiles (âgées, jeune enfant…). Face à l’hésitation vaccinale, la moindre efficacité des vaccins dans certaines populations et l’émergence et une propagation rapide des virus pharmaco-résistants, de nouveaux traitements sont nécessaires pour contrôler les infections virales respiratoires. Pour de nombreux virus respiratoires, comme celui de la grippe, le virus respiratoire syncitial et celui de la Covid-19, les cavités nasales sont le site d’entrée, de réplication primaire du virus, et constitue un réservoir pour la transmission du virus aux poumons, où l’infection peut provoquer une pneumonie potentiellement mortelle. Le contrôle de la réplication des virus respiratoires et de l’infection dans les cavités nasales offre donc une réelle opportunité de limiter les pneumonies lorsqu’une épidémie émerge. Aujourd’hui, de nombreuses biothérapies à visée intranasale (protéines et vaccins) sont en cours de développement ou commercialisés pour diverses applications. S’appuyant sur des décennies de recherche translationnelle en immunothérapie sur les infections respiratoires, en ingénierie des anticorps et en inhalation le but de ce projet européen est de développer des traitements inhalables (par voie intranasale), à base d’anticorps contre différents virus respiratoires (grippe, COVID) afin de bloquer l’infection dans les cavités nasales. Plus concrètement, cela implique : 1/ d’évaluer le dépôt de l’anticorps dans les voies respiratoires après inhalation par voie intranasale chez le primate non humain afin de déterminer la dose délivrée dans les cavités nasales et 2/ d’analyser le devenir et l’impact de l’anticorps inhalé dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les infections respiratoires représentent un lourd tribut en termes de morbi/mortalité, perte de productivité et coût pour le système de santé. L’impact sociétal potentiel du projet est immense. La prévention des décès et des hospitalisations dus aux virus respiratoires avec des anticorps inhalés aura un avantage direct pour la santé humaine et un potentiel économique et sociétal important. Cette approche anticorps/voie intranasale offrirait une opportunité de mieux contrôler les épidémies. L’approche par inhalation intranasale avec des anticorps capables de neutraliser différentes virus respiratoires est très attractive pour limiter la transmission entre personnes et pour prévenir des pneumonies sévères.

Procédures

- Pose des points de repère spatiale : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Mesure du coefficient d’atténuation des cavités nasales : sous anesthésie chimique légère- 10 minutes - Administration par voie intranasale de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 1 minute au total - Imagerie scintigraphique du dépôt dans les voies respiratoires de l’anticorps radiotracé : sous anesthésie chimique légère - 15 minutes - Intubation par sonde intratrachéale : sera réalisée à l’occasion des gestes nécessitant l’anesthésie gazeuse à l’isoflurane- le geste lui-même dure environ 2 minutes mais les animaux seront intubés et sous assistance respiratoire pendant 1 heure. - Prélèvements sanguins : sous anesthésie–5-10 minutes par prise de sang Et sur animaux vigiles – 5-10 minutes par prise de sang. - Lavage nasal : sous anesthésie 5 -10 minutes par lavage.

Impact sur les animaux

Nous avons identifié quelques nuisances attendues/prévues : - Stress causé par la contention et manipulation des animaux, - Douleur causée par l’injection d’anesthésiques chimiques De plus, nous avons identifié des facteurs engendrant des potentiels effets indésirables/secondaires : l’utilisation d’anesthésiques pouvant éventuellement entraîner des troubles cardio-respiratoires, des hématomes lors des prises de sang, une irritation locale lors de l’inhalation par voie intranasale de l’anticorps radiotracé et lors des lavages nasaux.

Devenir

Au vu de l'espèce utilisé dans ce projet et de la classification de la gravité de la procédure (moderée), les animaux pourront être réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire réferent.

Remplacement

Le principe de remplacement de la règle de bien-être animal est appliqué. En effet, les résultats in vitro préalables à l’utilisation des animaux, notamment l’utilisation de répliques anatomiques de cavités nasales macaques, nous permettrons de calibrer les différentes expériences in vivo afin de limiter le nombre d’animaux nécessaire et d’utiliser d’emblée des posologies et modalités d’administration adaptées.

Réduction

Les animaux seront réutilisés d’un autre projet, mais naïfs vis-à-vis de l’anticorps anti-viral. L'étude est réalisée sur un effectif réduit (n=5) et servira à obtenir des données qualitatives, sans analyse statistique, du devenir et de l’impact de l’anticorps inhalé. Comme indiqué dans la saisine, les temps de prélèvements (sanguin et nasal) pourront varier selon les animaux car ils seront ajustés, au cours de l'étude, sur la base des données issues des premiers animaux. Une analyse statistique n'apparaît donc pas compatible compte tenu du n faible à chacun des temps (n

Raffinement

Pour réduire au maximum l’utilisation d’anesthésiques, du renforcement positif est inclus pour les prélèvements sanguins (PS) à T3h-72h post-inhalation (PS sans lavage nasal concomitant). A ces temps les PS seront réalisés sur animaux vigiles sans contention uniquement sur les animaux répondants car, d’après des études, certains animaux n’adhèrent pas à ce type de démarche même après plusieurs semaines d’entrainement. Pour les animaux non réceptifs les PS seront réalisés sur animal vigile mais immobilisé par contention. Le renforcement n’est pas envisagé pour les PS aux temps T15min->T60min car le respect de ces temps précis est primordial pour l’analyse pharmacocinétique. Il n’est pas envisagé pour les lavages nasaux pour des questions de sécurité du personnel car, d’après les zootechniciens, il est difficile d’entrainer un PNH à accepter l’administration nasale d’un soluté et d’en récupérer un volume. Ce geste sur un animal non coopérant amène des questions de sécurité (risque morsures). La totalité des lavages nasaux se fera donc sur des animaux anesthésiés avec des molécules et dosages adaptés. Enfin, vu que les lavages nasaux impliquent une anesthésie nous réaliserons les PS aux temps T0, T1sem, T2sem, T3sem, T4sem durant l’anesthésie. Pour réduire la douleur et éviter des hématomes la taille de l’aiguille sera adaptée et un point de compression sera appliqué. Si insuffisance respiratoire des mesures d’oxygénothérapie et réanimation seront mis en place. Pour réduire le risque d’irritation locale, la taille des embouts narinaires sera adaptée et les lavages seront réalisés avec soin. Au cours de l’anesthésie prolongée : -Gel oculaire pour prévenir la sècheresse des yeux - Humidification et réchauffement des voies aériennes par filtre échangeur d’humidité chaleur - Sonde d’intubation de taille adaptée avec ballonnet pour éviter une lésion trachéale et garantir une bonne ventilation. - Tapis chauffant pour maintien d’une température - Fluides de remplacement (solution isotonique) après des PS multiples. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 et de 2 dans 2 volières conformes aux normes en vigueur. Ils disposent dans leur hébergement de plateformes surélevées, de tunnels, de jouets et de piscine. L’alimentation couvre les besoins journaliers et est complétée par une distribution de friandises. La nourriture pourra être cachée dans des jouets pour stimuler la recherche alimentaire. Les friandises distribuées sont différentes d’un jour à l’autre.

Choix des espèces

Le primate non humain est une espèce de référence pour les études de dépôt de particules inhalées dans le tractus respiratoire, permettant de mettre en place différentes conditions de ventilation et d’utiliser des dispositifs à qui seront directement utilisés chez l’homme. Le choix de l’espèce macaque se justifie par : - La tenue bipède, la morphologie du nez et le volume des cavités nasales. La tenue assise lors de l’administration de la molécule et la taille du nez permet l’utilisation de dispositif à visée humaine avec un embout adapté. Le volume des cavités nasales est compatible avec les volumes administrés avec les différents dispositifs. - Proximité anatomique de l’espèce. Les cavités nasales des macaques sont plus similaires à celle de l’homme, que celles d’autres espèces. - Proximité physiologique de l’espèce. La morphologie et la distribution de l’épithélium nasal (où se réplique le virus de la grippe et cible de l’anticorps) chez le macaque est plus proche de celles de l’homme que celles d’autres espèces (rongeurs, chiens) - Similarité des réponses immunologiques et biologique avec l’humain, faisant du PNH une espèce de référence pour les études réglementaires avec des anticorps thérapeutiques. 5 animaux adultes de 3-4 kg réutilisés de projets précédents après accord du vétérinaire référent.