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Etude des effets cocktail de perturbateurs endocriniens sur la production de Vésicules Extracellulaires (VEs) adipeuses chez la souris
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- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour que leur tissu adipeux soit prélevé et mis en commun, une seule souris n'en fournissant pas assez, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent neuf gavages hebdomadaires d'une huile contenant un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose, une partie d'entre elles suivant en plus un régime riche en graisses pendant toute l'étude. Une partie des souris est obèse par mutation génétique, ce que le porteur relie à des troubles de mobilité, une résistance à l'insuline et une inflammation chronique, en précisant que ces effets "ne provoquent pas de douleur directe". Les vésicules extraites de leur graisse seront ensuite testées sur des cellules en culture et injectées à des larves de poissons zèbres, toute application humaine restant hors du projet.
Objectifs
Les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse (appelées MASLD, anciennement NAFLD) sont de plus en plus fréquentes et représentent un véritable problème de santé. Elles commencent par une infiltration excessive de graisse dans les cellules du foie (stéatose), ce qui peut entraîner des complications plus graves comme l’inflammation du foie (MASH), puis évoluer vers de la fibrose, une atteinte sévère du foie (cirrhose) et, dans certains cas, un cancer du foie. Parmi les facteurs qui pourraient aggraver ces maladies, l’exposition prolongée à certaines substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs) est particulièrement inquiétante. Ces substances, présentes dans l’environnement et certains produits du quotidien, pourraient perturber le fonctionnement normal du foie et favoriser la progression de ces maladies. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment certaines substances chimiques de l’environnement, appelées perturbateurs endocriniens (PEs), pourraient influencer les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse. Pour cela, nous allons produire en laboratoire des particules appelées vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), issues de la graisse de souris ayant été exposées à différents niveaux de PEs. Ces particules pourraient jouer un rôle clé dans l’évolution de ces maladies. Pour cela, nous exposerons des souris de différentes souches (normales, obèses et nourries avec un régime riche en graisses) à des perturbateurs endocriniens. Après leur mise à mort, nous collecterons le tissu adipeux pour produire in vitro les AdVEs. Grâce à ces différents modèles expérimentaux, nous pourrons étudier comment le sexe et l’état métabolique des souris (obésité d’origine génétique ou liée à l’alimentation) influencent la production et la composition des vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhensions des interactions entre exposition environnementale, adiposité et dysfonctionnements métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une exposition prolongée à un mélange de substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs), à deux niveaux d’exposition différents, dans des situations métaboliques variées. L’objectif est de mieux comprendre l’impact combiné de ces substances, en particulier lorsqu’elles sont associées à de l’obésité. Des études précédentes ont montré que certains de ces polluants, pris individuellement, ont peu d’effet, mais qu’en cocktail, ils peuvent perturber davantage le métabolisme en agissant ensemble. Cette approche aidera à mieux comprendre comment l’environnement influence notre organisme. Enfin, les vésicules extracellulaires issues de la graisse des souris seront utilisées pour étudier leurs effets soit sur des cellules en laboratoire, soit après injection dans des larves de poissons-zèbres. Ces modèles complémentaires permettront d’avoir une vision plus large des conséquences de ces substances dans un contexte pathologique particulier.
Procédures
Une partie des souris sera soumise à un régime riche en graisses HFD pendant toute la durée de l’étude. Et toutes les souris recevront, par gavage oral (5 secondes) et à neuf reprises, soit une huile servant de contrôle, soit une huile contenant un mélange de 4 perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose.
Impact sur les animaux
Le gavage hebdomadaire est la principale source de nuisance dans cette étude. Bien qu’indispensable pour une administration contrôlée des substances, cette méthode peut entraîner du stress pour les animaux. Pour réduire cet impact, les manipulations seront effectuées par du personnel qualifié, en utilisant une contention appropriée et en limitant la durée des manipulations. L’exposition aux substances étudiées vise à simuler une exposition environnementale chronique, comparable à celle à laquelle les humains peuvent être confrontés. Toutefois, l’administration répétée peut provoquer un stress physique, notamment à cause des manipulations fréquentes. L'obésité, qu'elle soit causée par un régime alimentaire spécifique ou une mutation génétique, peut entraîner des problèmes de mobilité, des troubles métaboliques tels que la résistance à l'insuline et une inflammation chronique. Toutefois, ces effets ne provoquent pas de douleur directe chez l'animal, bien qu'ils nuisent à son bien-être en réduisant sa capacité à se déplacer et en générant un stress physiologique.
Devenir
À la fin de la procédure toutes les souris seront mises à mort, afin de permettre le prélèvement du tissu adipeux nécessaire à l’isolement des vésicules extracellulaires.
Remplacement
Le développement des maladies hépatiques liées à l’accumulation de graisse est souvent associé à l’obésité et résulte d’interactions complexes entre plusieurs organes, notamment le foie, le tissu adipeux et le pancréas. Ces échanges impliquent également divers types cellulaires au sein du foie. Les perturbateurs endocriniens (PEs) agissent en perturbant les hormones, ce qui peut influencer ces mécanismes. En l’absence de modèle alternatif fiable pour reproduire l’obésité à l’échelle de l’organisme, nous utiliserons un modèle murin de souris déjà bien caractérisé. De plus, ces interactions complexes entre les organes, qui jouent un rôle clé dans les troubles métaboliques, ne peuvent être correctement reproduites qu’avec un modèle vivant.
Réduction
L’expérimentation sera réalisée avec un nombre d'animaux suffisant pour garantir des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le nombre total d'animaux est déterminé en fonction du nombre de groupes nécessaires et du nombre d'animaux par groupe pour obtenir des données fiables. Pour extraire les vésicules extracellulaires provenant du tissu graisseux, une certaine quantité de matière est indispensable. Comme une seule souris ne fournit pas assez de tissu, il est nécessaire de regrouper celui de plusieurs animaux. Le nombre varie selon le type de souris utilisé : il en faut davantage pour les souris de poids normal, et un peu moins pour les souris obèses. Des tests statistiques ont montré qu’il fallait au minimum huit échantillons indépendants pour chaque condition afin de pouvoir comparer les résultats de façon fiable. Ces échantillons seront préparés séparément pour les mâles et les femelles, car les effets étudiés peuvent différer selon le sexe. Au total, ces besoins justifient l’utilisation de 720 souris pour l’ensemble de l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce, avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tubes en carton, morceaux de bois). Le protocole expérimental prévoit un suivi quotidien des animaux, basé sur l’observation de signes physiques et comportementaux prédéfinis, qui permettront de repérer tout signe de mal-être. Leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. En cas de douleur ou de souffrance, des antalgiques pourront être administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, une euthanasie pourra être pratiquée pour éviter toute souffrance prolongée, selon une grille d’évaluation spécifique. Les souris obèses, mâles ou femelles, seront placées par groupes de 2 ou 3 par cage, en tenant compte de leur poids et de la taille des cages, et des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise. Étant moins mobiles, une attention particulière sera portée lors de leurs transferts.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris, c’est un modèle bien établi d’étude préclinique et facilement accessible, permettant d’étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte physiologique complexe. Leur exposition à un gavage hebdomadaire est facile à réaliser, ce qui simplifie l’administration contrôlée des substances. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées, car les maladies liées à l'accumulation de graisses dans le foie touchent principalement les adultes.
Role des hormones thyroïdiennes dans les altérations de mémoire liées à la consommation de régime obésogène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est implantée dans l'hippocampe de 1 124 souris par chirurgie stéréotaxique, geste qui peut provoquer des crises d'épilepsie et que l'animal peut décoller en se frottant. 1 700 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 384 dans des procédures d'un niveau sévère. Le porteur ramène les nuisances à leur durée, deux tests de cinq minutes pour les troubles émotionnels et trois minutes de contention pour la mesure de masse grasse, quand 384 souris relèvent tout de même du niveau de souffrance le plus élevé. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyse de l'expression des gènes, électrophysiologie ou immunohistochimie, afin de comprendre comment un régime gras et sucré consommé dès l'adolescence altère la mémoire.
Objectifs
Le thème général du projet porte sur l’effet délétère d’une alimentation déséquilibrée (obésogène) sur la mémoire. Une alimentation trop riche en gras et en sucre augmente le risque de problèmes cognitifs comme la mémoire. La période d’adolescence est particulièrement sensible à ce type d’alimentation car le cerveau est encore en maturation. Les conséquences de difficultés de mémoire chez les adolescents sont importantes car elles vont impacter la performance scolaire et influencer la mémoire pour toute la vie. Il est donc important de comprendre la vulnérabilité spécifique à l'adolescence et de trouver les moyens de prévenir ces déficits de mémoire. Nos études précédentes ont mis en lumière l'implication des hormones thyroïdiennes dans ces déficits de mémoire et ont montré que la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. L'objectif du projet présenté ici est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes altèrent la mémoire associée à la consommation de régime obésogène durant l'adolescence et comment la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. Une recherche pré-clinique est indispensable pour cette compréhension des mécanismes neurobiologiques mises en jeu de par les conditions expérimentales contrôlées (mêle nourriture, même condition de vie) et la possibilité d'étudier le cerveau au-delà de l'imagerie cérébrale.
Bénéfices attendus
L’achèvement des expériences proposées, sur une durée de 4 ans, devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps (chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones thyroïdiennes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à l’hypothyroïdie légère.
Procédures
Nous effectuerons des chirurgies sur 562 males et 562 femelles. Nous ne ferons pas de prélèvements sur animaux vigiles. 1316 animaux feront des tests de comportement qui n'engendrent pas de souffrance. 384 animaux ferons 2 tests de comportement pour estimer les troubles émotionnels, qui peuvent engendrer de l'angoisse mais chaque test ne dure que 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections. L'implantation de canule dans l'hippocampe de souris peut entrainer parfois des crises d'épilepsie. La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée en la frottant. La prise de poids sous régime obésogène est modérée et n’entraine pas de nuisance observable. Certains tests de comportement sont stressants mais ils ne durent que 5 min chacun. Enfin la mesure de masse grasse par RMN oblige à faire une contention de l’animal qui entraine un stress mais ne dure également que 3 min et les animaux sont préalablement habitués à cette contention pour atténuer l'angoisse associée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car nous faisons des analyses post-mortem: analyse de l'expression de gènes, de protéines, électrophysiologie ou immunohistochimie pour préciser les mécanismes moléculaires expliquant les déficits de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin dêtre au point et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Raffinement
Dans ce projet nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées de guide-canules sont 2 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre). Toutes les cages ont au moins un enrichissement (maison en carton, barre à ronger, frisoti et carré de coton pour fabrique de nid). Nous assurons une surveillance quotidienne afin d'apporter des soins rapidement si nécessaire. Nous privilégions les approches non invasives (imagerie in vivo) et pour celles qui ne le sont pas nous appliquons les soins pre et post opératoires, l'anesthésie et l'analgésie. Nous faisons des habituations aux souris qui doivent subir des brèves contentions afin que celles-ci ne soient pas associées à de l'angoisse. Nous avons mis en place des critères de points d’arrêt précoces où nous intervenons très rapidement pour réduire le stress et la douleur des animaux si cela apparait.
Choix des espèces
Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validés dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. Enfin, nous disposons pour ce projet de diverses souris transgéniques permettant de répondre aux questions scientifiques posées, par exemple des souris déficientes pour la signalisation des hormones thyroïdiennes. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permettant des comparaisons directes avec ce qui est déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence jusqu'à l'état adulte. Cette période du développement est en accord avec nos objectifs d'étudier l'effet d'une alimentation obésogène consommée dès l'enfance et couvrant la période d'adolescence.
Impact des rythmes de croissance, au cours de la récupération post-ponte, sur l’activité des cellules souches musculaires chez la truite arc-en-ciel femelle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Mesurer si les truites arc-en-ciel retrouvent après la ponte la proportion de filet, la couleur et la texture attendues du produit vendu. 1 000 truites vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour des prélèvements musculaires. Chacune est anesthésiée, sortie de l'eau une minute, marquée par un pit-tag et amputée d'un morceau de nageoire pelvienne d'environ 5 mm2, 500 d'entre elles étant ensuite pêchées à l'épuisette chaque mois, et les femelles prêtes à pondre restant à jeun cinq jours. Le porteur précise que les poissons atteindront 2 à 2,5 kg au point final, ce qui correspond au poids du produit commercialisé sous forme de filets de truite fumés.
Objectifs
Chez la truite, la reproduction affecte fortement la croissance. C’est particulièrement impactant chez la femelle qui produit une quantité d’œufs correspondant à 10 à 15 % de son poids. Au moment de la reproduction, la croissance s’arrête et elle reprend après la ponte. Cela affecte également la qualité des produits, en particulier la proportion de filets du poisson, et la couleur et la texture des filets, qui sont dégradés au moment de la ponte. Ces qualités sont ensuite restaurées. L'objectif du projet est d’évaluer si le changement de rythme de croissance, au moment de la ponte et après la ponte, affecte le nombre et l’activité des cellules souches musculaires (cellules satellites), qui vont permettre la croissance musculaire. Ce projet a également comme objectif d’évaluer la possibilité d’effectuer un sexage par échographie (méthode non invasive) des truites dès le printemps qui précède leur maturation sexuelle.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur la plasticité des cellules satellites. Nous espérons ainsi montrer que ces cellules sont la clé de la reprise de croissance et de la restauration des qualités après la ponte. Ce type de connaissance peut permettre, dans des travaux futurs, d’identifier des souches de truites ou des pratiques d’élevage favorisant cette aptitude à la récupération post-ponte des poissons. Ce projet sera également l’occasion de tester, en parallèle du sexage moléculaire sur prélèvement de nageoire, un sexage par échographie. Si cette technique non invasive s’avère fiable, elle permettra, à l’avenir, d’éviter de prélever un échantillon biologique, pratique dommageable pour les poissons.
Procédures
En début de procédure, 1000 poissons anesthésiés seront soumis une première fois à une émersion d’une 1 minute maximum, puis à l’insertion d’un pit-tag et à un prélèvement concomitant d’un échantillon de nageoire pelvienne pour sexage moléculaire. Ils seront également soumis à une mesure échographique non invasive dans l’eau qui durera 1 minute maximum. Une seconde mesure échographique sera réalisée 2 mois plus tard, lors d’une biométrie, sur les poissons anesthésiés, après l’obtention des résultats du sexage moléculaire, pour valider la fiabilité de l’identification du sexe par échographie. Puis 500 d’entre eux seront ensuite soumis une fois par mois à une pêche avec une épuisette, une anesthésie, une émersion de 30 sec pour la lecture du numéro de pit-tag, la mesure du poids et de la longueur. Enfin, ils seront également soumis à des transferts pour constituer les lots post ovulation.
Impact sur les animaux
Les poissons seront mis à jeun 72 heures avant les manipulations liées au contrôle de la maturité sexuelle, et les femelles prêtes à pondre seront mises à jeun pendant 5 jours, le temps nécessaire à la réalisation des mesures et des prélèvements avant d’être remises en élevage. La nuisance attendue de ces mises à jeun est d’intensité légère. Une nuisance d’intensité modérée sera générée par un prélèvement invasif de tissu au niveau de la nageoire pelvienne (de l’ordre de 5 mm2) pour réaliser l'analyse génétique du sexe des poissons. Pour l’observation des organes reproducteurs par échographie, le temps nécessaire est estimé à moins d’1 min par poisson. La nuisance attendue est d’intensité légère. Cette observation sera réalisée deux fois : une 1ère fois au moment du prélèvement de nageoire, et une 2nde fois lors de la biométrie où les males seront écartés. Les poissons subiront également un stress d’intensité légère engendré par la pêche, l’anesthésie et un temps d'émersion, au moment du prélèvement de nageoire, d’une durée maximale de 1 minute. La somme des nuisances attendues lors de cette procédure est classée modérée.
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de projet afin de réaliser des prélèvements musculaires.
Remplacement
L'objectif du projet est de déterminer l'impact des rythmes de croissance du poisson, au moment de la ponte et après la ponte, sur la plasticité des cellules souches, en lien avec la qualité des produits. La croissance est une fonction physiologique qui impacte l’ensemble des tissus et organes de l’animal. Cette fonction interagit biologiquement avec une autre fonction essentielle qu’est la reproduction. Pour répondre à l’objectif du projet, nous devons réaliser des mesures sur des animaux en croissance, donc vivants.
Réduction
Le lot bisexué de 1000 truites incluses dans ce projet correspond à l’effectif minimum pour répondre à l’objectif fixé. En effet, il nous faut inclure 1000 truites pour disposer des 500 femelles nécessaires à la réalisation du projet. Le projet nécessite d’avoir des truites témoins immatures pour chaque point de mesure post-ponte, soit 4 points de mesure à 0, 1, 2 et 4 mois post-ponte. Le nombre requis, par point de mesure, est de 10 à 15 poissons, soit un nombre de 40 à 60 poissons immatures au total. Pour avoir ce nombre de femelles immatures, il nous faut partir d’un lot de 500 femelles, puisque seulement environ 10% (environ 50 poissons) vont rester immatures à 2 ans, tandis que les autres (450 animaux, 90%) vont maturer sexuellement et produire des œufs. Ce nombre de poissons prévus est donc l’effectif minimal pour les analyses prévues. Il permettra d’évaluer d’une part l’impact de la maturation sexuelle et de la ponte sur le nombre et l’activité des cellules satellites, en lien avec la qualité des produits et la taille des fibres musculaires, en comparant les poissons ayant pondus avec les témoins immatures à chaque point de mesure. Il permettra également d’évaluer l’effet du temps post-ponte, pour les poissons ayant pondu et les témoins immatures, en comparant les données obtenues aux différents temps de mesures, à 0, 1, 2, et 4 mois post-ponte.
Raffinement
Les prélèvements d’échantillons de nageoire, ainsi que toutes les manipulations seront réalisés sous anesthésie. Un tissu humide sera utilisé pour manipuler les poissons pour éviter la déperdition de mucus. Un prélèvement d'un petit bout de nageoire sera réalisé pour l'analyse génétique du sexe des poissons. Une surveillance des poissons sera réalisée à l'issue de ce prélèvement et dans les jours qui suivent. Des tables de suivi des soins seront mises en place et utilisées tout au long du projet. L’observation des gonades par échographie sera réalisée sur chaque poisson directement dans le bac d’anesthésie à l’occasion de biométrie.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est une espèce robuste dont l’élevage, la croissance et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. C’est de plus une espèce d'intérêt agronomique qui représente 95 % de la production piscicole française et l’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusé dans la communauté scientifique (>50 000 références). C’est une espèce avec une très grande plasticité de croissance qui a démontré sa capacité de reprise de croissance après la ponte. Cette espèce n'est pas incluse dans la liste des espèces identifiées comme devant provenir d’élevage ou de fournisseurs agréés. Les poissons feront environ 600 g (16 mois post-fécondation) au début de l’expérimentation. C’est à ce stade qu’ils seront soumis à la procédure expérimentale décrite dans la présente saisine. Ils seront ensuite élevés dans les conditions standard jusqu’à l’atteinte de leur maturité sexuelle, qui débouche sur la ponte de leurs œufs, à 2 ans (1,5 - 2kg), puis lors de la phase de récupération post-ponte jusqu’à 2 ans et 4 mois pour le point final, où les poissons feront 2 - 2,5 kg. Ce poids final correspond au produit commercialisé, en condition de production, sous forme de filets de truite fumés.
Mécanismes de développement et de régénération du système visuel chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un pincement de dix secondes sur le nerf optique, des injections directement dans l'œil, une chirurgie de quarante minutes pratiquée sur des embryons à travers l'utérus de leur mère. 4 520 souris vont être utilisées, dont 4 490 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre un jour et plusieurs semaines après la fin de leur procédure. S'y ajoutent trois tests de comportement de trois heures, trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour mesurer si la connexion entre l'œil et le cerveau se rétablit, dans la perspective lointaine de traiter le glaucome. Le porteur écarte le poisson zèbre précisément parce que son système nerveux central régénère spontanément, et retient la souris pour la disponibilité de ses lignées transgéniques.
Objectifs
Le glaucome concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau. Dans ce contexte, il s’agit de faire repousser le nerf optique et de le connecter correctement aux zones du cerveau qui traitent l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la connexion entre l'œil et le cerveau au cours du développement embryonnaire. Une fois ces mécanismes identifiés, il s’agira de les manipuler chez l’adulte pour induire la connexion entre l'œil et le cerveau et permettre un retour visuel fonctionnel.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment le système visuel se forme chez l’embryon. Les mécanismes identifiés peuvent ensuite être utilisés afin de générer des approches thérapeutiques pour des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.
Procédures
Les souris peuvent subir une ou plusieurs injections : -injection dans l’œil: les souris sont endormies environ 30 min. L’injection dans l’œil dure 20s. -injection dans le cerveau: les souris sont endormies environ 40 min. La chirurgie dure 15 min -lésion du nerf optique : les souris sont endormies environ 30 min. La procédure dure 5 min, la lésion correspondant à 1 pincement de 10 secondes. -chirurgie chez l’embryon : les souris sont endormies environ 50 min. La chirurgie dure 40min. Les souris participeront à 3 tests de comportement pour étudier le fonctionnement du système visuel du cerveau. Elles sont testées durant 4 semaines avec une fréquence de trois fois par semaine, chaque test a une durée de 3h, acclimatation comprise.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure de chirurgie in utero, il y a deux types de nuisances. Premièrement pour la mère gestante : les sutures peuvent s’infecter (ceci represent un risque faible) ou alors les points pourraient être arrachées. Pour les embryons, la chirurgie peut entrainer la mort précoce des embryons. L’injection dans l'oeil chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil. Le traitement génétique peut éventuellement entrainer des phénotypes dommageables.
Devenir
Notre projet nécessite de récupérer les tissus dans les meilleures conditions afin d’étudier l’étendue de la repousse axonale suite au traitement par nos molécules. A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort entre 1 jour et plusieurs semaines plus tard.
Remplacement
Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Il est à noter que tous les candidats identifiés testés in vivo seront étudiées d’abord sur des cultures de tissues. Seuls les candidats les plus pertinents (ceux qui montrent un effet significatif en culture) seront manipulés in vivo chez la souris.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures de tissus. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris. Les conditions de régénérations avec le meilleur résultat in vivo seront utilisés dans pour les tests de comportement.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience. Avant chaque injection réalisée sous anesthésie, les souris reçoivent un antalgique local en crème. Après chaque injection, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil... Les douleurs post-opératoires seront prévenues par l’addition d’un antalgique dans l’eau de boisson). Des grilles de points limites adaptées sont utilisées pour le suivi des animaux.
Choix des espèces
Le développement et la régénération du système nerveux sont des phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les mécanismes moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les études scientifiques que nous réalisons. La souris permet aussi l’utilisation de tests de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est en cours de maturation et chez l’adulte. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence et de plasticité dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.
Impact des sucres ou édulcorants sur la santé cérébrale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
1 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 152 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection ou un gavage de solution sucrée, une puce sous la peau, un test de tolérance au glucose de deux heures avec sept prélèvements de sang à la queue, et des tests comportementaux de cinq à vingt minutes que le porteur dit destinés à analyser les comportements émotionnels et mnésiques, sans les nommer. L'objet déclaré est d'améliorer les recommandations alimentaires sur le sucre, bénéfice renvoyé à des travaux ultérieurs quand les procédures, elles, sont immédiates. Le porteur affirme que les comportements anxieux, dépressifs et les performances cognitives ne peuvent s'étudier que sur des animaux vivants, et que la nutrition ne se modélise pas in vitro.
Objectifs
La consommation de sucres (naturels ou artificiels), qui a fortement augmenté ces dernières années notamment par l’utilisation de sirop dans les produits transformés, est parallèle à celle du nombre de patients atteints d’obésité. Ces données suggèrent un rôle de ce sucre dans le développement des désordres métaboliques et ont conduit l’Anses à émettre des recommandations pour développer des recherches plus approfondies sur « le lien entre consommation de sucres et pathologies associées ».
Bénéfices attendus
Le projet permettra de déterminer quels est l'impact de la consomation de ces sucres naturels ou artifiicels sur la santé cérébrale. Ces données seront clefs pour améliorer les recommandations alimentaires liées à la consommation de sucre.
Procédures
Les animaux seront injectés ou gavés une seule fois avec une solution de sucre. Les injections ou gavages durent 5 secondes. Les animaux subiront des tests comportementaux durant 5 à 20 minutes permettant d'analyser les comportements émotionnels et mnésiques. Les animaux recevront une puce sous la peu (procédure durant 1 minute) et réaliseront des tests de tolérance au glucose (suivi de la concentration sanguine de glucose pendant 2 heures suite à une injection de glucose). Du sang (une goutte) sera prélevé à la queue des animaux 7 fois durant les 2h du test de tolérance au glucose). Chaque prélèvement de sang dure 5 secondes.
Impact sur les animaux
Les gavages ou inections intrapérotonéales de solutions sucrées peuvent induire un inconfort aux animaux. Les mises à jeûn induiront également un inconfort aux animaux. Les tests comportementaux induiront des stress modérés aux animaux le temps de ces dits tests. Les régimes pourront entrainer une prise de poids. Le placement d'une puce en sous-cutané pourra induire un inconfort des animaux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour analyses biochimiques ou immunohistochimiques.
Remplacement
L’étude des comportements de type anxieux et dépressif, des performances cognitives et de la prise alimentaire ne peuvent être réalisées que sur des animaux vivants ce qui rend impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. L'étude de l'effet de régimes alimentaires et plus largement de la Nutrition ne peut pas non-plus être modélisé in vitro et nécessicte l'utilisation vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux sera reduit au mieux en se basant sur des articles scientifiques qui ont montré par le biais de tests statistiques des differences entre plusieurs groupes. D’après les études scientifiques sur l’analyse de marqueurs comportementaux et cérébraux, nous estimons que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour atteindre une signification statistique.
Raffinement
Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux la douleur (antalgique et sédation avant mise à mort) et l’inconfort (manipulation régulière et enrichissement de l’hébergement) des animaux. L’hébergement se fera à 5 souris/cage et l’environnement sera enrichi : igloo et carré de coton. La mesure de la prise alimentaire se fera dans des cages automatisées collectives. Les expérimentateurs et soigneurs sont titulaires de leur certificat d’expérimentation animale niveau concepteur et/ou opérateur. Les expérimentateurs travaillent avec des animaux depuis de nombreuses années et sont très fortement sensibilisés au sujet du bienêtre animal de par leur thématique de recherche (stress, anxiété, bien-être cérébral) et de par le travail de la structure du bien être animal (SBEA). La SBEA procède à des contrôles réguliers de respect des procédures et de bien-être des animaux. Des points limites précoces ont été définis afin de limiter au mieux la souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. La souris est un mammifère comme l’Homme, avec des cycles de reproduction rapides. Il est largement utilisé dans le champ de la cognition et de l'entrainement physique, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec les études antérieures. C’est un animal sur lequel les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les souris mâles et femelles arriveront à l’animalerie à l’âge adulte (3 mois), âge auquel les expérimentations seront réalisées. L'âge adulte a été choisi du fait de l'absence de données de l'impact de la consommation de sucres ou édulcorants sur la santé cérébrale à ce stade de développement.
Etude du rôle des Heat Shock Protein (HSP) dans les glomérulopathies avec prolifération extracapillaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Un sérum toxique pour le rein, obtenu en immunisant des moutons contre des composants du glomérule de souris, est injecté sous anesthésie à toutes les souris du projet. 760 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, avec selon les protocoles un gavage ou une injection quotidienne pendant dix à quatorze jours et un recueil d'urine deux fois par semaine. Il s'agit de tester si l'inhibition d'une protéine de stress freine la formation des croissants cellulaires qui détruisent le filtre du rein. Le porteur décrit une prise de poids par ascite et par œdèmes après l'injection du sérum, puis conclut que les protocoles sont "relativement courts" et qu'il ne devrait pas observer de complications trop sévères.
Objectifs
Les maladies rénales affectent dix pour cent de la population mondiale avec une incidence croissante et elles représentent de nos jours un véritable enjeu de santé publique. Si ces maladies ne sont pas prises en charge, elles peuvent aboutir à une insuffisance rénale terminale (IRCT). L'IRCT est associée à une importante mortalité cardiovasculaire et à un coût élevé pour la société (environ 4 milliards d'euros par an en France). L'une des causes les plus sévère d'IRCT sont les glomérulonéphrites extracapillaires (GEC). Les GEC sont associées à une prolifération anormale de cellules rénales : les cellules épithéliales pariétales formant un "croissant" cellulaire dans le glomérule, unité de filtration du rein. Des données suggèrent l'implication des protéines de stress dans le développement de ces croissants. Il a été démontré que l'une de ces protéines de stress aurait un rôle délétère dans la GEC faisant de cette protéine une cible thérapeutique potentielle. Le principal modèle murin de GEC est caractérisé par l'injection d'un sérum toxique pour les reins (sérum obtenu après immunisation de mouton contre des composants du glomérule de la souris). Dans ce modèle, les animaux développent une atteinte rénale rapide dès le dixième jour, caractérisée par des lésions de croissants (reproduisant les caractéristiques histologiques et fonctionnelles des GEC humaines). Pour préciser le rôle in vivo de cette protéine de stress et l'intérêt thérapeutique éventuel de son inhibition, nous nous sommes fixés plusieurs objectifs : 1/ Etude de l'expression de la protéine de stress au cours du développement de la GEC expérimentale pour affiner le rôle in vivo de cette dernière 2/ Inhibition pharmacologique de la protéine à visée thérapeutique 3/Inhibition génétique de la protéine de stress dans plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées pour déterminer quelles cellules rénales sont impliquées dans la signalisation de cette protéine.
Bénéfices attendus
Les maladies glomérulaires représentent la première cause d'insuffisance rénale terminale. Le développement de thérapies ciblées agissant spécifiquement sur les cellules épithéliales glomérulaires (cellules locales) est donc essentiel afin de contrôler ces maladies glomérulaires. Ces travaux pourraient permettre de proposer la protéine de stress (étant déjà la cible de différents traitements) comme une cible thérapeutique prometteuse dans diverses maladies glomérulaires rénales. Comme nos premiers résultats l'indiquent, cette protéine pourrait être impliquée dans le développement de pathLaologies dévastatrices comme la glomérulonéphrite extracapillaire (GEC) aboutissant dans la majorité des cas à l'apparition d'une Insuffisance Rénale Chronique (IRC). De nos jours, l'insuffisance rénale chronique à des conséquences socio-économiques majeures. Son traitement représente l'un des couts les plus importants du budget de la santé pour une petite fraction de la population : il est urgent de disposer de davantage de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques. De plus, actuellement, le traitement de la GEC repose principalement sur une thérapie qui a des effets nefastes importants pour les patients concernés. Ce projet a l'ambition de proposer des stratégies thérapeutiques inhibant les mécanismes physiopathologiques clés impliqués dans le développement des croissants.
Procédures
(1) Tous les animaux recevront une injection de sérum sous anesthésie environ 3 minutes par souris sur un plateau thermostaté à 37degrés. (2) Pour les protocoles, certains animaux recevront un gavage par jour sur les périodes de traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minutes par souris. (3) Pour un autre protocole, certains animaux recevront une injection d'un traitement soit dix jours ou quatorze jours sur animal vigile,environ 1 minute par souris. (4) L'ensemble des souris auront un recueil des urines pendant le protocole deux fois par semaines environ 1 minute par souris. (5) Prélèvement de sang sous anesthésie et analgésie (1 minute environ/souris).
Impact sur les animaux
Le stress et la douleur peuvent être générés par : 1.les différentes injections des medicaments. Les douleurs liées aux injections seront de courte durée mais les animaux peuvent developper une inflammation et un stress lors de la contention pour la bonne administration. 2. Les manipulations quotidiennes en particulier pour les pesées et les spots urinaires. Les animaux peuvent developper un stress lors de la contention pour le recueil d'urines quand elle est nécéssaire. 3. Les complications associées au modèle murin. Suite à l'injection du sérum toxique pour le rein, les animaux peuvent prendre du poids en raison de l'ascite et des oedemes développés lors de la mise en place des lésions rénales. 4. Complications liées à l'anesthésie au moment de l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Les protocoles mis en place dans le projet sont relativement cours, nous ne devrions pas observer de complications trop sévères pour les reins (perte de poids, baisse de la température corporelle).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale et analgésie par une personne expérimentée afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.
Remplacement
En raison notamment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l’état encore embryonnaire de la recherche sur les organoïdes, l’étude des maladies rénales requiert l’obtention de tissu rénal prélevé sur l’animal d’expérience ou l’homme. Il n’existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l’évolution de défaillance chronique progressive d’organes. De plus, l'un des critères majeurs est la fonction rénale, qui doit être mesurée par le dosage de la concentration plasmatique de créatinine et d'urée.
Réduction
Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du phénotype étudié (lésions tissulaires rénales) dans nos deux modèles d'insuffisance rénale aigue. Des lots de 10 animaux sont nécessaires pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences phénotypiques entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Chaque procédure sera effectuée deux fois sur des lots indépendants. Le nombre total d'animaux est de 760 souris. De plus, nous utiliserons des tests statitiques adaptés.
Raffinement
Les nuisances pour les animaux seront réduites au maximum grâce à l’application de mesures de raffinement appropriées. Avant le début de la procédure, les animaux seront acclimatés dans l’animalerie pendant au moins une semaine afin de les préparer à leur environnement. Leur bien-être sera assuré par un enrichissement optimal de leur environnement, comprenant une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments de tailles différentes. Cette litière, initialement compacte, sera décompactée par les animaux eux-mêmes. Des morceaux de bois à ronger et un dôme refuge en cellulose seront fournis dans chaque cage, offrant aux animaux des éléments pour explorer et se cacher, contribuant ainsi à leur confort. La gestion de la douleur sera une priorité, avec l’utilisation de méthodes d’analgésie et d’anesthésie adaptées pour minimiser toute souffrance. Des points limites ont été définis pour assurer une surveillance stricte du bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Afin de garantir leur état de santé optimal, une surveillance quotidienne de leur aspect physique et du poids des animaux sera effectuée par le personnel qualifié de l'animalerie ou les responsables du projet. Les animaux seront hébergés dans des conditions strictement conformes à la réglementation en vigueur. Chaque cage contiendra un maximum de cinq animaux, et l’animalerie respectera des conditions de température, d’humidité et de renouvellement de l’air rigoureuses conformément à la réglementation en vigueur.Enfin, pour la mesure de certains paramètres, des efforts seront faits pour réduire au maximum le stress lié à la contention, garantissant ainsi le bien-être des animaux tout au long de la procédure
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans cette étude est bien maîtrisé par le personnel du laboratoire, qui possède une grande expérience avec cette espèce. De plus, de nombreuses données relatives à ce modèle sont déjà disponibles dans la littérature scientifique, ce qui en fait un choix particulièrement pertinent, surtout en comparaison avec d'autres espèces. Cette étude bénéficie également de la possibilité de tester l'implication de voies de signalisation spécifiques à certaines cellules, grâce à l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Les animaux sélectionnés pour cette étude seront à un stade adulte, entre 8 et 10 semaines. À cet âge, ils possèdent un système glomérulaire mature, tout en ne présentant pas encore de lésions dues au vieillissement, ce qui garantit des résultats plus fiables et représentatifs.
Rôle d’AhR et de MCP1 dans les processus de sténose et de thrombose de la fistule artério-veineuse
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Poils hérissés, dos courbé, posture prostrée : ces signes, attendus plus tôt chez les souris rendues insuffisantes rénales, déclenchent la mise à mort. 192 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour histologie. Chacune subit trois interventions chirurgicales de vingt minutes, deux pour provoquer une maladie rénale chronique et une pour créer une fistule entre une artère et une veine, une partie d'entre elles recevant en plus vingt-quatre gavages sur sept semaines. L'objet est de comprendre pourquoi les fistules de dialyse se bouchent, complication qui cause 30 % des hospitalisations de patients dialysés, et le bénéfice annoncé se limite pour l'instant à "proposer des cibles thérapeutiques".
Objectifs
Au stade terminal de maladie rénale chronique (MRC) les patients bénéficient d’un traitement par dialyse qui consiste à épurer le sang en remplacement des reins qui ne fonctionnent plus. La fistule artério-veineuse (FAV) qui consiste à relier chirurgicalement une veine superficielle du bras à une artère, est indispensable pour épurer le sang par dialyse. Cependant, il arrive fréquemment que la FAV rétrécisse ou se bouche amenant à son dysfonctionnement. C’est une complication majeure qui est responsable de 30% des hospitalisations des patients en dialyse et les mécanismes liés à cette dysfonction ne sont pas décrits à ce jour. Notre hypothèse est que des toxines, dont la concentration est élevée dans la circulation sanguine de ces patients, provoquent ce dysfonctionnement amenant à l’échec de fistule artério-veineuse. Notre objectif est d'étudier in vivo, dans un modèle animal de maladie rénale chronique et de FAV, le rôle des toxines et de leur récepteur dans l’échec de création de fistule artério-veineuse (FAV). Nous testerons : 1) Si la maladie rénale chronique augmente le taux d’échec de FAV, et 2) si l’inhibition du récepteur aux toxines permet d’augmenter le taux de réussite de création de FAV.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence des mécanismes liés à l'échec de création de fistule artério-veineuse (FAV) et de proposer des cibles thérapeutiques afin d'améliorer la qualité des séances de dialyse et par conséquent la qualité de vie des patients atteints de maladie rénale chronique.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux seront soumis à des 2 interventions chirurgicales pour reproduire une maladie rénale chronique, sous anesthésie générale, espacées d'une semaine et chaque interventionchirurgicale durera 20 minutes. Deux semaines après, ces mêmes animaux seront soumis à une 3ème intervention chirurgicale pour la création de la fistule artério-veineuse (FAV) qui durera 20 minutes également. Les animaux de la procédure n°2 seront soumis aux mêmes interventions chirurgicales que ceux de la première procédure à savoir 3 chirurgies de 20 min (à 8, 9 et 11 semaines de vie). Ces mêmes animaux seront également soumis à un gavage oral toutes les 48h pendant 7 semaines et chaque gavage durera quelques secondes, soit 24 gavages sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées aux différentes procédures chirugicales (douleur et/ou risque infectueux), aux gavages par voie orale (stress), ainsi qu'à la détérioration de la fonction rénale des souris qui aurons une maladie rénale chronique (MRC). Chez ces souris MRC, nous nous attendons à observer une perte de poids et une apparition plus précoce des points limites par rapport à l’apparence physique (poils hérissés, dos courbé ou posture anormale), aux signes cliniques (augmentation de la fréquence respiratoire par exemple) et aux comportements non provoqués (attitude prostrée par exemple).
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prèlèvements de tissus à des fins d'histologie. Ceci permettra de comprendre les mécanismes liés aux échecs de fonctionnement des fistules artério-veineuses.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur les mécanismes de dysfonctionnement des fistules artério-veineuses (FAV) qui sont fréquentes chez les patients traités par dialyse. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux sauvages et génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme.
Réduction
Dans ce projet, nous utiliserons tous les animaux, à savoir 192 souris. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées afin d’utiliser le moins d’animaux possibles : rédaction d'un protocole expérimental avant toute expérimentation, utilisation des statistiques lors de la conception du protocole expérimental pour une estimation préalable du nombre d'animaux nécessaire et suffisant à l'obtention de résultats statistiquement exploitables. Afin de réduire le nombre d'animaux, le partage d'organes ou de tissus d'animaux mis à mort sera également effectué, avec d’autres d’équipes du centre de recherche et d'autres équipes s'intéressant à la maladie rénale chronique.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, et angoisse que pourraient ressentir les animaux. Les animaux resteront sous surveillance journalière pendant la durée entière du projet. La douleur ou la détresse de l’animal sera évaluée sur les paramètres suivants : poids, apparence physique externe, signes cliniques, changement dans les comportements non provoqués, réponses comportementales aux stimuli externes. Des scores seront établis en fonction de ces observations et grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Des mesures seront prises en fonction de ces scores pour éviter tout inconfort de l’animal. Nous serons particulièrement attentifs à la perte de poids qui est un symptôme lié à la détérioration de la fonction rénale et aux suivis postopératoires. Le contrôle quotidien des animaux sera réalisé par un technicien animalier et la mesure du poids sera réalisée au moyen d'une petite balance de paillasse deux fois par semaine. Les animaux seront hébergés par groupes de 5 individus au maximum par cage et un enrichissement sera mis en place par l’ajout de dômes ou de matériaux de nidification de type « Nestlets ». Les quantités de nourriture et d'eau de boisson seront aussi vérifiées quotidiennement. Concernant la chirurgie, l’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant les chirurgies en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera maintenue grâce à un tapis chauffant pendant et après chirurgie et une analgésie avant et après les chirurgies sera mis en place pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie est prévue. Pour l'administration d'un composé par gavage, des canules en plastique seront utilisées afin de réduire le risque de blessure et cette procédure d'administration sera réalisée par une personne expérimentée à cette technique.
Choix des espèces
Les modèles animaux de maladie rénale chronique (MRC) sont essentiels pour l’étude des évènements physiopathologiques permettant ainsi des études translationnelles dont le but est d’améliorer la prise en charge des patients présentant une MRC. L'espèce animale utilisée sera la souris car c’est le modèle le mieux maitrisé pour générer des animaux génétiquement altérés. Les animaux utilisés pour notre projet seront utilisés à partir de 8 semaines car nous souhaitons que la période de la puberté soit révolue (vers 4-6 semaines chez les mâles, 6-7 semaines chez la femelle). Toutes les expérimentations seront réalisées avec des souris au stade adulte. En effet, la maladie rénale chronique est une pathologie qui touche principalement les sujets humains adultes. Il faut donc utiliser un modèle murin adulte pour ce projet. Par ailleurs, il est beaucoup plus aisé de réaliser les procédures chirurgicales sur des souris de taille adulte et ainsi d’effectuer les bons gestes, ce qui justifie également d'utiliser les souris au stade adulte.
Effet des molécules antimicrobiennes du lait maternel sur le diabète chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Biopsie de la pointe de la queue, jusqu'à huit prélèvements sanguins par microcoupure caudale, jusqu'à six injections intrapéritonéales, une mise à jeun de douze heures puis de six heures, et un gavage. 3 840 souris vont être utilisées, dont 2 400 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyses. Elles développent un diabète, immunodépendant ou insulinorésistant selon les groupes, pour tester si des molécules antimicrobiennes du lait maternel protègent du diabète par l'intermédiaire du microbiote. Sur la réduction du nombre d'animaux, une seule phrase, "les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée", sans effectif par groupe ni calcul permettant d'arriver à 3 840.
Objectifs
Le nombre de personnes atteintes de diabète est passé de 108 millions en 1980 à 500 millions en 2021 et ce nombre atteindra 700 millions d'ici 2045 avec 1,5 million de décès directement attribués au diabète chaque année. Il n’existe aucun remède pour aucun type de diabète. Il est donc urgent de mieux comprendre les raisons sur développement du diabète. De nombreux facteurs influencent le développement du diabète dont l'allaitement maternel qui présente un effet protecteur contre le diabète. Cependant, lce rôle est mal connu notamment le rôle du microbiote intestinal. Nous voulons déterminer si des molécules véhiculées par le lait maternel jouent un rôle dans la construction du microbiote et peuvent aider à prévenir le diabète. Nous testerons ces hypothèses dans des souris diabétiques ne produisant pas cette protéine dans le lait.
Bénéfices attendus
Notre étude révélera les mécanismes protecteurs de l'allaitement maternel contre le diabète et ouvrira la voie à des approches thérapeutiques innovantes pour prévenir le diabète chez les enfants à risque.
Procédures
- Biopsie extrême pointe de la queue : 1 fois par animal, 2-3 secondes. - Prélèvement de sang : entre 0 et 8 fois par animal (une seule microcoupure à la queue pour l'ensemble des prélèvements), toutes les deux semaines par microcoupure à la queue, 2-3 secondes. - Régime alimentaire : les animaux vont prendre ou perdre du poids, durée entre 1 et 20 semaines. • Injection intrapéritonéale (IP) : entre 0 et 6 injections, 2-3 secondes. A la fin du régime : • Mise à jeun : une fois 12h et une fois 6h. • Gavage : une fois par animal, 5-10 secondes.
Impact sur les animaux
-Injections intrapéritonéales (douleur de quelques secondes) -Développement du diabéte immuno-dépendant -Développement du diabète insulino-resistant
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyses.
Remplacement
Pour étudier le diabéte, seuls les modèles in vivo sont capables de refléter la complexité de la maladie. Mise en place d’une veille bibliographique pour éviter toute répétition d’expérimentations déjà menées.
Réduction
les groupes ont été dimensionnés par une étude statistique adaptée.
Raffinement
-nombre d’individus par cage : 5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de stress engendrés par une surpopulation; Stratégies d’enrichissement pour assouvir leur besoin ludique (blocs de cotons); Surveillance de leur bien-être quotidien par le personnel de l’animalerie; Selon le plan d’action défini, par les expérimentateurs : Détermination de points limites précoces pour réduire la sévérité des procédures au maximum tout en préservant l’analyse scientifique. Aucune anesthésie ne sera utilisée les tissus étant prélevés post-mortem. Tout animal qui aura une valeur totale de points limites comprise entre 2 et 3 recevra un analgésique (Ketoprofen, dose 5mg/kg, volume 0,012ml/g; SC) sauf pour la perte de poids.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) car il existe des modéles établis de diabète. Les souris seront utilisées à différents stades de développement du diabète.
Biomarqueurs et mécanismes de la fibrose rénale induite par obstruction urétérale unilatérale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une ligature de l'uretère sous anesthésie, une opération d'environ dix minutes qui bloque l'écoulement de l'urine et provoque en dix jours une fibrose du rein, avec un risque de saignement, de cicatrice mal refermée ou infectée. Une partie des souris est ensuite transportée entre deux établissements utilisateurs, dans des sacs isothermes, pour un trajet de cinq à huit minutes, avant les prélèvements terminaux de reins, de plasma et d'urine. Le porteur qualifie le recours aux animaux d'"indispensable" pour comprendre l'insuffisance rénale chronique et indique tenir une veille bibliographique sur d'éventuelles méthodes alternatives.
Objectifs
L’insuffisance rénale chronique (IRC) est une maladie multifactorielle qui peut conduire à la dialyse ou la greffe rénale si elle n’est pas correctement prise en charge. L’IRC mettant en jeux l’interaction croisée de plusieurs organes, son étude nécessite des études précliniques sur des modèles animaux adaptés. L’IRC est très fréquemment associé à une fibrose du rein. Alors que la fibrose est une cause majeure de l’altération de la fonction rénale, sa détection précoce et les mécanismes de sa mise en place restent encore mal connus. L’obstruction urétérale unilatérale (UUO) chirurgicale chez la souris consiste en une ligature du canal d'excrétion de l'urine du rein à la vessie. C'est un modèle classique d’induction de la fibrose rénale. L’obstruction de l’uretère bloque l’écoulement de l’urine vers la vessie, entrainant une accumulation d’urine dans le pelvis induisant une fibrose des tubules rénaux et une perte de la fonction rénale. Ce projet a pour but de rechercher les biomarqueurs urinaires et plasmatiques précoces associés à la fibrose rénale induite par une UUO chirurgicale chez la souris. Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont l’identification de biomarqueurs et une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans le développement de l'IRC liée à une obstruction urétérale.
Procédures
- Chirurgie (obstruction urétérale unilatérale): x1 (environ 10 minutes) - prélèvement de sang: x1 (environ 2 minutes) - injection d'un colorant sous contention: x1 (maximum 5 minutes). Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs, EU1 et EU2. Les procédures non-terminales seront réalisées dans l’EU1. Les procédures terminales seront réalisées soit à l’EU1, soit à l’EU2 selon la disponibilité des salles et du matériel nécessaires.
Impact sur les animaux
Effet indésirable lié à l'UUO dans les 10 jours avant la mise à mort. - Chirurgie : peut provoquer de la douleur et du stress et des complications sont possibles (saignement, cicatrice mal refermée ou infectée). - Mesure de la permeabilité vasculaire rénale : légère douleur liée à l’injection dans la veine caudale sous contention - Prise de sang : risque de saignement
Devenir
Tous les animaux sont mise à mort en vue de l'analyse de leurs reins, de leur plasma et de leur urine en post-mortem.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation sur des animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes physiopathologiques complexes mis en jeux dans l'installation de l’IRC. Ces mécanismes restent à l’heure acutelle impossibles à modéliser in vitro. Toutefois, une veille bibliographique est réalisée régulièrement par les responsables du projet pour prendre connaissance d’éventuelles nouvelles méthodes alternatives.
Réduction
La chirurgie UUO est bien maitrisée par les expérimentateurs impliqués. Cela limite les étapes de mise au point couteuses en animaux. D’après notre expérience du modèle, le nombre d’animaux est calculé au plus juste pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes interprétables pour chaque paramètre mesuré. Il est prévu d’utiliser 240 souris. La comparaison entre 2 groupes sera réalisée en utilisant un test statistique. La comparaison entre plusieurs groupes sera réalisée en utilisant un autre test statistique.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les expériences réalisées au laboratoire. Les animaux seront hébergés par groupes de 4 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec libre accès à l'eau et à la nouriture. Ils seront observés quotidiennement (apparence générale, comportement, absence de plaies, apparence des cicatrices après la chirurgie...) afin de s’assurer de leur bien-être, et pesés une fois par semaine. Une grille de scoring a été établie définissant précisemment les points limites à ne pas dépasser. Si un des points limites est atteint, l'animal concerné sera mis à mort. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les personnels intervenant dans ce projet sont formés à l’expérimentation animale et à la chirurgie. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (anesthésie, analgésie, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Lors de chirurgies, les animaux sont placés sur tapis chauffant, et du gel diet et de l’hydrogel sont placés dans les cages après les chirurgies pour faciliter l’alimentation et l’hydratation des animaux. Si les animaux sont transportés dans l’EU 2/2, il le seront en respectant la charte de transport. Le transport est assuré seulement par les personnes formées à l’expérimentation animale. Les cages sont transportées dans des sacs isothermes (2 cages maximum par sac) de façon à limiter au maximum le stress lié aux variations de température ou aux bruits excessifs. Le trajet du transport se fait selon un plan défini selon la pièce de destination à l’EU2/2. La durée du transport peut varier entre 5 et 8 minutes selon la pièce de destination.
Choix des espèces
L’espèce choisie permet d’utiliser le moins d’animaux possible pour atteindre les objectifs du projet. De plus, la littérature indique qu’elle est celle qui fournit les résultats les plus satisfaisants et qu’elle est la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance, de l'angoisse ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines au début de l'expérience, à ces âges les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques adultes.
Recherche d’agents d’imagerie pour discriminer la Maladie d’Alzheimer et le Diabète de type 2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tuées pour fournir des tissus sur lesquels les sondes d'imagerie seront testées, les souris de ce projet ne reçoivent aucun agent d'imagerie de leur vivant. 210 souris vont être utilisées, 72 dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil, 90 en souffrance légère et 48 en souffrance modérée. Elles portent des modèles de maladie d'Alzheimer ou de diabète de type 2, sont génotypées par un punch à l'oreille, développent pour certaines une hyperglycémie dès deux mois avec perte de poids, et sont tuées à trois, six ou douze mois selon le stade de maladie étudié. Le bénéfice annoncé, un diagnostic capable de distinguer les deux maladies, reste au stade du projet, la sélection des sondes se faisant d'abord in vitro.
Objectifs
Le diabète de type 2 (DT2) et la maladie d'Alzheimer (MA) mettent en jeu des fibres amyloïdes, agrégats de protéines spécifiques de chaque pathologie. La détection par imagerie de ces fibres est importante à la fois pour le diagnostic et pour la compréhension des mécanismes moléculaires de ces maladies. Malgré le grand nombre d'agents d'imagerie existants pour la détection des pathologies à amyloïdes, aucun n'a jusqu'à présent montré de sélectivité permettant de discriminer les agrégats du DT2 et de la MA. Comme de plus en plus de données suggèrent l’influence de chaque pathologie sur l'incidence de l’autre, leur discrimination sélective devient importante pour leur diagnostic et le développement de potentiel traitement. Avec ce projet, nous avons l'intention de contribuer à ce domaine émergent en développant des outils sélectifs (sondes spécifiques de chaque agrégats), qui pourront servir d’agent d’imagerie pour le diagnostic. Ces outils chimiquement produits sont testés au préalable sur des agrégats de chaque pathologie in vitro. Seuls ceux ayant une capacité de reconnaissance spécifique seront testées sur des tissus post-mortem de modèles animaux rongeurs.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer à terme des outils d'imagerie sélectifs contre les agrégats qui sont intrinsèquement liés et impliqués dans la MA et le DT2. Avec les preuves émergentes d'une influence sur l’incidence d’apparition de la MA chez les diabétiques et inversement d’un diabète chez les patients MA, le développement d'outils de diagnostic pouvant sélectivement les différencier devient primordial pour engager des traitements appropriés et personnalisés.
Procédures
Certains animaux seront injectés sous anesthésie, 1 heure avant leur euthanasie (durée : 1 min). Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie. Dans ce projet il n’y a pas d’injection in vivo d’agent d’imagerie. Les tissus sont prélevés post-mortem chez les animaux pour faire des tests ex vivo. Tous les animaux seront systématiquement génotypés à partir d’une biopsie à l’oreille (durée moins d’1 min)
Impact sur les animaux
Les modèles animaux rongeurs diabétiques développent une hyperglycémie à partir de 2 mois et peuvent perdre du poids. Identification des animaux par punch à l’oreille (douleur légère et de courte durée). Injection intraveineuse sous anesthesie (risque d’hématome au niveau de l’injection)
Devenir
Les modèles animaux utilisés dans l’étude seront tous euthanasiés pour collecter le sang à des fins de suivi de marqueurs des pathologies, des tissus pour tester le bon ciblage des agents d‘imagerie avec les agrégats présents dans chaque pathologie afin de s’assurer que le diagnostic est pertinent.
Remplacement
Le projet porte sur l’étude de pathologies chroniques et à évolution progressive. L’étude de l’influence de la maladie d’Alzheimer sur le développement du diabète, et inversement, est abordée en première instance in vitro, mais il est ensuite important, pour vérifier nos données, de passer sur des modèles animaux rongeurs des 2 pathologies pour valider le potentiel discriminant de ces sondes in situ.
Réduction
Dans ce projet, plusieurs temps d'étude sont considérés pour prendre en compte l'évolution des pathologies. Afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris (pathologique ou non) comporte 10 individus hébergés de façon mixte pathologique et non-pathologique. L’évolution des 2 pathologies et de leur incidence chez les hommes et les femmes étant différentes, l’étude considère les 2 sexes. Pour l’étude sur la MA, 3 temps au cours de la pathologie seront étudiés (3, 6 et 12 mois), ce qui engage 60 mâles et 60 femelles. Pour l’étude sur le DT2, 2 temps au cours de la pathologie seront étudiés (2 et 4 mois), ce qui engage 40 mâles et 40 femelles. ..
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans un environnement enrichi: petites maisons en plastique, matériel de nidification et buchettes à ronger. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par les zootechniciens et les personnes intervenant dans ce projet (état général) tout au long de l’étude, avant leur euthanasie, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les modifications de comportement et l’état général des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur, par administration d’un analgésique par période de 6/8h et sur au moins 48h afin d’atténuer la douleur, voire d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés après une analgésie et une anesthésie.
Choix des espèces
L’objectif du projet est d’étudier l’influence de la maladie d’Alzheimer sur le développement du diabète de type 2 et inversement. Les modèles animaux rongeurs de chacune de ces pathologies utilisés dans ce projet reproduisent respectivement ces 2 maladies. Ils sont appropriés car ils expriment des facteurs humains qui reproduisent certains caractères de chaque maladie au cours du vieillissement. Les stades étudiés au cours du projet correspondent 1/avant le développement ou au début de la pathologie et 2/ à un stade où la maladie est installée.
Etude des effets d’un traitement sur le développement tumoral et sur le microbiote dans un modèle murin de cancer du foie
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Transgéniques, les souris de ce projet développent spontanément un carcinome hépatocellulaire, détectable au scanner vers vingt semaines. 40 vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une injection dans la veine caudale, sept injections intra-abdominales sur deux semaines et demie, un isolement jusqu'à dix minutes dans une cage vide pour récupérer une crotte, et un scanner hebdomadaire sous anesthésie. Le porteur écarte le rat traité par un cancérogène chimique au motif que ce traitement serait plus douloureux et brouillerait les mesures de microbiote. Toutes sont tuées à la fin du traitement pour que leur tumeur soit prélevée.
Objectifs
Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95% des cancers du foie. Il est le sixième cancer le plus fréquent dans le monde (nombre de nouveaux cas par an) et le troisième plus mortel. De plus, le nombre de cas est en augmentation constante. Le CHC apparaît à la suite d’infection chronique par le virus de l’hépatite B ou C, ou de maladies hépatiques chroniques non virales, dues à la consommation d’alcool, à l’obésité ou au diabète. Il est trois fois plus fréquent chez l’homme que chez la femme. Pendant 15 ans, un seul médicament était préconisé pour les patients dont le CHC était non opérable. Il ralentissait l’évolution de la maladie, mais permettait rarement la guérison complète. Récemment, l’utilisation de l’immunothérapie a permis d’augmenter considérablement la survie des patients, mais pour un tiers d’entre eux seulement. Il est donc très important d’identifier d’autres traitements qui pourraient bénéficier à la majorité des patients atteints de CHC et de tester leur efficacité. Les altérations de protéines impliquées dans la régulation épigénétique (qui permet de définir comment les gènes vont être utilisés par une cellule) au cours du développement des cancers ont été rapportées dans de nombreux types de cancer dont le CHC. Il a été montré, à l’aide de culture de cellules en laboratoire, que l’inhibition de ces protéines entraîne la mort des cellules cancéreuses. D’autre part, un nombre croissant d’études montre que la composition du microbiote intestinal a une influence sur la réponse des patients au traitement anti-cancéreux. Il est à noter que notre laboratoire a mis en évidence des différences dans les altérations des régulateurs épigénétiques et dans la composition du microbiote entre mâles et femelles, chez des souris transgéniques développant un CHC. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité d’inhibiteurs de protéines impliquées dans la régulation épigénétique sur la croissance d’un CHC chez les souris mâles et femelles. Nous suivrons la taille de la tumeur au cours du traitement par imagerie scanner et nous analyserons les modifications de la composition du microbiote au cours du traitement.
Bénéfices attendus
La mortalité importante et précoce des patients atteints de CHC à un stade avancé oblige à intensifier la recherche de nouveaux traitements. Le ciblage de régulateurs épigénétiques est une option qui a montré son efficacité dans des modèles murins d’autres types de cancer et qui est actuellement en développement clinique. Nous pensons que l’administration d’un inhibiteur de ces régulateurs épigénétiques entraînera une réduction de la croissance tumorale dans notre modèle murin de CHC. En outre, nous pourrons déterminer si le sexe est un composant de cette réponse. En parallèle, nous caractériserons les modifications du microbiote au cours du traitement. Notre étude devrait nous permettre de tester l’efficacité de ce type de médicaments dans le CHC, ainsi que l’influence du sexe et de la composition du microbiote sur cette efficacité. Nos résultats contribueront à déterminer si un tel traitement peut être envisagé dans le traitement du CHC chez l’Homme.
Procédures
Pour pouvoir étudier le microbiote fécal, chaque souris sera isolée deux fois dans sa vie dans une cage vide jusqu’à obtention d’une crotte (10 minutes au maximum). Concernant le traitement, elles recevront une injection intraveineuse dans la veine de la queue (durée maximum trois minutes, comprenant le temps de contention et de préparation de la veine) et sept injections intra-abdominales (durée maximum 30 secondes par injection), à raison de trois injections par semaine. La croissance de la tumeur sera suivie par imagerie une fois par semaine, ce qui nécessitera une anesthésie gazeuse d’une durée de 7 à 10 minutes.
Impact sur les animaux
- A 20 semaines, les animaux inclus dans l’expérience recevront une injection unique dans la veine caudale (environ trois minutes, comprenant la contention et la préparation de la queue), ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Lorsqu’ils entreront dans la procédure et à la fin de celle-ci, le prélèvement d’une crotte nécessitera de les isoler dans une cage vide (de 30 secondes à 10 minutes maximum), ce qui les stressera. - Lorsqu’ils entreront dans le protocole de traitement, les animaux recevront 3 injections intrapéritonéales par semaine, pendant deux semaines et demi (7 au total), 30 secondes par injection. Toutes les injections se feront sur souris vigiles, ce qui engendrera du stress et une douleur au point d’injection. - Les animaux seront pesés avant chaque injection (30 secondes), engendrant là aussi un stress. - Les animaux seront surveillés pour détecter des signes liés à une gêne ou une douleur générée par la présence de tumeurs hépatiques ou par l’injection du médicament.
Devenir
A la fin du traitement, les souris seront mises à mort, pour prélever leur tumeur et étudier l’effet du traitement.
Remplacement
L’efficacité du traitement que nous voulons appliquer aux souris a été démontrée sur des cellules cancéreuses en culture par de nombreux laboratoires, dont le nôtre. Mais cette approche ne permet pas d’étudier l’effet du traitement sur le cancer lorsqu’il se développe au sein d’un organe, ni les modifications et le rôle potentiel du microbiote au cours du traitement. C’est pour cette raison que nous devons tester notre traitement sur des souris qui développent un cancer du foie.
Réduction
Nous avons utilisé un test statistique qui a permis de déterminer qu'il fallait au minimum 9 mâles et 9 femelles par groupe (un groupe recevant le traitement et un groupe contrôle), soit 36 animaux, pour que les résultats soient statistiquement significatifs. Comme nous utilisons le nombre minimum, nous conserverons deux mâles et deux femelles supplémentaires, au cas où une des souris entrées dans l’expérience décèderait. D’autre part, grâce au suivi par imagerie, nous pourrons homogénéiser les groupes en terme de taille de tumeur au début du traitement et être sûrs de ne traiter que des souris ayant développé un CHC, ce qui permettra d’obtenir des résultats fiables en utilisant un nombre minimum de souris.
Raffinement
A partir de 18 semaines, soit deux semaines avant l’apparition supposée de la tumeur, l’observation minutieuse de l’état général des animaux sera effectuée 2 fois par semaine, pour détecter tout signe de souffrance lié au développement de la tumeur, en particulier un gonflement abdominal. Pendant la durée de l’expérience, un traitement de la douleur sera mis en place si des signes de souffrance légère apparaissent et des points limites ont été définis en cas de signes de souffrance plus importants. A partir de 20 semaines, le suivi du développement tumoral par imagerie permettra d’éviter aux animaux une souffrance due à une taille de tumeur importante.
Choix des espèces
Les souris transgéniques sont souvent le seul modèle dont on dispose pour se rapprocher au mieux du développement du cancer chez le patient. Dans le cas du CHC, il est possible d’utiliser des rats traités avec un cancérogène chimique, mais le traitement chimique est plus douloureux. De plus, il risque d’avoir des effets sur le microbiote qui masqueraient ceux dus au développement de la tumeur. Comme nous souhaitons suivre l’effet du traitement lorsqu’une tumeur est présente, nous utiliserons des souris à partir de 20 semaines (âge auquel une tumeur est détectable par scanner). Nous utiliserons des animaux des deux sexes, pour étudier les différences éventuelles dans la composition du microbiote et la réponse au traitement entre mâles et femelles.
Étude des circuits neuronaux et gènes impliqués dans le contrôle de la navigation et de la morphogénèse du poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, isolement jusqu'à sept jours en attente du résultat de génotypage, puis placement en arène de comportement pendant six heures au maximum sous stimulations visuelles ou mécaniques. 5 520 poissons zèbres vont être utilisés, dont 500 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 5 020 dans des procédures légères. Les larves sont immobilisées dans l'agar pour l'enregistrement de leur activité neuronale, jusqu'à cinq sessions de trente minutes à deux heures, ce qui peut provoquer une baisse d'oxygénation et des tentatives de fuite, afin de relier des mutations de gènes parkinsoniens à des défauts moteurs. Une centaine de poissons adultes seront proposés à l'adoption par du personnel de l'établissement, les autres étant tués, y compris les reproducteurs maintenus jusqu'à dix-huit mois pour entretenir les lignées.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ont des origines génétiques et environnementales, affectant la motricité, la posture et la cognition. Pour comprendre ces troubles comportementaux, un modèle animal s’impose. Nous étudions le poisson zèbre car cet organisme partage 70 pourcents de ses gènes avec l'humain et est transparent durant son développement larvaire, permettant une observation non invasive du cerveau et de la moelle épinière. Le poisson zèbre offre des avantages pour étudier la posture et la locomotion, car ses contraintes posturales et biomécaniques sont plus proches de celles des humains (bipèdes) que celles des quadrupèdes. Nous comparerons dans ce projet des poissons témoins à des mutants présentant des pertes de fonction pour des gènes identifiés chez des patients Parkinsoniens avec un développement précoce de la maladie. Nous analyserons chez ces mutants leur navigation en réponse à des stimulations sensorielles, leur capacité à capturer des proies, et examinerons les défauts des circuits moteurs sous-jacent par des techniques innovantes d’imagerie et de physiologie. Cette approche permettra d'identifier les origines des défauts du comportement moteur dans les circuits neuronaux du cerveau et de la moelle épinière et d'améliorer notre compréhension des maladies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Ce projet offre deux bénéfices principaux : d’un point de vue translationnel pour l’humain et d’un point de vue fondamental pour augmenter nos connaissances sur les formes larvaires des poissons. D’un point de vue scientifique, ce projet permettra d’améliorer notre compréhension du rôle des gènes dans l’organisation et la fonction des circuits moteurs vertébrés. Notre approche se fonde sur des résultats obtenus pour des gènes associés à la maladie de Parkinson. En vue de progresser dans notre compréhension de la maladie de Parkinson, ce projet permettra d’établir un lien entre mutations géniques et le dysfonctionnement et la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques qui affectent les circuits moteurs. Ainsi d’un point de vue sociétal, il permettra à plus long terme d’identifier de nouveaux traitements par stimulation ciblée génétiquement des circuits moteurs chez les patients Parkinsoniens. D’un point de vue écologique, le contrôle de la locomotion chez les poissons aux stades larvaires est très peu connu. Notre étude permettra en se focalisant sur le poisson zèbre et en le comparant à d’autres espèces grâce à des collaborations (poissons cavicoles du Mexique, poissons clown de la barrière de corail), d’établir des principes fondamentaux conservés dans la navigation larvaire des espèces aquatiques.
Procédures
Afin de connaitre le patrimoine génétique d’une partie des poissons potentiellement mutants, une biopsie minimale de la nageoire caudale sera réalisée sous anesthésie générale (durée de moins d’une minute par animal et une seule fois). Ils seront ensuite hébergés seuls jusqu’à réception des résultats (durée inférieure à 7 jours). Dans le but de déceler des dysfonctionnements des circuits moteurs associés à des mutations identifiées chez des patients de la maladie de Parkinson, une partie des poissons zèbre seront placés dans des arènes de comportement. Après une habituation de 30 minutes maximum, ces poissons seront soumis à des stimulations visuels ou mécaniques légères pour évaluer leur aptitude motrice et cela pendant 360 minutes maximum. Afin de comprendre l’effet des mutations génétiques sur les neurones impliqués dans le contrôle du mouvement, une partie des animaux sera placée sous un microscope afin d’enregistrer l’activité de populations de neurones par imagerie ou par électrophysiologie (une session de 30 min à 2h maximum par jour, qui sera répétée si besoin jusqu’à 5 fois).
Impact sur les animaux
Les manipulations et déplacements des aquariums nécessaires au cours du projet pourront être source de stress pour les animaux. Chez l’adulte, l’acte de biopsie consistant à prélever un échantillon de nageoire caudale sous anesthésie générale brève (moins de 3 minutes) peut provoquer un stress lié à la capture et une légère douleur due à la lésion de l’extrémité de la nageoire. L’anesthésie présente des risques très limités pour l’animal du fait de sa durée courte et de la sédation peu profonde. Il est possible qu’un phénotype dommageable émerge par suite des modifications génétiques générées. Les effets indésirables de nos expériences comportementales sur les larves sont le confinement dans une arène et la stimulation sensorielle qui peuvent augmenter leur stress. L’immobilisation des larves pour les enregistrements optiques et électrophysiologiques peut générer du stress lors de l’immobilisation en agar, une diminution d’oxygénation, un comportement moteur d’échappement ou une réduction des fréquences operculaire et cardiaque.
Devenir
A l’issue des manipulations, l’ensemble des animaux sera euthanasié. Des prélèvements de tissus seront effectués pour analyser l’anatomie du système nerveux. Une partie des animaux sera maintenue en vie pour être adoptée (une centaine d’animaux) si leurs caractéristiques génétiques et leur statut sanitaire le permettent. Les poissons adultes permettant le maintien des lignées sur la durée du projet seront maintenus en vie jusqu’à 18 mois, âge de fin de vie où ils seront euthanasiés.
Remplacement
Les études de mutations de la maladie de Parkinson in vitro ont permis d’observer des défauts cellulaires au niveau des mitochondries, mais n’expliquent pas la source des défauts moteurs et ne permettent pas d’élucider quels réseaux neuronaux au sein des circuits moteurs demeurent résilients chez ces mutants. Une étude comportementale est inévitable pour comprendre comment des mutations génétiques entrainent des défauts moteurs. Pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents aux pertes de fonction motrice, il est nécessaire de procéder à la perte de fonction du gène ciblé dans des animaux modèles car posture, locomotion ou cognition ne peuvent être évidemment récapitulées in vitro. Pour l’étude du tronc cérébral dans le contrôle moteur, le poisson zèbre (Danio rerio) est un organisme génétique modèle dont le génome comporte 70 pourcents de conservation avec celui de l’être humain. L’analyse du comportement du poisson zèbre porteurs de mutations de gènes candidats parkinsoniens en comparaison à des animaux intacts permettra ainsi d’associer ces mutations à des défauts moteur.
Réduction
Afin de limiter le plus possible le nombre d’animaux pour notre étude, nous avons évalué le nombre d’individus nécessaires pour chaque procédure. Pour cela nous nous sommes basés sur un calcul de puissance statistique prenant compte de l’amplitude des effets et de la variabilité du comportement afin d’avoir le nombre minimal d’individus pour détecter un effet. Pour diminuer le nombre d’adultes à élever, si cela est compatible avec les mutations générées, nous génotyperons dès le stade larvaire ce qui permettra de n’élever que des poissons d’intérêts (poissons porteurs des mutations d’intérêt et témoins sains. Pour identifier avec le minimum d’animaux possibles les mutations entraînant des défauts moteurs, nous utiliserons une approche de criblage reposant sur l’analyse des stades larvaires entre 5 et 7 jours de développement. Pour chaque quantification, les tests statistiques appropriés seront utilisés pour évaluer la significativité des effets observés. Le nombre total d’animaux utilisés dans ce projet sera de 5 520 poissons zèbre.
Raffinement
L’hébergement des animaux sera conforme à la réglementation : en incubateur jusqu’à 6 jours puis mise en eau avec flux progressif favorisant une prise alimentaire optimale. Nous respecterons le besoin social des poissons zèbre et, quand utile, un enrichissement avec des poissons de souche différente aura lieu pour former un groupe social avec un sexe ratio optimal. Les poissons en aquarium seront nourris 2 à 3 fois par jour avec une nourriture adaptée à leur taille et stade physiologique. Surveillés chaque jour, ils sont hébergés dans des conditions précautionneuses : suivi des paramètres physico-chimiques de l’eau journalier et contrôle sanitaire 3 fois/an. Une fois par semaine, notre équipe observera en détail les poissons mutants en vérifiant mobilité, flottabilité, prise alimentaire et morphologie adéquate pour leur âge. Nous manipulerons à minima les animaux avec des instruments atraumatiques (épuisette, cuillère) en plastique. Autant que possible, nous génotyperons les larves à 3 jours par « grattage » minimalement invasif de la queue pour n’élever que des poissons mutants et témoins sauvages et diminuer la variabilité de phénotypes en les séparant précocement. Quand le génotypage adulte s’impose, la biopsie de la nageoire caudale se fera sous anesthésie générale via des manipulations atraumatiques et un prélèvement limité avec outils désinfectés. Nous n’inclurons dans nos procédures expérimentales que des larves ou adultes en apparente bonne santé. Les animaux auront une période d’habituation adéquate au changement environnemental dans les chambres de comportement et d’imagerie. Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Afin de limiter l’inconfort des animaux et de diminuer la douleur lorsque des enregistrements par imagerie et électrophysiologie, les larves seront anesthésiées durant toutes les phases de manipulation et de préparation des enregistrements. L’anesthésie sera graduellement levée une fois que l’animal sera préparé. Afin d’offrir une fin de vie de qualité pour nos poissons non utilisés, nous offrons la possibilité au personnel formé et sensibilisé aux bases de l’aquaculture de pouvoir recueillir des animaux adultes chez eux via un programme d’adoption dédié.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle de choix pour étudier les défauts moteurs associés à des mutations dans des gènes critiques pour le fonctionnement des neurones et conservés au sein des espèces vertébrées. Notre connaissance réduite de la structure et du fonctionnement dynamique des circuits moteurs vient notamment du fait qu’ils sont difficiles d’accès chez les mammifères. Le poisson zèbre dont le tronc cérébral et la moelle épinière restent accessibles optiquement pendant le premier mois de vie est donc un modèle de choix pour mesurer l’activité neuronale de manière dynamique et non invasive en utilisant la lumière car les circuits moteurs sont ainsi conservés au niveau moléculaire, anatomique et physiologique. Notre projet repose sur l’étude des comportements larvaires et adultes. Nous sonderon phénotypes moteurs tels que navigation et capture de proies sur des larves de 5-7 jours puis les comportements sociaux sur des larves de 21-28 jours. Nous utiliserons l’électrophysiologie et l’imagerie optique reposant sur la transparence du tronc cérébral et de la moelle épinière de la larve auront lieu de 7 à 28 jours de développement.